Dénombrement d une flore d un produit microbien

Transcription

1

2 3 Chapitre Dénombrement d une flore d un produit microbien ACTIVITÉS COURS 1. Dénombrement après filtration sur membrane Dénombrement en milieu liquide Dénombrement en milieu solide (masse, surface) Dénombrement par observation directe 65 N 1 Diagnostic d une infection urinaire 68 N 2 Dénombrement des E. coli dans une préparation à base de viande 71 N 3 Dénombrement des entérocoques dans une eau 73 Les objectifs du programme Pour approfondir les méthodes de dénombrement vues en classe de première, l étude visera les caractéristiques essentielles des différentes méthodes de dénombrement et les paramètres qui les différencient. FICHE TECHNIQUE N 1 La filtration d un liquide 76

3 Chapitre 3 Dénombrement d'une flore d'un produit microbien Le terme «dénombrement d une flore» signifie que l analyse microbiologique doit permettre de quantifier dans l échantillon une flore particulière. Le résultat d une telle analyse quantitative est rendu sous forme d une concentration en micro-organismes (appartenant à une flore particulière) par unité de masse ou de volume d échantillon. Les échantillons peuvent correspondre : à des bioproduits, à de l eau, pour un dénombrement de : flore test d hygiène générale (Flore Mésophile Aérobie Totale), flore témoin de contamination fécale (coliformes totaux, coliformes thermotolérants, E. coli, Entérocoques, spores de bactéries anaérobies sulfito-réductrices, ), flore pathogène (Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans, Legionella pneumophilia, Listeria monocytogenes ) ; à des prélèvements issus de l environnement (air, sol) pour un dénombrement des micro-organismes saprophytes (bactéries, levures, moisissures) ; à des ferments contenant des micro-organismes utiles, permettant la transformation d une matière première en produit alimentaire fini : Saccharomyces cerevisiae (levure de bière) et fabrication de la bière à partir d un moût obtenu principalement à partir d orge germé, Streptococcus salivarus subsp. thermophilus, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus et fabrication du yaourt à partir du lait. Il existe de nombreuses méthodes de dénombrement. Les méthodes directes Certaines nécessitent une culture réalisée dans des conditions d incubation adaptées aux exigences de la flore dénombrée (temps, température, atmosphère) et à l aide d un milieu adapté à ses exigences nutritives (milieu pouvant en plus être sélectif et discriminatif ). La culture peut se faire sur différents types de milieux : sur milieu solide (milieu gélosé) : dénombrement dans la masse (avec ou sans double couche), dénombrement en surface (boîte de Petri classique ou boîte contact). Cette technique a été automatisée par la société Intersciences qui a développé un ensemenceur en surface Spiral (cf. p. 64), dénombrement après culture sur un filtre ayant permis une concentration des micro-organismes (échantillons peu concentrés en micro-organismes) puis déposé sur un milieu gélosé. Il existe des supports alternatifs aux supports traditionnels comme le Petrifilm TM ou les lames gélosées ; en milieu liquide (notamment méthode du Nombre le Plus Probable-NPP). La méthode traditionnelle avec culture en tubes à essais peut être miniaturisée (culture en microplaques, cf. p. 63). D autres méthodes directes ne nécessitent pas de mise en culture : estimation de la biomasse ou du nombre de cellules par unité de volume par mesure du trouble d une culture (ou d une suspension) en milieu liquide (opacimétrie, turbidimétrie) (cf. p. 57) ; cytométrie : manuelle : dénombrement en hématimètre, associé ou non à une estimation de la viabilité des microorganismes, automatisée : cytométrie de flux (cf. p. 67). Les méthodes indirectes Elles associent le résultat de la mesure d une activité biochimique à un nombre de micro-organismes : dénombrement par ATP-métrie (cf. p. 57). 1. DÉNOMBREMENT APRÈS FILTRATION SUR MEMBRANE Dans certains produits liquides (eau, solutés pharmaceutiques buvables ou injectables...), les micro-organismes sont à une concentration très faible (voire nulle si le produit est stérile). Leur dénombrement (rendu en UFC par unité de volume) impose donc de «concentrer les micro-organismes» pour pouvoir compter des colonies. Cette «concentration» se fait grâce à la filtration d un grand volume de produit sur une membrane retenant les micro-organismes Matériel nécessaire Les différentes étapes d un dénombrement par une technique de filtration nécessitent l utilisation d un matériel spécifique Une membrane filtrante La membrane filtrante (document 1 ) a des pores d un diamètre de 0,45 µm m dont la disposition selon un réseau en trois dimensions permet de retenir à sa surface les bactéries. En effet le diamètre des pores du filtre est inférieur à celui des bactéries classiquement rencontrées. Il existe aussi des membranes de porosité de 0,22 µm pour retenir les bactéries les plus petites, des bacilles très fins qui pourraient se faufiler dans le maillage de la membrane de 0,45 µm (cas de Pseudomonas aeruginosa) ou encore des spores. 56

4 1 Membrane filtrante et aspect microscopique du réseau tridimensionnel d une membrane de cellulose Mesure du trouble et estimation de la biomasse ou du nombre de cellules par unité de volume Le trouble d une suspension microbienne (bactéries, levures) est proportionnel à la biomasse présente dans la suspension. Cette technique ne distingue pas la biomasse morte de la vivante, mais son intérêt principal est sa rapidité et sa facilité d application. La mesure peut se faire à l aide d un spectrophotomètre en assimilant l absorbance mesurée entre 600 et 650 nm à celle du trouble. Ce principe est également celui de la méthode des étalons de MacFarland (solutions troubles obtenues traditionnellement par précipitation de sulfate de baryum). On peut comparer visuellement le trouble d une suspension microbienne à celui d un étalon artificiel pour en estimer sa concentration. En effet, le trouble développé par chaque étalon est assimilable à une concentration bactérienne selon le tableau de correspondance suivant : Étalon McFarland Numéro 0, Chlorure de Baryum à 1 % (ml) 0,05 0,1 0,2 0,3 0,4 Acide sulfurique à 1 % (ml) 9,95 9,9 9,8 9,7 9,6 Concentration cellulaire approximative (x10 8 UFC.ml -1 ) 1,5 3,0 6,0 9,0 12,0 Absorbance à 600 nm 0,132 0,257 0,451 0,582 0,669 L ATPmétrie L ATPmétrie est une technique de dosage instantané de l ATP (Adénosine triphosphate), molécule de stockage d énergie présente dans les organismes vivants. La technique, basée sur le principe de bioluminescence, est une réaction enzymatique traduisant une quantité d ATP dans un échantillon en une quantité de lumière émise et mesurée par un luminomètre (valeur obtenue en Unité Relative de Lumière (URL) : luciférase Mg 2+ ATP + luciférine + O 2 AMP + PPi + oxyluciférine + lumière On distingue trois sources d ATP au niveau des prélèvements à analyser : ATP d origine microbienne, provenant des bactéries, des levures ou des moisissures ; ATP dit «somatique», provenant de cellules d êtres vivants (lait, sang, muscle, végétaux, ) ; ATP extracellulaire, provenant de débris de micro-organismes ou de cellules somatiques. Cet ATP est rapidement dégradé dans le milieu extérieur. Le problème des opérations de nettoyage et de désinfection dans les bio-industries est celui de l hygiène. Le nettoyage et la désinfection sont donc des étapes primordiales de la fabrication. Appliqué ainsi au nettoyage-désinfection, le dosage de l ATP sur les surfaces ou les eaux de rinçage permet la détection de résidus organiques vivants (résidus alimentaires) et de développement microbien : si de l ATP est détecté sur une surface ou dans un liquide, c est qu il y a présence de cellules vivantes ; dans le cas d ATP microbien, la présence de micro-organismes représente un risque direct puisqu il peut y avoir contamination des produits ; en revanche, si l ATP est d origine somatique, c est qu il reste des débris organiques sur la surface ; ceux-ci peuvent servir de support de croissance pour des micro-organismes, ce qui constitue un risque indirect pour les produits. 57

