Micro-ondes et immunomarquage

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Roger Lheureux
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1 Micro-ondes et immunomarquage

2 Microscopie optique (coupes cryostat, vibratome, rabot et coupes paraffine) Immunocytochimie ultrastructurale Fixation «in situ» : application en neurosciences

3 FIXATION ENROBAGE (paraffine, Epoxy, Métacrylates) COUPES (Cryostat, vibratome, rabot montées ou flottantes) COUPES ICC Microscopie optique ICC ENROBAGE (Epoxy) et coupes UF

4 Utilisation des MO à différentes étapes du protocole d immunocytochimie Fréquence 2,45 Ghz, puissance de 150 à 800 W selon protocoles Fixation Démasquage antigénique Réduction de la durée des temps d incubation Application dans les cas de marquages multiples (Leong et Sormunen) Pour l ultrastructure : Réduction de la durée des étapes de déshydratation/ imprégnation/polymérisation Réduction des temps de contraste sur grilles (2 x 15 s vs 40 min) et diminution du nombre de précipités

5 Micro-ondes et ICC en microscopie optique

6 Coupes paraffine montées sur lames de verre 1-Réduction de la durée des étapes de déparaffinage 2-Réduction de la durée des temps d incubation 3-Possibilité de démasquage antigénique Coupes cryostat, rabot Pour les coupes montées : cf 1 et 2 précédents Coupes flottantes : cf 1 et 2 précédents

7 Exemple de protocole paraffine (Pelco) Etape Puissance/température Durée Déparaffinage - Xylène 250 W 4 min Réhydratation- Alcool W 1 min Réhydratation Eau 30 sec Démasquage antigénique Pas de méthode spécifique Blocage des peroxydases endogènes W 1 min Rinçage (tampon) W 1 min Blocage des sites NS W 3 min Anticorps primaire W Sous vide 6 min (2 on - 2 off - 2 on) ou 12 min (3 on - 3 off - 3 on) Rinçage (tampon) W 1 min Anticorps secondaire W Sous vide 6 min (2 on - 2 off - 2 on) ou 12 min (3 on - 3 off - 3 on) Rinçage (tampon) W 1 min Système de révélation W Sous vide 6 min (2 on - 2 off - 2 on) ou 12 min (3 on - 3 off - 3 on Rinçage (tampon) W 1 min Chromogène W 1-6 min Rinçage eau désionisée W 1 min Contre coloration W 1-3 min Rinçage eau désionisée W 1 min

Démasquage antigénique Pas de méthode universelle Solutions commerciales contenant des métaux lourds toujours commercialisées (TEBU, chères) peu usitées car toxiques Immersion 5 à 10 minutes

8 Démasquage antigénique Pas de méthode universelle Solutions commerciales contenant des métaux lourds toujours commercialisées (TEBU, chères) peu usitées car toxiques Immersion 5 à 10 minutes à C Efficaces (amélioration du marquage pour 44 des 46 AC testés) Classiquement tampon citrate 10 mm ph6 quelques minutes Il existe un effet MO indépendant de l élévation de température

Etapes de l ICC Raccourcissement de la durée des incubations avec les AC Possibilité d obtenir des résultats plus rapidement Selon les auteurs immunoréactivité aussi bonne ou meilleure, ou moins

9 Etapes de l ICC Raccourcissement de la durée des incubations avec les AC Possibilité d obtenir des résultats plus rapidement Selon les auteurs immunoréactivité aussi bonne ou meilleure, ou moins spécifique Augmentation du marquage spécifique, mais pour chaque AC, paramètres MO à ajuster Cas des marquages multiples à la peroxydase: dénaturation des anticorps déjà liés diminution des réactions croisées entre 2 séquences Inactivation des peroxydases entre 2 révélations diminution du risque de développement d une couleur inappropriée

10 EXEMPLE DE PROTOCOLE A LA DAB SUR COUPES FLOTTANTES GFAP MO Conv Témoin

11 Exemple de protocole sur culture cellulaire avec fluorophore Neurones et ß-tubuline Astrocytes et GFAP

12 Micro-ondes et ICC ultrastructurale

Conservation antigénique et enzymatique De nombreuses publications font état d une meilleure préservation antigénique et enzymatique Irradiation par MO permet d écourter la durée d exposition aux

13 Conservation antigénique et enzymatique De nombreuses publications font état d une meilleure préservation antigénique et enzymatique Irradiation par MO permet d écourter la durée d exposition aux fixateurs aldéhydiques Mise en évidence de nombreuses protéines non visualisées par les méthodes de fixation conventionnelles En général la fixation par MO permet d augmenter l antigénicité des antigènes sensibles au glutaraldéhyde tout en conservant une bonne préservation ultrastructurale (Jamur et al 1995)

14 Immunocytochimie pré-enrobage

15 Immunocytochimie post-enrobage

16 Comparaison de l intensité de marquage de l histamine dans les granules de mastocytes fixés conventionnellement ou au MO (d après Login et al. 1992) Méthode de fixation Immersion dans Paraf 2% - Gluta 2,5% 1h 20 C MO 7 s 48 C dans Paraf 2%- Gluta 2,5% Surface du granule (µm 2 ± SEM) 1,02 ±0.07 (7 images, 29 granules) 0,98 ± 0.09 (5 images, 31 granules) Densité (particules/µm 2 ± SEM) 28 ± 5 38 ± 13 NS (p>0,1)

Démasquage antigénique Peu de publications sur matériel inclus en résine car méthode considérée comme capricieuse Applications décrites sur GMA, epoxy Polarbed 812, MMA et LRW (coupes de 1mm

17 Démasquage antigénique Peu de publications sur matériel inclus en résine car méthode considérée comme capricieuse Applications décrites sur GMA, epoxy Polarbed 812, MMA et LRW (coupes de 1mm immergées dans du tampon citrate 10 mm en ébullition mise en évidence de vimentine, collagène de type IV, cytokératine, laminine non visualisés sans traitement MO ou pré-traitement enzymatique) Applications directement sur coupes UF

18 Démasquage antigénique sur coupes UF Coupes déposées sur grilles Ni/formvar Immersion dans du tampon citrate 10 mm dans des supports plastiques Chauffage du tampon à C pendant 5 min Maintien dans le tampon 20 min avant transfert en TBS et ICC

19 Démasquage antigénique sur coupes UF

20 Intérêt de l irradiation MO Morphologie de qualité comparable à celle obtenue par fixation conventionnelle En général augmentation de l intensité de marquage (possibilité de diminuer les concentrations d AC) et réduction du bruit de fond (optique et électronique) Gain de temps

21 Application en neurosciences Fixation «in situ» du cerveau sur animaux vigiles

Animal installé dans un système de contention Irradiation par un faisceau de MO (4 à 5 kw) pendant quelques secondes température à l intérieur du cerveau de l ordre de 90 C provoquant une

22 Animal installé dans un système de contention Irradiation par un faisceau de MO (4 à 5 kw) pendant quelques secondes température à l intérieur du cerveau de l ordre de 90 C provoquant une inactivation des systèmes enzymatiques Applications Etude de l état de phosphorylation des phosphoprotéines Préservation des niveaux des neurotransmetteurs Préservation des seconds messagers Préservation de métabolites d intérêt

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