Antibiorésistance des entérobactéries aux β-lactamines. Introduction

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1 Introduction Après un demi-siècle d'utilisation des antibiotiques, l'émergence et la dissémination de la résistance bactérienne posent un problème de santé publique très important. L'augmentation de la résistance aux antibiotiques se traduit dans la pratique hospitalière par une augmentation de la morbidité et de la mortalité, des coûts d'hospitalisation et par l'apparition de microorganismes résistants à l'ensemble des antibiotiques disponibles. Les entérobactéries résistantes aux β-lactamines occupent une place importante dans les infections nosocomiales, notamment en milieu de réanimation. Ces bactéries deviennent de plus en plus résistantes aux antibiotiques et à franchir les limites de l hôpital pour émerger dans la communauté. La dissémination de ces bactéries présente une menace grave qui met en cause la validité de l arsenal antibiotique actuellement disponible, d autant plus qu aucune classe nouvelle d antibiotique n est attendue dans les prochaines années. Les causes de l'émergence et de la dissémination de cette résistance sont multiples, mais l'utilisation excessive et/ou inappropriée des ces antibiotiques est, sans conteste, la principale raison de cette évolution. Face à cette problématique, nous allons envisager dans ce travail d étudie : L évolution de cette résistance aux β-lactamines au CHU IBN SINA de Rabat au cours de la période qui s étend de 2005 à

2 Première partie : Résistance bactérienne - 2 -

3 I. Définition : L antibiorésistance c est la capacité d une souche bactérienne de se développer en présence d une concentration d antibiotique notamment plus élevée qui inhibe le développement de la plupart des autres souches de même espèce. La définition de la résistance bactérienne peut être clinique ou microbiologique. On appelle résistance microbiologique la possibilité pour une bactérie de se multiplier in vitro en présence de concentration d antibiotique supérieure à celle qui permet normalement d inhiber la croissance des bactéries de même espèce. On appelle résistance clinique l évolution clinique défavorable d une infection sous traitement antibiotique, cet échec de l antibiothérapie peut avoir des coûts multiples [1]. Cette antibiorésistance s explique par l existence, chez les bactéries, de gènes leurs permettant d échapper à l action des antibiotiques. Elles sont capables de transférer ces gènes à d autres bactéries qui deviennent résistantes à leur tour. Il s agit donc d une forme transmissible de la résistance [2]. Elle est liée au mauvais usage des antibiotiques, prescris en cas d'infections virales, ventes d'antibiotiques sans prescription, pratiques d'automédication [3]

4 II. Les différents types de résistance : Naturelle [4] : existence d un ou de plusieurs mécanismes de résistance innés, donc propres à l espèce bactérienne. Elle intervient dans la définition du spectre clinique d un antibiotique (Fig. 1). Figure 1. Phénotype de résistance naturelle aux pénicillines à large spectre d une souche de Klebsiella pneumoniae. Acquise [5] : acquisition d un mécanisme de résistance pour une souche d une espèce habituellement sensible (Fig. 2). Figure 2. A. Phénotype de résistance acquise aux pénicillines à large spectre chez Escherichia coli. B. Phénotype sauvage

5 Clinique [5, 6] : expression habituelle de la résistance in vivo par l échec thérapeutique. La corrélation entre la réponse in vitro obtenue avec l antibiogramme et celle in vivo n est pas possible sans l expérience clinique. Un exemple significatif est celui de la lecture de l antibiogramme non interprétée, bien qu il y ait «sensibilité in vitro» à la pipéracilline (CMI de 2 mg/l) pour une souche sauvage de Klebsiella pneumoniae (Fig. 1). Il y a souvent résistance clinique lors du traitement d une pneumopathie par cette pénicilline à large spectre. Cet exemple est, par ailleurs, symbolique de la lecture interprétative, compte tenu de la présence d un mécanisme de résistance naturel en relation avec un effet inoculum. Croisée [5] : fait référence au spectre d inactivation lié à un même mécanisme de résistance vis-à-vis de divers antibiotiques appartenant à la même famille ou sous-groupe. Cette notion est utilisée lors de la lecture interprétative de l antibiogramme. Les souches de Klebsiella pneumoniae sont naturellement de phénotype «pénicillinase de bas niveau» avec une résistance à l amoxicilline et à la ticarcilline aisément détectée in vitro. La résistance est croisée avec les autres aminopénicillines telles l ampicilline, l épicilline, la métampicilline, etc., ou les carboxypénicillines telle la carbénicilline. Il y a résistance croisée entre toutes les β-lactamines, quelle que soit la valeur de CMI obtenue in vitro. Chromosomique [4] : résistance liée au chromosome. Il s agit ainsi d expliquer le déterminisme génétique d une résistance naturelle ou acquise dont le ou les gènes est ou sont lié (s) au chromosome. Aussi compte tenu de la localisation naturelle de ce ou ces gènes de résistance au chromosome, cette résistance est souvent propre à certaines espèces

6 Extrachromosomique [4] : la résistance est liée à l acquisition d un fragment d ADN porteur d un ou plusieurs gènes de résistance, le plus souvent en position cytoplasmique tel un ADN plasmidique identifié facilement après une électrophorèse sur gel suivie d une révélation avec un colorant fluorescent (cf. infra, plasmide). Le synonyme de cette résistance, qui est donc acquise, est plasmidique. Plasmidique [4] : le support génétique de la résistance est un ADN additionnel porteur d un ou plusieurs gènes de résistance, le plus souvent en position cytoplasmique, donc facilement détectable (cf. extrachromosomique). Le contenu plasmidique de souches bactériennes peut être inventorié par une électrophorèse sur gel d agarose (étape de séparation) puis révélation avec un colorant fluorescent se fixant sur l ADN (bromhydrate d éthidium) (Fig. 3). La taille des plasmides varie de 0,5 kilobase (kb) à 450 kb. Plus leur taille est importante, plus grand sera le nombre de gènes codant la résistance, par exemple, résistance à plusieurs familles d antibiotiques ou encore aux antiseptiques, etc. (cf. résistance associée). Figure 3. contenu plasmatique de souches d'escherichia coli (A à F) résistantes à plusieurs familles d antibiotiques telles que les β-lactamines, aminosides, tétracyclines, sulfamides, etc. En F, souche sans plasmide. En G, marqueurs de taille en acide désoxyribonucléique. La flèche blanche indique le sens de la migration des ADN sur le gel

7 Associée [4] : cette résistance est médiée par un plasmide codant la résistance à des antibiotiques de familles différentes (cf. résistance plasmidique). Transposable [4] : gène(s) de résistance localisé(s) sur un ADN «mobile» ayant une organisation particulière. Le transposon peut transposer d un plasmide à un chromosome ou vice versa. Cet ADN additionnel augmente la taille du génome, de l ordre de 4 à 30 kb (Fig. 4). Figure 4. Modèle de mobilisation de transposon (Tn) d un chromosome d une bactérie donatrice à gauche à un plasmide (acide désoxyribonucléique cytoplasmique). Après conjugaison (modèle le plus fréquent de transfert de gènes de résistance) du plasmide à la bactérie réceptrice B, il peut y avoir excision, et transposition du Tn, donc insertion sur le chromosome de cette bactérie. Génétique [7,8] : sa définition pourrait être : «modification du patrimoine génétique d une bactérie entraînant des augmentations limitées de CMI ( 4 à 8 fois), souvent peu apparente». De légères modifications du patrimoine génétique d une bactérie peuvent entraîner une moindre sensibilité à un antibiotique ou plusieurs de la même famille selon le mécanisme de résistance ; celles-ci sont révélées lors de la détermination de CMI (mg/l) ou par une - 7 -

8 diminution des diamètres d inhibition (mm) (antibiogramme par diffusion ou méthode des disques). L échec clinique n est pas obligatoirement connu lors de l émergence de telles souches de sensibilité diminuée. Cette situation a été celle de l émergence, dès 1983, des premières souches d entérobactéries telles Klebsiella pneumoniae ou Escherichia coli productrices de β-lactamases à spectre élargi (BLSE).Cette modification de la sensibilité d une espèce bactérienne a été prise récemment en compte dans la définition de la concentration épidémiologique (epidemiological cut-off) par l European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST) (Fig. 5). Figure 5. Escherichia coli : exemple de distribution des concentrations minimales inhibitrices (CMI) (mg/l) de la ciprofloxacine avec prise en compte de epidemiological cut-off value par l European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST) observations. Point critique clinique : S 0,5 mg/l. R > 1 mg/l. Inductible [4] : ce terme évoque l expression augmentée de la résistance en présence d un inducteur de type antibiotique. Il y a donc une diminution de l activité antibactérienne lors de l association de deux antibiotiques de la même famille dont l un est inducteur et l autre sensible à cette augmentation de l expression du mécanisme de résistance. La détection de la résistance inductible - 8 -

9 est simple par la méthode de diffusion avec la mise en évidence d un antagonisme (diminution d activité). La détection d un tel mécanisme entraîne, en pratique quotidienne, une interprétation pour les antibiotiques des familles des MLS. L effet régulé ou variable de l expression de la sensibilité vis-à-vis de certains antibiotiques d une même famille ou d une famille voisine a eu pour conséquences pratiques de rechercher à commercialiser des molécules non inductrices comme les macrolides à 16 atomes. La deuxième conséquence pratique est d éviter d associer deux antibiotiques de la même famille dont l une est inductrice et l autre sensible à l induction. Cette règle a été oubliée dans les années 1980 lors d association de type carbénicilline + céfoxitine pour le traitement d infections à bacilles à Gram négatif chez le neutropénique. En effet, diverses espèces telles Enterobacter cloacae, Enterobacter aerogenes, Citrobacter freundii présentent une résistance inductible à nombre de β-lactamines en présence de céfoxitine. Enfin, la troisième conséquence est liée à l éventualité d isoler, lors de traitement avec des antibiotiques appartenant à la même famille que celui qui est inducteur, un clone ou un variant présentant une dérégulation du mécanisme de résistance entraînant une hyperproduction de l enzyme inactivatrice (cf. résistance constitutive). Constitutive [5,9] : suite à une modification de l ADN codant un gène impliqué dans la résistance inductible (mutation, insertion d IS, etc.), il s agit alors d une expression augmentée de la résistance. La détection en pratique du phénotype MLSB constitutif est relativement facile. Un autre synonyme de cette résistance pourrait être déréprimée. Au plan expérimental, il est plus difficile de démontrer la modification d un gène (séquençage nécessaire) que de mesurer - 9 -

10 l activité enzymatique d une souche hyperproductrice. Un exemple de résistance constitutive est celui lié à l introduction, dans les années 1980, de céphalosporines stables aux pénicillinases de l époque (céphalosporines de 3 eme génération [C3G]). Dès les premiers traitements lors d infections à Enterobacter cloacae par exemple, avec une C3G telle la céfotaxime, ont été rapportés des échecs liés à la sélection de variantes devenus résistants par hyperproduction de leur céphalosporinase chromosomique de base (Fig. 6). Figure 6. Enterobacter cloacae. A. Phénotype «Céphalosporinase inductible». B. Phénotype «Hyperproducteur ou déréprimé» De bas niveau [4] : l individualisation de ce type de résistance, dont l expression est faible en termes de diamètre ou de CMI, s oppose à une expression plus importante du même mécanisme. Il y a une conséquence dans le choix thérapeutique de bien distinguer la résistance de bas niveau (naturelle) de celle de haut niveau (acquise). L exemple le plus caractéristique est celui des aminosides (gentamicine, par exemple) qui peuvent être associés, lors de résistance de bas niveau, avec un antibiotique d une autre famille telle β- lactamine ou glycopeptide, pour obtenir une synergie bactéricide. En pratique au laboratoire, la distinction entre ces deux types de résistance s effectue avec un

11 choix judicieux de concentrations d aminosides (par exemple, disques hautement chargés ou concentration plus élevée). III. Mécanismes biochimiques [4] Préciser le déterminisme biochimique de la résistance présente un intérêt avant tout scientifique mais aussi pratique. Car pour des cliniciens, il amène à comprendre la résistance croisée entre antibiotiques de la même famille. L intérêt scientifique permet d imaginer de nouvelles molécules plus actives, car échappant à l action de tel ou tel mécanisme. Ainsi le renouveau des β-lactamines dans les années 1980 (C3G et carbapénèmes) chez les bacilles à Gram négatif a été l obtention de molécules d hémisynthèse plus hydrophiles, donc ayant d une part une meilleure diffusion à travers les porines (canaux aqueux), d autre part une meilleure affinité pour leurs cibles, à savoir les protéines liant la pénicilline (PLP) (radioactive), leur synonyme étant penicillin binding protein (PBP). Le choix d une nouvelle β- lactamine pouvait aussi porter sur une moindre affinité pour les β-lactamases, donc une éventuelle plus grande stabilité à l inactivation enzymatique. La figure 7 est une représentation très schématique du mode d action d un antibiotique (exemple d une β-lactamine)

12 Figure 7. Représentation schématique du mode d action d un antibiotique (exemple d une bêtalactamine). me : membrane externe ; mc : membrane cytoplasmique. Le mode d action des antibiotiques comme celui des β-lactamines permet aussi une meilleure compréhension des mécanismes de résistance éventuels. Depuis quelques années, cinq mécanismes ont été individualisés pour expliquer la résistance naturelle et surtout acquise des bactéries aux antibiotiques (Fig. 8) : Imperméabilité ; Inactivation enzymatique ; Affinité diminuée ; Substitution de cible ; Efflux

13 Figure 8. Mécanismes biochimiques de la résistance bactérienne. me : membrane externe ; mc : membrane cytoplasmique. III.1. Interférence avec le mécanisme de transport de type imperméabilité Ce mécanisme est connu depuis très longtemps et explique pour partie la résistance naturelle de nombreux bacilles à Gram négatif aux antibiotiques hydrophobes comme les premières β-lactamines telles benzylpénicilline, méticilline, oxacilline, les macrolides (érythromycine) ou encore les glycopeptides (vancomycine) [10]. La résistance acquise par imperméabilité est aussi décrite en liaison avec le dysfonctionnement d une porine. Ce mécanisme de résistance a été par le passé difficile à distinguer de celui qui fut découvert plus tardivement et appelé efflux (cf. infra). Chez les bacilles à Gram négatif, son expression phénotypique est de niveau peu élevé, les CMI étant augmentées d un facteur 4-8 fois pour certains antibiotiques tels que β-lactamines, quinolones, triméthoprime, fosfomycine,

14 chloramphénicol ou encore tétracyclines (Fig. 9A, B). Il peut être associé à un autre mécanisme de résistance [11]. Figure 9. Expression phénotypique usuelle d une souche d Escherichia coli imperméable K : kanamycine ; GM : gentamicine ; TM : tobramycine ; NET : nétilmicine ; AN : amikacine ; NA : acide nalidixique ; PEF : péfloxacine ; CIP : ciprofloxacine ; TMP : triméthoprime ; SSS : sulfamides ; SXT : cotrimoxazole ; CS : colistine ; FOS : fosfomycine ; RA : rifampicine ; C : chloramphénicol ; FT : nitrofuranes. III.2. Inactivation ou détoxification enzymatique La résistance par destruction des molécules d antibiotiques soit à l extérieur de la bactérie (enzyme exocellulaire) soit dans la bactérie (enzyme endocellulaire ou périplasmique) est soit naturelle, soit plus fréquemment acquise et touche plusieurs familles d antibiotiques. Si l on examine la famille des β-lactamines, une étonnante diversité d enzymes dénommées β-lactamases est maintenant individualisée, au moins 350 ; ce qui montre la prédominance de ce mécanisme de résistance, en particulier dans la résistance acquise. Il est d ailleurs intéressant de constater depuis un peu plus d une décennie, au niveau mondial, une émergence continuelle de nouveaux types enzymatiques pour expliquer la résistance vis-àvis des C3G ou encore des carbapénèmes [12,13]