5 Chapitre 3 Dénombrement d'une flore d'un produit microbien Un système de filtration L unité ou rampe de filtration (document 2 ) comporte un socle grillagé stérilisable sur lequel on dépose dans un premier temps la membrane filtrante, puis dans un second temps un godet (entonnoir) stérilisable dans lequel on verse le volume de produit à analyser. Le tout est relié à une pompe à vide qui permet de faire passer rapidement le volume de produit à analyser à travers la membrane. Le liquide filtré, débarrassé des bactéries, est collecté dans un récipient «poubelle» pour être éliminé Des milieux de culture La membrane est ensuite déposée sur une gélose nutritive adaptée au type de flore recherchée et l ensemble est mis à incuber (document 3 ). Les milieux utilisés sont le plus souvent sélectifs : ils permettent le développement de la flore recherchée en inhibant (au mieux) les autres flores (dites flores contaminantes). Ils sont aussi souvent discriminatifs (différentiels) : ils permettent de mettre en évidence un (des) caractère(s) biochimique(s) caractéristique(s) de la flore recherchée. Les nutriments diffusent au travers de la membrane et les colonies se développent directement à sa surface. La taille des colonies observées après 24 à 48 heures d incubation reste inférieure à celle de colonies qui se développeraient directement sur le milieu gélosé Exploitation des résultats Le nombre de colonies suspectes sur la membrane (colonies présentant les caractères biochimiques caractéristiques de la flore recherchée en fonction du milieu utilisé) permet de calculer la concentration bactérienne N en nombre d Unité Formant Colonies (UFC) par ml selon la formule : n V N UFC/mL = n v nombre d UFC sur la membrane volume de produit filtré (en ml) Dans l analyse microbiologique des eaux, les normes imposent de filtrer 100 ml d eau à analyser et le résultat est rendu en UFC pour 100 ml. Il n y a donc pas de calcul à faire : le résultat correspond directement au nombre de colonies sur la membrane. 2. DÉNOMBREMENT EN MILIEU LIQUIDE 2.1. Principe Si les conditions optimales de croissance sont réunies, un seul micro-organisme présent dans l inoculum introduit dans un milieu liquide se développe en y créant un trouble (et une modification visible du milieu si celuici est discriminatif ). La lecture des tubes contenant le milieu liquide et ensemencés avec l inoculum est donc de type binaire : résultat négatif si absence de trouble et de modification du milieu : il y avait moins de un microorganisme présent dans l inoculum introduit dans le milieu liquide ; résultat positif si présence de trouble (et de modification du milieu si celui-ci est discriminant) : il y avait au moins un micro-organisme présent dans l inoculum introduit dans le milieu liquide. Le résultat sera positif, que l inoculum introduit dans le tube de milieu liquide contienne 1, 10, 100, micro-organismes. La méthode repose sur la répartition aléatoire des microorganismes dans le prélèvement (méthode statistique reposant sur l utilisation de la loi de Poisson). On ensemence donc une série de tubes avec un volume donné du produit à analyser ou ses dilutions, à raison de 1, 2, 3, 5 voire même 10 tubes par dilution testée. Connaissant le nombre de résultats positifs obtenus dans la série de tubes, on peut déterminer la concentration en micro-organismes présents dans une unité de volume ou de masse du produit analysé Mode opératoire La méthode décrite ci-dessous (NF ISO 7218, mai 1996) est techniquement lourde, mais utilisée lorsque les bactéries cultivent difficilement en milieu gélosé ou lorsque le nombre de bactéries présentes dans l échantillon est relativement faible (document 4 ) : - volume de l inoculum : le plus souvent V inoculum = 1 ml (parfois 10 ml) ; - choix du milieu à ensemencer :. milieu de croissance sans indicateur : la présence de micro-organismes se traduit par un trouble,. milieu sélectif et discriminatif du micro-organisme à quantifier : sa présence se manifeste par un trouble et le virage d un indicateur de ph par exemple ; - choix des dilutions à tester : dépend de la population estimée, le but étant d obtenir, pour une analyse statistique optimale des résultats :. une dilution contenant moins d un micro-organisme dans l inoculum utilisé,. une dilution contenant plus d un micro-organisme dans l inoculum utilisé ; - choix du nombre d essais par dilution (dépend de la précision souhaitée pour les résultats en fonction de leur analyse statistique) :. en général trois tubes sont ensemencés par dilution,. un ou deux tubes sont ensemencés si une précision moins importante est suffisante,. cinq ou même dix tubes sont ensemencés si une précision plus importante est demandée. 58

6 2 Unité et rampe de filtration pour analyse microbiologique Couvercle de l entonnoir Entonnoir de 250 ml Joint torique en sillicone (à l intérieur) Membrane filtrante Grille support du filtre godets Branchement du tuyau Flacon récepteur «poubelle» valve rampe de filtration poubelle pompe à vide 3 Exemples de milieux utilisés dans les techniques de filtration sur membrane Gélose lactosée au TTC et Tergitol 7 Ce milieu est utilisé pour le dénombrement des coliformes qui sont des bacilles Gram négatif de la famille des Entérobactéries, capables de dégrader le lactose. Ils sont recherchés comme témoin de contamination fécale récente. Le Tergitol 7 inhibe la croissance des micro-organismes à Gram positif, limite l envahissement par les Proteus et favorise la récupération des coliformes. Ceux-ci présentent des colonies de coloration jaune ou orangée, à l intérieur d un halo jaune visible sous la membrane. Ce halo est provoqué par l acidification liée à la dégradation du lactose en présence de l indicateur coloré de ph, le bleu de bromothymol (teinte jaune à ph acide). Les autres micro-organismes présentent des colonies dont la coloration rouge à marron est due à la réduction du TTC en formazan insoluble. Sont considérées comme caractéristiques toutes les colonies «lactose-positif», quelle que soit leur taille, si le milieu sous la membrane présente une coloration jaune. Gélose de Slanetz et Bartley Ce milieu est utilisé pour le dénombrement des entérocoques. Les entérocoques sont des coques Gram positif recherchés comme témoin de contamination fécale plutôt ancienne. L azide de sodium permet d inhiber la croissance de la majorité des micro-organismes utilisant une chaine respiratoire aérobie. Le TTC est un indicateur de la croissance bactérienne. Il est réduit en formazan insoluble à l intérieur de la cellule. Cette réaction se manifeste par l apparition de colonies de couleur rouge à marron. Les entérocoques ont un fort potentiel réducteur et leurs colonies présentent donc cette coloration. 4 Organigramme d un dénombrement en milieu liquide 59

