Stratégies de Réplications des génomes viraux

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1 Mardi 3/11/09 18h30-20h Cours 2 Virologie Dr Claire Deback RT : Fancelli Olivier RL : Martineau Camille Stratégies de Réplications des génomes viraux INTRODUCTION : Généralités et définitions 1 er PARTIE : Le Cycle général de multiplication d un virus (différentes étapes) 2 e PARTIE : Cycles de multiplication des différents types de virus (exemples) INTRODUCTION Définition : _ Les virus sont des parasites absolus : il se répliquent dans une cellule vivante _ spectre d hôte : espèces qu un virus est capable d infecter. Le spectre varie considérablement selon le virus. Certains virus sont capables d infecter plusieurs types cellulaires chez des espèces animales différentes tandis que d autres sont capables d infecter un seul type cellulaire chez une espèce animale spécifique. L homme est très peu infecté par des virus d animaux, mais parfois il arrive que de petits virus passent les barrières d espèces comme l herpès du singe. _ le tropisme tissulaire et cellulaire d un virus : ce sont respectivement les tissus cellulaires et les types cellulaires particuliers qu un virus est capable d infecter. _ Les cellules résistantes : ce sont les cellules ne pouvant être infectées. Il y a un blocage au cours des étapes précoces de multiplication empêchent toute expression des gènes viraux. Ce blocage peut être dû : _ à une incompétence de la cellule infectée _ à la cellule infectée qui n est pas dans le cycle cellulaire approprié _ à la cellule infectée qui est sénescente _ à la cellule infectée qui ne se divise pas _ Les cellules sensibles = cellules capables d être infectées.

2 _ Les cellules permissives permettent au virus de réaliser un cycle de multiplication complet (cycle productif ou lytique) avec production de nouvelles particules infectieuses. Il en résulte un arrêt de la machinerie cellulaire conduisant à une apoptose ou à une explosion de la cellule. NB : tous les cycles viraux ne sont pas lytiques. _ les cellules non-permissives sont les cellules dont le cycle viral ne peut s y dérouler complètement. On peut trouver du matériel viral à l intérieur de la cellule mais pas de nouvelles particules virales. Les différents types d infections de la cellule Infection Expression du génome viral Devenir de la celluleproduction de virions Productive Expression de tous les gènes viraux LYSE OUI Abortive Persistance ou Latence Expression interrompue (le virus est Retour à la normale défectif ou la cellule est non permissive) des constituants (la cellule se débarrasse viraux) NON Persistance du génome dans la Survie avec cellule avec expressions de quelques modifications NON gènes viraux NB : Après une infection productive ou abortive, le virus peut persister dans le génome cellulaire, la plupart du temps sous forme d épisomes viraux (morceaux de génome viral circulaire ils persistent à vie dans la cellule) Ex : infection par le virus de l herpès. Nous avons tous du génome de l herpès caché dans nos cellules. De temps à autre, on aura l expression de quelques gènes afin de se maintenir ou pour occasionner des récurrences. La phase de latence est comme une infection chronique et silencieuse. 1 er PARTIE : Le Cycle général de multiplication d un virus Il existe 3 grandes phases.

