COBAS TaqMan HBV Test HBV HPS
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- Émile Cormier
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1 COBAS TaqMan HBV Test For Use With The High Pure System DESTINÉ AU DIAGNOSTIC IN VITRO. COBAS TaqMan HBV Test HBV HPS 48 Tests P/N: High Pure System Viral Nucleic Acid Kit 48 Tests P/N: UTILISATION Le test HBV COBAS TaqMan, à utiliser avec le système High Pure (HPS) est un test d'amplification in vitro de l'acide nucléique destiné à doser l'adn du virus de l'hépatite B (HBV) dans le sérum ou le plasma humain, en utilisant le nécessaire Acide nucléique viral High Pure System pour la préparation manuelle d'échantillons et l'analyseur COBAS TaqMan 48 pour la détection et l'amplification automatisées. Le test COBAS TaqMan HBV n'est pas n'est pas conçu pour le dépistage du HBV dans le sang ou les produits sanguins ni en tant que test diagnostique pour confirmer l'existence d'une infection par le HBV. RESUME ET DESCRIPTION DU TEST Le virus de l'hépatite B (HBV) est l'un des différents virus responsables de l'hépatite virale. Dans le monde, plus de 2 milliards de personnes ont été infectées par le HBV et plus de 350 millions d'entre elles ont une infection chronique 1. Les porteurs chroniques présentent un risque élevé de complications à long terme, parmi lesquelles il faut citer l'hépatite chronique, la cirrhose et l'hépatocarcinome 2,3,4. Des marqueurs sérologiques sont couramment utilisés pour confirmer le diagnostic et/ou aider au pronostic d'une infection aiguë ou chronique par le HBV. Le principal marqueur de l'infection par le HBV est la présence de l'antigène d'enveloppe (AgHBs). Bien que les porteurs puissent éliminer l'aghbs et développer des anticorps anti- AgHBs, il semble qu'il y ait toujours un risque ultérieur de complications hépatiques graves 5,6. L'antigène e du HBV (AgHBe) est généralement utilisé comme marqueur secondaire et indique une réplication active du HBV associée à une maladie hépatique évolutive. Une clairance incomplète de l'aghbe semble augmenter le risque de maladie hépatique terminale 7,8. Des variants du HBV peuvent produire un AgHBe indétectable dans le sérum, ou bien encore la souche peut perdre son aptitude à fabriquer l'aghbe même au cours d'une infection active 9. Par conséquent, l'utilisation de ce marqueur peut avoir un intérêt limité dans la surveillance de l'évolution de la maladie 10. Certains auteurs ont signalé que l'aptitude à détecter l'adn du HBV dans le sérum a une valeur pronostique pour ce qui concerne l'évolution des infections aiguës et chroniques dues au HBV 11,12,13,14. La méthodologie peut permettre la détection de l'adn du HBV après clairance de l'aghbs 15 ou la détection du HBV en l'absence de marqueur sérologique 16. Cependant, on n'a pas encore établi de relation entre les marqueurs sérologiques et les taux d'adn du HBV. L'efficacité du traitement antiviral utilisé pour traiter les patients porteurs du HBV peut aussi être évaluée grâce aux marqueurs sérologiques ou par une mesure de la fonction enzymatique du foie. Néanmoins, le dosage quantitatif de l'adn viral du HBV dans le sérum ou le plasma est considéré comme la mesure la plus directe et la plus fiable de la réplication virale 13,17,18,19. On a montré qu'une chute rapide et persistante des taux d'adn du HBV chez des patients recevant un traitement à base d'interféron alpha, de lamivudine ou de ganciclovir est un facteur prédictif d'évolution favorable sous traitement 10,20,21,22,23,24. La surveillance des taux d'adn du HBV permet de prédire le développement d'une résistance à la lamivudine 25. Par conséquent, un test quantitatif offrant un dosage de l'adn du HBV est un outil utile que l'on peut utiliser en association avec d'autres marqueurs sérologiques lors de la prise en charge d'une infection par le HBV. PRINCIPES DU TEST Le test HBV COBAS TaqMan se base sur deux processus essentiels : (1) la préparation manuelle d'un échantillon pour obtenir de l'adn du HBV ; (2) l'amplification automatisée par PCR de l'adn cible en utilisant des amorces complémentaires spécifiques du HBV et la détection par sondes oligonucléotidiques doubles et clivées, à marquage fluorescent, qui permettent la quantification du produit cible HBV amplifié (amplicons) et de l'adn du standard de quantification HBV, qui est traité, amplifié et détecté simultanément avec l'échantillon. Le mélange réactionnel (Master Mix) contient des paires d'amorces et de sondes spécifiques à la fois de l'adn du HBV et de l'adn du standard de quantification HBV. Le mélange réactionnel a été développé pour 1
2 assurer une quantification équivalente des génotypes A à G du HBV. La détection de l'adn amplifié s'effectue en utilisant des sondes oligonucléotidiques à double marquage spécifiques de la cible et du standard de quantification, permettant ainsi une identification indépendante de l'amplicon HBV et de l'amplicon du standard de quantification HBV. La mesure de l'adn viral du HBV s'effectue en utilisant le standard de quantification du HBV. Le standard de quantification HBV est un plasmide linéarisé non infectieux qui contient des sites de liaison aux amorces identiques à la cible d'adn du HBV et une région de liaison unique de liaison à la sonde qui permet à l'amplicon du standard de quantification HBV d'être différencié de l'amplicon cible HBV. Le standard de quantification HBV est incorporé à chaque échantillon et témoin individuel selon un nombre de copies connu, et subit les étapes de préparation de l'échantillon, d'amplification PCR et de détection conjointement avec la cible HBV. L'analyseur COBAS TaqMan 48 calcule le titre de l'adn du HBV dans l'échantillon test en comparant le signal HBV au signal du standard de quantification HBV pour chaque échantillon et témoin. Le standard de quantification HBV compense les effets d'inhibition et des témoins pendant les processus d'amplification et de préparation afin de permettre une quantification précise de l'adn du HBV dans chaque échantillon. Préparation de l'échantillon Le test COBAS TaqMan HBV traite les échantillons de sérum et de plasma, et isole l'adn du HBV grâce à une préparation manuelle standard d'un échantillon reposant sur la liaison de l'acide nucléique contenu dans les prélèvements à des fibres de verre. Les particules de virus HBV sont lysées par incubation à température élevée avec une protéase et un tampon chaotrope de lyse/ liaison qui