7 Chapitre 3 Dénombrement d'une flore d'un produit microbien 2.3. Exploitation des résultats Dénombrement à un seul essai Ce dénombrement s effectue sans recourir aux tables de Mac Grady. On ensemence 1 tube par dilution avec 1 ml d inoculum. Exemple de résultats : Dilution Résultats il y a au moins un micro-organisme dans l inoculum (1 ml) de la plus grande dilution (10-2 ) présentant encore un trouble : la concentration est donc d au moins 10 2 micro-organismes par ml de produit ou de «suspension mère» non dilués ; il y a moins de un micro-organisme dans l inoculum (1 ml) de la première dilution (10-3 ) ne présentant plus de trouble : la concentration est donc strictement inférieure à 10 3 micro-organismes par ml de produit ou de «suspension mère» non dilués. On peut exprimer le résultat selon l intervalle : 10 2 N micro-organismes/ml < 10 3 La concentration du produit analysé est comprise entre 10 2 et 10 3 micro-organismes dans 1 ml Dénombrement à essais multiples Ce dénombrement s effectue en utilisant les tables de Mac Grady (document 6 ). Mise en place du nombre caractéristique Le nombre caractéristique de la série réalisée est une combinaison de trois chiffres : chaque chiffre correspond au nombre de tubes «positifs» pour une dilution donnée ; les trois chiffres correspondent à trois dilutions successives ; le chiffre des centaines correspond à la plus faible dilution (donc à la plus forte concentration en micro-organismes), celui des dizaines à la dilution intermédiaire et celui des unités à la plus grande dilution. Parmi les différentes combinaisons, on choisit celle correspondant au nombre le plus grand et, si possible, inférieur à 330 (correspond à une meilleure répartition des micro-organismes dans les dilutions). Exemple : cinq dilutions ont été ensemencées à raison de trois essais par dilution ; trois combinaisons (de trois chiffres) sont possibles avec les résultats obtenus (tableau 5 ). Parmi les trois combinaisons de trois chiffres possibles (332 ; 321 ; 210), laquelle choisir? Le nombre le plus élevé et inférieur à 330 est sélectionné ; dans cet exemple, il s agit de 321. Si les dilutions sont insuffisantes, on peut être amené à utiliser des nombres caractéristiques comme 333, 332 ou 331. Lecture du NPP (Nombre le Plus Probable) dans la table statistique de Mac Grady On reporte le nombre caractéristique de la série dans une table statistique de Mac Grady. On y lit le Nombre le Plus Probable (NPP) de microorganismes présents dans l inoculum de la dilution correspondant au chiffre des centaines du nombre caractéristique. Exemple : 321 correspond au NPP de 15. Cela signifie qu il y a statistiquement quinze bactéries dans l inoculum de la dilution 10 -(n+1). D après les limites de confiance données par certaines tables, cette valeur numérique de 15 est en fait considérée comme comprise entre 3 et 38 avec une probabilité de 95 %, entre 2 et 52 avec une probabilité de 99 %. Expression du résultat N NPP k V nombre de micro-organismes par ml de produit NPP x k analysé ou de «suspension mère» nombre lu dans la table facteur de la dilution correspondant au chiffre des centaines du nombre caractéristique (combinaison retenue) volume de l inoculum (1 ml en général) Si le produit analysé est solide, on prépare une «suspen- sion mère» de produit en introduisant «x» g de produit dans «9 x» ml de diluant. Cela correspond à une dilution au 1/10 e du produit. Le nombre de micro-organismes par g de produit analysé est donc N x DÉNOMBREMENT EN MILIEU SOLIDE (MASSE, SURFACE) Le principe de ces méthodes s appuie sur le fait qu un micro-organisme présent dans un produit ou dans une suspension de ce produit, mis en culture dans des conditions optimales, en milieu solide convenable, s y développe en formant une colonie. Il s agit de faire correspondre un micro-organisme à une UFC (Unité Formant Colonie) puisque, dans certains cas, le développement de plusieurs micro-organismes 1. Biotechnologies 1 re STL, SCEREN, 2012 groupés peut conduire à une unique colonie. Ces techniques ayant déjà été décrites dans l ouvrage de Première 1, voici les principales informations à retenir (document 7 ). Dilution préalable : le plus souvent, le nombre d UFC par unité de masse ou de volume du bioproduit à analyser est important ; une étape préalable de dilution (série de dilutions de raison 1/10 e ) est nécessaire. 60

8 5 Mise en place du nombre caractéristique Résultats (trois essais par dilution) Dilutions et aspect des tubes après incubation (lecture d un trouble associé à la production de gaz collecté dans une cloche). 10 -n 10 -(n+1) 10 -(n+2) 10 -(n+3) 10 -(n+4) Résultats Nombre de tubes Combinaison possible Combinaison possible Combinaison possible Tables de Mac Grady Deux tubes par dilution Trois tubes par dilution Nombre caractéristique NPP Nombre caractéristique NPP Nombre caractéristique NPP ,0 0,5 0,5 0,9 0,9 0,6 1,2 1,3 2,0 2,0 3,0 2,5 5,0 6,0 13,0 20,0 25,0 70,0 110, ,0 0,3 0,3 0,6 0,6 0,4 0,7 1,1 0,7 1,1 1,1 1,5 1,6 0, ,4 2,0 1,5 2,0 3,0 2,0 3,0 3,5 4,0 3,0 3,5 4,0 2,5 4,0 Nombre caractéristique NPP 6,5 4,5 7,5 11,5 16,0 9,5 15,0 20,0 30,0 25,0 45,0 110,0 140,0 61

9 Chapitre 3 Dénombrement d'une flore d'un produit microbien Inoculation du milieu gélosé : dans la masse : V inoculum = 1 ml. Cet inoculum est introduit dans une boîte de Petri vide et stérile, recouvert du milieu gélosé en surfusion que l on laisse durcir après parfaite homogénéisation. On peut ensuite recouvrir le milieu d une couche de milieu stérile (double couche) pour limiter l envahissement des colonies en surface et avoir des colonies présentant toutes le même aspect ; en surface : V inoculum = 0,1 ml, à étaler à la surface d un milieu gélosé préalablement coulé en boite de Petri. Incubation à la température adaptée à la flore recherchée pendant 18 à 72 heures. Dénombrement des colonies : en surface : elles ont un aspect macroscopique classique et caractéristique ; en profondeur : elles ont un aspect lenticulaire. Exploitation des résultats Elle peut être effectuée selon la norme ISO 7218 (manipulation réalisée en ensemençant deux boites par dilution) : voir Biotechnologies 1 re STL, pp Elle peut être effectuée selon la norme ISO 7218 modifiée en octobre 2007, qui officialise l utilisation d une seule boite par dilution : - choix des essais : choisir deux dilutions successives dont :. l une au moins présente un minimum de dix colonies,. le «nombre maximal de colonies en totalité est de trois cents par boite». En présence d un agent de différenciation, le «nombre maximal de colonies caractéristiques ou présumées est de cent cinquante par boite»,. pour les levures et les moisissures, on retient pour le calcul les dilutions présentant entre dix et cent cinquante colonies par boite ; - calcul de la concentration bactérienne N en UFC par ml ou par g de produit : Arrondir le résultat calculé à deux chiffres significatifs et l exprimer en nombre compris entre 1,0 et 9,9.10 n UFC par ml ou par g. 62