15 Ainsi, la résistance vis-à-vis des C3G apparue dans les années 1985 était en relation avec des pénicillinases mutées de type TEM ou sulfhydril-variable (SHV) et dénommées BLSE [14]. Plus de 150 enzymes modifiées sont à l heure actuelle identifiées dans le monde. Cependant, le mécanisme allait se compliquer avec l émergence de nouvelles BLSE aux dénominations le plus souvent exotiques comme brazilian extended spectrum (BES-1), guyana extended spectrum (GES-1), Pseudomonas extended résistance (PER-1), Serratia fonticola (SFO-1), Tlahuicas (TLA-1), tribu mexicaine, et enfin Vietnam extended spectrum (VEB-1). Cependant, le groupe émergent le plus important reste celui dénommé céfotaximase (CTX-M) [15, 16]. La résistance acquise aux carbapénèmes, imipénème par exemple, est plus récente. Quelques souches d Enterobacter productrices d enzymes inactivatrices ont été isolées dans les années 1985 avec l individualisation des types imi-1, sme-1, etc. [17, 18]. Plus récemment, de nouveaux types plasmidiques ont été rapportés, dénommés Klebsiella pneumoniae carbapenemases (KPC). Ces enzymes sont heureusement encore exceptionnelles, car isolées presque uniquement en Amérique du Nord [13]. Enfin, un exemple de cette complexité croissante des enzymes inactivatrices des β-lactamines est celui des souches d Acinetobacter baumannii pour lesquelles les β-lactamases produites appartiennent à la classe D, soit des oxacillinases (OXA) [19]. III.3. Modification d affinité de la cible La modification d affinité d une ou plusieurs cibles affecte plus les bactéries à Gram positif que celles à Gram négatif. L exemple le plus important concerne la résistance à la pénicilline G de Streptococcus pneumoniae. Si son

16 émergence fut longue, les premières souches résistantes en France ont été isolées dans les années 1985 [20]. Cette modification d affinité de la cible a pour effet d exiger une plus grande concentration de l antibiotique concerné, donc la CMI de l antibiotique sera supérieure [21, 22]. Si l exemple des β-lactamines chez le pneumocoque illustre bien ce type de résistance, d autres antibiotiques auraient pu être cités. III.4. Substitution de cible [5] Ce mécanisme a été individualisé depuis plusieurs décennies avec l exemple des sulfamides. Mais un exemple aussi contributif est celui de la résistance intrinsèque ou méticillinorésistance des staphylocoques, d autant que la cible additionnelle PLP2A identifiée dans les souches résistantes courtcircuite les autres PLP. La conséquence majeure au plan thérapeutique concerne la résistance croisée entre toutes les β-lactamines. III.5. Interférence avec le mécanisme de transport de type efflux La résistance non enzymatique liée à des modifications de protéines membranaires évoquant d une part un rôle éventuel des porines (imperméabilité) et d autre part d autres mécanismes de résistance est rapportée depuis plus de 15 ans [23, 24]. La résistance par systèmes d efflux, de découverte plus récente, apparaît être le principal mécanisme chez les bactéries à Gram négatif et divers gènes codent pour des protéines membranaires permettant l efflux de l antibiotique hors de la cellule et donc empêchant son accumulation intracellulaire. Ces protéines, de l ordre de kda, montrent des homologies structurales entre elles ainsi qu avec d autres protéines d efflux comme celles des systèmes multidrug resistance (MDR) [25, 26]

17 Les gènes chromosomiques codant des protéines membranaires de transport peuvent être responsables de la résistance à divers antibiotiques. Chez Escherichia coli, le système multiple antibiotic resistance (mar) est un système qui augmente le niveau de résistance à de nombreux antibiotiques dont les β- lactamines. Constitué de plusieurs gènes tels mara, marb, marrab, marc, etc. mara code un activateur transcriptionnel qui agit au niveau de plusieurs promoteurs, et dont la synthèse est réprimée en l absence d antibiotique par un répresseur, produit du gène marrab. La surexpression de MarA entraîne la diminution de l expression de la porine OmpF et la surexpression de la pompe à efflux AcrAB et la résistance à divers antibiotiques. Des mutants résistants aux β-lactamines dans d autres systèmes d efflux homologues au système AcrAB ont été décrits chez d autres entérobactéries qu Escherichia coli [6]. IV. Mécanismes génétiques [27, 28] Le déterminisme génétique de la résistance, qu elle soit naturelle ou acquise, est de mieux en mieux appréhendé grâce aux progrès des méthodes d analyses moléculaires incluant le clonage de gènes, l amplification génique (polymerase chain reaction [PCR]), le séquençage et plus récemment l amplification génomique. La résistance acquise d une bactérie offre un éventail très diversifié de solutions génétiques que celle-ci peut développer à l égard des antibiotiques. Parmi les définitions de la résistance proposées ci-dessus, plusieurs d entre elles sont d ailleurs en relation directe avec le déterminisme génétique comme les résistances chromosomique, extrachromosomique, plasmidique, transposable, inductible, constitutive ou déréprimée, etc

18 De manière un peu schématique, les mécanismes génétiques sont de deux types : modification d ADN chromosomique par mutation et transferts d ADN plasmidiques ou non, ces deux mécanismes pouvant survenir simultanément ou successivement. Ces deux grands types d événements peuvent survenir de manière très variée comme l illustrent les exemples suivants ou encore, schématiquement, la Figure 10. Figure 10. Destins possibles d un gène de résistance aux antibiotiques. tra : transférable. Il peut s agir d un gène de résistance en position chromosomique spécifique d espèce et responsable de la résistance naturelle à plusieurs antibiotiques de la même famille, par exemple les pénicillines telles l ampicilline, l amoxicilline et la ticarcilline. Ce gène peut se transposer sur un

19 ADN cytoplasmique de type plasmide multicopie qui va alors générer une plus grande quantité d enzyme, donc un niveau de résistance beaucoup plus important incluant maintenant la pipéracilline, les céphalosporines de première et de deuxième génération (C1G, C2G). Le gène transposé sur un plasmide conjugatif, dit «tra+» pour transférable, peut alors diffuser dans d autres bactéries, jusque-là naturellement sensibles à ces antibiotiques. Cependant, dans des conditions de survie difficiles liées à une pression antibiotique à la suite d un traitement, certaines bactéries transposent du chromosome au plasmide, en amont du gène de résistance, une séquence d insertion IS. La conséquence est une production d enzyme très augmentée. Un autre événement génétique, banal en apparence, permet à la bactérie de surmonter le dernier traitement à base de C3G. Le gène de résistance peut muter, c est-à-dire qu à la faveur du renouvellement de l ADN (réplication), un changement minimal d une base va entraîner dans l enzyme le codage d un nouvel acide aminé. Cette mutation dite «ponctuelle» va modifier la structure tertiaire de l enzyme et donc lui donner, peut-être, beaucoup plus d affinité pour la C3G (Km [constante de Michaelis] diminuée) et donc permettre de l inactiver. D une pénicillinase spécifique d espèce, la bactérie, en quelques événements génétiques de fréquence faible, de l ordre du millionième pour chacun d entre eux, a donné la possibilité à d autres bactéries de parenté proche de survivre à une attaque par C3G. Si le dernier recours reste les carbapénèmes telle l imipénème, la grande question que l on peut se poser est la suivante : existe-t-il une mutation ponctuelle permettant à l enzyme codée d inactiver l imipénème? C est une probabilité possible ; elle peut être appréciée soit in vitro au laboratoire par sélection de mutants, soit en clinique avec l émergence de souches résistantes

20 Le scénario précédent pourrait s appliquer en pratique à la β-lactamase chromosomique de l espèce Klebsiella pneumoniae dénommée SHV-1 ou encore, comme démontré beaucoup plus récemment, chez une autre entérobactérie de l environnement, d isolement rare en pratique médicale, Kluyvera ascorbata, progéniteur probable des β-lactamases du groupe CTX M. Le terme CTX-M désigne une plus grande activité de ces enzymes vis-à-vis du céfotaxime (C3G) que de la ceftazidime (autre C3G). Elles peuvent ensuite évoluer par mutation et donc acquérir la résistance vis-à-vis de cette dernière C3G. Si nos connaissances au plan génétique ont fantastiquement progressé au cours de la dernière décennie, l usage de plus en plus répandu des techniques d analyse moléculaire au plan mondial permet de nouvelles découvertes, expliquant partiellement la diffusion de nouveaux gènes de résistance. L acquisition d éventuels gènes de résistance s effectue donc, le plus souvent par conjugaison ou sexualité bactérienne, par simple contact entre deux bactéries pouvant être d espèces différentes. Ces gènes de résistance sont portés sur diverses structures génétiques de type plasmide, intégron avec un ou plusieurs gènes cassettes. Les analyses comparatives de séquences ont conduit à la découverte récente de nouvelles structures génétiques avec les common region (CR) et leurs probables recombinases. En conclusion, les bactéries, en particulier commensales, constituent d importantes populations, de l ordre de 10 8 à individus par millilitre ou gramme dans lesquelles peuvent préexisté des variantes moins sensibles ; aussi la pression de sélection d un antibiotique actif peut favoriser leur émergence, d où de constante évolution probable

21 V. Évolution [4] Les déterminismes biochimiques et surtout génétique de la résistance bactérienne amènent à un constat pessimiste en raison de cet extraordinaire potentiel d adaptation dont disposent les bactéries. La résistance bactérienne est donc une fatalité mais d importance variable selon le pays, l espèce bactérienne et l antibiotique, fonction de son succès, donc de son utilisation. Nous illustrons d abord cette constante évolution à l aide d exemples puisés à partir de la principale famille d antibiotiques, les β-lactamines (Fig.11). La résistance bactérienne acquise présente certaines caractéristiques en termes d évolution. Figure 11. Évolution de la résistance aux bêtalactamines entre 1940 et TRI/IRT : résistant aux inhibiteurs/inhibitor TEM resistant ; OXA : oxacillinases ; Case : carbapénémase ; Pase : pénicillinase ; Méti-R : méticillinorésistant

22 V.1. Émergence rapide Dès la découverte d un nouvel antibiotique, il a été constaté l isolement d espèces bactériennes naturellement résistantes à celui-ci. Ainsi avant les premiers essais cliniques de la pénicilline G, il a été découvert la résistance naturelle des entérobactéries dont Escherichia coli lors de la production industrielle de cet antibiotique. Plus de 40 ans après, lors de la découverte de l imipénème, des espèces naturellement résistantes à ce dernier antibiotique ont été identifiées telles Stenotrophomonas maltophilia, Burkholderia cepacia, Chryseobacterium meningosepticum, etc. Les premières souches d entérobactéries résistantes à l ampicilline, première pénicilline à large spectre introduite en Europe en 1963 et productrices de TEM, émergent en 1964 en Grèce (Fig. 11). La première C3G a été introduite en 1980, les premiers échecs de traitement par hyperproduction de céphalosporinase (HP case) sont observés dès les premiers essais cliniques ; puis les premières souches de Klebsiella pneumoniae productrices de BLSE [9, 14, 29]. Cette émergence rapide de la résistance acquise en clinique est initialement limitée à quelques espèces bactériennes [30]. V.2. Fréquence du mécanisme émergent rapidement en augmentation [31] La prévalence des souches d Escherichia coli résistantes aux pénicillines à large spectre est maintenant de 50 %. Cependant, si la prévalence peut rapidement augmenter après l émergence des premières souches, celle-ci peut heureusement régresser très significativement lorsque le nouveau mécanisme de résistance est bien détecté au laboratoire comme celui de la production de BLSE chez les entérobactéries et

23 la mise en œuvre de mesures spécifiques. Nous analyserons ultérieurement ces mesures qui peuvent être prises dans un souci de nette diminution de la fréquence de résistance. V.3. Résistance diffusible, car transférable [4] Une des explications de cette prévalence de résistance augmentant inexorablement est liée soit au déterminisme génétique de celle-ci, soit aux aptitudes de la bactérie en cause. Dans le premier cas, il s agit de gènes facilement transférables comme ceux intégrés dans un plasmide, un transposon, voire un intégron. La résistance est alors détectée dans diverses espèces bactériennes, cela dans de nombreux pays. L exemple le plus probant reste la diffusion épidémique du gène codant la β-lactamase TEM. V.4. Évolution possible d un gène de résistance Diverses observations illustrent le potentiel évolutif d un gène de résistance bactérien avec, comme exemple, la découverte dans les années 1985 des BLSE [7, 8] et, quelques années après, celles dénommées TEM résistant aux inhibiteurs (TRI) ou encore inhibitor TEM resistant (IRT) [32], résultats de mutations dans des positions différentes du gène codant l enzyme précédemment citée, TEM-1 ou TEM-2 (Fig. 12). Figure 12. Deux exemples d évolution par mutation chez la β-lactamase TEM. BLSE; TRI/IRT : TEM résistant

24 Ainsi, selon les besoins d évolution de la bactérie pour sa survie, un même gène peut, selon les conditions environnementales, évoluer dans deux sens opposés. D une part, il peut y avoir l évolution vers une plus grande résistance aux β-lactamines dont les C3G ; dans ce cas, les mutations ont été observées toujours dans les mêmes positions du gène codant, à savoir 104, 164, 237 et/ou 238 [14, 29]. L effet de cette ou de ces substitutions en acides aminés est une meilleure affinité (Km diminuée) pour les β-lactamines. À l inverse, la β-lactamase TEM peut évoluer par mutation du gène dans les positions 69 et 244 ou d autres, identifiées par la suite, vers une plus grande sensibilité à certaines β-lactamines sans conséquences thérapeutiques notables. Cette substitution d acide(s) aminé(s) a pour effet d obtenir une enzyme modifiée avec un Km augmenté (μm), donc ayant une moindre affinité pour les β-lactamines, dont l acide clavulanique. Cette diminution d affinité a comme conséquence une plus grande concentration de l inhibiteur pour obtenir le même effet. Cette résistance aux inhibiteurs définit les enzymes TRI ou IRT [33]. L obtention de mutants mixtes, BLSE et TRI, est possible mais rare. On parle d enzymes CMT pour complexe mutant TEM [34]. Cette évolution d un gène de résistance n est pas seulement liée au gène de structure mais elle peut être en relation avec une mutation dans le système de régulation (dérépression ou hyperproduction) en relation vers une plus grande résistance comme celle vis-à-vis des C3G (ceftazidime) est aussi observée chez les bacilles à Gram négatif naturellement producteurs d une case tels qu Enterobacter cloacae, Enterobacter aerogenes, Pseudomonas aeruginosa [8]