libère les acides nucléiques et protège l'adn du HBV libéré des désoxyribonucléases du plasma et du sérum. Un nombre connu de molécules d'adn du standard de quantification HBV est introduit dans chaque échantillon conjointement avec le réactif de lyse. Ensuite, on ajoute de l'isopropanol au mélange de lyse, qui est centrifugé dans une colonne contenant un filtre en fibres de verre. Pendant la centrifugation, l'adn du HBV et l'adn du standard de quantification HBV se lient à la surface du filtre en fibre de verre. Les substances non liées, comme les sels, les protéines et d'autres impuretés cellulaires, sont éliminés par centrifugation. Les acides nucléiques adsorbés sont lavés et élués avec une solution aqueuse. Les pipettes jetables permettent le traitement parallèle de 12 échantillons ou de multiples de 12 échantillons. L'échantillon traité contenant l'adn du HBV et l'adn du standard de quantification HBV est ajouté au mélange de détection/amplification. L'ADN du HBV cible et l'adn du standard de quantification HBV sont ensuite amplifiés et détectés sur l'analyseur COBAS TaqMan 48 en utilisant les réactifs de détection et d'amplification qui sont fournis dans le nécessaire de test. Amplification par PCR Sélection de la cible La sélection de la séquence d'adn cible pour le HBV dépend de l'identification des régions qui, à l'intérieur du génome du HBV et sur l'ensemble des génotypes de HBV, ont le plus fort taux de conservation de la séquence. De la même manière, la sélection appropriée des amorces et de la sonde est essentielle pour permettre au test de détecter tous les génotypes cliniquement pertinents de HBV. On a montré qu'une région de l'adn génomique circulaire partiellement monocaténaire du HBV présente une conservation maximum de la séquence d'adn entre les génotypes du HBV connus. Le test COBAS TaqMan HBV utilise des amorces d'amplification PCR qui définissent une séquence à l'intérieur de la région hautement conservée du pré-noyau/ noyau du génome du HBV. Amplification de la cible Les échantillons traités sont ajoutés au mélange d'amplification dans des tubes d'amplification (tubes K) dans lesquels se produit l'amplification PCR. Le thermocycleur de l'analyseur COBAS TaqMan 48 chauffe le mélange afin de dénaturer l'adn bicaténaire et d'exposer les séquences cibles de l'amorce spécifique sur l'adn génomique circulaire du HBV et sur l'adn du standard de quantification HBV. Au fur et à mesure du refroidissement du mélange, les amorces s'hybrident à l'adn cible. L'ADN polymérase thermostable Thermus specie Z05 ADN (Z05), en présence de Mn 2+ et d'un excès de désoxyribonucléotides triphosphates (dntp), dont la désoxyadénosine triphosphate, désoxyguanosine triphosphate, désoxycytidine triphosphate et la désoxyuridine triphosphate (au lieu de la thymidine), étend les amorces hybridées le long de la matrice pour produire une molécule d'adn bicaténaire appelée amplicon. L'analyseur COBAS TaqMan 48 répète automatiquement cette opération au cours d'un nombre défini de cycles, chacun devant doubler la quantité d'amplicons ADN produits. Le nombre de cycles nécessaires est préprogrammé dans l'analyseur COBAS TaqMan 48. L'amplification ne concerne que la région du génome HBV située entre les amorces ; le génome HBV entier n'est pas amplifié. Amplification sélective Dans le test COBAS TaqMan HBV l'amplification sélective d'un acide nucléique cible à partir d'un échantillon est obtenue au moyen de l'enzyme AmpErase (uracile-n-glycosylase) et de la désoxyuridine triphosphate (dutp). L'enzyme AmpErase reconnaît et catalyse la destruction des brins d'adn contenant de la désoxyuridine 26, mais non celle des brins contenant de la désoxythymidine. L'ADN naturel ne contient pas de désoxyuridine, mais les amplicons en contiennent toujours en raison de l'utilisation de 2
3 désoxyuridine triphosphate comme dntp dans le mélange réactionnel. Ainsi, seuls les amplicons renferment de la désoxyuridine. La désoxyuridine permet la destruction des amplicons contaminants par l'amperase avant l'amplification de l'adn cible. De plus, elle détruit étalement tout produit non spécifique formé après l'activation initiale du mélange réactionnel par du manganèse, ce qui améliore la sensibilité et la spécificité. L'enzyme AmpErase, contenue dans le mélange réactionnel, catalyse le clivage de l'adn contenant de la désoxyuridine au niveau des résidus de désoxyuridine par ouverture de la chaîne de désoxyribose en position C1. Au cours du réchauffage de la première étape du cycle thermique, la chaîne de l'amplicon d'adn se brise au niveau de la désoxyuridine, rendant l'adn impossible à amplifier. L'enzyme AmpErase est inactive à une température supérieure à 55 C, c'est-à-dire pendant toutes les étapes du cycle thermique et, de ce fait, ne détruit pas l'amplicon cible formé pendant l'amplification. Détection des produits PCR dans un test COBAS TaqMan Le test COBAS TaqMan HBV utilise une technologie PCR en temps réel 27,28. L'utilisation de sondes fluorescentes à double marquage permet une détection en temps réel de l'accumulation des produits PCR en surveillant l'intensité de l'émission des colorants fluorescents rapporteurs libérés pendant le processus d'amplification. Les sondes consistent en oligonucléotides spécifiques du HBV et du standard de quantification HBV marqués par un colorant rapporteur et par un colorant extincteur. Dans le test COBAS TaqMan HBV, le HBV et les sondes du standard de quantification du HBV sont marquées par différents colorants rapporteurs de fluorescence. Lorsque les amorces à colorants à double fluorescence sont intactes, la fluorescence du rapporteur est supprimée en raison de la proximité du colorant extincteur en raison des effets Förster de transfert d'énergie. Pendant la phase PCR, la sonde hybride une séquence cible et se trouve clivée par l'activité de la nucléase 5' 3' de l'adn-polymérase Z05 thermostable. Une fois que les colorants rapporteur et extincteur sont libérés et séparés, l'extinction ne se produit plus et la fluorescence du colorant rapporteur augmente. L'amplification de l'adn du HBV et de l'adn du standard de quantification HBV sont mesurées indépendamment à des longueurs d'onde différentes. Ce processus est répété pendant un nombre déterminé de cycles, chacun d'entre eux augmentant effectivement l'intensité de l'émission des colorants rapporteurs individuels, permettant une identification indépendante de l'adn