10 Dénombrement en microméthode des entérocoques Pour l analyse des eaux, il existe des microplaques de 96 puits permettant de dénombrer les Enterococcus selon le principe du NPP (d autres microplaques permettent de dénombrer E. coli). La microplaque MUD/SF permet de réaliser le dénombrement des entérocoques dans les eaux, suivant la méthode NF EN ISO Les entérocoques (E. faecium, E. faecalis, E. durans, E. hirae), représentant 70 à 100 % des «streptocoques fécaux», sont de bons indicateurs de contamination fécale ancienne. Le principe de ce dénombrement repose sur la mise en évidence des entérocoques par la détection d une de leur enzyme spécifique, la β-glucosidase, dont le substrat (4-méthylumbelliféryl-β-D-glucopyranoside ou MUD) est déshydraté dans les cupules de la microplaque. En présence de l enzyme le substrat libère un composé fluorescent révélé dans l UV. Le milieu de culture est déshydraté et fixé au fond des puits de la microplaque. La réhydratation du milieu se réalise lorsque l eau à analyser est introduite dans les puits. Les entérocoques (éventuellement présents dans l inoculum) hydrolysent le MUD en 4-méthylumbelliférone et en glucose. La production de 4-méthylumbelliférone, composé à fluorescence bleue, est observée à l aide d une lampe UV proche du visible, à 366 nm. De plus, la composition du milieu, à teneur élevée en peptone et en galactose, permet une excellente récupération des entérocoques. Le milieu contient aussi de l acide nalidixique et de l acétate de thallium qui assurent l inhibition de la presque totalité de la microflore contaminante. L incubation à 44 C permet aussi d inhiber la croissance de la majorité des micro-organismes de la microflore secondaire. Ainsi, toutes ces conditions sélectives de culture ne permettent que la croissance des entérocoques. Une analyse statistique fondée sur la loi de Poisson permet, une fois la lecture faite, de dénombrer les entérocoques présents dans l échantillon en fonction du nombre de puits fluorescents obtenus par dilution testée. Exemple de résultats pour une eau de surface. On ensemence 24 puits (3 colonnes de 8 puits) avec 200 µl de chaque dilution : dilution au 1/2 de l eau à analyser ; on obtient 10 puits positifs sur les 24 ensemencés ; dilution au 1/20 e, on obtient 3 puits positifs sur 2 ; dilution au 1/200 e, on obtient 1 puits positif sur 24 ; dilution au 1/2 000 e, on obtient 0 puits positif sur 24. Le nombre caractéristique de la série est de 3/24, 1/24 et 0/24 soit 3/1/0 (si possible ce nombre doit se terminer par 0). On reporte ce nombre caractéristique dans une table statistique et on obtient le NPP puis on calcule la concentration en entérocoques de l eau analysée. Dilution 1/2 Dilution Dilution Dilution 1/20 e 1/200 e 1/2000 e 7 Dénombrement en milieu solide (masse, surface) (ISO 7218 modifiée) 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml Échantillon à analyser Dilutions de raison 1/10 réalisées dans des tubes contenant 9 ml de diluant stérile 1/10 1/100 1/1000 1/ / ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml Culture Dilutions non exploitables : nombre de colonies supérieur à 300 Dilutions exploitables : deux dilutions successives dont une contient entre 10 et 300 UFC. 63

11 Chapitre 3 Dénombrement d'une flore d'un produit microbien Dénombrement grâce à un ensemenceur Spiral La méthode d ensemencement Spiral permet l ensemencement automatique et standardisé à partir d un échantillon contenant de 30 à UFC/mL, sur une seule boîte de Petri et sans dilution préalable, selon la norme AFNOR V Un volume fixe de l échantillon (50, 100 ou 200 µl) est ensemencé en suivant la forme d une spirale d Archimède décroissante (du centre vers la périphérie). Le volume est donc calibré et connu en tout point de la boîte. Aspect de la spirale mise en évidence par un colorant bleu La densité des colonies est décroissante du centre vers la périphérie Après incubation, la lecture s effectue en rapportant le nombre de colonies au volume déposé sur un secteur donné. Seuls servent au dénombrement les secteurs où les colonies sont correctement espacées. Le comptage est réalisé manuellement à l aide de la grille qui divise la boîte en secteurs correspondant à un volume précis d échantillon déposé. Exemple : ensemencement en mode spiral de 50 µl d échantillon sur une boite de Petri de 90 mm de diamètre Paires de secteurs opposés µl déposés (volume cumulé) 1 1,00 2 2,58 3 5,07 4 9, , ,00 Boîte entière 50,00 Dans un quadrant choisi (A ou B) on dénombre les colonies de la périphérie vers le centre et sur un nombre de secteurs suffisants pour compter au moins 20 colonies. On répète ce comptage sur le même nombre de secteurs dans le quadrant opposé. On calcule ensuite la concentration en micro-organismes de l échantillon : en additionnant les deux comptages ; en ramenant ce nombre d UFC au volume déposé dans les secteurs dénombrés ; en prenant en considération une dilution préalable du produit analysé A B A B 6A B A B colonies comptées sur les secteurs 1 à 4 du quadrant B en haut à gauche. 15 colonies sur le nombre de secteurs équivalent dans le quadrant B en bas à droite. Dans notre exemple, le volume correspondant aux secteurs 1 à 4 des deux quadrants B opposés est de 9 µl (mode spiral exponentiel de 50 µl) et le produit à analyser a été préalablement dilué au 1/10 e avant ensemencement. C = nombre total de colonies x k = (21+15) x 10 = 4, UFC.mL -1 V secteur

12 4. DÉNOMBREMENT PAR OBSERVATION DIRECTE La numération cellulaire peut être réalisée par comptage au microscope, à l aide d une lame de comptage spéciale ou cellule de numération ou hématimètre. Cette technique ayant déjà été décrite dans l ouvrage de Première 2, voici les principales informations à retenir. Lorsque la suspension cellulaire est trop concentrée, il est nécessaire de réaliser une dilution préalable de façon à permettre le comptage des cellules au microscope. Le comptage se fait grâce à un hématimètre, épaisse lame en verre dont le plateau central comporte un quadrillage spécifique gravé (document 8 ). Le volume de comptage est déterminé par : la surface du quadrillage gravé sur la lame ; la profondeur de la chambre : hauteur entre le plancher de la plate-forme centrale et la face inférieure de la lamelle optiquement plane. Remplissage de l hématimètre : faire adhérer parfaitement la lamelle optiquement plane aux plateaux latéraux ; remplir complètement la chambre de comptage avec la suspension cellulaire préalablement homogénéisée. Le remplissage doit être fait en une seule fois, sans bulles d air et sans faire déborder le liquide dans les rigoles. L hématimètre doit toujours rester «à plat» pour éviter une mauvaise répartition des cellules sur le quadrillage ; laisser sédimenter les cellules sur le quadrillage quelques minutes. Numération au microscope (objectif X 40 en général) : vérifier l homogénéité de la répartition des cellules à compter (si la répartition est mauvaise, recommencer) ; compter les cellules contenues sur une surface donnée donc un volume donné ; le nombre de cellules comptées doit être compris entre 200 et 500 cellules pour être statistiquement correct. Prévoir une décontamination et un rinçage de l hématimètre après comptage. Calcul de la concentration cellulaire : n V k N N= n k V nombre de cellules comptées volume de comptage (L ou ml) facteur de dilution nombre de cellules par litre (ou ml) 8 Un hématimètre de Malassez 9 Quadrillage d'un hématimètre de Malassez L hématimètre de Malassez possède un quadrillage spécifique de 2,5 mm de longueur, 2 mm de largeur et une hauteur sous lamelle de 0,2 mm (document 9 ). Le volume correspondant au quadrillage total est égal à 1 mm 3. Ce quadrillage comporte 100 rectangles ; chaque rectangle correspond à un volume de 0,01 mm Biotechnologies 1 re STL, SCEREN,