3 A) Les étapes précoces 1) L Attachement ou Adsorption Fixation sur la membrane plasmique au niveau de récepteurs spécifiques grâce à des structures externes (glycoprotéines ou protéines) situées : _ sur la capside pour les virus nus _ sur l enveloppe pour les virus enveloppés L attachement conditionne le tropisme (il faut que le virus rencontre le bon récepteur) 2) La Pénétration Contrairement à l adsorption, la pénétration est un phénomène actif. La pénétration dans le cytoplasme dépend de la température et du ph. Il existe 3 différents mécanismes d internalisation des particules virales : a) Endocytose médiée par un récepteur : Il s agit de la formation de vésicules d endocytose (à partir de clathrines situées au niveau de la membrane plasmique) qui vont venir fusionner avec les endosomes à l intérieur du cytoplasme. Le ph acide des lysosomes permet le relargage de la nucléocapside dans le cytosol. - pénétration du virion entier, très rapide - pénétration habituelle des virus nus - ex : adénovirus, influenzavirus b) Fusion-Lyse Fusion entre la membrane plasmique cellulaire et enveloppe lipidique virale. Les ligands s accrochent aux récepteurs laissant lors de la fusion les glycoprotéines structurales virales à l extérieur. Seule la nucléocapside pénètre dans le cytosol. NB : certains virus possèdent une couche supplémentaire entre la membrane de l enveloppe et la capside, celle-ci est nommée le tégument. Lors de la pénétration, il y a libération de ces téguments dans le cytosol. - des virus possèdent des protéines de fusion qu on appelle des protéines fusogènes. Ces protéines ont la capacité de favoriser ces fusions. - pénétration habituelle des virus enveloppés - ex : paramyxovirus, herpesvirus, VIH c) translocation directe - pénétration habituelle des virus nus et de petites tailles - ex : poliovirus 3) La Décapsidation Libération de l acide nucléique associée à une perte de la capside. Cette libération nécessite des enzymes et de l énergie pour casser la capside. Suivant les virus, elle sera : dans le cytoplasme ou le noyau totale ou partielle (protection temporaire) faite en même temps que la pénétration ou après.

4 B) La Synthèse des Macromolécules Cette phase est dédiée à la réplication, transcription/traduction du virus. Ces étapes s opèrent conjointement. Pendant cette phase, il n y a pas de virions matures malgré la présence du matériel génétique viral ou de ses protéines. On la nomme phase d éclipse en raison de la cinétique de maturation des virions. 1) Transcription Le virus utilise des transcriptases et protéines de régulation cellulaires ou virales pour obtenir un ARNm viral de polarité positive traductible. ADN bicaténaire utilise une ARN polymérase cellulaire pour avoir un ARNm viral (+) traductible. ADN monocaténaire passe d abord par une ADN pol cellulaire pour obtenir un ADN bicaténaire qui sera transcrit en ARNm viral (+). ARNm monocaténaire (+) est directement reconnu par les ribosomes. ARNm monocaténaire de polarité négative (-) ne peut pas produire de protéines directement. Il sera d abord transcrit en ARNm (+) par une transcriptase virale. ARN monocaténaire positif (cas des retrovirus) nécessite de passer par un ADN bicaténaire par l intermédiaire d une transcriptase inverse virale. ARN bicaténaire, plus rare, retrouvé au niveau des rotavirus (virus appartenant à la famille des reoviridae) utilisera une transcriptase virale. Rotavirus appartenant à la famille des roviridae donne des gastro entérites chez les enfants. La transcription a lieu soit dans le cytoplasme ou soit dans le noyau suivant les virus.virus ADN se répliquant dans le noyau : _ transcription est réalisée par une ARN polymérase II ADN dépendante _ elle s opère soit en une phase ou en phases chronologiques (Activation des gènes très précoces codant pour des facteurs de transactivation qui vont activer les gènes précoces codant pour des protéines intervenant dans la réplication du génome viral et durant cette réplication, activation des gènes tardifs codant pour les protéines de structure virales) _ des modifications post-transcriptionnelles : addition d une coiffe en 5, ajout d une queue poly A en 3 ou épissages Virus ARN : Chez le virus ARN, la transcription joue un rôle clé dans la régulation du cycle viral Elle est régulée par des séquences régulatrices sur l ARN viral (motifs très conservés). La transcription de l ARN viral est réalisée par une transcriptase virale spécifique (sauf ARN (+) ) qui est une ARN polymérase ARN dépendante.