25 La résistance acquise peut être, donc, extrêmement modulable. Une telle souplesse permet au monde bactérien une adaptation possible aux thérapeutiques, même les plus récentes. V.5. Évolution de la résistance aux C3G (nouvelles β-lactamases à spectre élargi) Parmi les autres exemples de résistance enzymatique aux C3G chez les entérobactéries prédomine au plan mondial un groupe d enzymes dénommé CTX-M (pour céfotaximase) qui conférait, à l origine, un plus haut niveau de résistance au céfotaxime (ou ceftriaxone), céfépime et aztréonam qu à la ceftazidime [12, 15, 16]. Certaines d entre elles ont, plus récemment, évolué par mutation (ponctuelle ou non) générant un haut niveau de résistance à la ceftazidime telles que les enzymes CTX-M-15, CTX-M-16, CTX-M-19, CTX- M-23 ou encore très récemment CTX-M-32 dérivant par simple mutation (Asp240Gly) de CTXM- 1. Ce groupe d enzymes rencontré chez diverses espèces de bacilles à Gram négatif telles qu entérobactéries (Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis, Salmonella enterica, Shigella flexneri, etc.) ou autres (Vibrio cholerae) est maintenant très largement répandu dans le monde. La phylogénie de ces nouvelles BLSE montre actuellement un regroupement au sein de cinq branches. Les analyses génétiques ont montré que les gènes progéniteurs appartiennent au genre Kluyvera, entérobactéries d isolement très rare en bactériologie médicale [16, 27]. Ainsi le phylum CTX-M-2 dérive de la β-lactamase naturelle de Kluyvera ascorbata alors que le phylum CTX-M-8 vient de Kluyvera georgiana. L environnement génétique de plusieurs CTX-M a permis de découvrir l existence de structures génétiques

26 inconnues comme la séquence d insertion ISEcp1 apportant un promoteur ou encore l IS513. Si le mécanisme exact de la mobilisation de ces gènes est encore mal précisé, il reste la question essentielle du lieu de capture de ces gènes : environnement hydrique, tellurique, alimentaire, voire agronomique, etc. D autres BLSE caractérisées par un haut niveau de résistance à la ceftazidime et parfois à l aztréonam plutôt qu au céfotaxime ont une distribution moins large que le groupe CTX-M [4, 17,35]. Dans ce groupe sont individualisées BES-1, GES- 1, PER-1, SFO-1, TLA-1, et enfin VEB-1. Des enzymes proches de GES-1 ont été découvertes en Grèce, malheureusement dénommées à tort integron borne cephalosporinase (IBC-1, IBC-2) [36]. L existence, pour ces nouvelles enzymes, de localisation géographique préférentielle rend compte d une distribution géographique différente. Ainsi l enzyme VEB-1 est très répandue dans le Sud-Est asiatique, PER-1 est prépondérante en Turquie alors que PER-2 n a été décrite qu en Argentine [16]. Enfin TLA-1 n a été observée qu au Mexique. Néanmoins, elles peuvent être observées en France comme PER-1, GES-1 et même sous une forme épidémique comme récemment VEB-1 chez Acinetobacter baumannii [37]. La β-lactamase plasmidique SFO-1 n a été identifiée qu une seule fois dans une souche d Enterobacter cloacae au Japon. Elle présente la particularité d avoir pour progéniteur une entérobactérie d isolement rare en bactériologie médicale, l espèce Serratia fonticola. Enfin, les gènes correspondant à ces BLSE sont le plus souvent retrouvés dans des structures de type intégron comme gènes cassettes (VEB-1, IBC-1, GES-1, GES-3) et donc sous la dépendance de promoteurs situés à l extrémité 3' du gène de l intégrase

27 V.5.1. Résistance acquise aux C3G, aux céfamycines et aux inhibiteurs enzymatiques (classe C) par acquisition d une céphalosporinase plasmidique : Ce n est que vers 1988 que sont apparues aux États-Unis et en Europe les premières souches cliniques de Klebsiella (Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca) montrant un phénotype de résistance de type céphalosporinase alors qu elles n en produisent pas naturellement [38-39]. La découverte de «céphalosporinases plasmidiques» originaires d entérobactéries, productrices naturelles, indiquait une nouvelle et importante étape de la résistance acquise aux antibiotiques (C3G en particulier) par mobilisation de gènes chromosomiques. Cette émergence d un mécanisme de résistance tout à fait inédit et important allait s amplifier et être démontrée chez diverses espèces d entérobactéries : Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Salmonella enterica, Proteus mirabilis, Escherichia coli, Enterobacter cloacae, Enterobacter aerogenes, Shigella, etc. De très nombreuses publications confirment cette émergence dans de nombreux pays avec la prédominance d un ou deux types dont CMY-2, et même chez l animal. Les perspectives sont inquiétantes, liées à l isolement de Salmonella productrices de case, en particulier, d origine animale [40]. Le phénotype de résistance observé est similaire à celui d une céphalosporinase chromosomique hyperproduite avec, généralement, une résistance aux C3G, une sensibilité au mécillinam, aux «C4G» (céfépime, cefpirome) et à l imipénème et enfin une résistance aux associations avec l acide clavulanique

28 La majorité des souches productrices est résistante à la céfoxitine, à l exception de celles productrices de l enzyme ACC-1 [39]. Si ces enzymes en position chromosomique sont inductibles, caractère aisément détecté dans l antibiogramme par diffusion par un antagonisme entre une β-lactamine inductrice (imipénème) et une C3G, les enzymes plasmidiques sont, le plus souvent, non inductibles, à l exception d ACT-1, de DHA-1 et de CFE-1. Par séquençage, il a été démontré la présence d un gène régulateur ampr en amont du gène de structure, ampc. L interprétation de l antibiogramme pour ce mécanisme de résistance est identique à celle de l hyperproduction chromosomique. Ce nouvel aspect de la résistance acquise aux C3G a eu, pour première conséquence, de clairement démontrer la possible mobilisation de gènes chromosomiques au sein du monde bactérien. Ainsi pour plusieurs de ces enzymes transférables, les progéniteurs ont été identifiés : groupe CMY (Citrobacter freundii), DHA-1 (Morganella morganii), groupe FOX (Aeromonas caviae), ACT-1 (Enterobacter asburiae) et ACC-1 (Hafnia alvei). Cette dernière céphalosporinase présente la particularité d être inhibée par la céfoxitine, donc la souche productrice apparaît sensible à cette β-lactamine. L étude de l environnement génétique de ces gènes a démontré que la mobilisation de ces gènes faisait intervenir des séquences d insertion déjà évoquées pour certaines BLSE telles ISEcp1, orf513 ou encore des IS de type IS de transposon composite [28]. Si le mécanisme exact de la mobilisation de ces gènes est encore mal précisé, il reste la question majeure du ou des lieux de telle mobilisation de gènes. L environnement hydrique peut être évoqué ; en effet, l agriculture et l aquaculture a utilisé, ou utilise les antibiotiques. Que savons

29 nous de la consommation d antibiotiques en horticulture, par exemple, pour le traitement du feu bactérien ou encore dans l alimentation, etc.? V.5.2. Résistance acquise aux C4G (cases chromosomiques à spectre élargi) La résistance chromosomique acquise aux C3G liée à l hyperproduction de la case (mutation du gène régulateur ampd) s individualise par une résistance à diverses β-lactamines dont la ticarcilline, la pipéracilline, les céfamycines, les C3G ou encore l aztréonam mais quelques β-lactamines restent épargnées telles mécillinam, C4G (céfépime, cefpirome) et carbapénèmes (imipénème). Cependant a émergé, depuis peu en clinique, la résistance acquise aux C4G, en particulier en France [41, 42]. Les rares souches cliniques isolées (Enterobacter cloacae, Enterobacter aerogenes, Serratia marcescens) sont souvent hyperproductrices de leur céphalosporinase chromosomique, par ailleurs modifiée soit par mutation ponctuelle (par exemple L-293-P), soit par délétion de plusieurs bases (9 à 12) au niveau de la région codante de la case, dite alpha 10. Des mutants ponctuels in vitro ont déjà été rapportés et étaient liés à des substitutions d acides aminés dans la même région du gène ampc. Ces deux types de modification génique diminuent le Km de l enzyme qui a pour effet d augmenter le rapport k (cat)/k(m) vis-à-vis par exemple du céfépime. Il y a donc une résistance additionnelle aux C4G (céfépime, cefpirome). V.5.3. Résistance aux carbapénèmes Commercialisés depuis plus de 15 ans, l imipénème ou encore le méropénème restent toujours des molécules très actives, donc apparaissent souvent, pour le clinicien, le dernier recours thérapeutique. Cependant, quelques signes d inquiétude pointent, suite à la découverte d enzymes nouvelles,

30 majoritairement transférables, dénommées IMP, VIM, SPM, GIM, KPC, GES, OXA, etc. chez des bactéries opportunistes comme Pseudomonas aeruginosa et Acinetobacter baumannii mais beaucoup plus rarement chez des entérobactéries en France [13,17, 18, 19]. Les métallobêtalactamases (classe B) sont d isolement rare chez les entérobactéries en France. Ces enzymes ont été rapportées en particulier sur des souches de Pseudomonas aeruginosa. Deux mécanismes «anciens», au moins, sont déjà connus. L un combine l hyperproduction d une céphalosporinase à celle de la perte d une porine comme déjà décrit dans les années 1980 chez Enterobacter cloacae ou Enterobacter aerogenes [43]. Ce type d association est maintenant observé lors de production d une case plasmidique chez Klebsiella pneumoniae, Salmonella enterica, etc. [44,45]. d L autre mécanisme de résistance, connu depuis les années 1980, se caractérise par un haut niveau de résistance à l aztréonam et une sensibilité presque normale aux C3G. Il s agit de la production d une carbapénémase en position chromosomique de classe A (NMC-A, Sme-1, Sme-2, IMI-1, IMI-2). Ces enzymes sont restées heureusement marginales. La dernière évolution identifiée depuis peu est beaucoup plus inquiétante, car elle est liée à la découverte de carbapénémases plasmidiques, majoritairement de type KPC. Ces enzymes sont heureusement encore exceptionnelles, car isolées presque uniquement en Amérique du Nord [13]. Néanmoins, un cas vient d être identifié en France [46]. Phénotypiquement, KPC-1, KPC-2, KPC-3 confèrent un haut niveau de résistance aux C3G contrairement aux carbapénémases chromosomiques ayant une sensibilité presque normale aux C3G (NMC-A, Sme-1, Sme-2 et IMI-1). De

31 plus, pour le groupe KPC, la résistance est croisée entre carbapénèmes (imipénème, méropénème, ertapénème, doripénème). Identifiées chez diverses entérobactéries telles Klebsiella pneumoniae, Salmonella enterica, Escherichia coli, Klebsiella oxytoca, et causes d épidémies hospitalières, les gènes KPC sont, au moins, plasmidiques et se transmettent facilement par conjugaison. Les gènes cassettes codant les BLSE de type GES-1, voire GES- 3 peuvent, par mutation, acquérir une activité carbapénémase, voire céphamycinase ; il s agit au moins de GES-4, récemment identifié au Japon et en Grèce [36]. V.6. Association de mécanismes La dernière évolution notable de la résistance acquise aux β-lactamines au sein des bacilles à Gram négatif concerne l isolement de souches multirésistantes présentant une accumulation de mécanismes de résistance. À titre d exemple, chez diverses entérobactéries, l association d une céphalosporinase et d une imperméabilité au niveau d une porine et/ou associée à un efflux génère la résistance à de nombreuses β-lactamines (spectre de la céphalosporinase) à laquelle s ajoute celle aux carbapénèmes dont l imipénème. La β-lactamase AmpC ou céphalosporinase peut être chromosomique, en général hyperproduite (Enterobacter cloacae, Enterobacter aerogenes, etc.), ou plasmidique [43,45]. Il n est pas rare, maintenant, d isoler des souches de Klebsiella pneumoniae, productrices de trois, voire de quatre β-lactamases [35,46]. À l heure actuelle, un constat préoccupant sur la résistance acquise aux C3G chez Salmonella doit être dressé, aussi bien pour des souches d origine humaine qu animale. Ainsi ont été identifiées diverses enzymes de type CTX-M dans divers sérovars dans de nombreux pays,

32 dont de nombreux continents. Le constat est tout aussi préoccupant pour les souches de Salmonella productrices de diverses cases transférables telles CMY-2, CMY-4, ACC-1, ou encore DHA-1. Récemment a été rapportée en France une épidémie de toxi-infection alimentaire collective (TIAC) de 14 cas liée à la consommation d une viande de cheval importée et contaminée mais d origine inconnue [40]. En conclusion, il apparaît urgent de mettre en oeuvre une surveillance beaucoup plus étroite de ce groupe bactérien. Cependant, la détection de ces enzymes exige une implication beaucoup plus grande des autorités en moyens et en matériel ; la difficulté sera, quelque fois, l association de plusieurs mécanismes de résistance enzymatique comme CMY-7 + SHV-9 (61) ou encore SHV-2a + CMY-4 + CTX-M-3. V.7. Évolution globale [4] Les diverses évolutions évoquées ci-dessus ont amené les divers acteurs de la santé, il y a plusieurs années, à tenter de diminuer cette inexorable augmentation de la résistance, en particulier initialement en Amérique du Nord. Un autre élément capital de cette réflexion était l absence de découverte, donc d éventuelle commercialisation de nouveaux antibiotiques. Si l on n y avait pas pris garde, nous nous serions retrouvés avant l ère des antibiotiques. Au plan européen, l European Antimicrobial Resistance Surveillance System (EARSS) rassemble 45 pays européens et fournit des informations sur un nombre limité d espèces. Il est à prévoir que dans quelques années, les bases de données seront beaucoup plus conséquentes. Bien évidemment, au plan international, se mettent en place divers réseaux comme au Center for Diseases Control (CDC) aux États-Unis avec, en

33 particulier, le National Antimicrobial Resistance Monitoring System (NARMS) créé dès 1996 en collaboration avec la Food and Drug Administration. Celui-ci surveille, en particulier, la sensibilité des entérobactéries d origine humaine et animale. D autres initiatives concourent à cette prise de conscience à destination du corps médical (recommandations) ou encore du grand public (bonne prescription). Voici Un exemple de surveillance de la résistance au sein des hôpitaux de l Assistance publique de Paris est celui de la fréquence d isolement de souches productrices de BLSE au sein des entérobactéries (Fig. 13). Figure 13. Évolution du pourcentage d entérobactéries productricesde β-lactamases à spectre élargi (BLSE) entre 1995 et 2003 au sein des hôpitaux de l Assistance publique-hôpitaux de Paris. VI. Conclusion À partir des années 1945, les antibiotiques ont révolutionné nos pratiques médicales, mais ils sont aujourd hui en danger, suite à une utilisation excessive et trop fréquente, même en dehors du domaine purement médical. Quel que soit

34 le type de résistance examiné, il est à noter que la résistance bactérienne est une fatalité à plus ou moins long terme en raison de l étonnant arsenal génétique que les bactéries sont en mesure d opposer à nos thérapeutiques. L exemple des β- lactamines, principale famille d antibiotiques, en est une parfaite illustration, en particulier chez les bactéries à Gram négatif comme les entérobactéries. Comme la découverte et la commercialisation de nouveaux antibiotiques devenaient de plus en plus aléatoires, une prise de conscience du milieu médical, relayé par les pouvoirs publics, a tenté et tente de juguler cette émergence continuelle de bactéries résistantes. Il convient donc de mettre en œuvre, au plan planétaire, diverses stratégies ou mesures correctrices telle celle du bon usage des antibiotiques et pas seulement à l hôpital avec son référent «antibiotique». Parmi les autres mesures, il convient de sensibiliser le malade lui-même ou son entourage sur le non-intérêt de leur prescription devant certains types d infection ; d autant que la surveillance comparative de la consommation d antibiotiques entre pays peut convaincre les sceptiques, etc. Enfin, la mise en place d observatoire de la résistance permettra de mieux évaluer l intérêt de certaines mesures comme la détection des bactéries multirésistantes (BMR), suivie de marquage et de mesures d isolement. Restreindre leur usage dans d autres domaines apparaît d autant plus évident que nous connaissons mal les conséquences en termes de sélection de pression dans d autres écosystèmes comme ceux de l agriculture dont l harboriculture, l aquaculture, par exemple