13 Chapitre 3 Dénombrement d'une flore d'un produit microbien Comptage cellulaire et viabilité cellulaire des micro-organismes eucayotes (levures) L industrie agro-alimentaire utilise de nombreuses levures sélectionnées, conditionnées sous forme de levain (ou de ferment). Ces levures, ajoutées à une matière première, assurent des étapes de la transformation de cette matière première en produit fini. L inoculation de la matière première doit se faire avec un nombre connu de micro-organismes (on veut y obtenir une concentration initiale optimale) et ceux-ci doivent être vivants, pour être capables d exprimer leurs activités enzymatiques et de se multiplier pendant le processus de transformation. La viabilité cellulaire des levures peut être analysée lors du comptage en hématimètre grâce à l utilisation de colorants qui, en fonction de leurs caractéristiques, pénètrent soit dans les cellules vivantes soit dans les cellules mortes. La proportion relative des cellules colorées ou non est un reflet exact du nombre de cellules vivantes ou mortes et donc de la viabilité de l ensemble de la population cellulaire. On peut alors calculer le % de viabilité d une suspension cellulaire : Il existe deux types de colorants utilisables lors d une recherche de viabilité réalisée en hématimètre. Les colorants vitaux ou d inclusion, qui colorent les cellules vivantes. Un colorant vital est une substance qui met en évidence une structure cellulaire sans provoquer la mort immédiate de la cellule. Pour cela, il faut que le colorant soit utilisé à concentration relativement faible et qu un élément cellulaire soit capable de l accumuler. Le rouge neutre, par exemple, est un colorant cationique qui diffuse rapidement à travers la membrane plasmique et se concentre dans les vacuoles (cellules végétales) et les lysosomes. Sa concentration intracellulaire peut être 100 à fois plus importante que la concentration extracellulaire. Les cellules vivantes sont donc rouges et les cellules mortes sont incolores. Les colorants supravitaux ou d exclusion, qui colorent les cellules mortes. Il existe deux explications concernant la coloration différentielle des cellules mortes et vivantes à l aide de ce type de colorant : ces colorants ne se fixent que sur les cellules mortes car la membrane plasmique des cellules vivantes leur est imperméable. Toute perturbation de l intégrité membranaire provoquera une modification de la pénétration de ces colorants. Les cellules vivantes n incorporent pas ces colorants au contraire des cellules mortes (non viables) qui les incorporent et qui apparaissent alors colorées ; ces colorants ont tendance à entrer dans les cellules qu ils rencontrent. Une fois dans la cellule, le colorant entraîne un mécanisme d exclusion qui va éjecter cette molécule dans le milieu extérieur. Ce mécanisme nécessitant de l énergie, seules les cellules possédant une source d ATP peuvent le mettre en place. Ainsi, une cellule vivante expulsera la molécule et restera blanche au microscope, au contraire une cellule morte n aura pas les moyens de la rejeter et deviendra colorée. Exemples de colorants d exclusion : le bleu trypan (cancérigène), l érythrosine B, le bleu de Funk, des colorants fluorescents comme l iodure de propidium ou le bromure d éthidium. Avec le bleu trypan ou le bleu de Funk, les cellules vivantes sont incolores et les cellules mortes sont donc bleues. Observation de Saccharomyces cerevisiae coloré au bleu de Funk (cellules vivantes blanches, cellules mortes bleues) 66

14 Le cytomètre de flux Bactiflow ALS But recherché : passage d une méthode traditionnelle lente à une méthode alternative rapide (24 h) pour réduire le temps de stockage du produit fini en industrie agro-alimentaire (mise plus rapide sur le marché de produit à DLC courte, augmentation de la production en flux tendu). La technique est basée sur : le marquage fluorescent des organismes viables présents dans le produit ; la cytométrie en flux, adaptée à la microbiologie industrielle. L échantillon à analyser est envoyé dans une veine liquide. Un rayon laser permet d activer la fluorescence des bactéries vivantes. Un système optique permet de détecter et de mesurer l émission de fluorescence. Flux liquidien contenant les bactéries vivantes (fluorescentes) ou mortes (non fluorescentes) Un signal fluorescent détecté est dû à la présence d une bactérie vivante. La comptabilisation des signaux détectés pour un volume d échantillon donné permet de connaître le nombre de bactéries vivantes par unité de masse ou de volume de l échantillon à analyser. La méthode alternative doit donner des résultats équivalents à la méthode de référence. Dans le cadre d un test qualitatif, la validation de la méthode alternative consiste à réaliser le test de présence/absence comparativement avec la méthode traditionnelle, avec des charges en micro-organismes de plus en plus faibles et en dessous de 1 UFC.g -1 et une pré-incubation en bouillon de 24 heures. L ensemble des résultats obtenus permet de valider (pour chaque souche testée) que la limite de détection de la méthode alternative est inférieure à1 UFC/g, ce qui permet de la valider pour un test qualitatif en présence /absence dans 1 g et garantir l absence des germes spécifiés. Rayon laser activant la fluorescence Système optique détectant l émission de fluorescence 67