du HBV et de l'adn du standard de quantification HBV. L'intensité des signaux est fonction de la quantité initiale de matériel au commencement de la PCR. Points fondamentaux du dosage par le test COBAS TaqMan HBV Le test COBAS TaqMan HBV fournit avec précision des résultats quantitatifs dans une plage dynamique très étendue dans la mesure où le monitorage de l'amplicon a lieu pendant la phase exponentielle de l'amplification. Plus le titre en HBV de l'échantillon est élevé, plus rapidement la fluorescence du colorant rapporteur de la sonde HBV dépasse le niveau de fluorescence de base (voir la Figure 1). La quantité d'adn du standard de quantification (QS) du HBV étant constante entre tous les échantillons, la fluorescence du colorant rapportée par la sonde QS HBV doit apparaître selon le même cycle pour tous les échantillons (voir la Figure 2). Dans les cas où l'amplification QS et la détection sont affectées par une inhibition ou par un prélèvement inadéquat de l'échantillon, la fluorescence apparaît plus lentement, permettant ainsi aux titres calculés de l'adn cible HBV d'être ajustés en conséquence. L'apparition de signaux fluorescents spécifiques est considérée comme étant une valeur critique de seuil (Ct). La Ct est définie comme étant le numéro de cycle fractionnel la fluorescence du colorant rapporteur dépasse un seuil prédéterminé (le niveau de fluorescence attribué) et représente le début d'une phase de croissance exponentielle de ce signal (voir la Figure 3). Une valeur Ct plus élevée est l'indication d'un titre initial d'adn cible HBV plus bas. Lorsque le titre double, le Ct diminue de 1 point pour l'adn du HBV cible alors qu'une multiplication par 10 du titre est corrélée à une diminution de 3,3 Ct. La Figure 1 présente les courbes de croissance de la cible pour une série de dilution du virus s'étageant sur une gamme de 5 log 10. Au fur et à mesure de l'augmentation de la concentration du virus, les courbes de croissance se décalent vers les cycles précédents. C'est pourquoi, la courbe de croissance la plus à gauche correspond au niveau de titre viral le plus élevé alors que la courbe de croissance la plus à droite correspond au niveau de titre viral le plus faible. 3
4 Figure 1 9,00 8,00 7,00 Fluorescence normalisée 6,00 5,00 4,00 3,00 2,00 1,00 Titre le plus élevé Titre le plus faible 0,00-1, La Figure 2 montre les courbes de croissance du standard de quantification pour les échantillons provenant d'une série de dilution virale s'étageant sur une gamme de 5 log 10. La quantité de standard de quantification ajoutée à chaque échantillon est constante pour chaque réaction. La valeur de Ct du standard de quantification est la même quel que soit le titre viral. Figure 2 35,00 Nombre de cycles 30,00 Titre le plus faible 25,00 Fluorescence normalisée 20,00 15,00 10,00 5,00 Titre le plus élevé 0,00-5, Nombre de cycles La Figure 3 présente un exemple de la manière avec laquelle sont normalisées les valeurs de fluorescence lors de chaque cycle pour chaque courbe de croissance. Le nombre de cycles fractionnels (Ct) est calculé à l'emplacement où le signal de fluorescence croise le niveau de fluorescence attribué. 4
5 Figure 3 1 0,9 Fluorescence normalisée 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 Fluorescence attribuée Valeur Ct = 27,1 0,1 0 Mesure de l'adn du HBV Le test COBAS TaqMan HBV quantifie l'adn viral du HBV en utilisant une deuxième séquence cible (standard de quantification du HBV) qui est ajoutée à chaque échantillon selon une concentration connue. Le standard de quantification du HBV est une construction d'adn plasmidique linéarisé non infectieux, contenant des fragments de séquences du HBV avec une amorce liant des régions identiques à celles de la séquence cible HBV. Le standard de quantification HBV génère aussi un produit d'amplification de même longueur et de même composition en bases que l'adn du HBV cible. La région d'hybridation de la sonde de détection du standard de quantification HBV a été modifiée pour différencier l'amplicon du standard de quantification HBV de l'amplicon HBV cible. Pendant la phase d'hybridation de la PCR sur l'analyseur COBAS TaqMan 48, les échantillons sont illuminés et excités par une lumière filtrée, et les données de fluorescence de l'émission filtrée sont recueillies pour chaque échantillon. Les mesures provenant de chaque échantillon sont alors corrigées en fonction des variations de l'appareil. Ces mesures de fluorescence sont envoyées par l'appareil vers le logiciel AMPLILINK et stockées dans une base de données. Des vérifications préalables servent à déterminer si les données concernant l'adn du HBV et l'adn du standard de quantification HBV constituent des éléments valides, et des messages sont émis lorsque ces données se situent en dehors des limites prédéfinies. Quand toutes les vérifications préalables sont terminées et acceptées, les mesures de fluorescence sont traitées pour générer des valeurs Ct pour l'adn du HBV et à l'adn du standard de quantification HBV. Les constantes d'étalonnage spécifiques du lot fournies avec le test COBAS TaqMan HBV sont utilisées pour calculer le titre des échantillons et des témoins en se basant sur les valeurs Ct de l'adn du HBV et de l'adn du standard de quantification HBV. Le test COBAS TaqMan HBV est normalisé par rapport au standard international HBV de l'oms pour le test NAT 97/ et les résultats du titrage sont fournis en unités internationales (UI/ml). REACTIFS High Pure System Viral Nucleic Acid Kit 48 Tests Nécessaire Acide nucléique viral High Pure System (P/N: ) LYS 2 x 25 ml (Tampon de lyse/de liaison) Tris 52 % Guanidine-HCl < 1 % Urée 20 % Triton X-100 Xn 52 % Guanidine-HCl (m/m) + -0, Nombre de cycles Nocif 5
6 CAR (ARN porteur, lyophilisat) PK (Protéinase K, lyophilisat) + 99% Protéinase K, lyophilisat Xn 99 % Protéinase K, lyophilisat 2 x 2 mg 2 x 100 mg Nocif IRB (Tampon d'élimination de l'inhibiteur) Tris 65 % Guanidine-HCl (ajouter 20 ml d'éthanol) Xn 65 % Guanidine-HCl + 1 x 33 ml Nocif WASH (Tampon de lavage) Tris Chlorure de sodium (ajouter 80 ml d'éthanol) ELB (Tampon d'élution) RS (Nécessaire de portoirs de système pour acide nucléique viral High Pure) Portoir à lyse Portoir de tube filtrant avec portoir de vidange Portoir à élution Portoir à couvercles Pinces WR (Portoir à vidange système pour acide nucléique viral High Pure, blanc) COBAS TaqMan HBV Test HBV HPS test COBAS TaqMan HBV (P/N: ) Specimen Préparation and Control Reagents Préparation des échantillons et des témoins HBV QS (réactif de standard de quantification du HBV) Tampon de Tris-HCl EDTA < 0,001 % d'adn plasmidique linéarisé, bicaténaire contenant un insert avec des séquences de liaison à l'amorce HBV et une seule région de liaison de la sonde. Amarante (colorant) < 0,005 % d'arn poly ra (synthétique) 0,05 % d'azide de sodium 1 x 20 ml 1 x 30 ml 4 x par unité 8 x par unité 48 Tests 2 x 1,0 ml 6