5 2) Traduction Production de protéines de structure, de régulation du cycle :facteurs de transcription, protéines inhibant les synthèses cellulaires (on appelle cela le shut off). Modifications post-traductionnelles : glycosylation, clivage _ Virus ADN se répliquant dans le noyau : La traduction se déroule comme pour les ARNm cellulaires. (transcrits monocistroniques) 1 ARNm donne 1 protéine s il n y a pas de clivages protéiques _ Virus ARN : À partir d une même matrice, il y a synthèse de plusieurs protéines. (transcrits polycistroniques) Il y aura la synthèse d une glycoprotéine qui sera clivée secondairement en plusieurs protéines par des protéases cellulaires ou virales. - épissage - en l absence de coiffe en 5 de l ARN, on aura une structure IRES (internal ribosome enter site) qui sera reconnue par les ribosomes pour la traduction. 3) Réplication _ Virus à ADN : utilise une ADN polymérase ADN dépendante virale (sauf papovaviridae) intervention d autres enzymes :hélicases, Ribonucléases, protéines de liaison aux acides nucléiques, enzymes de régulation du métabolisme des nucléotides Le virus se réplique à partir d origine de réplication qui sont : _ unique ou multiple. _ mono ou bidirectionnelle Des protéines de liaison appelées ORI vont reconnaître ses origines de réplications. La réplication du virus à ADN est le plus souvent nucléaire (herpesvirus, adénovirus, papillpmavirus, parvovirus) ou cytoplasmique (poxvirus =virus de la variole) _ Virus à ARN : La réplication à besoin d une ARN polymérase ARN dépendante VIRALE appelée aussi réplicase ou transcriptase. (sauf le retrovirus qui utilise ARN polymérase cellulaire) elle est le plus souvent cytoplasmique (sauf pour Orthomyxoviridae, virus de la grippe) Pour se répliquer, le virus à : ARN monocaténaire (+) passe par un intermédiaire de réplication qui est un ARN complémentaire négatif qui servira de matrice. ARN monocaténaire (-) produit un ARN complémentaire positif qui servira de matrice pour la réplication et la traduction. NB : _ grippe appartient à la famille des orthomyxoviridae _ rougeole appartient à la famille des paramyxoviridae _ rage appartient à la famille des Rhaboviridae ARN monocaténaire (+) rétro virus passe d abord par un ADN proviral qui sera intégré au génome cellulaire pour être transcrit par une ARN pol cellulaire afin de redonner de l ARN. ARN bicaténaire se sert du brin positif comme matrice pour synthétiser l ARN complémentaire. Ne pas oublier toutes les enzymes sont virales sauf l ARN pol cellulaire du retrovirus.

6 propriétés de l ARN polymérase ARN dépendante virale : Haute efficacité (copie rapidement les génomes d ARN de petite taille) Taux d erreurs importants car elle copie rapidement mais aussi parce qu elle n a pas de fonction réparatrice contrairement à ADN pol. Par conséquent, les génomes viraux ne sont jamais répliqués correctement. Il en résulte une variabilité importante, définissant une «quasi espèce» = l ensemble des génomes d un même virus. _ propriété de l ADN polymérase : peu d erreurs car capable de revenir en arrière pour corriger d éventuels «fautes de frappes» (comme le ronéolecteur) Grande Stabilité. ex : 1 erreur pour 10^7 nucléotides en considérant un un génome de grande taille. C) La Phase Tardive : Assemblage et Libérations des virions néo-formés _ clivages et glycosylations de certaines protéines virales. Ces protéines passent par les voies du RE et du golgi afin d être externalisées au niveau de la membrane plasmique. _ Assemblage de l acide nucléique et des protéines de structure (protéines de core, protéine de capside) définit l encapsidation du virus. _ Acquisition de l enveloppe dans le cas de virus enveloppés _ la libération se fait par cheminement dans les canalicules intracellulaires, puis par le bourgeonnement du virus à partir de la membrane plasmique 2 e PARTIE : Cycles de multiplication des différents types de virus A) Virus à ADN double brin Ex : virus herpes simplex _Ils se multiplient dans le noyau. _ VP16 (tégument) initie la transcription des gènes très précoces en coopération avec des composants cellulaires. _ Au moins deux protéines très précoces (ICP4 et ICP0) ont des fonctions de contrôle sur la transcription des gènes précoces et tardifs. NB: ICP=infected cellular protein= protéine de la cellule inféctée. Ces gènes très précoces s autorégulent par l intermédiaire de leurs proteins ICP. _ Les protéines précoces sont des enzymes impliquées dans le réplication du génome : ADN polymérase (UL30), thymidine kinase (UL23). Ces enzymes sont les cibles des antiviraux. _ La réplication est bidirectionnelle, après circularisation du génome linéaire _ Les herpesvirus sont capables d entrer dans un programme alternatif de transcription établissant une infection latente. Un groupe spécifique d ARN messagers LAT ( latency associated transcripts ) bloque la synthèse ICP4, ce qui aboutira à l arrêt du cycle viral. _ Les épisomes restent dans le noyau à vie.