15 Chapitre 3 Dénombrement d'une flore d'un produit microbien ACTIVITÉ 1 DIAGNOSTIC D UNE INFECTION URINAIRE PRÉSENTATION Le diagnostic et le traitement des infections des voies urinaires reposent sur le dénombrement des bactéries (bactériurie), leur identification et la détermination de leur sensibilité à différents antibiotiques (antibiogramme). Au cours des dernières années de nombreuses techniques simplifiées ont été développées pour le comptage des bactéries urinaires, comme les cultures sur lames gélosées de type «Uricult». L ensemencement se fait immédiatement après la miction (au maximum après 20 min pour éviter tout développement des bactéries) en plongeant directement la lame gélosée dans l urine. La lame gélosée introduite dans un flacon est mise à incuber 18 à 24 h à 37 C. En général les lames ont deux faces gélosées différentes (document 1 ) : une face avec le milieu CLED (Cystine, Lactose, Electrolyte Déficient, cette dernière caractéristique évite l envahissement par certaines bactéries très mobiles comme Proteus), milieu non sélectif permettant de mettre en évidence le caractère lactose + grâce à la présence de lactose et de BBT (jaune à ph < 6 ; vert entre ph 6 et 7,6 ; bleu au-delà) ; une face avec un milieu sélectif pour les bactéries Gram -, le milieu de Mac Conkey qui permet lui aussi de mettre en évidence le caractère lactose + grâce à la présence de lactose et de rouge neutre (rouge à ph < 6,8 ; orange entre ph 6,8 et 8 ; jaune-orangé au-delà). Après incubation, on estime le nombre des bactéries (en UFC.mL -1 ) en comparant la croissance sur la lame gélosée à la tabelle du fournisseur (document 2 ). Critères diagnostiques dans l urine : UFC 10 5 /ml : bactériurie significative. Une analyse bactériologique (culture, identification et antibiogramme) est indiquée ; UFC compris entre 10 4 et 10 5 /ml : valeur limite. S il s agit d une culture pure (un seul type de colonie), une analyse bactériologique (culture, identification et antibiogramme) est également indiquée. S il s agit d une culture mixte (plusieurs colonies d aspect différent), répéter l analyse ; UFC < 10 4 /ml : bactériurie non significative. QUESTIONS 1. Le document 3 présente le résultat obtenu avec la lame immergée d un patient : 1.1. Conclure sur la bactériurie d après la densité des colonies obtenues sur la face CLED Les colonies observées sont-elles lactose + ou -? 1.3. La bactérie responsable de l infection urinaire est-elle probablement Gram + ou Gram -? 1.4. À l aide de l annexe 1, proposer, en les justifiant, les tests nécessaires pour réaliser une orientation de famille ou de genre? 2. Le technicien a ensemencé une galerie API 20E à l aide des colonies obtenues après repiquage. Le document 4 montre le résultat obtenu après culture et révélation des tests dans les différentes cupules. On a identifié ainsi E. coli comme bactérie responsable de cette infection urinaire. À l aide de l annexe 2, répondre aux questions suivantes : 2.1. Pourquoi certaines cupules ont-elles leur titre souligné? Encadré? 2.2. Quel réactif a été ajouté à la cupule IND? Ce réactif révèle la présence d indole, produit par l action d une tryptophanase sur le tryptophane. En déduire : la composition minimale du milieu présent dans la cupule ; le nom de l enzyme présente chez la bactérie en cas de réaction positive Le perchlorure de fer ajouté à la cupule TDA met en évidence la présence d acide indolpyruvique produit par l action d une tryptophane désaminase sur le tryptophane. Écrire la réaction catalysée par la TDA Donner le résultat + ou - pour les cupules suivantes MAN et SAC. Le mannitol et le saccharose sont des glucides dont l utilisation est visualisée grâce à la présence de BBT dans le milieu déshydraté Faire un logigramme permettant d expliquer les différents résultats possibles du test de la réduction des nitrates en nitrites, puis éventuellement des nitrites en azote L identification proposée est-elle en adéquation avec l aspect des colonies obtenues sur les deux faces de la lame immergée? 3. Le traitement de cette infection urinaire nécessite une antibiothérapie. Le technicien entreprend donc la réalisation d un antibiogramme dont le résultat est fourni par le document 5. Répondre aux questions suivantes à l aide des fiches techniques de la partie 2 de cet ouvrage (Réalisation d un antibiogramme et Lecture d un antibiogramme : 3.1. Faire un organigramme des différentes étapes de la réalisation d un antibiogramme Donner le nom du milieu utilisé. 68

16 3.3. Indiquer, en le justifiant, le nom donné à la concentration en antibiotique obtenue dans la gélose à la limite entre croissance et absence de croissance Pourquoi le technicien mesure-t-il les diamètres d inhibition de la croissance autour des disques d antibiotique? 3.5. Construire l abaque de lecture pour la ticarcilline (TIC), puis : estimer la CMI de la ticarcilline pour la souche E. coli ; dire si le médecin peut prescrire la ticarcilline pour soigner cette infection urinaire. Données Diamètre d inhibition mesuré pour la ticarcilline : 26 mm. Diamètre correspondant à la concentration critique inférieure : 22 mm. Diamètre correspondant à la concentration critique supérieure : 18 mm. Concentration critique supérieure (concentration plasmatique maximale) : 64 mg.l -1. Concentration critique inférieure (concentration plasmatique minimale) : 16 mg.l Lame gélosée 2 Comptage des bactéries sur lame gélosée : tabelle du fournisseur 4 Résultat galerie API 20E 3 Bactériurie sur lame gélosée Face CLED 5 Résultat de l'antibiogramme Face Mac Conkey ANNEXE 1 Principales espèces bactériennes retrouvées dans les infections urinaires Bacilles Gram - de la famille des entérobactéries (oxydase -) : Escherichia coli (lactose +), Proteus mirabilis (lactose -), Klebsiella spp. (lactose +). Bacilles Gram -, oxydase + : Pseudomonas spp.(lactose -). Coques Gram + : entérocoques (catalase -) et Staphylococcus saprophyticus (catalase +). 69

17 Chapitre 3 Dénombrement d'une flore d'un produit microbien ANNEXE 2 Extrait de la notice de la galerie API 20E 1. Principe La galerie API 20E comporte vingt microtubes contenant des substrats déshydratés. Les microtubes sont inoculés avec une suspension bactérienne qui reconstitue les tests. Les réactions produites pendant la période d incubation se traduisent par des virages colorés spontanés ou révélés par l addition de réactifs. La lecture de ces réactions se fait à l aide du tableau de lecture et l identification est obtenue à l aide du Catalogue Analytique (vendu par le fournisseur) ou d un logiciel d identification. microcupule microtube contenant le milieu déshydraté 2. Échantillons (prélèvement et préparation) La galerie API 20E ne doit pas être utilisée directement à partir des prélèvements d origine clinique ou autres. Les micro-organismes à identifier doivent, dans un premier temps, être isolés sur un milieu de culture adapté à la culture des Enterobacteriaceae et/ou des bacilles à Gram négatif non exigeants selon les techniques usuelles de bactériologie. 3. Mode opératoire Test oxydase Le test oxydase doit être réalisé selon les instructions du fabricant, il constitue le 21 e test d identification à noter sur la fiche de résultats. Préparation de l inoculum Ouvrir une ampoule d API NaCl 0,85 % Medium (5 ml) ou utiliser un tube contenant 5 ml d eau physiologique stérile ou d eau distillée stérile, sans additif. À l aide d une pipette, prélever une seule colonie bien isolée sur milieu gélosé. Réaliser une suspension bactérienne en homogénéisant soigneusement cette colonie dans le milieu. Cette suspension doit être utilisée extemporanément. Inoculation de la galerie Introduire la suspension bactérienne dans les tubes de la galerie à l aide de la même pipette : pour les tests CIT, VP et GEL, remplir microtube et microcupule ; pour les autres tests, remplir uniquement les microtubes (et non les cupules) ; pour les tests : ADH, LDC, ODC, H 2 S et URE, créer une anaérobiose en remplissant leur microcupule d huile de paraffine. Refermer la boîte d incubation. Incuber à 36 C ± 2 C pendant h. 4. Lecture et interprétation Lecture de la galerie Noter sur la fiche de résultats toutes les réactions spontanées puis révéler les tests nécessitant l addition de réactifs, soient les tests : TDA : Ajouter une goutte de réactif TDA (perchlorure de fer). Une couleur marron rougeâtre indique une réaction positive (présence d acide indol pyruvique) à noter sur la fiche de résultats. IND : Ajouter une goutte de réactif JAMES (ou de KOVACS). Une couleur rose diffusant dans toute la microcupule indique une réaction positive (présence d indole) à noter sur la fiche de résultats. VP : Ajouter une goutte des réactifs VP1 (KOH) et VP2 (α-naphtol). Attendre au minimum 10 min. Une couleur rose ou rouge indique une réaction positive (présence d acétoïne) à noter sur la fiche de résultats. Une faible coloration rose apparaissant après 10 min doit être considérée négative. Réduction des nitrates en nitrites (NO 2 ) et en azote (N 2 ) et cupule GLU : après avoir lu le caractère glucose, ajouter 1 goutte des réactifs NR1 (acide sulfanilique) et NR2 (α-naphtylamine). Attendre 2 à 5 minutes. Une coloration rouge indique une réaction positive (présence de NO 2 issu de la réduction des nitrates par une nitrate réductase bactérienne). Une réaction négative (coloration jaune) peut être due à la production d azote (N 2 ) à partir des nitrites : ajouter 2 à 3 mg de réactif Zn (poudre de zinc) dans la cupule GLU. Après 5 minutes, un tube resté jaune indique une réaction positive (présence de N 2 ) à noter sur la fiche de résultats. Si la cupule est orange-rouge, la réaction est négative, les nitrates encore présents dans le tube ont été réduits en nitrites par le Zinc. 70