7 HBV H(+)C [Témoin HBV Haut (+)] < 0,001 % d'adn plasmidique linéarisé, bicaténaire contenant des séquences HBV. Plasma humain négatif aux tests agréés par la FDA américaine de détection des anticorps anti-hcv, des anticorps anti-hiv-1 et anti-hiv-2, de l'antigène p24 du HIV et de l'antigène AgHBs. ARN-HIV-1, ARN-HCV et ADN du HBV non détectables par PCR. 0,1 % de ProClin 300 HBV L(+)C [Témoin HBV Bas (+)] < 0,001 % d'adn plasmidique linéarisé, bicaténaire contenant des séquences HBV. Plasma humain négatif aux tests agréés par la FDA américaine de détection des anticorps anti-hcv, des anticorps anti-hiv-1et anti-hiv-2, de l'antigène p24 du HIV et de l'antigène AgHBs. ARN-HIV-1, ARN-HCV et ADN du HBV non détectables par PCR. 0,1 % de ProClin 300 CTM ( ) C [Témoin négatif COBAS TaqMan (Plasma humain)] Plasma humain négatif aux tests agréés par la FDA américaine de détection des anticorps anti-hcv, des anticorps anti-hiv-1 et anti-hiv-2, de l'antigène p24 du HIV et de l'antigène AgHBs. ARN-HIV-1, ARN-HCV et ADN du HBV non détectables par PCR. 0,1 % de ProClin 300 Amplification and Detection Reagents Réactifs d'amplification et de détection HBV MMX (Mélange réactionnel COBAS TaqMan HBV) Tampon de Tricine Potassium hydroxide Acétate de potassium Glycérol < 0,001 % de datp, dctp, dgtp, dutp < 0,001 % d'amorces d'amont et d'aval pour la région du pré-noyau/ noyau du HBV < 0,001 % de sondes oligonucléotidiques marquées par fluorescence, spécifiques pour l'adn du HBV et le standard de quantification du HBV < 0,001 % d'aptamère d'oligonucléotide < 0,05 % d'adn-polymérase Z05 (microbienne) < 0,1 % d'amperase (uracile-n-glycosylase) (microbienne) 0,09 % d'azide de sodium CTM Mn 2+ (Solution de manganèse COBAS TaqMan) < 1,2 % d'acétate de manganèse Acide acétique 0,09 % d'azide de sodium 2 x 1,0 ml 2 x 1,0 ml 4 x 1,0 ml 2 x 24 Tests 2 x 1,4 ml 2 x 24 Tests 2 x 1,0 ml 7
8 PRÉCAUTIONS D EMPLOI A. DESTINÉ AU DIAGNOSTIC IN VITRO. B. Ce test doit être utilisé avec du plasma humain recueilli sur anticoagulant EDTA et du sérum humain. C. Ne pas pipetter à la bouche. D. Ne pas manger, boire ou fumer dans les zones de travail du laboratoire. Porter des gants de protection jetables, une blouse de laboratoire et des lunettes de protection lors de la manipulation des échantillons et des réactifs se trouvant dans le nécessaire. Se laver soigneusement les mains après la manipulation des echantillons et des réactifs du nécessaire. E. Éviter toute contamination microbienne et contamination par la ribonucléase des réactifs lors de l'extraction des parties aliquotes des flacons de réactifs. F. L'utilisation de pipettes stériles jetables ou d'embouts de pipettes sans ARNases est recommandée. G. Ne pas regrouper des réactifs de differents lots ou de différents flacons du meme lot. H. Ne pas mélanger des réactifs provenant de différents nécessaires. I. Éliminer les réactifs, déchets et échantillons inutilisés conformement aux règlements nationaux, fédéraux et locaux. J. Ne pas utiliser un nécessaire après sa date de péremption. K. Des fiches de sécurité (Material Safety Data Sheets = MSDS) des produits sont disponibles sur demande auprès bureau Roche le plus proche. L. Les échantillons et les témoins doivent être manipulés comme s'ils étaient infectieux en recourant aux bonnes pratiques de laboratoire conformément aux directives décrites dans Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 30 et sur le document M29-A 31 du NCCLS. Nettoyer et désinfecter soigneusement tous les plans de travail avec une solution a 0,5 % d'hypochlorite de sodium préparée extemporanément avec de l'eau distillée ou demineralisée. REMARQUE: l'«eau de Javel» du commerce contient généralement de l'hypochlorite de sodium à une concentration de 5,25 %. Une dilution de l'eau de Javel au 1/10 produira une solution d'hypochlorite de sodium a 0,5 %. M. ATTENTION : Les réactifs CTM( ) C, HBV L(+)C et HBV H(+)C contiennent du plasma humain dérivé de sang humain. Le matériel source a été soumis aux tests agréés par la FDA américaine et s'est avéré être non réactif à la recherche de l'antigene de surface de l'hépatite B (AgHBs), des anticorps anti-hiv-1, anti-hiv-2, et anti-hcv, de l'antigènes HIV p24. Les tests par PCR sur le plasma humain négatif n'ont détecté aucun ARN-HIV-1, ARN-HCV et ADN du HBV. Cependant, aucune méthode de test ne peut garantir avec une certitude absolue que des produits dérivés du sang humain sont exempts de risques de transmission d'agents infectieux. C'est pourquoi, tout produit d'origine humaine doit être considéré comme potentiellement infectieux. CTM( ) C, HBV L(+)C et HBV H(+)C doivent être manipulés comme s'ils étaient infectieux en respectant les consignes de sécurité de laboratoire conformément aux directives de Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 30 et sur le document M29-A 31 du NCCLS. Nettoyer et désinfecter soigneusement tous les plans de travail avec une solution a 0,5 % d'hypochlorite de sodium préparée extemporanément avec de l'eau distillée ou déminéralisée. N. HBV MMX, HBV QS et CTM Mn 2+ contiennent de l'azide de sodium. L'azide de sodium peut réagir avec le plomb ou le cuivre des canalisations pour former des azides métalliques hautement explosifs. Lors de l'élimination de solutions contenant de l'azide de sodium dans les eviers du laboratoire, rincer les canalisations avec une grande quantité d'eau afin d'éviter l'accumulation d'azides. O. Porter des lunettes de protection, une blouse de laboratoire et des gants de protection jetables lors de la manipulation des réactifs. Éviter tout contact de ces produits avec la peau, les yeux ou les muqueuses. En cas de contact, rincer immédiatement avec de grandes quantités d'eau. Des brûlures peuvent se produire en l'absence de traitement. Si de tels réactifs sont repandus, les diluer avec de l'eau avant de les essuyer. CONSERVATION ET MANIPULATION Specimen Préparation Reagents Réactifs de préparation de l'échantillon A. Conserver les réactifs d'acide nucléique viral High Pure System à une température de 15 à 25 C des leur arrivée. 8