35 Principes de mesure de la sensibilité aux antibiotiques L'activité des antibiotiques sur les bactéries rencontrées en pathologie est évaluée in vitro. L'effet bactériostatique est étudié par la détermination de la CMI. Les méthodes de référence sont des méthodes de dilution en gélose ou en milieu liquide. En pratique courante, la sensibilité aux antibiotiques est étudiée par des méthodes de diffusion en milieu solide comme l'antibiogramme ou par des techniques automatisées. La concentration minimale bactéricide (CMB) rend compte de l'effet bactéricide des antibiotiques. Il est cependant préférable d'étudier la bactéricidie de manière cinétique en fonction du temps [48]. I. Définition concentration minimale inhibitrice (CMI) C'est le test le plus utilisé pour évaluer in vitro l activité d un antibiotique sur une bactérie. La CMI est la plus faible concentration d'antibiotique capable d'inhiber toute croissance visible de la souche bactérienne étudiée (bactériostase) exprimée en mg/l ou μg/ml [49]. II. Méthodes de mesure : II.1. Dilution en milieu solide (méthode de dilution en gélose) C'est la méthode de référence en France (CA-SFM Comité de l'antibiogramme de la Société française de Microbiologie). Elle consiste à incorporer des quantités croissantes de l'antibiotique dans la gélose coulée en boîte de Pétri, réalisant une gamme de concentrations en progression géométrique de raison 2. Les souches bactériennes sont ensemencées en strie ou en spot (en «tache») à l'aide d'un ensemenceur multiple de type Steers (inoculum de 104 bactéries par spot) [48]. La lecture se fait à 18 et 24 heures

36 II.2. Dilution en milieu liquide C'est la méthode de référence du NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standards), à côté de la méthode de dilution en gélose. La gamme de concentrations d'antibiotiques est réalisée en bouillons nutritifs ensemencés avec la souche à tester. La CMI correspond au tube dans lequel il n'y a pas de croissance visible. Cette méthode peut être automatisée en utilisant des plaques de microtitration (micro dilution en milieu liquide). Des souches de contrôle doivent être incluses dans toute étude de CMI. La méthode de dilution fournit une bonne appréciation de l'activité d'un produit, mais elle est relativement imprécise [49]. II.3. Diffusion en milieu solide : E-test Le E-test est une technique d'étude de la sensibilité des bactéries par diffusion en gélose, donnant une lecture directe de la CMI [49]. Le principe de la technique repose sur l'utilisation d'une bandelette imprégnée avec un gradient de concentrations d'antibiotique. Elle est déposée sur une gélose préalablement ensemencée avec la souche bactérienne, selon des recommandations précises indiquées par le fournisseur (AB BIODISK). Après heures d'incubation, il se forme une zone d'inhibition de croissance bactérienne en forme d'ellipse autour de la bandelette. La CMI est lue à l'intersection entre l'ellipse et la bandelette. Cette technique permet de fournir des résultats de CMI en général bien corrélés avec les techniques de référence. Elle ne remplace cependant pas ces

37 techniques et son coût élevé en limite l'utilisation. D'autre part, des variations importantes peuvent être observées selon la composition des milieux utilisés [50]. II.4. Antibiogramme par diffusion en gélose (méthode des disques) Les méthodes de dilution ne sont pas réalisées en pratique courante sur toutes les souches isolées au laboratoire, plusieurs antibiotiques devant être testés. C'est la méthode de diffusion en gélose qui est couramment utilisée, son principe étant la détermination indirecte de la CMI [48]. Des disques de papier buvard imprégné d'une quantité définie d'antibiotique sont déposés à la surface d'un milieu gélosé préalablement ensemencée avec le germe à étudier. À partir du disque, l'antibiotique diffuse dans la gélose, y créant un gradient de concentrations. Après incubation (18-24 h à 37 C), chaque disque est entouré d'une zone d'inhibition de la croissance bactérienne : la culture s'arrête là où dans la gélose la concentration d'antibiotique est égale à la CMI de la souche bactérienne étudiée. L'antibiogramme est une méthode simple, fiable et reproductible mais sensible à certains facteurs : milieu de culture : standardisé : Mueller-Hinton, épaisseur 4 mm, pour les bactéries à croissance rapide sur milieux usuels ; inoculum bactérien : standardisé : bactéries par ml ; conservation des disques (+ 4 C) [19]. Interprétation des résultats : catégorisation des souches en S, I, R

38 La CMI est une caractéristique de la souche étudiée. Elle permet, par comparaison aux concentrations critiques fixées annuellement pour chaque antibiotique et espèce bactérienne, et classer la souche dans une des trois catégories : sensible, intermédiaire ou résistante [49]. Les concentrations critiques sont des bornes supérieures et inférieures de sensibilité ou de résistance fixées en fonction des caractères bactériologiques, pharmacocinétiques et des confrontations des données in vitro aux données cliniques [48]. La CMI est estimée à partir de la mesure du diamètre d'inhibition par une relation établie au préalable sur un grand nombre de souches (courbe de concordance). Celle-ci permet de calculer des diamètres discriminants (critiques) correspondant aux CMI critiques. Le classement sensible/intermédiaire/résistant de la bactérie est calculé par rapport à des valeurs préétablies soit de diamètres d'inhibition (D, d), soit de concentrations d'antibiotiques ou concentrations critiques (C, c). Une souche est catégorisée comme sensible à un antibiotique lorsque la CMI de l'antibiotique considéré est inférieure ou égale à la concentration critique inférieure (c) pour cet antibiotique. Il y a alors une forte probabilité de succès thérapeutique dans le cas d'un traitement systémique à dose recommandée. La souche est résistante si la CMI de l'antibiotique est supérieure à la concentration critique supérieure (C). Il y a alors une forte probabilité d'échec thérapeutique avec cet antibiotique

39 La souche est intermédiaire quand la CMI de l'antibiotique est comprise entre c et C, le succès thérapeutique étant alors imprévisible [48]. La lecture interprétative de l antibiogramme permet : De détecter les anomalies d'un phénotype et de les prendre en considération ; La prédiction de la valeur d'autres antibiotiques ou au contraire les antibiotiques qui ne pourront avoir de meilleure activité ; La suppression des fausses sensibilités qui en réalité, sous l'influence des mécanismes de résistance impliqués et interférant ne peuvent être valablement retenus pour actifs dans le cadre d'une antibiothérapie. Accessoirement, cette lecture interprétative de l antibiogramme est un pas dans la surveillance des résistances [51,52]

40 Problème de la résistance en milieu hospitalier Pendant longtemps le problème de la résistance était considéré comme strictement hospitalier réservé aux bactéries responsables d infections nosocomiales, parce que l hôpital constitue un environnement propice au développement et à la dissémination des résistances bactériennes. L émergence et la fréquence croissante à l hôpital de bactéries multi résistances aux antibiotiques ont été favorisés par un certains nombres de facteurs : -Une augmentation du nombre de patients à risque infectieux élevé du fait des procédures invasives et des traitements immunosuppresseurs. -L utilisation massive des antibiotiques favorisant la sélection des bactéries les plus résistantes. -La transmission croisée par l intermédiaire du personnel soignant permettant la dissémination des bactéries multi résistantes. La recrudescence des bactéries mulirésistantes en milieu hospitalier est un phénomène mondial observé pour toutes les espèces bactériennes mais à des degrés variables selon les pays et les services en fonction des habitudes de prescription et des pratiques d hygiène. Le développement et la fréquence des bactéries résistantes parmi les espèces communément responsables d infections nosocomiales ont eu pour conséquence une consommation accrue de certains antibiotiques, plus précisément les molécules les plus récentes comme les nouvelles β-lactamines, les glycopepetides, et les Fluoroquinolones entraînant ainsi une escalade de résistances [1]

41 Deuxième partie : Les Bêta-lactamines

42 I. Introduction : Les β-lactamines sont les antibiotiques les plus prescrits en médecine générale. Leur spectre d activité et leur diffusion sont très variables. Ce sont souvent des molécules à spectre très large dont l utilisation doit être réfléchie afin de respecter l écologie bactérienne et d éviter, ou tout au moins de limiter, la sélection de bactéries résistantes. Famille d antibiotiques majeure, elle regroupe les pénicillines, les inhibiteurs de β-lactamases (IBL), les carbapénèmes, les monobactames, Les céphalosporines. Ces différents groupes se caractérisent par : Une structure de base commune : le noyau β-lactame Un mode d action commun : lyse bactérienne par inhibition de la synthèse du protéoglycane par fixation sur les protéines de liaison des pénicillines (PLP) au niveau de la membrane cytoplasmique Des mécanismes de résistance bactérienne secondaires à ce mode d action : production d enzymes d inactivation appelées β-lactamases, diminution de la perméabilité de la paroi bactérienne, modification des protéines de liaison des pénicillines, efflux [53]

43 II. Classification : La majorité des β-lactamines, sont classées en fonction de la nature du noyau entrant dans leur structure de base (Tableaux I Aet IIA) [54]. Tableau IA. Classification des β-lactamines (pénames, carbapénèmes et oxapénames)

44 Tableau IIA. Classification des β-lactamines (céphèmes et oxacéphèmes, monobactames). La structure du noyau de base, qui comporte toujours le cycle b-lactame, permet de répartir ces produits en trois grands groupes (Fig.14, 15) : les dérivés

45 de l acide 6-amino-pénicillanique, les dérivés de l acide 7-aminocéphalosporanique et les monobactames. Cycle commun β-lactame (B) Dérivés de l'acide 6-amino-pénicillanique Cycle β-lactame (B) + cycle thiazolidine (A) Pénames (pénicillines) - Pénicillines G et V sensibles aux pénicillinases - Pénicillines antistaphylococciques résistantes aux pénicillinases : pénicillines M semi-synthétiques - Pénicillines à large spectre (ampicilline et apparentés) et pénicillines actives sur Pseudomonas aeruginosa (carboxypénicillines et uréidopénicillines) - Amidinopénicillines (pivmécillinam) - Pénicillines sulfones (sulbactam et tazobactam) Carbapénèmes Clavames ou oxapénames - Acide clavulanique Figure 14. Classification des β-lactamines : dérivés de l acide 6-amino-pénicillanique

46 Dérivés de l'acide 7-aminocéphalosporanique Cycle β-lactame B + cycle dihydrothiazine C (noyau céphème) Céphalosporines Céphamycines Céfoxitine, céfotétan : radical α-méthoxy en C7 Oxacéphèmes Monobactames Figure 15. Classification des β-lactamines : dérivés de l acide 7-amino-céphalosporanique et monobactames. II.1. Dérivés de l acide 6-amino-pénicillanique Il intègre le grand groupe des β-lactamines ayant un noyau péname, caractéristique des pénicillines, parmi lesquelles il y a lieu de distinguer au moins sept sous-groupes différenciés par leur structure chimique, leur stabilité, leur spectre et leur activité antibactérienne. Ce sont (Fig. 14) : les phénoxypéniciilines et analogues de la pénicilline G, la méthicilline et les

47 isoxazolylpénicillines, les aminopénicillines, les carboxypénicillines, les acyluréidopénicillines, les amidinopénicillines, les pénicillines sulfonées et les méthoxycarboxypénicillines. Cette liste n est pas close en raison de l individualisation d un nouveau type de pénicilline (Nformamidinopénicilline) dont l activité antibactérienne est ostensiblement améliorée. D autres β-lactamines ont un noyau qui dérive du noyau péname par substitution du soufre en position 1 (Fig. 14) : La substitution du soufre en position 1 du noyau péname par un oxygène est à l origine du noyau clavame ; l acide clavulanique est la seule molécule naturelle actuellement commercialisée dans ce groupe ; La substitution du soufre en position 1 du noyau péname par un atome de carbone est à l origine du noyau pénème ; les carbapénèmes les plus connus sont l imipénème, le méropénème et l ertapénème. II.2. Dérivés de l acide 7-amino-céphalosporanique Leur noyau de base associe un cycle b-lactame à un cycle dihydrothiazine pour former l acide 7-aminocéphalosporanique ou 7-ACA (noyau céphème), qui distingue les céphalosporines des pénicillines. Suivant les substituants en R3 et R4, on distingue les céphalosporines, les céphamycines et les oxacéphèmes (Fig. 15). La particularité du noyau céphème et les nombreux radicaux de substitution proposés expliquent les propriétés antibactériennes différentes des céphalosporines, justifiant leur distinction fonctionnelle en plusieurs générations, de spectre et d intérêt clinique variables (Tableau IIA)

48 II.3. Monobactames Leur noyau se caractérise par la présence du noyau monocyclique, azétidine, limité au cycle b-lactame (Fig. 15). Seul l aztréonam est à l heure actuelle prescrit. III. Mécanisme d action Les β-lactamines bloquent la synthèse du peptidoglycane par inhibition de certaines enzymes responsables de la transpeptidation, étape essentielle de la synthèse du peptidoglycane. Ces enzymes, collectivement appelées PLP, sont insérées dans la partie externe de la membrane cytoplasmique bactérienne. Pour être actives, les β-lactamines vont devoir atteindre leur cible en pénétrant dans la paroi bactérienne et se fixer sur les PLP. La connaissance de la structure de la paroi bactérienne permet de mieux comprendre le mécanisme d action des β- lactamines et, par la suite, les mécanismes de résistance des bactéries à ces antibiotiques. III.1. Paroi bactérienne et site d action des β-lactamines [55] Chez les bactéries à Gram positif, la paroi est épaisse. Elle est constituée en majeure partie de peptidoglycane, associé à des carbohydrates dont le plus connu est l acide teichoïque. Le peptidoglycane a une structure stratifiée avec un degré de réticulation très élevé chez les bactéries à Gram positif et représente environ 40 à 60 % du poids sec de la bactérie (Fig. 16). Cette paroi est relativement poreuse. La capsule externe polysaccharidique, facteur de virulence, est un élément inconstant de ces bactéries. Chez certaines bactéries à Gram positif, lorsque la paroi intègre une proportion élevée de lipides, il en résulte une diminution de sensibilité aux β-lactamines (exemple : E. faecalis)

49 La paroi des bactéries à Gram négatif est beaucoup moins épaisse et plus complexe. Elle est constituée, de l extérieur vers l intérieur, d une membrane externe qui recouvre une couche fine de peptidoglycane (environ 5 nm) séparée de la membrane cytoplasmique par un espace périplasmique (Fig. 16). Figure 16. Représentation schématique de la paroi des bactéries à Gram négatif et à Gram positif. LPS : lipopolysaccharide ; PLP : protéines de liaison aux pénicillines. L accès des β-lactamines aux PLP est donc plus ou moins facile selon qu il s agit de bactéries à Gram positif ou de bactéries à Gram négatif. III.2. Membrane externe des bactéries à Gram négatif Elle joue un grand rôle dans les échanges bactériens avec l environnement et représente une barrière de perméabilité protectrice, y compris pour la pénétration des antibiotiques, alors que ceux-ci traversent très rapidement le peptidoglycane. Ainsi, la membrane externe protège les bactéries à Gram négatif contre certains antibiotiques non diffusibles et qui ne vont être actifs que sur les