18 ACTIVITÉ 2 DÉNOMBREMENT DES E. COLI DANS UNE PRÉPARATION À BASE DE VIANDE PRÉSENTATION Le tableau 1 présente un extrait du règlement (CE) n 2073/2005 de la commission européenne du 15 novembre 2005 concernant les critères microbiologiques applicables aux denrées alimentaires. La norme NF ISO d août 2001 (annexe 1 ) est une méthode pour le dénombrement des E. coli β-glucuronidase positive par la technique de comptage des colonies à 44 C au moyen d un milieu contenant du 5-bromo-4-chloro-indolyl-b-Dglucuronate, substrat chromogénique permettant la détection de l enzyme β-glucuronidase. QUESTIONS 1. Que traduit la présence de E. coli en quantité importante dans une préparation à base de viande? 2. La présence du sérotype E. coli O157:H7 ne peut pas être détectée avec la gélose TBX (annexe 2 ). À l aide du Zoom p. 23 (Les cas groupés de syndrome hémolytique et urémique), indiquer si cela peut engendrer un problème de santé publique. 3. Combien attend-on au maximum de colonies sur les boîtes de la dilution 10-2 si l unité d échantillon de l aliment analysé est «acceptable» (classe 2)? 4. Les résultats du dénombrement réalisé sont présentés dans le tableau À l aide de la formule de calcul normalisée, calculer le nombre d UFC : - par ml de suspension mère ; - par gramme de préparation à base de viande. Donnée : formule de calcul normalisée : 4.2. Analyser les résultats obtenus pour cette unité d échantillon. Conclure Les analyses des autres unités d échantillon ont donné les résultats suivants : n 2 = UFC.g -1 ; n 3 = UFC.g -1 ; n 4 = UFC.g -1 ; n 5 = UFC.g -1. Conclure. 1 Recherche et dénombrement d E. coli dans une préparation à base de viande Plan d échantillonnage Limites en UFC/g Méthode d analyse de n C m M référence ISO ou 2 Stade d application du critère Fin du procédé de fabrication Action en cas de résultat insatisfaisant Amélioration de l hygiène de production et amélioration de la sélection et/ou de l origine des matières premières 2 Résultats du dénombrement Nombre de colonies totales Nombre de colonies caractéristiques Suspension mère Boîte Boîte Boîte Boîte

19 Chapitre 3 L eau, Dénombrement un composant d'une essentiel flore d'un des produit organismes microbien vivants ANNEXE 1 Recherche et dénombrement des E. coli selon la norme NF EN ISO Introduire 10 g de préparation à base de viande dans 90 ml de tryptone-sel. Homogénéiser après broyage. On obtient la «suspension mère». J 0 Réaliser les dilutions 10-1 et 10-2 de la «suspension mère» en tryptone-sel. Introduire 1 ml de la «suspension mère» et de chacune des dilutions dans deux boîtes de Petri stériles. Ajouter 15 ml de milieu TBX en surfusion à C. Bien homogénéiser. Laisser durcir. Recouvrir de milieu stérile. Laisser durcir. Incuber 18 à 24 h à 44 C. J 1 Après la période d incubation spécifiée, compter les UFC caractéristiques de E. coli β-glucuronidase positive dans chaque boîte contenant moins de 150 UFC caractéristiques et moins de 300 UFC au total (UFC caractéristiques et non caractéristiques). Pour que le résultat soit valide, il est en général estimé nécessaire de compter les UFC caractéristiques sur au moins une boîte contenant un minimum de 15 UFC caractéristiques. Dans la formule de calcul normalisée, Cest alors la somme des UFC comptées sur toutes lesboîtes de deux dilutions successives dont au moins une contient un minimum de 15 UFC caractéristiques. ANNEXE 2 Le milieu TBX Les sels biliaires inhibent la croissance de la majorité des microorganismes à Gram positif et favorisent la récupération des Escherichia coli. Le BCIG (acide 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronique) est un substrat chromogène. La plupart des souches d Escherichia coli possédant une β-glucuronidase agissent par clivage du BCIG, entraînant la coloration des colonies en bleu. Il est important de noter que toutes les bactéries de l espèce Escherichia coli ne possèdent pas de β-glucuronidase. C est le cas notamment du sérotype O157:H7 qui présente donc des colonies blanches. L incubation réalisée à 44 C et impérativement limitée à 24 h permet d inhiber la croissance de la majorité des micro-organismes contaminants. 72

20 ACTIVITÉ 3 DÉNOMBREMENT DES ENTÉROCOQUES DANS UNE EAU PRÉSENTATION Les entérocoques possèdent les propriétés suivantes : ce sont des coques Gram +, catalase -, ne formant pas d endospore ; ils appartiennent aux streptocoques du groupe D (selon Lancefield), groupe divisé en deux sous-groupes : les entérocoques et les non-entérocoques ; ils sont, entre autre, capables de cultiver à 45 C et en bouillon 6,5 % de NaCl à 35 C ; ils résistent à de nombreux inhibiteurs et notamment à la bile et à l azide de sodium ; ils sont, entre autres caractères biochimiques, TTC+ et esculine +. Leur présence dans une eau traduit une contamination fécale relativement ancienne si elle est associée à celle des coliformes fécaux. Il existe également des entérocoques d origine non fécale provenant de matières végétales, du sol et des insectes. Ces espèces ne sont pas associées à la présence de coliformes fécaux. Étant donné qu il est difficile de discriminer les entérocoques d origine fécale et les entérocoques d origine non fécale, les entérocoques doivent être plutôt perçus comme un indicateur général de pollution d origine organique. Le dénombrement des entérocoques dans une eau peut se faire par filtration ou par une méthode de dénombrement en milieu liquide (selon le NPP). QUESTIONS 1. Dénombrement des entérocoques par la technique de filtration (norme NF EN ISO ) Selon cette norme (annexe 1 ) : les entérocoques présumés sont les bactéries se développant en 44 ± 4 h à 36 C, sur milieu sélectif à l azoture de sodium (gélose de Slanetz et Bartley, document 1 ) en donnant des colonies typiques réduisant le chlorure de triphényl-2,3,5 tétrazolium (colonies TTC+) ; les entérocoques sont les bactéries se développant en 44 ± 4 h à 36 C, sur milieu sélectif à l azoture de sodium en donnant des colonies typiques réduisant le chlorure de triphényl-2,3,5 tétrazolium qui, de plus donnent une réaction positive sur une gélose biliée à l esculine (colonies esculine +) (document 2 ) et une réponse négative au test catalase. Le document 5 montre le résultat de la membrane déposée sur gélose de Slanetz et Bartley après incubation, pour une eau analysée selon cette norme Commenter le choix de la porosité de la membrane filtrante ; en déduire le diamètre minimal des entérocoques Commenter l aspect macroscopique des colonies observées sur la gélose de Slanetz et Bartley. Conclure Après transfert de la membrane sur gélose BEA, on observe sous 2/3 des colonies l apparition d un halo noirâtre. Conclure Rendre le nombre d entérocoques pour 100 ml d eau analysée. 2. Dénombrement des entérocoques par la méthode du NPP (norme NF EN ISO ) Dans cette norme (annexe 2 ) sont considérés comme entérocoques les micro-organismes donnant une réaction positive en 48 h à 37 C dans un milieu de Rothe (document 3 ) et une réaction positive en 24 h à 37 C sur un milieu de Litsky (document 4 ). Le tableau 6 donne les résultats obtenus pour une eau analysée selon cette norme Le choix des dilutions testées est-il satisfaisant? 2.2. Pourquoi certains résultats dans la série de Litsky sont «non effectués»? 2.3. Déterminer NPP, le nombre le plus probable d entérocoques par ml d eau analysée (cf. table de Mc Grady p. 61) Une eau analysée précédemment a donné comme résultat : entérocoques par ml. Quelles dilutions doivent être réalisées pour avoir une série de résultats exploitables de façon optimale par cette méthode? 3. Comparaison des deux méthodes 3.1. Dresser un tableau de comparaison entre la technique par filtration et la technique par dénombrement en milieu liquide (NPP) en comparant les points suivants : temps de manipulation (court, long) ; temps nécessaire à l obtention du résultat de l analyse (en heures) ; matériel nécessaire À partir des critères microbiologiques suivants établis pour différentes catégories d eau, quelle méthode peut-on choisir pour leur analyse? eau de consommation : 0 entérocoques pour 100 ml ; eau de baignade (eau de qualité correcte) : 100 entérocoques pour 100 ml ; eau destinée à la production d eau potable nécessitant un traitement classique : entéro- coques pour 100 ml. 73