9 B. Conserver le tampon d'élution (ELB) et le tampon de lyse/ liaison (LYS) entre 15 et 25 C. Une fois ouverts, les flacons de ELB et LYS doivent être conservés entre 15 et 25 C ; les flacons de ELB et LYS doivent être utilisés dans les 30 jours suivant leur ouverture ou jusqu'à leur date de péremption, selon ce qui survient en premier. C. Après avoir ajouté du tampon d'élution (ELB) pour reconstituer l'arn porteur et la protéinase K, conserver l'arn porteur reconstitue (CAR) et la protéinase K reconstituée (PK) non utilisés entre -15 et -25 C. Une fois reconstitués, l'arn porteur et la protéinase K doivent être utilisés dans les 30 jours ou jusqu'à leur date de péremption, selon ce qui survient en premier. D. Après avoir ajouté de l'éthanol, conserver le tampon d'élimination de l'inhibiteur (IRB) et le tampon de lavage (WASH) a une température comprise entre 15 et 25 C. Ces solutions actives restent stables pendant 30 jours ou jusqu'a leur date de péremption, selon ce qui survient en premier. E. La solution de lyse/ liaison active [tampon de lyse/ liaison avec de l'arn porteur, de la protéinase K et du HBV QS] doit être utilisée immédiatement après sa préparation. Éliminer tout excédent. PCR Reagents (Amplification and Detection) Réactifs PCR (Amplification et détection) A. Ne pas congeler les réactifs ou les témoins. B. Conserver HBV MMX, CTM ( ) C, HBV L(+)C, HBV H (+)C, HBV QS et CTM Mn 2+ à une température comprise entre 2 et 8 C. Tant qu'ils n'ont pas été ouverts, ces réactifs restent stables jusqu'a la date de péremption indiquée. Une fois qu'ils ont ete ouverts afin d'en extraire une partie aliquote pour un lot de 12 échantillons, conserver le reste de HBV MMX, HBV L(+)C, HBV H(+)C, HBV QS et de CTM Mn 2+ à une température comprise entre 2 et 8 C. Une fois ouverts, HBV MMX, HBV L(+)C, HBV H(+)C, HBV QS et CTM Mn 2+ sont stables entre 2 et 8 C pendant 30 jours ou jusqu'à la date de péremption, selon ce qui survient en premier. Une fois le flacon ouvert, toute partie inutilisee de CTM ( ) C doit être éliminée. C. Le mélange réactionnel actif (préparé en additionnant du CTM Mn 2+ a du HBV MMX) doit être conservé à une température comprise entre 2 et 8 C, a l'abri de la lumiere. Les échantillons et les témoins préparés doivent être ajoutés dans les 2 heures suivant la préparation du mélange reactionnel. D. La durée maximale de stabilité des échantillons et les témoins traités est de 3 heures à une température comprise entre 20 et 30 C, de 24 heures entre 2 et 8 C et d'une semaine s'ils sont congeles a -20 C. E. L'amplification doit être démarrée dans les 3 heures suivant l'ajout des témoins et des échantillons au mélange réactionnel. MATERIEL FOURNI Specimen Preparation Reagents Réactifs de préparation des échantillons A. High Pure System Viral Nucleic Acid Kit Nécessaire Acide nucléique viral High Pure System (P/N: ) LYS (tampon de lyse/liaison) CAR (ARN porteur) PK (Protéinase K) IRB (Tampon d'élimination de l'inhibiteur) WASH (Tampon de lavage) ELB (Tampon d'élution) RS (Ensemble de portoirs de système pour acide nucléique viral High Pure System) WR (Portoir de vidange pour système pour acide nucléique viral High Pure, blanc) 9
10 Amplification and Detection Reagents Réactifs d'amplification et de détection B. COBAS TaqMan HBV Test HBV HPS test COBAS TaqMan HBV (P/N: ) HBV QS (Réactif de standard de quantification COBAS TaqMan HBV) HBV H(+)C [HBV Témoin Haut (+)] HBV L(+)C [HBV Témoin Bas (+)] CTM ( ) C [Témoin négatif COBAS TaqMan (Plasma humain)] HBV MMX (Master Mix HBV COBAS TaqMan) CTM Mn 2+ (Solution de mangànese COBAS TaqMan) MATERIEL NECESSAIRE MAIS NON FOURNI Instrumentation et logiciel Analyseur COBAS TaqMan 48 Logiciel AMPLILINK, v ou ultérieure Station de données pour le logiciel AMPLILINK Manuel de l'opérateur de l'analyseur COBAS TaqMan 48 Capsulateur de tube K (P/N : ) CD ROM avec fichier pour le test COBAS TaqMan HBV PCR (P/N : ) Matériels à usage unique Boîte de 12 x 96 tubes K (P/N : ) Centrifugeuse Une centrifugeuse Sigma 4-15 C de table ou une centrifugeuse de plaques à titrage équivalente, capable d'atteindre une force centrifuge de g Un rotor horizontal de centrifugeuse Sigma, n (comprenant 2 godets, P/N : et 2 porte plaques, P/N : 17978) ou équivalent AUTRES MATERIELS NECESSAIRES MAIS NON FOURNIS Isopropanol (> 99 %) - conforme ou supérieur aux spécifications ACS Éthanol ( %) - conforme ou supérieur aux spécifications ACS Pipettes ajustables* : (capacité de 250 µl et 1000 µl) avec barrière aérosol ou embouts à déplacement positif sans ARNase Aide pipettes : Drummond (P/N : ) ou équivalent Bain-marie à 50 C Bloc à chaleur sèche réglé à 70 C Pipettes sérologiques, stériles et jetables : 5, 10 et 25 ml Tubes coniques stériles en polypropylène, 15 et 50 ml : Corning (P/N : et ) ou équivalent Tubes microfuges stériles de 2 ml : Sarstedt (P/N : ) ou équivalent Mélangeur Vortex Portoirs Gants jetables, non poudrés Thermomètres étalonnés pour bain-marie et bloc à chaleur sèche * La capacité des pipettes ne peut différer de plus de 3 % du volume indiqué. Lorsque cela est spécifié, utiliser des embouts avec barrère contre les aerósols ou à déplacement positif, sans ARNases, pour éviter une contamination croisée de l'échantillon et de l'amplicon. 10
11 PRELEVEMENT, TRANSPORT ET CONSERVATION DES ECHANTILLONS REMARQUE : manipuler tous les échantillons et témoins comme s'ils étaient susceptibles de transmettre des agents infectieux. A. Prélèvement des échantillons Le test COBAS TaqMan HBV doit être exclusivement utilisé avec des échantillons de sérum ou de plasma. Le sang doit être recueilli dans des tubes séparateurs de sérum BD SST ou dans des tubes contenant de l'edta comme anticoagulant (bouchon lavande). Conserver le sang total à une température comprise entre 2 et 25 C pendant moins de 24 heures. L'utilisation de plasma EDTA ou de sérum aboutit à des résultats de tests équivalents. La Figure 4 présente l'influence du type de matrice sur les résultats d'adn du HBV à partir d'échantillons de patients. Figure 4 Comparaison des échantillons sur plasma EDTA et sur sérum 12,00 10,00 Résultat moyen des échantillons de plasma (UI/ml [Log ] ADN du HBV, n = 2) 10 8,00 6,00 4,00 y = 1,0139x - 0,0703 R 2 = 0,9984 2,00 0,00 0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 Résultat moyen des échantillons de sérum (UI/ml [Log 10 ] ADN du HBV, n = 2) Séparer le sérum ou le plasma du sang total dans les 24 heures suivant le recueil par centrifugation entre 800 et 1600 g pendant 20 minutes à température ambiante. Transférer le sérum ou le plasma dans un tube en polypropylène stérile. La Figure 5 présente les donnees issues des études après recueil des échantillons. Figure 5 Stabilité du HBV dans du sang total sur anticoagulant EDTA ou dans des tubes pour séparation du sérum avant séparation en plasma ou en sérum 4,5 Résultat moyen de l ADN du HBV (UI/ml [log ] ADN du HBV, n = 2) 10 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 Plasma-1 Plasma-2 Plasma-3 Plasma-4 Plasma-5 Sérum-1 Sérum-2 Numéro d identification de l échantillon < 1 heure 25-30C 6 heures 25-30C 24 heures 25-30C 48 heures 25-30C 72 heures 25-30C < 1 heure 2-8C 6 heures 2-8C 24 heures 2-8C 48 heures 2-8C 72 heures 2-8C 11