7 B) Virus à simple brin de polarité positive. _ Regroupe un grand nombre de virus animaux : Picornaviridae, Togaviridae, Flaviviridae, Astroviridae,Caliciviridae, Coronaviridae Le génome de ces virus peut servir directement d ARN messager. Il est directement codant. Les enzymes responsables de la réplication/transcription du génome sont synthétisées après et ne nécessitent pas d être apportés par le virion. Le génome est dit «infectieux». REPLICATION: L ARN génomique positif est répliqué par une ARN polymerase. Elle synthétise un ARN(-) complémentaire, qui servira de matrice pour la synthèse de nouveaux ARN(+). Ceux-ci pourront recommencer un cycle de traduction/réplication ou être encapsidés dans de nouveaux virions. TRADUCTION : Type Picornaviridae : ARN génomique est traduit en une seule polyprotéine qui subira des clivages successifs par des protéases virales ou cellulaires. ex : virus de l hépatite C (famille flaviviridae), virus de la Polio (Famille des Picornaviridae) TypeTogaviridae: Tout d abord, il y aura la traduction de l extrémité 5 de l ARN (+) parental viral qui conduira à la synthèse des protéines non structurales parmi lesquelles, l ARN polymérase. Cette dernière transcrira un ARN (-). Il servira à la fois, de matrice pour la replication de nouveaux genomes viraux et à la fois, de matrice pour synthétiser un ARN subgénomique (+) (représentant l extrémité 3 du genome viral). Cette extrémité 3 code pour les protéines structurales et elles seront donc traduites à partir de cet ARN subgénomique (+). C) Virus à ARN simple brin de polarité négative Ces génomes de polarité négative ne sont pas «infectieux». L infection nécessite une ARN polymérase associée au virion pour la transcription en ARNm. 1) Virus non segmenté (=génome unique) Ex : Filoviridae, Paramyxoviridae, Rhabdoviridae, Bornaviridae Les génomes sont constitués de gènes séparés par des régions intergéniques. Ces séquences intergéniques contiennent des séquences de polyadénylation, de terminaison et d initiation pour la transcription en ARNm du gène suivant. TRANSCRIPTION : Réalisée par une ARN polymérase associée au virion. Les séquences poly (A) à l extrémité 3 du messager sont ajoutées par la lecture itérative de séquences d uridine situées à la fin du gène. L ARN pol initie ensuite la synthèse d un autre ARNm et ainsi de suite jusqu à la fin du génome. Seule une fraction des ARN polymérase franchit les régions intergéniques. Ainsi la quantité d ARNm synthétisés varie selon la localisation du gènes (diminution de 3 en 5 ) : la transcription est séquentielle et polaire

8 REPLICATION : L ARN(-) sert de matrice pour la synthèse d une copie du génome entier en ARN (+). Lorsque la concentration de nucléoprotéines (N) atteint un certain seuil, celles-ci se fixent sur l ARN(+) nouvellement synthétisé et permettent à l ARN polymérase de copier les jonctions intergéniques sans s arrêter. L ARN (+) sert de matrice pour la production de nouveaux génomes ARN (-). 2) Virus ségmenté (= genome composé de plusieurs segments) Ex : Les Orthomyxoviridae et les Bunyaviridae sont constitué de segments génomiques ARN-: 8 et 3 respectivement. Chaque segment est transcrit en 1 ARNm, lui même traduit en une protéine ou polyprotéine qui subit un clivage protéolytique. Pour les Orthomyxoviridae, le complexe ARN polymérase comprend les protéines PA (initiation de la réplication), PB1 (élongation) et PB2 (initiation de la transcription). Au bout de chaque segments, se trouve cette ARN pol. TRANSCRIPTION : Réalisée par une ARN polymérase associée au virion. Nécessite une initiation de l ARN polymérase par une amorce provenant de l extrémité 5 des ARNm cellulaires. Ces amorces sont obtenues par des endonucléases virales. L élongation se poursuit jusqu à l addition d une séquence poly A à l extrémité 3 de l ARNm. REPLICATION : L ARN polymérase initie la synthèse des brins ARN+ et ARN-sans intervention d amorces. (ex : grippe) NB sur la particularité des virus à ARN(-) ségmentés : lorsque qu une cellule est inféctée par 2 de ces virus, il y aura des échanges de ségments génétiques, à l origine de génotype différent. Ex : Virus H1N1= recombinaison d un virus aviaire, humain et porcine D) Virus à ARN double brin Ex : les Reoviridae qui ont un génome segmenté TRANSCRIPTION : Transcription d un ARNm à partir de la matrice négative de chaque segment d ARN double brin par l ARN polymérase associée au genome viral. Il y a une ARN pol par segment, or dans le cas du rotavirus qui possède 11 segments, on en dénombre 12. C est un grand mystère! _ Ces ARNm sont constitutés d une coiffe en 5 _ Ils ne sont PAS polyadénylés en 3. L ARNm sort de la particule pour être traduit en protéine dans le cytoplasme REPLICATION : Elle a lieu au sein de la particule virale par l ARN pol à partir du brin d ARN (+)