50 bactéries à Gram positif. Pour les antibiotiques qui diffusent à travers la membrane externe, comme les β-lactamines, cette dernière représente un frein à leur pénétration à l intérieur de la bactérie. La membrane externe des bactéries à Gram négatif est une membrane biologique comportant un double feuillet de phospholipides hydrophobes, dans lequel sont enchâssées de nombreuses protéines, et qui se distingue de la membrane externe des cellules eucaryotes par la présence de lipopolysaccharides (LPS). Ces LPS ou endotoxines sont responsables du choc à bacilles à Gram négatif lors de la lyse bactérienne dans la circulation sanguine. Ils comprennent trois régions distinctes : une portion lipidique hydrophobe constituée d acides gras saturés qui se situent dans le feuillet externe de la membrane (lipide A) ; une petite chaîne de sucres appelée «core», ou noyau polysaccharidique de base, qui est rattachée au lipide A par un aminoarabinose ; des chaînes polysaccharidiques de longueur variable fixées sur le core. Le lipide A et le core varient peu, alors que la portion polysaccharidique polaire (appelée antigène O), qui fait saillie à la surface de la cellule, a une composition très variée qui définit la spécificité antigénique O de la bactérie. Le caractère saturé des acides gras qui réalisent un continuum hydrophobe et la forte cohésion des chaînes polysaccharidiques maintenues par des ions Mg++ lui confèrent une faible fluidité. Cette faible fluidité du LPS explique une faible perméabilité aux molécules hydrophiles, mais aussi aux molécules hydrophobes. Les β-lactamines sont des molécules essentiellement hydrophiles et leur pénétration est liée à l existence de porines, canaux protéiques transmembranaires remplis d eau, constitués par un assemblage trimérique de protéines enchâssées dans la membrane externe. Du fait du diamètre limité de

51 leur lumière, ces canaux ne laissent passer que des molécules de petite taille, inférieure à 600 daltons pour E. coli. Le LPS contribue à déterminer l orientation et l exposition à la surface bactérienne des porines. En résumé, la caractéristique fonctionnelle essentielle de la membrane externe des bactéries à Gram négatif est donc la présence d une barrière lipidique hydrophobe qui permet le passage des molécules nutritives essentielles par l intermédiaire des porines, mais empêche à la fois la pénétration vers l intérieur de molécules plus grosses comme les enzymes ou certains antibiotiques et la sortie d enzymes périplasmiques. Une autre protéine de la membrane externe, la muréine lipoprotéine, assure la stabilité de l ensemble de la membrane externe avec le peptidoglycane. En effet, cette protéine est liée d une manière covalente au peptidoglycane par l intermédiaire du groupement NH2 de sa lysine terminale. III.3. Peptidoglycane bactérien III.3.1. Structure du peptidoglycane [56] Le peptidoglycane, est un polymère en réseau, de structure tridimensionnelle, composé de chaînes linéaires de N-acétyl-Dglucosamine et d acide N-acétyl muramique (de 20 à 100 molécules). Ces chaînes polyosidiques sont reliées entre elles par de courtes chaînes de tétrapeptides qui contiennent de la L-alanine, de l acide D-glutamique, de la L-lysine et de la D-alanine. Ces tétrapeptides sont fixés par une de leurs extrémités à l acide N-acétyl muramique et par l autre à un autre tétrapeptide, soit directement, soit par l intermédiaire d acides aminés supplémentaires (pentaglycine chez S. aureus) (Fig. 17)

52 Figure 17. Structure simplifiée du peptidoglycane de Staphylococcus aureus. NAG : N- acétylglucosamine ; NAM : acide N-acétylmuranique. III.3.2. Synthèse du peptidoglycane [57] La synthèse du peptidoglycane se décompose en trois phases : les précurseurs du peptidoglycane sont dans un premier temps synthétisés dans le cytoplasme puis, après traversée de la membrane cytoplasmique, ils sont polymérisés à l extérieur et s assemblent pour former le peptidoglycane (Fig. 18)

53 Figure 18. Etapes de la synthèse du peptidoglycane

54 La première phase est la formation par une chaîne enzymatique intracytoplasmique du précurseur du peptidoglycane, l uridine diphosphate- Nacétyl- muramyl-pentapeptide (UDP-NAMP). La séquence du pentapeptide varie avec les espèces, mais les deux résidus terminaux sont toujours des D alanines. La traversée de la membrane cytoplasmique de l UDP-NAMP s effectue grâce à un transporteur lipidique membranaire. Pendant cette étape, il y a addition d un autre sucre, la N-acétyl-glucosamine, et d une chaîne peptidique secondaire qui varie selon les espèces bactériennes (pentaglycine dans le cas de S. aureus). On obtient ainsi un disaccharide pentapeptide (N-acétylglucosamine- N-acétylmuramique- pentapeptide) dont le motif se répète sur la chaîne du peptidoglycane. L étape pariétale est la dernière étape qui permet la synthèse du peptidoglycane. Le produit formé antérieurement vient se lier au peptidoglycane en voie de croissance. Durant cette phase, deux enzymes essentielles vont intervenir : une transglycosylase permettant la liaison au peptidoglycane en formation par création de chaînes polysaccharidiques à partir de disaccharides pentapeptides attachés entre eux et une transpeptidase qui unit les différentes chaînes polysaccharidiques entre elles. Cette liaison entre chaînes polysaccharidiques est obtenue en clivant le dipeptide D-alanine terminal porté par le disaccharide pentapeptide d une chaîne polysaccharidique et en reliant le quatrième peptide D-alanine au troisième peptide d un disaccharide pentapeptide d une autre chaîne polysaccharidique (Fig. 18). D autres enzymes comme les carboxypeptidases sont susceptibles d interférer avec la transpeptidation en coupant la liaison entre le D-alanine 4 et le D-alanine 5. Ces

55 carboxypeptidases auraient ainsi un rôle dans la régulation de la synthèse, et donc dans l épaisseur du peptidoglycane. Les β-lactamines agissent en inhibant les transpeptidases D-Ala-D-Ala et les carboxypeptidases par analogie structurale entre le noyau b-lactame et le dipeptide d alanine. III.4. Espace périplasmique C est dans l espace périplasmique situé entre la membrane externe et la membrane cytoplasmique que se trouvent le peptidoglycane et les enzymes capables d hydrolyser les β lactamines (Fig. 16). Celles-ci existent à l état naturel ou acquis chez de très nombreuses espèces bactériennes et sont situées sur le passage obligé des molécules de β-lactamines vers leur cible. III.5. Membrane cytoplasmique et protéines de liaison à la pénicilline La membrane cytoplasmique des bactéries à Gram positif et à Gram négatif est la structure la plus interne de la paroi bactérienne. Elle est constituée d une double couche phospholipidique, dont la perméabilité est influencée par les variations de longueur et le degré de saturation des acides gras qui la composent. Certaines protéines qui «flottent» dans la masse des phospholipides sont des perméases qui facilitent la diffusion et le transport actif à travers la membrane. C est à ce niveau que se trouvent les transpeptidases et carboxypeptidases impliquées dans la synthèse du peptidoglycane. Ces protéines à activité enzymatique sont insérées dans la membrane cytoplasmique par leur extrémité COOH, leur site actif enzymatique étant ainsi projeté vers le substrat. Elles sont collectivement nommées PLP car ce sont les protéines cibles de l action des β- lactamines

56 III.6. Mécanisme et conditions nécessaires à l action des β- lactamines [58] Les β-lactamines sont des molécules cycliques qui interfèrent avec les étapes finales de la synthèse du peptidoglycane. Elles présentent une analogie structurale entre le noyau b-lactame et le dipeptide terminal D-alanine-D-alanine du pentapeptide constitutif du peptidoglycane. Leur reconnaissance par les transpeptidases et les carboxypeptidases (PLP) aboutit à la fixation du cycle b- lactame sur le site actif de ces enzymes cibles, qui comporte en général une sérine. Cette fixation entraîne une ouverture du cycle β-lactame par rupture de la liaison amide et une acylation du site actif sérine avec formation d un complexe pénicilloyl-enzyme covalent qui aboutit à l inactivation du site actif de l enzyme, provoquant une inhibition de la synthèse du peptidoglycane et l arrêt de la croissance bactérienne (Fig. 19). La fixation est irréversible et l antibiotique se comporte comme un substrat suicide. Les β-lactamines n ont en revanche pas d action sur la transglycosylation. Figure 19. Acylation du site actif sérine d une protéine de liaison à la pénicilline (PLP) par une β-lactamine. Enz : enzyme

57 Pour développer au mieux leur action antibiotique, les β-lactamines doivent répondre à plusieurs conditions : pouvoir pénétrer à travers la membrane externe et le peptidoglycane ; traverser l espace périplasmique sans être inactivées par les β-lactamases ou rejetées à l extérieur par des systèmes de pompes d efflux ; se lier avec une affinité suffisante aux PLP présentes sur la membrane cytoplasmique ; cette liaison inhibant les transpeptidases, il en résulte un arrêt de la synthèse pariétale ; provoquer l intervention du système autolytique (muréine-hydrolases), responsable de la lyse ultérieure de la bactérie, d où une action bactéricide. Le niveau de réalisation de ces différentes conditions permet de différencier en termes d activité les diverses β-lactamines entre elles. III.7. Pénétration des β-lactamines à travers la membrane externe [59, 60] Chez les bactéries à Gram négatif, les β-lactamines doivent traverser la membrane externe pour atteindre les PLP cibles. Cette membrane agit comme une barrière hydrophobe et les β-lactamines, qui sont le plus souvent des molécules hydrophiles, vont traverser cette barrière essentiellement par la voie des porines. Les porines représentent une très forte proportion des protéines transmembranaires de la membrane externe bactérienne (environ 105 chez E. coli) et jouent un rôle-clé dans la pénétration des β-lactamines. Leur regroupement en trimères pour former des canaux transmembranaires avec une structure en tonneau et un canal central hydrophile rempli d eau permet la diffusion au travers de la membrane de divers solutés hydrophiles, dont les b-

58 lactamines hydrophiles. Le niveau de diffusion à travers ces canaux, qui varie avec les molécules, est responsable, en synergie avec des mécanismes d efflux actif et la présence d une β-lactamase chromosomique, de la résistance intrinsèque des bacilles à Gram négatif à certaines β-lactamines hydrophobes et/ou de masse moléculaire élevée qui diffusent peu. C est le cas des pénicillines G, V ou M chez les entérobactéries ou P. aeruginosa, des aminopénicillines et de nombreuses céphalosporines chez P. aeruginosa. La vitesse de diffusion des β-lactamines au travers des porines varie avec la taille des molécules, leur hydrophilie relative et leur charge. Ces propriétés sont souvent interdépendantes. Ainsi, la charge électrique d une molécule détermine l hydrophilie de celle-ci. Par exemple, la présence d un zwitterion (une charge positive et une charge négative) augmente l hydrophilie de la molécule. La diffusion est diminuée pour les molécules de grande taille (exclusion complète en dessus de 800 daltons chez E. coli), hydrophobes et chargées négativement. Elle est bonne pour les molécules de petite taille, zwittérioniques et hydrophiles. Chez E. coli, les deux porines les plus importantes, OmpC et OmpF, ont une lumière très étroite (respectivement 1,1 et 1,2 nm). Pour cette espèce, ce sont les petites molécules zwittérioniques comme l ampicilline ou surtout l imipénème qui diffusent le mieux, alors que les carboxypénicillines (grande taille et prédominance des charges négatives) diffusent mal. Les céphalosporines, globalement plus hydrophiles que les pénicillines, pénètrent plus facilement que celles-ci. Les autres entérobactéries possèdent également une ou deux porines majeures proches de OmpC et OmpF [61]. Pour les bactéries non fermentaires comme P. aeruginosa, il existe également des porines, mais dont la fonctionnalité est moins clairement élucidée

59 que chez les entérobactéries. Chez P. aeruginosa, deux porines semblent jouer une fonction importante pour permettre le passage des β-lactamines, les porines OprF et OprD. La porine OprD laisse passer spécifiquement les carbapénèmes, alors que OprF est la porine majeure qui laisse passer les autres β-lactamines anti-pseudomonas. Cette dernière est très abondante à la surface de P. aeruginosa et a une lumière deux fois plus importante que les porines des entérobactéries. La raison pour laquelle la membrane externe de P. aeruginosa est beaucoup moins perméable que celle des entérobactéries n est pas encore complètement élucidée, mais semble liée à l ouverture d un faible nombre de porines OprF associée à l existence constitutive de la pompe d efflux actif MexAB-OprM et à l hydrolyse par la β-lactamase AmpC constitutive de l espèce [62, 63]. Cependant, pour certaines β-lactamines parmi les plus lipophiles, les porines ne représentent pas la seule voie de passage des β-lactamines à travers la membrane externe. En effet, certaines pénicillines de grande taille dotées de chaînes latérales lipophiles comme l oxacilline peuvent diffuser lentement au travers des lipides membranaires mais sont rapidement hydrolysées par les β-lactamases périplasmiques ou extrudées par l intermédiaire des pompes d efflux [64]. Après avoir traversé la membrane externe des bactéries à Gram négatif, les β-lactamines diffusent facilement à travers le peptidoglycane, qui est une structure réticulée laissant passer des molécules de daltons alors que le poids moléculaire des β-lactamines varie de 300 à 700 daltons. Chez les bactéries à Gram positif, la pénétration est toujours possible puisqu il n existe pas de membrane externe

60 III.8. Traversée de l espace périplasmique et rôle des β-lactamases périplasmiques [58] La membrane externe ralentit, mais n empêche pas, l entrée des petites molécules hydrophiles. L hydrolyse des β-lactamines par les β-lactamases périplasmiques est alors un des facteurs les plus importants de protection des bactéries contre les antibiotiques. Beaucoup de bactéries à Gram négatif produisent à l état naturel des β-lactamases constitutives codées par un gène chromosomique. Ces enzymes, produites chez les souches sauvages à des niveaux variables suivant les espèces, contribuent à définir les phénotypes de résistance naturelle aux β-lactamines chez les souches sauvages (Tableau IIIA). Pour E. coli, une modélisation de l interaction entre le niveau de perméabilité et l hydrolyse par la β-lactamase constitutive a pu être proposée pour prédire les concentrations minimales inhibitrices (CMI). Ce modèle s applique toutefois mal à certaines espèces pour lesquelles l action naturelle des pompes d efflux est importante, comme P. aeruginosa

61 Tableau IIIA. Exemples de résistances naturelles aux β-lactamines chez différentes espèces de bacilles aérobies non exigeants à Gram négatif (adapté d après [65] ). PEN : pénicilline G ; AM : aminopénicillines ; CTT : céfotétan ; MA : céfamandole III.9. Action des pompes d efflux [66] La faible perméabilité membranaire bactérienne et l hydrolyse par les β- lactamases chromosomiques ne peuvent expliquer l ensemble des résistances naturelles de certaines bactéries, en particulier vis-à-vis de certaines familles d antibiotiques qui ne subissent pas de dégradation intracellulaire comme les quinolones, les cyclines ou les sulfamides. La découverte des pompes d efflux actif est venue combler ce vide. L existence de tels systèmes a été décrite initialement chez des bactéries à Gram négatif comme E. coli et P. aeruginosa, puis plus récemment chez les bactéries à Gram positif. Ces pompes habituellement utilisées par la bactérie pour ses échanges avec le milieu extérieur présentent toutes la même organisation chez les bactéries à Gram