12 B. Transport des échantillons Le transport de sang total, de sérum ou de plasma doit être conforme aux lois nationales, fédérales et régionales relatives au transport d'agents étiologiques 32. Le sang total doit être transporté à une température comprise entre 2 et 25 C et traité dans les 24 heures suivant le recueil. Le plasma ou le sérum peuvent être transportes a une température comprise entre 2 et 8 C ou congelés entre -20 et -80 C. C. Conservation des échantillons Les échantillons de plasma ou de sérum peuvent être conservés à température ambiante pendant 3 jours maximum, pendant 7 jours maximum à une température comprise entre 2 et 8 C, ou congelés pendant au moins six semaines à une température comprise entre -20 et -80 C. Il est recommandé de conserver les échantillons sous formes de parties aliquotes de 800 a 900 µl dans des tubes de 2 ml en polypropylène avec bouchon à vis (du type Sarstedt, P/N : ). La Figure 6 presente les données des études de conservation d'échantillons. Figure 6 Stabilite du HBV dans du plasma EDTA ou du sérum Résultat moyen de l ADN du HBV (UI/ml [log ] ADN du HBV, n = 2) 10 4,5 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 Plasma-1 Plasma-2 Plasma-3 Plasma-4 Plasma-5 Sérum-1 Sérum-2 heure 0 1 Jour RT 3 Jours RT 5 Jours RT 7 Jours RT 1 Jour 2-8C 3 Jours 2-8C 5 Jours 2-8C 7 Jours 2-8C 6 semaines -80C Numéro d identification de l échantillon Les échantillons de sérum et de plasma peuvent être congelés et decongelés cinq fois au maximum sans aucune perte d'adn du HBV. La Figure 7 présente les données issues des etudes après congelationdécongélation des échantillons. Figure 7 Résultats HBV après cinq cycles de congélation-décongélation 4,5 Résultat moyen de l ADN du HBV (UI/ml [log ] ADN du HBV, n = 2) 10 4,0 3,5 3,0 2,5 Témoin 1 C-D 2 C-D 3 C-D 4 C-D 5 C-D 2,0 Plasma-1 Plasma-2 Plasma-3 Plasma-4 Sérum-1 Sérum-2 Numéro d identification de l échantillon 12
13 MODE D'EMPLOI REMARQUE : se reporter au manuel d'utilisation de l'analyseur COBAS TaqMan 48 pour des instructions détaillées sur son fonctionnement REMARQUE : tous les réactifs de détection et d'amplification doivent être à température ambiante avant utilisation ; les sortir de l'endroit de conservation a 2-8 C au moins 30 minutes avant l'emploi. REMARQUE : les échantillons de plasma et de sérum doivent être stabilisés pendant 15 à 30 minutes a température ambiante avant d'être utilisés. REMARQUE : utiliser des pipetteurs et des embouts avec barrière contre les aérosols ou à déplacement positif quand cela est spécifié. La plus grande prudence est de rigueur afin d'éviter toute contamination. Taille de la serie : Chaque nécessaire contient une quantité suffisante de réactifs pour quatre séries d'analyses de 12 tests, pouvant être effectuées séparément ou simultanément. Un exemplaire de CTM ( ) C, de HBV L(+)C et de HBV H(+)C doit être inclus dans chaque série de tests comptant un maximum de 24 échantillons et témoins (Cf. Le chapitre «Contrôle de qualité»). Les réactifs d'amplification et de détection sont conditionnés dans des flacons doubles pour 24 tests. Pour une utilisation optimale des réactifs, traiter les échantillons et les témoins par lots multiples de 12. Préparation des échantillons et des témoins REMARQUE : en cas d'utilisation d'échantillons congelés de sérum ou de plasma, laisser les échantillons à température ambiante jusqu'à ce qu'ils soient completement décongelés et les passer au vortex pendant 5 à 10 secondes avant utilisation. REMARQUE : laisser tous les réactifs revenir à température ambiante avant de les utiliser. Prechauffer les blocs chauffants a une température de 70 C et le bain-marie à une température de 50 C avant de commencer les réactions de purification. A. Préparation des réactifs REMARQUE : préparer la solution de travail de lyse/ liaison seulement après que les échantillons et les témoins ont été stabilisés à température ambiante pendant 15 à 30 minutes. 1. Préparer le tampon d'élimination de l'inhibiteur en pipettant 20 ml d'éthanol a % du flacon IRB. Retourner 5 à 10 fois pour mélanger. Cette quantite de tampon d'élimination de l'inhibiteur reconstitué est suffisante pour réaliser 48 tests. 2. Préparer le tampon de lavage en pipettant 80 ml d'éthanol à % du flacon marqué (WASH). Mélanger par retournement 5 à 10 fois. Cette quantite de tampon de lavage reconstitué est suffisante pour realiser 48 tests. 3. Préchauffer le tampon d'élution (ELB) à 70 C dans un tube microfuge de 2 ml avec bouchon à vis. Plusieurs tubes peuvent être utilisés. Le volume d'élution par échantillon est de 75 µl. Préchauffer le volume indique dans le tableau ci-dessous en fonction du nombre de tests. Nombre de replicats Réactif Tampon d'elution (ml) 2,0 4,0 4. Pipetter le volume d'isopropanol indiqué dans le tableau ci-dessous dans un tube stérile et propre en fonction du nombre de tests. Nombre de replicats Réactif Isopropanol (ml) 5,0 10,0 5. Pipetter 0,5 ml de tampon d'élution (ELB) dans l'arn porteur (CAR) Remettre le bouchon en place, retourner le flacon et le passer au vortex jusqu'à dissolution complète de tout l'arn porteur. L'ARN porteur reconstitue suffit pour effectuer 24 tests. La quantité non utilisée d'arn porteur reconstitué peut être conservée à une température de -15 a -25 C pendant 30 jours maximum ou jusqu'à la date de péremption, selon ce qui survient en premier. 6. Pipetter 5 ml du tampon d'élution (ELB) dans la protéinase K (PK). Remettre le bouchon en place, retourner le flacon et mélanger au vortex jusqu'à ce que toute la protéinase K soit dissoute. La protéinase K reconstituée est suffisante pour effectuer 24 tests. La quantité non utilisée de 13