9 E) Virus à ARN utilisant une transcription inverse pour leur réplication (ARN AND db) Les Retroviridae (virus à ARN) et les Hepadnaviridae (virus à ADN) ont la capacité de produire une molécule d ADN à partir d ARN(+). Cette étape est redue possible par la présence d un enzyme virale, la transcriptase inverse ou reverse transcriptase (RT). Il s agit d un hétérodimère qui possède deux fonctions importantes : une activité ADN polymérase et une Rnase H, qui lui permet de dégrader l ARN hybridé à l ADN nouvellement formé. 1) Hepadnaviridae (ex: virus de l hépatite B, VHB ou HBV) Le génome de ces virus est constitué de deux brins d ADN circulaires un brin (-) complet un brin (+) complémentaire mais incomplet. Après la pénétration du virion dans le cytoplasme, le génome viral est introduit dans le noyau où la synthèse du brin (+) s achève pour donner un génome circulaire bicaténaire super-enroulé (nonintégré). Le génome persiste à vie dans l hépatocyte sous forme de mini-chromosome (sans être répliqué par la machinerie de la cellule hôte) C est une sorte de latence différente de l herpes mais qui y ressemble beaucoup. TRANSCRIPTION : Quand le virus entre dans sa phase lytique, le brin (-) de l ADN est transcrit par l ARN polymérase II de le cellule hôte en deux catégories d ARN : ARN correspondant à l ensemble du génome appelé «pré-génome ARN». Il sert d ARNm qui est traduit en protéine P (polymérase) qui possède une activité de RT et en protéines structurales qui s assemblent pour former la capside virale. Des ARNm plus courts qui sont traduits pour la synthèse des protéines d enveloppe (AgHBs : ptotéine S, prés1 et prés2) et la protéine X : ARN prégénomique(arnpg) de 3,5kb + ARNm de 2,4 kb + ARNm de 2,1 kb + ARNm de 0,5kb REPLICATION : 1) La réplication s effectue par reverse transcription à partir du pré-génome ARN. 2) Le pré-génome ARN possède des structures répétées (DR1) et (DR2) à chaque extrémité qui jouent un rôle important dans la réplication et l encapsidation. 3) Le pré-génome est incorporé dans une capside nouvellement formée. 4) La protéine P initie la synthèse d un brin ADN(-) à l intérieure de la particule virale. 5) Alors que se poursuit la synthèse de l ADN (élongation), le pré-génome est degrade par l activité RnaseH de la polymérase. 6) L extrémité 5 terminale du pré-génome (15 à18 nucléotides) est laissée libre. 7) Cet ARN hybridé sert d amorce pour la synthèse du brin complémentaire (+) d ADN. 8) 2) Retroviridae (ex: VIH) STRUCTURE : Le VIH est un virus à ARN monocaténaire de polarité positive. Sa capside est en forme de cone tronqué et elle est entourée d une envelope contenant des glycoprotéines Le génome est constitué de deux brins d ARN (+) identiques.