62 négatif, faite de l association de trois composants protéiques : un transporteur inséré dans la membrane cytoplasmique (la pompe proprement dite), une protéine dans la membrane externe et une protéine de liaison périplasmique qui relie entre elles les deux autres protéines (Fig. 20). Le transporteur fournit l énergie de capture de la molécule à rejeter, puis va transmettre, via la protéine de liaison périplasmique, la molécule à la protéine de membrane externe qui est le canal par lequel la molécule va être expulsée à l extérieur de la bactérie. Ce mécanisme d efflux, qui présente une large spécificité de substrats, concerne des classes d antibiotiques aussi diverses que les tétracyclines, les quinolones, le chloramphénicol, les macrolides ou les β-lactamines. Les β-lactamines les plus concernées par ce mécanisme pourraient être les molécules les plus lipophiles (et hydrophobes), comme la carbénicilline qui porte deux charges négatives et s accumule dans l espace périplasmique sans passer la membrane cytoplasmique (systèmes AcrAB/TolC d E. coli et MexAB/OprM de P. aeruginosa) [64]. Ils contribuent à définir le phénotype naturel de résistance aux antibiotiques propre à chaque espèce bactérienne, en synergie avec la barrière de perméabilité représentée par la membrane externe et avec l hydrolyse par les β-lactamases constitutives

63 Figure 20. Schéma simplifié d une pompe d efflux chez un bacille à Gram négatif. III.10. Fixation et action sur les protéines de liaison à la pénicilline [66] Les PLP, qui sont les cibles de β-lactamines, sont des protéines dont le site actif enzymatique est enchâssé sur la face extérieure de la membrane cytoplasmique. Ce sont des polypeptides qui ont un poids moléculaire de à daltons. La plupart des bactéries contiennent à molécules de PLP par cellule, ce qui représente environ 1 % des protéines membranaires totales. Chez les bacilles à Gram négatif, on retrouve entre six et huit PLP désignées d un nombre en fonction de leur taille décroissante : 1a, 1b, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8. Ces PLP, dont le nombre et le poids moléculaire varient en fonction des espèces, sont au nombre de sept pour les entérobactéries et P. aeruginosa, cinq pour A. baumannii, huit pour H. influenzae. Les quatre premières PLP (1a à 3)

64 ont une activité transglycosylase/d-alanyl-dalanine transpeptidase et jouent un rôle majeur dans la survie de la bactérie alors que les PLP4 à 6 ont une activité D-alanyl-D-alanine carboxypeptidase et ne sont pas essentielles à la survie bactérienne [55]. L inactivation simultanée des PLP1a et 1b, impliquées dans l élongation cellulaire, aboutit à la formation de sphéroplastes, rapidement suivie d une lyse et de la mort bactérienne. L inactivation de la PLP2, impliquée dans la réalisation de la forme bactérienne, aboutit à la formation de cellules ovoïdes osmotiquement stables, alors que celle de la PLP3, impliquée dans la formation du septum de la division cellulaire, aboutit à la formation de longs filaments qui vont se lyser lentement. L inactivation des PLP4, 5 ou 6, qui ne sont pas des PLP essentielles, n entraîne pas de conséquences évidentes pour la bactérie. A des concentrations faibles, chaque β-lactamine a une affinité préférentielle différente vis-à-vis de chacune des PLP (Tableau IVA). Si on augmente la concentration de l antibiotique, d autres PLP moins affines sont également inhibées. A titre d exemple, chez E. coli, l ampicilline se fixe surtout sur les PLP2 et 3, l amoxicilline sur les PLP1a, 1b et 2, les céphalosporines le plus souvent sur les PLP1a et 3 (avec souvent une prédilection pour la PLP3 pour les aminothiazylcéphalosporines) et l imipenème sur les PLP2 et 4 (Tableau VA). En règle générale, les β-lactamines n ont pas ou très peu d affinité pour les PLP de bas poids moléculaire

65 Tableau IVA. Effet en fonction des concentrations de différentes β-lactamines sur la croissance d Escherichia coli. Tableau VA. Interactions des protéines liant la pénicilline (PLP) avec les β-lactamines chez Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa et Staphylococcus aureus. L action de la β-lactamine sur les PLP varie avec les concentrations d antibiotiques.a titre d exemple, des céphalosporines comme le céfotaxime ou la ceftazidime, qui ont une forte affinité pour la PLP3, vont l inhiber à de faibles concentrations et provoquer une filamentation bactérienne, alors que, à de plus fortes concentrations, elles vont également inhiber les PLP1a et 1b, et provoquer l apparition de sphéroplastes et une lyse rapide. Si chaque β-lactamine a une ou plusieurs cibles préférentielles (Tableau VA), l action antibactérienne des β-lactamines résulte en fait d un effet cumulatif par l inhibition de

66 plusieurs PLP ou d un déséquilibre entre les quantités relatives de PLP restant fonctionnelles [56]. Chez les bacilles à Gram négatif comme E. coli, la liaison à une des trois PLP essentielles entraîne une inhibition de la croissance avec une mort bactérienne lente, alors que la saturation de toutes les PLP essentielles aboutit à une mort bactérienne rapide et complète [69]. Pour des concentrations supérieures à celles nécessaires à la saturation des PLP, il n y a pas d augmentation de cette bactéricidie. L action préférentielle sur certaines PLP peut avoir des conséquences importantes chez les bacilles à Gram négatif. En effet, les agents comme l ampicilline ou certaines céphalosporines, qui se lient préférentiellement à la PLP3, sont responsables de la formation prédominante de filaments et d une augmentation considérable de la biomasse bactérienne avant la lyse. La lyse n apparaît que secondairement, si le contact des bactéries avec l antibiotique maintenu à concentration suffisante est suffisamment long et il existe alors un risque plus important de relargage d endotoxine et de choc endotoxinique. Si la concentration d antibiotique tombe au-dessous d un certain seuil, les formes filamenteuses, par un processus de division cellulaire, vont se fragmenter en bactéries de vitalité et de morphologie normales. En revanche, les agents comme l amoxicilline ou les carbapénèmes, qui agissent préférentiellement sur les PLP1a, 1b et 2, déterminent la formation prédominante de sphéroplastes avec lyse rapide et présentent un risque moins élevé de choc endotoxinique car ils ne favorisent pas l augmentation de la biomasse bactérienne. [55,68] Ainsi, parmi les aminopénicillines, l amoxicilline s avère plus rapidement et plus fortement bactéricide que l ampicilline chez E. coli

67 Pour les bactéries autres que les bacilles à Gram négatif, les relations entre l inhibition des différentes PLP et la bactéricidie sont encore mal connues. Chez les Neisseria spp. on retrouve trois PLP, alors que ce nombre varie de quatre à six chez les cocci à Gram positif : quatre chez S. aureus et Streptococcus pyogenes, cinq chez Enterococus faecium et six chez S. pneumoniae et E. faecalis. Chez S. aureus, bien que les PLP1, 2 et 3 semblent jouer un rôle essentiel, il n y a pas de PLP dont l inhibition est à elle seule létale, n importe laquelle de ces PLP pouvant assurer une fonction de transpeptidation. Chez les entérocoques, la faible sensibilité naturelle aux β-lactamines et en particulier aux céphalosporines semble essentiellement liée à la production d une PLP5 de faible affinité, qui est un composant normal de cet organisme [67]. Les cinq PLP de S. pneumoniae sont inactivées par de très faibles concentrations de pénicilline et de nombreuses céphalosporines. Les cocci à Gram positif mis en présence de β-lactamines tendent à former de grandes cellules segmentées, quelles que soient les PLP préférentiellement impliquées [69]. Il existe une analogie entre ces PLP et les β-lactamases. En effet, la séquence d acides aminés est comparable et les β- lactamases comme les PLP ont un même résidu sérine au site de fixation des β- lactamines. III.11. Lyse bactérienne sous l effet des β-lactamines [56] Les β-lactamines sont des antibiotiques bactéricides, c est-à-dire des antibiotiques dont le rapport concentration minimale bactéricide/cmi est voisin de 1. Leur vitesse de bactéricidie est le plus souvent lente et dépend essentiellement du temps d exposition à une concentration supérieure au seuil d efficacité. Leur bactéricidie est dite temps dépendante, en opposition à d autres familles d antibiotiques dont l activité bactéricide est concentration

68 dépendante, c est-à-dire dépendant essentiellement de la concentration réalisée (aminoglycosides, fluoroquinolones). L arrêt de la synthèse du peptidoglycane, qui résulte de la fixation sur les PLP, va entraîner un arrêt de la croissance bactérienne qui correspond à l effet bactériostatique de l antibiotique. L action bactéricide des β-lactamines sur les bactéries sensibles est liée à une dégradation du peptidoglycane qui conduit à une lyse de la bactérie. Si la lyse bactérienne peut théoriquement survenir par l action des forces osmotiques sur une paroi altérée, le processus de lyse bactérienne résulte surtout de la mise en jeu d un système faisant intervenir des autolysines. Ces autolysines sont des hydrolases endogènes présentes chez toutes les bactéries qui, sous le contrôle strict de mécanismes de régulation, peuvent dégrader à plusieurs niveaux la structure du peptidoglycane bactérien. Elles sont actives au cours de la phase de croissance bactérienne, ce qui explique que les β-lactamines n ont en règle générale pas d action bactéricide sur les bactéries en phase stationnaire, mais uniquement sur celles en phase de croissance. L importance de ces autolysines dans le processus de lyse est souligné par l existence du phénomène de tolérance, bien mis en évidence chez les cocci à Gram positif : des mutants sensibles aux β-lactamines et déficitaires pour plusieurs autolysines ne sont pas détruits, mais seulement inhibés par les β- lactamines. On définit ce phénomène de tolérance par le fait qu une souche sensible, avec une CMI normale, a une concentration minimale bactéricide au moins égale à 32 fois la CMI, les mesures étant effectuées sur un inoculum en phase exponentielle de croissance. Les mécanismes par lesquels sont mises en jeu ces autolysines à la suite de l inhibition des différentes PLP et l importance

69 réelle en pratique clinique de ce phénomène de tolérance sont encore mal connus. IV. Spectre antibactérien [66] : On répartir les espèces bactériennes en trois classes en fonction de leur comportement vis-à-vis de l antibiotique : sensible, modérément sensible ou résistant. Pour les espèces classées sensibles, l antibiotique a en théorie toutes les chances d être actif et de contribuer à la guérison. Pour les espèces modérément sensibles, l activité modérée de l antibiotique peut être compensée in vivo au site de l infection par une concentration élevée, avec dans ce cas une probabilité de succès importante, surtout dans les infections de gravité modérée. Avec les espèces classées résistantes, le risque d échec est important et doit faire récuser l antibiotique dans les infections dues à ces espèces bactériennes. Pour les souches sensibles ou modérément sensibles, l existence de résistances acquises doit faire pratiquer un antibiogramme. La connaissance de la fréquence de ces résistances acquises dans chaque pays pour les espèces naturellement sensibles apporte une information complémentaire au prescripteur. Certaines bactéries échappent d emblée à l activité des β-lactamines, pour plusieurs types de raisons, parfois associées entre elles : l existence d une résistance naturelle ; une situation de parasitisme intracellulaire qui met la bactérie hors de portée d un antibiotique diffusant mal dans les cellules ; une inefficacité in vivo ou une fréquence très élevée de résistance acquise (Tableau VIA)

70 Tableau VIA. Principales bactéries d intérêt médical échappant au spectre des β- lactamines [70,71, 72]. Bactéries Chlamydia Rickettsia Legionella Brucella Francisella tularensis Mycoplasma pneumoniae Mycoplasma hominis Mycobactéries Staphylococcus aureus résistants à la méthicilline Corynebacterium jeikeium Corynebacterium urealyticum Clostridium difficile Remarques bactéries intracellulaires : diffusion intracellulaire des β -lactamines insuffisante pour atteindre des concentrations compatibles avec une activité thérapeutique bactéries dépourvues de paroi (cible des β- lactamines) structure très rigide et imperméable de la paroi bactérienne résistances acquises : les Staphylococcus aureus résistants à la méthicilline représentent de 30 à 50 % des S. aureus isolés à l hôpital. La résistance à la méthicilline est croisée pour toutes les β - lactamines résistances acquises de haut niveau de ces bactéries pas d efficacité clinique des b-lactaires sur les entérocolites à C. difficile Les spectres d activité antibactériens des principales espèces d intérêt médical sont indiqués sur les Tableaux VIIA à IXA

71 Tableau VIIA. Spectre d activité antibactérien des pénicillines et pénèmes (aérobies à Gram positif, anaérobies, autres) [69,70, 73, 74]. Pénicillines Sensibles aux pénicillinases Résistantes aux pénicillinases Spectre élargi : aminopénicillines Actives sur Pseudomonas aeruginosa Pénèmes P G PV Cloxa Oxa Ampicilline AMX AMC Amp+sulbactam TIC TICC Pip+ Mezlocilline PTZ IPM Aérobies à Gram positif Bacillus anthracis S S S S S S S S Corynebacterium diphteriae S S S S S S S S S S S Enterococcus faecalis M R R S S S S M M S S S Enterococcus faecium M R S : espèce sensible ; R : espèce résistante ; M : espèce modérément sensible ; blanc : résultat non disponible ou pas d indication clinique. * Fréquence très élevée de résistances acquises par production de pénicillinases. R M M M M R R R R M Erysipelothrix rhusiopathiae S S S S S Listeria monocytogenes S S S S S S S S S S Staphylococcus oxacilline S R* S S R* R* S S R* S R* S S Streptococcus pneumoniae S S S S S S S S S S S S S Anaérobies Actinomyces sp. S S S S S S S S S S Bacteroides fragilis R R R R R S S S S S S S Clostridium perfringens S S S S S S S S S S S S Eubacterium sp. S S S S S Fusobacterium S S S S S S S S S Peptostreptococcus S S S S S S S S S S Porphyromonas sp. S S S S S S S S Prevotella sp. S S S S S S S S S S Propionibacterium acnes S S S S S S S S S Autres Bartonella sp. S S S S S S Borrelia sp. S S S S S S Leptospira sp. S S S S S S Treponema pallidum S S S S S S

72 Aérobies à Gram négatif Tableau VIIIA. Spectre d activité antibactérien (aérobies à Gram négatif) des pénicillines et pénèmes P.Sensibles aux pénicillinases Résistantes auxpénicillinases [69, 70, 75]. Spectre élargi : aminopénicillines Actives sur Pseudomonas aeruginosa Pénèmes PG P V Clox Oxa Amp AMX AMC Ampi +sulb TIC TICC Pipé+Mezlo PTZ Imipénème Acinetobacter baumannii R R R R R S S S S S Aeromonas hydrophila R R R R R S S S S S/R* Branhamella catarrhalis R R R S S R S R S S Burkholderia cepacia R R R R R R R S S M Burkholderia pseudomallei R R R S R S S S S Campylobacter jejuni S S S Citrobacter freundii R R R R R S S S S S Citrobacter koseri R R R S S R S R S S Enterobacter sp. R R R R R S S S S S Escherichia coli R S S S S S S S S S Haemophilus influenzae M S S S S S S S S S Haemophilus ducreyi R R R S S Helicobacter pylori S Klebsiella sp. R R R S R R S R S S Morganella morganii R R R R R S S S S S Neisseria gonorrhoeae S S S S S S Neisseria meningitidis S S S S S S Pasteurella multocida S S S S S S Proteus mirabilis R S S S S S S S S S Proteus rettgeri R R R R R S Proteus vulgaris R R R S R S S S S S Providencia sp. R R R R R S S S S S Pseudomonas aeruginosa R R R R R S S S S S Stenotrophomonas maltophilia R R R R R R S R S R Salmonella sp. R S S S S S S S S S Serratia sp. R R R R R S S S S S Shigella sp. R S S S S S S S S S Streptobacillus moniliformis S S S S S Vibrio cholerae R S S S S S S S S S Yersinia enterolitica R R R R R R S R S S Yersinia pestis R S S S S S S S : espèce sensible ; R : espèce résistante ; M : espèce modérément sensible ; blanc : résultat non disponible ou pas d indication clinique. * résistance par production de carbapénèmase par certaines souches seulement.