14 protéinase K peut être conservée entre -15 et -25 C pendant 30 jours maximum ou jusqu'à la date de péremption, selon ce qui survient en premier. 7. Préparez la solution active de lyse/liaison en pipettant les volumes indiques dans le tableau cidessous, en fonction du nombre d'échantillons et de témoins à traiter : Nombre de replicats Réactifs Tampon de lyse/ liaison (ml) 7,0 14,0 ARN porteurs (µl) HBV QS (µl) Protéinase K (ml) 1,4 2,8 REMARQUE : le volume du standard de quantification (QS) est spécifique au test COBAS TaqMan HBV. REMARQUE : en cas d'utilisation d'arn porteur reconstitué congelé ou de protéinase K, décongeler à la température ambiante et retourner les flacons plusieurs fois avant utilisation. Ajouter le volume indiqué de tampon de lyse/liaison dans un tube stérile propre de 50 ml. Ajouter le volume indiqué d'arn porteur reconstitué dans le tube contenant le tampon de lyse/ liaison. Mélanger au vortex le standard de quantification du HBV (HBV QS) pendant 3 à 5 secondes et ajouter le volume indiqué du standard de quantification du HBV (HBV QS) dans le tube contenant le tampon de lyse/liaison et l'arn porteur reconstitué. Reboucher le tube et mélanger en retournant le tube 10 à 15 fois. Ne PAS mélanger au vortex - le mélange au vortex provoquerait l'apparition de bulles dans la solution. Ajouter le volume indiqué de protéinase K reconstituée dans le tube contenant le tampon de lyse/liaison. Reboucher le tube et mélanger en retournant le tube 10 à 15 fois. Ne PAS mélanger au vortex - le mélange au vortex provoquerait l'apparition de bulles dans la solution. Commencer à utiliser la solution active de lyse/liaison immédiatement après l'ajout et le mélange de la protéinase K avec le tampon de lyse/ liaison. Le tampon de lyse/de liaison (LYS) inutilisé peut être conservé à une température comprise entre 15 et 25 C pendant 30 jours ou jusqu'a la date de péremption, selon ce qui survient en premier. Toute solution active de lyse/de liaison non utilisée doit être eliminée. B. Préparation des échantillons et des témoins REMARQUE : l'emploi de pipetteurs ajustables avec embouts résistants aux aérosols est recommandé pour cette procedure. REMARQUE : une pipette à répétition avec embouts combi-tips stériles de taille appropriée peut être utilisée aux etapes 14,16, 19 et 22. Cependant, il faut veiller à prendre le plus grand soin d'éviter toute éclaboussure de réactifs et toute contamination croisée. 1. Pipetter 625 µl de solution active de lyse/ liaison dans chaque puits du portoir de lyse (I, transparent). Refermer les couvercles. 2. En ouvrant un puits à la fois, pipetter 500 µl d'échantillon ou de témoin dans le puits approprie. Après addition de chaque échantillon ou de témoin, abaisser le couvercle jusqu'a enclenchement du mécanisme de fermeture afin d'assurer l'étancheité de chaque puits. 3. Après avoir ajouté tous les échantillons et les témoins, mélanger au vortex le portoir de lyse pendant 10 secondes environ. Examiner visuellement tous les puits pour s'assurer que le mélange au vortex est satisfaisant. 4. Incuber le portoir de lyse dans un bain-marie préchauffé à 50 C pendant 10 minutes. Laisser flotter le portoir de lyse dans un bain-marie rempli d'environ 5 à 7 cm d'eau. Secher le portoir de lyse après l'avoir retiré du bain-marie. 5. Centrifuger le portoir de lyse pendant 10 à 20 secondes à g dans la centrifuge de plaques de titrage. La centrifuge peut ne pas atteindre la vitesse réglée. 6. Ouvrir un puits à la fois et y pipetter 250 µl d'isopropanol. Après chaque ajout, abaisser le couvercle jusqu'à enclenchement du mécanisme de fermeture afin d'assurer l'étanchéité de chaque puits. REMARQUE : le volume d'isopropanol est spécifique de chaque test COBAS TaqMan. 7. Mélanger les échantillons en retournant le portoir trois fois de suite puis en le mélangeant au vortex 14
15 pendant 10 secondes environ. Examiner visuellement tous les puits pour s'assurer que le mélange au vortex est satisfaisant. 8. Centrifuger le portoir de lyse pendant 10 à 20 secondes à g dans la centrifugeuse de plaques à titrage. La centrifugeuse peut ne pas atteindre la vitesse réglée. 9. Ouvrir un puits à la fois, transférer 750 µl d'échantillon ou de témoin dans les puits correspondants du portoir à tubes filtrants (II, jaune) avec portoir de vidange apposé (blanc). Après addition de chaque échantillon ou de mélange témoin, abaisser le couvercle jusqu'à enclenchement du mécanisme de fermeture afin d'assurer l'étanchéité de chaque puits. 10. Après avoir ajouté tous les échantillons et témoins, centrifuger le portoir de tubes filtrants pendant 2 minutes à g dans la centrifugeuse à plaques de titrage. 11. Ouvrir un puits à la fois, transférer le reste du mélange d'échantillon ou de témoins dans les puits correspondants du portoir à tubes filtrants. Après avoir ajouté chaque mélange d'échantillon ou de témoin, fermer hermétiquement le couvercle du puits. Éliminer le portoir à lyse de manière appropriée. 12. Centrifuger le portoir à tubes filtrants pendant 2 minutes à g dans la centrifugeuse à plaques de titrage. 13. Retirer le portoir à tubes filtrants du portoir de vidange en appuyant sur les deux dispositifs de fixation situés sur la partie supérieure du portoir à tubes filtrants. Éliminer le portoir de vidange. Remplacer par un nouveau portoir de vidange et fixer enclencher le portoir à tubes filtrants sur le portoir de vidange. 14. Ouvrir tous les couvercles du portoir à tubes filtrants avec les pinces et pipetter 400 µl de tampon d'élimination d'inhibiteur (IRB) le long des côtés de chaque puits. Ne pas toucher les parois du puits. Après avoir ajouté le tampon d'élimination de l'inhibiteur dans chaque puits, fermer hermétiquement les couvercles. 15. Centrifuger l'ensemble portoir à tubes filtrants-portoir à vidange pendant 2 minutes à g dans la centrifugeuse de plaques à titrage. 16. Ouvrir chaque couvercle avec les pinces et pipetter 700 µl de tampon de lavage (WASH) le long des côtés de chaque puits. Ne pas toucher les parois du puits. Après avoir ajouté le tampon de lavage dans chaque puits, fermer hermétiquement les couvercles. 17. Centrifuger le portoir à tubes filtrants pendant 2 minutes à g dans la centrifugeuse de plaques à titrage. 