10 Sa REPLICATION et son expression nécessitent la synthèse d un intermédiaire ADN double brin assurée par la rétrotranscriptase associée au virion. 1) La synthèse du premier brin d ADN(-) est amorcée par la liaison d un ARNt à proximité de l extrémité 5 du génome, sur une séquence complémentaire appelée PBS (Primer Binding Site). 2) Cette courte synthèse s arrête à l extrémité 5 du génome. L ARN de l hybride ARN/ADN est alors degradé par l activité Rnase H de l enzyme. 3) Translocation et hybridation du fragment d ADN nouvellement synthétisé sur l extrémité complémentaire 3 du génome viral. 4) Élongation ADN et élimination de la matrice ARN par la Rnase H, à l exception de la région PBS(+). 5) Seconde translocation (intramoléculaire) avec hybridation des régions PBS des brins (+) et (-). 6) Élongation de l ADN (+) 7) L ADN bicaténaire complet est integré dans le génome cellulaire par une intégrase virale. TRANSCRIPTION : À partir de l ADN integré dans le génome Par l ARN polymérase II cellulaire Les produits de transcription formeront de nouveaux génomes ou ARNm qui seront traduits en précursseurs polyprotéiques (Gag/Pol/Env). D autres petits transcrits seront épissés et traduits en protéines de régulation (Tat,Rev,Nef ). Les précursseurs polyprotéiques sont clivés par la protéase virale pour donner naissance à des protéines virales matures. Env est clivée par des protéases cellulaires en deux protéines d enveloppe qui seront glycosylées par es enzymes de la cellule. Gag/Pol est clivé par la protéase virale pour donner les protéines constitutives internes, et les trois enzymes (RT, protéase et intégrase), au moment du bourgeonnement. Cette dernière étape s appelle la maturation, indispensables à la production de virus infectieux. REGULATION: Elle est complexe La synthèse de l ARN viral commence dans la région LTR 5 (promoteur) et se termine dans la région 3 (site depolyadénylation). Les extrémités 3 et 5 ou LTR (Long terminal repeat) qui encadrent la séquence codante contiennent des régions promotrices et régulatrices. LTR 5 contient des séquences régulatrices où se fixent des facteurs de transcriptions cellulaires (SP1, NF-kB) qui modifient l expression des gènes du VIH. Séquence TAR (Tat response element) : fixe la protéine Tat qui augmente le déclenchement de la transcription. Séquence RRE (Rev response element) sur les ARNm: REV restreint l épissage des ARNm et module le transfert des ARNm vers le cytoplasme. Il existe aussi de petits ARN chargés de fixer des proteins transactivatrice, ou de restreindre l épissage ou de réguler le transfert du VIH dans le cytoplasme. Cibles thérapeutiques des Anti viraux sont la transcriptase inverse, intégrase et la protease intervenant dans la maturation des protéines virales. Par ailleurs, il existe des inhibiteurs de fusion empêchant l enntrée su virus dans la cellule cible.

11 Bon Courage à tous et avant de se quitter 1 petite Blague: C est 3 blondes qui arrivent au ciel. Pour accèder au paradis, elles doivent monter un escalier. Le problème, c est qu à chaque marche, il y a une blague et elles ne doivent pas rire sinon elle plonge en enfer! La première, très motivée, s élance la première est fatale elle la lit puis s esclaffe comme une banane! Direction l enfer La deuxième se pensant meilleure, bondit et commence à escalader ces marches. Une, puis deux puis finalement elle n en peut plus! S en est trop pour une blonde! Elle s arrête et rigole comme un goeland à la blague de la 3e marche! Elle aussi n échappe pas à sa destinée La dernière des 3, encore plus blonde que les 2 autres, commencent son aventure elle monte 1 puis 2 puis 3 ça continue cette blonde est un phénomène, elle grimpe et ne rigole pas une résistance à toutes blagues jusqu au moment d arriver sur l avant dernière marche! À cet instant, un rire du tonnerre jaillit de son corps, sa chevelure de blonde remue dans tous les sens! Dieu stomaqué n y croit pas il lui demande nom du pipe, pourquoi elle a ri alors qu elle était si proche du but! Celle-ci lui répond à chaudes larmes: Je viens de comprendre la 1er