73 Céfaclor Cefadroxil Céfalexine Céfapirine, Céfalotine Céfazoline Céfoxitine Céfuroxime injectable Céfuroxime per os Cefotaxime Cefotétan Ceftazidime Ceftriaxone Cefixime Céfotiam Cefpodoxime Azréonam Antibiorésistance des entérobactéries aux β-lactamines Tableau IXA. Spectre d activité antibactérien des céphalosporines et du monobactame (aérobies à Gram positif, anaérobies, autres) [69,70, 73]. Céphalosporines Mono-bactames Première génération Deuxième génération Troisième générationinjectables Troisième génération orales Aérobies à Gram positif Bacillus anthracis M M R R Corynebacterium diphteriae S S S S S R S S Enterococcus faecalis R R R R R R R R R R R R R R R R Enterococcus faecium R R R R R R R R R R R R R R R R Listeria monocytogenes R R R R R R R R R R R R R R R R Staphylococcus oxacilline S S S S S S S S S S S M S R S M R Streptococcussp. S S S S S S S S S S S S S S S R Streptococcus pneumoniae S S S S S S S S S S S S S S S R Anaérobies Actinomyces S S S R R Bacteroides fragilis R R R R R S R R R S R R R R R R Clostridium perfringens M M M S S S S M S S S S R R R R Fusobacteriumsp S S S S S S S S S S S S S S S Peptostreptococcus sp. M M M S S S S M S S S S R S R R Porphyromonas sp. R Prevotellasp. S S S S S S S S S S S S S S Propionibacterium acnes S S S S S S S S S R S R Autres Borrelia sp S S S : espèce sensible ; R : espèce résistante ; M : espèce modérément sensible ; blanc : résultat non disponible ou pas d indication clinique

74 Céfaclor Cefadroxil Céfalexine Céfapirine, Céfalotine Céfazoline Céfoxitine Céfuroxie injectable Céfuroxime per os Cefotaxime Cefotétan Ceftazidime Ceftriaxone Cefixime Céfotiam Cefpodoxime Azréonam Antibiorésistance des entérobactéries aux β-lactamines Tableau XA. Spectre d activité antibactérien (principales bactéries aérobies à Gram négatif) des céphalosporines [69, 70, 75]. Céphalosporines Première génération Deuxième génération Troisième génération injectables Troisième génération orales Monobactames Aérobies à Gram négatif Acinetobacter baumannii R R R R R R R R R R M R R R R R Aeromonas hydrophila R S S S S S S S Branhamella catarrhalis S S S S S S S S S S S S S S S S S Burkholderia cepacia R S R R Burkholderia pseudomallei R R R R R R R M R M R M Citrobacter freundii R R R R R R S R S S S S R R R S Citrobacter koseri S M S S S S S S S S S S S S S S Enterobactersp. R R R R R R S R S R S S R R S Escherichia coli S S S S S S S S S S S S S S S S Haemophilus influenzae M M M S S S S S S S S S S S S S Haemophilus ducreyi S S S Klebsiellasp. S S S S S S S S S S S S S S S Morganella morganii R R R R R M R R S R S S R S Neisseria gonorrhoeae S S S S S S S S S S S S S S S S Neisseria meningitidis S S S S Pasteurella multocida S S S S S S S S S S Proteus mirabilis M M M S S S S M S S S S S S S S Proteus vulgaris R R R R R S R R S S S S S S S S Providenciasp. R R R R R S S R S S S S S S S S Pseudomonas aeruginosa R R R R R R R R R R S R R R R S Stenotrophomonas maltophilia R R R R R R R R R R R R R Salmonella sp. M S S S S Serratiasp R R R R R R R R S S S S R R R S Shigella sp. M S S S S Vibrio cholerae R R R R R Yersinia enterolitica R R R R S R S S S S Yersinia pestis S S S S S S : espèce sensible ; R : espèce résistante ; M : espèce modérément sensible ; blanc : résultat non disponible ou pas d indication clinique

75 Les pénicillines G et V sont actives contre de nombreuses bactéries aérobies à Gram positif et sont intrinsèquement plus actives que les autres pénicillines contre les cocci à Gram positif, en l absence de mécanisme de résistance acquis, malheureusement très fréquents chez S. aureus. Les aminopénicillines ont une activité élargie vers les bacilles à Gram négatif et le spectre vers ces espèces est encore étendu avec les carboxypénicillines (ticarcilline) et les uréidopénicillines (pipéracilline, mezlocilline). Beaucoup d anaérobies sont sensibles aux pénicillines, avec l exception notable de B. fragilis. Avec les céphalosporines, le spectre de la pénicilline G est étendu aux bacilles à Gram négatif aérobies, avec de grandes variations liées aux différentes propriétés de ces molécules et en particulier à leur résistance vis-à-vis des différents types de b-lactamases. La céphalotine résiste à l hydrolyse par les pénicillinases de S. aureus, et la céfoxitine, le céfuroxime et les céphalosporines de troisième génération sont plus résistantes à celles produites par les bacilles à Gram négatif. Elles sont en général peu actives sur les bactéries anaérobies et en particulier sur B. fragilis, avec l exception notable de la céfoxitine. L aztréonam est actif contre la grande majorité des bacilles à Gram négatif, mais il n est pas actif sur les bactéries à Gram positif et les anaérobies. Enfin, les carbapénèmes ont un très large spectre d activité, incluant la plupart des bactéries à Gram positif (sauf les S. aureus résistants à la méthicilline), la grande majorité des bacilles à Gram négatif (sauf S. maltophilia et B. cepacia) et la quasi totalité des bactéries anaérobies

76 V. Indications [66] Les indications des β-lactamines s intègrent dans plusieurs cadres : en prophylaxie, en antibiothérapie probabiliste ou bien lors d un traitement documenté. Les β-lactamines sont la principale famille antibiotique utilisée dans les infections communautaires et nosocomiales pour plusieurs raisons : le nombre et la variété des molécules disponibles, un spectre bactérien très vaste auquel échappent peu d espèces, leurs propriétés pharmacocinétiques et pharmacodynamiques, et un recul très important sur leur utilisation et leur tolérance. V.1. Indications des β-lactamines en antibioprophylaxie V.1.1. Antibioprophylaxie chirurgicale [76] Consiste à administrer un antibiotique avant une intervention chirurgicale chez un patient non infecté afin de réduire le taux des infections postopératoires en s opposant à la colonisation puis à l infection bactérienne du site opératoire. Il s agit d une mesure validée dans la prévention de la plupart des infections du site opératoire qui s adresse principalement à la chirurgie propre-contaminée (classe II d Altemeier) et à la chirurgie propre (classe I). Pour la chirurgie contaminée et la chirurgie sale (classes III et IV), l infection souvent patente relève d une antibiothérapie curative. En chirurgie propre orthopédique, cardiaque, vasculaire, ophtalmologique ou en neurochirurgie, l antibioprophylaxie peut diminuer significativement la fréquence des infections du site opératoire de 1 à 5 % des interventions sans antibioprophylaxie à moins de 1 %. De même, en chirurgie propre-contaminée, lors de l ouverture d un

77 viscère creux ou d une rupture minime d asepsie, l antibioprophylaxie permet globalement de diminuer par deux les taux d infection. a-règles générales [77] Les règles habituellement recommandées sont : une administration courte (le plus souvent 24 heures et au maximum 48 heures) effectuée juste avant l acte chirurgical, au mieux lors de l induction de l anesthésie, une administration par voie intraveineuse avec une dose de charge initiale double de la dose unitaire standard pour obtenir une concentration élevée dans les tissus. Une dose unitaire standard est administrée toutes les demi-vies en cas de chirurgie longue, supérieure à 3-4 heures. L objectif essentiel est de maintenir des concentrations tissulaires efficaces pendant toute la durée de l intervention. En l absence d antécédents allergiques, les β-lactamines (principalement l oxacilline, l association amoxicilline-acide clavulanique, les céphalosporines de première et de deuxième générations) sont largement utilisées en première intention du fait de leur spectre antibactérien, de leur bonne diffusion tissulaire et de leur faible toxicité associés à un coût raisonnable. Cependant, leur demi-vie souvent courte justifie un respect étroit des recommandations d administration. b-cas particuliers [66] Dans le cas de malades hospitalisés depuis plusieurs jours avant l acte opératoire ou ayant des antécédents d antibiothérapie, ou d intervention chirurgicale récente avec risque de portage d une flore bactérienne résistante aux antibiotiques, l emploi d autres familles antibiotiques peut être indiqué. A titre d exemple en chirurgie orthopédique ou neurologique chez un patient ayant des antécédents nosocomiaux, une prophylaxie par vancomycine permet de prendre en compte un éventuel S. aureus résistant à la méthicilline

78 Chez les malades porteurs d une valvulopathie ou d une prothèse cardiaque ou vasculaire, l antibioprophylaxie doit à la fois prévenir l endocardite et la surinfection de la prothèse. Elle doit obligatoirement être efficace sur les streptocoques et est même indiquée lors d interventions mineures comme une avulsion dentaire. V.1.2. Prophylaxie de l endocardite infectieuse [78, 79] En l absence d allergie aux β-lactamines, l amoxicilline est le produit de choix pour la prophylaxie de l endocardite infectieuse chez les cardiaques à risque. Pour les soins dentaires et lors d actes portant sur les voies aériennes supérieures, l amoxicilline est administrée à raison de 3 g per os dans l heure précédant le geste lors de soins ambulatoires ou de 2 grammes par voie intraveineuse (en perfusion de 30 minutes) dans l heure précédant le geste suivis de 1 g per os 6 heures plus tard en cas d anesthésie générale. Lors d interventions urogénitales et digestives, la gentamicine est associée à l amoxicilline dans l heure précédant le geste. V.1.3. Prophylaxie des rechutes du rhumatisme articulaire aigu La benzathine benzylpénicilline, administrée tous les 15 jours par voie intramusculaire profonde, demeure le traitement prophylactique de référence pour cette pathologie qui a quasiment disparu en France (dix cas par an depuis 1997), mais reste préoccupante dans les pays en voie de développement et, à un moindre degré, dans les territoires et départements d outre-mer

79 V.1.4.Prophylaxie des infections pneumococciques chez les sujets splénectomisés La pénicilline V est utilisée en prophylaxie des infections à pneumocoques chez les splénectomisés, les drépanocytaires majeurs et les autres aspléniques fonctionnels. La prise de l antibiotique doit être biquotidienne. Elle est débutée chez l enfant dès que le diagnostic est fait pour le drépanocytaire ; elle est à poursuivre au moins jusqu à l âge de 5 ans et au moins 5 ans suivant le geste pour le splénectomisé. Chez l adulte, la prophylaxie est à poursuivre au moins 2 ans après la splénectomie. V.2. Antibiothérapie curative Une antibiothérapie curative peut être débutée en l absence de documentation bactériologique devant certaines situations cliniques comme par exemple un érysipèle, une pneumopathie franche lobaire aiguë communautaire ne présentant pas de signe de gravité ou une pharyngite aiguë documentée par un test de dépistage du streptocoque β-hémolytique de groupe A positif. Les étiologies bactériennes ainsi que la sensibilité aux antibiotiques des bactéries responsables sont bien connues par des enquêtes épidémiologiques récentes. Il peut s agir aussi d une infection grave chez un patient faisant suspecter une étiologie bactérienne et dans ce cas le thérapeute, après avoir effectué les prélèvements bactériens indispensables à un diagnostic étiologique précis, entreprend sans tarder un traitement probabiliste orienté par la clinique et une connaissance des étiologies les plus fréquentes. Dans un deuxième temps, une réévaluation est effectuée et cette antibiothérapie initiale peut être éventuellement adaptée ou modifiée en fonction de la nature du ou des agents étiologiques et de leur sensibilité aux antibiotiques

80 V.2.1. Antibiothérapie probabiliste et β-lactamines au cours des infections communautaires a-lors des infections urogénitales [80] En dehors de la cystite aiguë non compliquée de la femme non enceinte et de la prostatite aiguë communautaire simple, les β-lactamines sont très largement prescrites en première intention, éventuellement associées à une cycline lorsque peuvent être incriminées des bactéries échappant au spectre des β-lactamines comme Chlamydia trachomatis ou Ureaplasma urealyticum, souvent responsables de maladies sexuellement transmissibles (Tableau XIA). Dans la cystite simple de la femme non enceinte et les prostatites, on utilise plutôt en première intention d autres familles antibiotiques comme les fluoroquinolones ou le cotrimoxazole

81 Tableau XIA. Place des β-lactamines dans le traitement probabiliste des infections urogénitales. b-infections pulmonaires Une β-lactamine est souvent prescrite en première intention (aminopénicilline, céphalosporine injectable) avec réévaluation systématique à la quarante-huitième heure qui, en cas d échec, fait appel à d autres familles d antibiotiques. L association d emblée d une β-lactamine et d un autre

82 antibiotique est recommandée dans certaines situations en fonction de la gravité et du terrain du malade (Tableau XIIA) [81, 82]. En cas d isolement d un S. pneumoniae de sensibilité diminuée à la pénicilline, habituellement dépisté sur l antibiogramme à l aide d un disque d oxacilline, une détermination des CMI de la β-lactamine utilisée en thérapeutique est indispensable [65]. c-infections oto-rhino-laryngologiques [58,83, 84] Pour les angines aiguës érythémateuses ou érythématopultacées, un test de détection rapide pour le streptocoque β-hémolytique de groupe A est préconisé. En cas de positivité, les traitements courts sont actuellement préférés du fait d une meilleure observance. Ils reposent sur l amoxicilline ou une céphalosporine orale (Tableau XIIA). La pénicilline V en traitement de 10 jours est le traitement historique de référence. Dans les sinusites aiguës communautaires et les otites moyennes aiguës, la fréquence élevée des bactéries productrices de pénicillinase nécessite de faire appel aux aminopénicillines associées aux inhibiteurs de β-lactamases ou aux céphalosporines de deuxième ou troisième génération orales, qui trouvent ici leurs principales indications (Tableau XIIA)

83 Tableau XIIA. Place des β-lactamines dans le traitement probabiliste des infections respiratoires communautaires de la sphère oto-rhino-laryngologique et bucco-dentaire