18. Retirer le portoir à tubes filtrants du portoir de vidange en appuyant sur les deux dispositifs de fixation situés sur la partie supérieure du portoir tubes filtrants. Éliminer le portoir de vidange. Remplacer par un nouveau portoir de vidange et enclencher le portoir à tubes filtrants sur le portoir de vidange. 19. Ouvrir tous les couvercles à l'aide des pinces et pipetter 700 µl de tampon de lavage le long des côtés de chaque puits. Ne pas toucher les parois du puits. Après avoir ajouté le tampon de lavage dans chaque puits, fermer hermétiquement les couvercles. 20. Centrifuger le portoir à tubes filtrants pendant 3 minutes à g dans la centrifugeuse de plaques à titrage. 21. Enlever le portoir à tubes filtrants du portoir de vidange en appuyant sur les deux dispositifs de fixation situés sur la partie supérieure du portoir à tubes filtrants. Placer le portoir à tubes filtrants sur le portoir à élution (IIIA, bleu) et enclencher le portoir à tubes filtrants sur le portoir à élution. Éliminer le portoir de vidange de manière appropriée. 22. Ouvrir chaque couvercle avec les pinces et pipetter 75 µl du tampon d'élution préchauffé (ELB) au centre de chaque filtre sans toucher le filtre. REMARQUE : ne pas ajouter de tampon d'élution en le versant le long du côté du puits du puits. Après avoir ajouté le tampon d'élution dans chaque puits, fermer hermétiquement les couvercles. Laisser incuber le portoir à élution à température ambiante pendant au moins 3 minutes après avoir ajouté le tampon d'élution au dernier puits 23. Centrifuger le portoir à tubes filtrants pendant 3 minutes à g dans la centrifugeuse de plaques à titrage. 24. Retirer le portoir à tubes filtrants du portoir à élution en appuyant sur les deux dispositifs de fixation situés sur la partie supérieure du portoir à tubes filtrants. Éliminer le portoir à tubes filtrants de manière appropriée. 25. Mettre le portoir à couvercle (IIIB, bleu) sur le portoir à élution (IIIA, bleu). Appuyer fermement et enclencher les dispositifs de fixation sur le portoir à élution. Fermer chaque couvercle. 15
16 26. Les échantillons et témoins traités sont utilisés directement pour la PCR. Utiliser 50 µl des échantillons et témoins pour l'amplification. Ajouter les échantillons et témoins traités au mélange réactionnel actif dans les 3 heures qui suivent leur préparation. Si les échantillons et témoins traités ne peuvent pas être utilisés dans les 3 heures qui suivent leur préparation, les échantillons et témoins traités peuvent être conservés à une température de 2 à 8 C pendant 24 heures maximum dans le portoir à élution avec couvercle fermé ou congelés à -20 C pendant au maximum une semaine dans des tubes stériles en polypropylène de 2,0 ml, avec bouchon à vis (par exemple Sarstedt, P/N : ). Amplification et détection REMARQUE : il faut essuyer les porteurs K et les supports de porteurs K à l'aide d'un chiffon non pelucheux imprégné d'une solution d'isopropanol à 70 %. C. Réparation du réactif REMARQUE : le mélange réactionnel COBAS TaqMan HBV Master Mix (HBV MMX), le mélange réactionnel actif (Working MMX) et le mélange réactionnel actif + échantillons et témoins traités sont sensibles à la lumière. Protéger ces réactifs de la lumière. REMARQUE : il faut stabiliser le mélange réactionnel COBAS TaqMan HBV (HBV MMX) et la solution de manganèse COBAS TaqMan (CTM Mn 2+ ) à température ambiante pendant au moins 30 minutes avant la préparation du mélange réactionnel actif. REMARQUE : préparer le mélange réactionnel actif après avoir terminé la préparation des échantillons et témoins. REMARQUE : le mélange réactionnel actif doit être utilisé dans les 2 heures qui suivent la préparation. REMARQUE : l'amplification doit débuter dans les 3 heures qui suivent l'ajout des échantillons et témoins traités au mélange réactionnel actif. 1. Stabiliser un flacon de HBV MMX et un flacon de CTM Mn 2+ à température ambiante pendant au moins 30 minutes. 2. Placer un porteur K dans un support de porteur K. 3. Placer des tubes K neufs dans le porteur K sans toucher les parois des tubes K. REMARQUE : si la série comporte moins de 24 tubes, les emplacements 1, 2, 5, 20, 23 et 24 doivent être occupées pour équilibrer le porteur K dans le thermocycleur. 4. Déboucher les tubes K à l'aide du décapsuleur de tubes K. Placer les bouchons dans le dispositif de maintien des tubes K. 5. Préparer le mélange réactionnel actif de la façon suivante : Pour 24 tests, ajouter 191 µl de CTM Mn 2+ à un flacon de HBV MMX. Boucher le flacon et bien mélanger en le retournant 10 fois. Ne pas mélanger le mélange réactionnel actif au vortex. Tenir le mélange réactionnel actif à l'abri de la lumière solaire et l'utiliser dans les 2 heures qui suivent. Pour 12 tests, prélever 660 µl de HBV MMX et les mettre dans un tube de 2 ml. Ajouter 90 µl de CTM Mn 2+ au tube de 2 ml contenant le HBV MMX, boucher le tube et bien mélanger en retournant le tube 10 fois. Tenir le mélange réactionnel actif à l'abri de la lumière solaire et l'utiliser dans les 2 heures qui suivent. Conserver le HBV MMX et le CTM Mn 2+ non utilisés dans leurs flacons d'origine à une température comprise entre 2 et 8 C. Après ouverture, le HBV MMX et le CTM Mn 2+ sont stables à 2-8 C pendant 30 jours ou jusqu'à la date de péremption, selon ce qui survient en premier. REMARQUE : le volume de CTM Mn 2+ est spécifique au test COBAS TaqMan HBV. 6. Pipeter 50 µl de mélange réactionnel actif dans chaque tube K. REMARQUE : si des échantillons et des témoins traités ont été conservés congelés avant amplification, les laisser décongeler à température ambiante avant de passer à l'étape Ajouter 50 µl de chaque échantillon et témoin au tube K approprié contenant le mélange réactionnel actif à l'aide d'une micropipette avec filtre contre les aérosols ou embout à déplacement positif. Mélanger doucement chaque échantillon en déplaçant le micropipetteur trois fois de haut en bas sans créer des bulles. 8. Répéter l'étape 7 pour chaque échantillon et témoin traités jusqu'à ce qu'ils soient tous transférés dans des tubes K. Utiliser un nouvel embout pour chaque échantillon ou témoin traité. Inspecter visuellement chaque tube à la recherche de bulles et les éliminer s'il y a lieu. Boucher les tubes K avec un capsuleur de tubes K. Vérifier visuellement que les volumes appropriés ont bien été ajoutés. 16
COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV Test CMVCAP
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