21 Chapitre 3 Dénombrement d'une flore d'un produit microbien 1 Milieu présomptif de Slanetz et Bartley La présence d azide de sodium limite la croissance de toutes les bactéries pourvues d une chaîne respiratoire (flore secondaire inhibée). Les entérocoques, bactéries anaérobies aérotolérantes donc dépourvues de chaîne respiratoire, ne sont pas inhibés. De plus ils réduisent le TTC en formazan qui colore leurs colonies en rouge. 2 Milieu confirmatif : gélose biliée à l esculine et à l azoture (BEA) Alors que la prolifération des entérocoques tolérant la bile n est pas ralentie, la croissance des bactéries secondaires d origine non intestinale est largement inhibée par les sels biliaires. Les entérocoques hydrolysent l esculine (glucoside) en glucose et en esculine. L esculine forme avec les ions Fer(III), un complexe noir qui diffuse dans le milieu. 3 Milieu présomptif : bouillon glucosé à l azoture (milieu de Rothe) Le milieu de Rothe contient du glucose, indispensable à la croissance des entérocoques (micro-organismes pour lesquels la présence de peptones ne suffit pas à la production d énergie), et un inhibiteur, l azide de sodium ou azoture de sodium, qui rend le milieu sélectif pour les bactéries dépourvues de chaîne respiratoire dont les entérocoques. 4 Milieu confirmatif : milieu de Litsky Le milieu de Litsky est plus sélectif que le milieu de Rothe car il contient, en plus de l azide de sodium, un second inhibiteur, l éthyl violet ou cristal violet. Les quelques souches de bacilles sporulés et coques à Gram positif autres que les entérocoques donnant des résultats positifs en milieu de Rothe, sont inhibés en présence d éthyl-violet. Le développement des entérocoques se traduit par un trouble associé à la formation (ou non) d une pastille violette au fond du tube. 5 Résultat de la culture sur gélose Slanetz et Bartley (44 h à 36 C) 6 Dénombrement des entérocoques en milieu liquide par la méthode du NPP Bouillon de Rothe - trouble Bouillon de Litsky - trouble - pastille violette 1 ne : test non effectué ne ne 1 - ne ne ne ne ne ne ne ne 74

22 ANNEXE 1 Recherche et dénombrement des entérocoques selon la norme NF EN ISO J 0 Filtrer 100 ml d eau à analyser sur une membrane filtrante de 0,45 µm de porosité. Placer la membrane sur une gélose de Slanetz et Bartley avec TTC. Incuber 44 h à 36 C. J 1 Dénombrer les colonies caractéristiques d entérocoques présumées présentant une coloration rouge, marron ou rose, pouvant être limitée au centre ou à la périphérie. En cas de présence de colonies d entérocoques présumées transférer la membrane sans la retourner sur une boîte de milieu confirmatif gélose Bile Esculine Azide (BEA). Placer 2 h à 44 C. Compter les colonies d entérocoques confirmées entraînant l apparition d un halo noir dans le milieu. En cas de doute, une réaction négative au test de la catalase confirmera la présence d entérocoques. ANNEXE 2 Dénombrement des entérocoques selon la norme NF EN ISO Méthode par ensemencement en milieu liquide et détermination du NPP J 0 Réaliser une série de dilutions de l eau à analyser en eau physiologique stérile de raison 1/10. Ensemencer trois bouillons présomptifs glucosés à l azoture (bouillon de Rothe) avec 1 ml d eau analysée et de chaque dilution réalisée. Incuber 24 h à 37 C. J 1 Lecture des bouillons de Rothe : considérer comme positifs les tubes pour lesquels on observe un trouble. À partir de chaque bouillon de Rothe positif, ensemencer à l aide d une anse calibrée, un bouillon confirmatif de Litsky. Incuber 24 h à 37 C. J 2 Lecture des bouillons de Litsky : la présence d entérocoques se caractérise par l apparition d un trouble dû au développement bactérien, avec ou sans dépôt violet au fond du tube. 75

23 Chapitre 3 Dénombrement d'une flore d'un produit microbien FICHE TECHNIQUE 1 LA FILTRATION D UN LIQUIDE 1 Stériliser, avant usage, l unité de filtration par autoclavage. 2 3 Installer la trompe à vide et placer l ensemble de l appareil entre deux becs Bunsen de manière à ménager une zone de travail stérile. Séparer le godet de la base de l unité de filtration, en déposant le godet, couvercle à l envers, derrière la zone de travail. Ne jamais passer les mains au-dessus des structures ouvertes. 4 Déposer stérilement sur le support, une membrane filtrante neuve et stérile (quadrillage vers le haut). 5 6 Replacer le godet et l ouvrir. Déposer son couvercle à l envers sur la paillasse, toujours derrière la zone de travail pour éviter de passer les mains par-dessus. Après avoir bien agité le liquide à analyser, le verser doucement jusqu à la graduation adéquate. Refermer le couvercle du godet. 7 Faire le vide sans brutalité pour ne pas briser la membrane filtrante et filtrer la totalité. du liquide 8 Arrêter la filtration. 9 Ouvrir l unité et rincer (trois fois) avec de l eau stérile les parois internes du godet pour récupérer les micro-organismes qui s y seraient déposés. Filtrer après chaque rinçage. 9 Sécher la membrane filtrante en effectuant plusieurs. petits vides. 10 Arrêter la filtration. 11 Ouvrir l unité en déposant toujours le godet, couvercle à l envers, derrière la zone de travail. 12 Prélever stérilement la membrane filtrante et la déposer sans la retourner sur une gélose nutritive. Il ne doit pas y avoir de bulles d air sous la membrane sous peine d avoir des zones ne permettant pas la diffusion des nutriments. Membrane filtrante sur un support Échantillon d H 2 O filtré au travers de la membrane (0,45 µm) Dépôt de la membrane sur une boite contenant le milieu. Incubation pendant 24 h 76

24