84 d-infections en odontologie et stomatologie [86] Parmi les antibiotiques recommandés dans les infections en odontologie et stomatologie, les aminopénicillines seules sont recommandées en première intention, avec en alternative l association amoxicilline-acide clavulanique (Tableau XIIA). e-infections dermatologiques [87] Dans les situations où le streptocoque β-hémolytique du groupe A (S. pyogenes) est en cause, la pénicilline ou les aminopénicillines sont les molécules de choix. L association amoxicillineacide clavulanique est efficace sur les staphylocoques sensibles à l oxacilline, même producteurs de pénicillinase, et est particulièrement intéressante en cas de flore anaérobie associée. La gravité de l infection (gangrène) et le terrain (diabétique) peuvent nécessiter de faire appel à des formes injectables comme l association pipéracilline-tazobactam ou les céphalosporines de troisième génération, et indiquer l association à une autre famille antibiotique comme les aminosides. En cas de morsure humaine ou animale, l association amoxicilline-acide clavulanique est l antibiotique de choix (Tableau XIIIA)

85 Tableau XIIIA. Place des β-lactamines dans le traitement probabiliste des infections cutanées communautaires. f-bactériémies communautaires de l adulte et endocardites sur valves natives [66] La porte d entrée suspectée oriente vers les agents étiologiques les plus probables et guide le choix de la β-lactamine. En absence d élément d orientation, une céphalosporine de troisième génération associée à un aminoside est employée (Tableau XIVA)

86 Tableau XIVA. Place des β-lactamines dans le traitement probabiliste des bactériémies et endocardites. g-méningites purulentes de l adulte et abcès cérébraux [88] En l absence d élément d orientation et hormis les situations dans lesquelles une infection à Listeria monocytogenes est suspectée, une céphalosporine de troisième génération injectable est d emblée utilisée, associée à la vancomycine pour prendre en compte un éventuel pneumocoque de sensibilité diminuée à la pénicilline. En cas de suspicion d infection à L. monocytogenes, qui se présente le plus souvent sous forme d une méningoencéphalite à liquide clair chez l adulte, l amoxicilline est utilisée en association avec un aminoside et un médicament à visée antiherpétique. Dans les méningites postneurochirurgicales et les abcès cérébraux posttraumatiques, l association du céfotaxime à la fosfomycine permet de prendre en compte une

87 éventuelle étiologie impliquant un bacille à Gram négatif ou un S. aureus sensible ou résistant à la méthicilline (Tableau XVA). Tableau XVA. Place des β-lactamines dans le traitement probabiliste des méningites bactériennes et abcès cérébraux. h-infections en hépato-gastro-entérologie [89, 90] Leur traitement fait le plus souvent appel aux céphalosporines de troisième génération injectables, à l amoxicilline-acide clavulanique ou à la pipéracillinetazobactam en association à un aminoside ou une fluoroquinolone. Dans le traitement de l ulcère gastrique duodénal à H. pylori, l amoxicilline per os associée à la clarithromycine et à un antisécrétoire est le traitement de première intention (Tableau XVIA).

88 Tableau XVIA. Place des β-lactamines dans le traitement empirique des infections en hépatogastro-entérologie. i-infections osseuses et articulaires [91, 92] Les ostéomyélites aiguës hématogènes de l adulte et les spondylodiscites sont principalement dues à S. aureus, et bien moins fréquemment aux entérobactéries et aux streptocoques. L association céfotaxime ou ceftriaxone et fosfomycine est souvent proposée en traitement empirique. En cas de probabilité élevée d une implication des bactéries anaérobies comme dans l infection du pied chez le diabétique, l association amoxicilline-acide clavulanique peut être prescrite, avec éventuellement une fluoroquinolone (Tableau XVIIA)

89 Tableau XVIIA. Place des β-lactamines dans le traitement probabiliste des infections osseuses et articulaires de l adulte. j-cas particulier de la femme enceinte [66] Les β-lactamines ont fait preuve de leur innocuité chez la femme enceinte. Elles traversent le placenta et atteignent des concentrations élevées dans le cordon ombilical et le liquide amniotique. C est la famille antibiotique la plus prescrite pendant la grossesse, tant dans un but thérapeutique que dans un but prophylactique (Tableau XVIIIA). Elles peuvent être utilisées sans risque, en dehors d antécédents allergiques, pendant toute la durée de la grossesse et l allaitement

90 Tableau XVIIIA. β-lactamines au cours de la grossesse. V.2.2. Infections nosocomiales [93] L infection est considérée comme nosocomiale si elle survient plus de 48 heures après l admission ou dans les 30 jours pour une infection du site opératoire, voire 1 an en cas de mise en place d un implant ou d une prothèse. Les cinq sites d infections les plus fréquents sont le site urinaire, le site opératoire, les infections sur cathéter vasculaire, les infections respiratoires et les septicémies. Les investigations microbiologiques, y compris celles nécessitant des techniques invasives, sont indispensables pour documenter l infection selon des critères microbiologiques qui sont intégrés dans les critères de définition. Les bactéries responsables d infections nosocomiales possèdent de nombreuses résistances naturelles ou acquises. La fréquence de ces dernières impose la pratique systématique d un antibiogramme. En probabiliste, le choix du traitement antibiotique intègre en pratique plusieurs variables : la nature du site de l infection, le terrain et les antécédents du patient, le niveau de gravité et les principaux micro-organismes habituellement impliqués. L écologie bactérienne locale, qui varie d un hôpital à un autre et au sein d un même hôpital selon les

91 différentes unités de soins, peut également influencer les choix thérapeutiques. La nécessité fréquente d une antibiothérapie bactéricide explique le fréquent recours à la famille des β-lactamines. Les molécules à spectre large sont les plus utilisées. Le céfotaxime ou la ceftriaxone, qui sont actifs sur les entérobactéries et la plupart des cocci à Gram positif, à l exception des entérocoques et des staphylocoques résistants à la méthicilline, sont souvent utilisés en première intention dans les infections nosocomiales urinaires, pulmonaires et les septicémies. La ceftazidime, qui est peu active sur les cocci à Gram positif, est principalement indiquée quand il y a une forte suspicion d infection à P. aeruginosa. Le céfépime, le cefpirome, trouvent leur place lors de suspicion d infection sévère à entérobactéries nosocomiales hyperproductrices de céphalosporinase, en particulier Enterobacter spp., Serratia spp., Providencia spp., C. freundii ou M. morganii. L imipénème est parmi les β-lactamines celle qui a le spectre le plus large et qui reste active sur les entérobactéries nosocomiales productrices de b-lactamases à spectre élargi ou hyperproductrices de céphalosporinase, ainsi que sur P. aeruginosa, A. baumannii et les anaérobies. Son indication est limitée aux infections nosocomiales sévères à l exclusion des méningites. L association pipéracilline-tazobactam, active sur l entérocoque, les staphylocoques sensibles à la méthicilline, les entérobactéries communautaires, la plupart des entérobactéries nosocomiales, P. aeruginosa, A. baumannii et la quasi-totalité des anaérobies, est largement utilisée dans les infections nosocomiales à flore mixte comme les infections abdominales ou cutanées

92 V.3. β-lactamines et associations d antibiotiques [66] Une association d antibiotiques a pour objectifs d obtenir une synergie bactéricide, de limiter le risque d émergence de mutants résistants et/ou d élargir le spectre antibactérien. Les principales indications des associations concernent des situations à risque élevé du fait de l implication de certaines espèces bactériennes particulièrement plastiques, du site infectieux et du terrain sousjacent. V.3.1. Bactérie [94] Chez P. aeruginosa ou les entérobactéries du groupe Klebsiella- Enterobacter-Serratia KES, l emploi d une monothérapie s accompagne d un risque élevé d émergence de mutants résistants. Afin de prévenir l émergence de ces mutants et d obtenir une synergie bactéricide, l association d une β- lactamine à un aminoside, à la ciprofloxacine ou à la fosfomycine est le plus souvent indiquée. Le traitement est réévalué en fonction de l évolution clinique et des résultats de l antibiogramme. De même, pour A. baumannii, bactérie naturellement résistante à de nombreux antibiotiques, une association comportant l imipénème et un aminoside est souvent préconisée. V.3.2. Site de l infection [66] Dans le cadre des infections d étiologie bactérienne mixte, une association peut être justifiée pour élargir le spectre. C est le cas par exemple des infections intra-abdominales ou des infections utéroannexielles. Dans le cas des endocardites, l intérêt de l association en termes de bactéricidie est bien validé. Enfin, dans d autres situations, il faut assurer une couverture maximale des différentes étiologies potentielles, par exemple dans les méningites primitives

93 non documentées, les méningites du nouveau-né ou secondaires à un geste chirurgical, ou encore les pneumopathies communautaires graves ou nosocomiales. V.3.3. Patient [95] Chez un patient immunodéprimé, l association d antibiotiques a surtout pour objectif d être active sur les agents infectieux potentiellement en cause et d obtenir une bactéricidie plus rapide. Ceci est particulièrement vrai chez les patients neutropéniques. En cas de fièvre chez un neutropénique, le traitement de référence consiste à associer une β-lactamine à large spectre avec un aminoside. Secondairement en cas de fièvre persistante à la quarante-huitième heure, ou d emblée si le patient est porteur d un cathéter central, un glycopeptide ou de la fosfomycine est ajouté. Enfin, en cas d échec clinique persistant, l introduction d un antifongique peut s avérer nécessaire (Tableau XIXA). Tableau XIXA. Place des β-lactamines en traitement de première intention devant une fièvre isolée chez un patient neutropénique [95]. Bactéries en caus Escherichia coli +++ Klebsiella spp. + Autres entérobactéries +/- Pseudomonas aeruginosa ++ Enterococcus +/- Streptocoques non groupables + Staphylococcus aureus ++ Staphylocoques à coagulase négative +++ Corynébactéries Traitement Absence de cathéter et pas de décontamination digestive Ceftazidime ou imipénème ou ticarcilline-acide clavulanique ou pipéracilline-tazobactam ou céfépime + aminoside Absence de cathéter et décontamination digestive préalable Céfotaxime ou ceftriaxone ou cefpirome + aminoside Patient porteur d un cathéter central ajout de glycopeptide ou de fosfomycine +/- : rare ; + : assez fréquent ; ++ : fréquent ; +++ : très fréquent

94 V.4. Administration des β-lactamines en cas d insuffisance hépatique ou rénale V.4.1. Chez le patient insuffisant rénal [96] La réduction des posologies doit être importante pour les β-lactamines éliminées presque exclusivement par voie rénale sous forme active non métabolisée. Les adaptations posologiques préconisées en fonction de la clairance de la créatinine sont indiquées dans les recommandations de l autorisation de mise sur le marché de chaque β-lactamine. Il est souvent préférable de diminuer les quantités de β-lactamines administrées en gardant le même intervalle de temps que chez un sujet ayant des fonctions rénales normales, afin de maintenir pendant un temps suffisant une concentration sanguine supérieure à la CMI de la bactérie. La réduction de la posologie journalière ne doit intervenir que lorsque la clairance de la créatinine est inférieure à 30 ml/min pour les céphalosporines acétylées et métabolisées par désacétylation (céfalotine, céfapirine, céfotaxime), pour les uréidopénicillines (en raison d une élimination biliaire d environ 20 %) et pour les carboxypénicillines. Il n est pas nécessaire (ou très peu) de modifier la posologie des β-lactamines ayant une élimination hépatobiliaire très importante comme la ceftriaxone et le céfotétan. En présence d une insuffisance rénale terminale (anurie) nécessitant une hémodialyse ou une dialyse péritonéale, il faut tenir compte de l effet de la dialyse sur les taux sériques et la demi-vie de la β-lactamine (Tableau XXA)

95 En cas de b-lactamine dialysable, il faut administrer une dose d antibiotique après chaque séance de dialyse en tenant compte des concentrations sériques après dialyse. Tableau XXA. Classification des β-lactamines selon leur capacité de dialyse [96]. β-lactamines dialysables Coefficient d extraction (> 40 %) Demi-vie écourtée par dialyse Pénicilline G Aminopénicillines Carboxypénicillines Uréidopénicillines Céphalosporines faiblement liées aux protéines plasmatiques Aztréonam Imipénème Méropénème β-lactamines dialysables Demi-vie non modifiée par dialyse Pénicillines antistaphylococciques fortement liées aux protéines plasmatiques Céphalosporines fortement liées aux protéines plasmatiques Ceftriaxone Céfopérazone Céfamandole Chez les sujets âgés, il est prudent de diminuer la posologie journalière des β-lactamines à élimination rénale importante en tenant compte de l état fonctionnel rénal et de la diminution du volume de distribution des antibiotiques qui aboutit à une augmentation de leurs taux sériques indépendamment de l état fonctionnel rénal. V.4.2. Chez le patient insuffisant hépatique [66] Il n y a pas de contre-indication absolue à l utilisation des β-lactamines en cas d insuffisance hépatique sévère. L oxacilline et l association amoxicillineacide clavulanique doivent être utilisées avec précaution, en diminuant la posologie et sous contrôle des tests fonctionnels hépatiques. Les uréidopénicillines, le céfotétan, la ceftriaxone et le céfixime peuvent être

96 utilisés, mais en réduisant leur posologie journalière. La plupart des autres pénicillines et les céphalosporines non métabolisées qui sont éliminées sous forme principalement rénale peuvent être utilisées sans restriction avec leur dosage usuel. En cas d association d insuffisance rénale et hépatique, la réduction de la posologie journalière s impose dans tous les cas. VI. Effets secondaires et interactions médicamenteuses VI.1. Effets indésirables des bêta-lactamines [70,97, 98] Les β-lactamines sont parmi les antibiotiques les plus prescrits et les mieux tolérés. Les effets indésirables les plus fréquents et potentiellement les plus graves sont d ordre immunologique et dominés par les réactions d hypersensibilité. L allergie vraie aux β-lactamines est rare mais peut être grave et il importe de la rechercher car elle contre-indique formellement l emploi de ces molécules. VI.1.1. Réactions d hypersensibilité [97] Avec la pénicilline G, ce type de réaction survient chez 0,6 à 10 % des patients sous traitement. Les réactions générales sont rencontrées dans environ 2 % des traitements, dont 10 % de chocs anaphylactiques. L évolution du choc anaphylactique est fatale dans 1 % des cas, ce qui représente 0,002 % des traitements par β-lactamines. Le déterminant antigénique majeur de la réaction d hypersensibilité immédiate pour les pénicillines est la combinaison avec des protéines du principal métabolite de la pénicilline : le radical benzylpénicilloyl. Les réactions avec les céphalosporines sont plus rares et moins intenses : le risque de réaction allergique aux céphalosporines chez les sujets déjà allergiques

97 aux pénicillines est de l ordre de 5 à 15 %. Ces réactions sont essentiellement cutanées (urticaire, éruption morbiliforme) et plus rarement systémiques, de type fièvre, maladie sérique ou réaction anaphylactique. L aztréonam peut être utilisé chez les patients allergiques aux autres β-lactamines du fait de ses propriétés antigéniques différentes. Les réactions allergiques aux pénicillines peuvent être divisées en plusieurs groupes. a-réactions d hypersensibilité immédiate Elles surviennent dans les 30 minutes qui suivent l administration de l antibiotique. Elles sont dues à l interaction de l antigène avec des anticorps immunoglobulines (Ig) E fixés sur la membrane des mastocytes ou des cellules basophiles, et à la libération d histamine et autres amines vasoactives. Le choc anaphylactique survient dans les secondes à minutes qui suivent l ingestion ou l administration parentérale de l antibiotique. Les principales manifestations, diversement associées, sont les nausées, les vomissements, les douleurs abdominales, un oedème laryngé, un bronchospasme, une éruption papuleuse érythémateuse, un prurit intense, une hypotension, une arythmie et un collapsus. b-réactions d hypersensibilité accélérée Elles surviennent entre 30 minutes et 72 heures après le contact avec l antigène et résultent de la circulation de complexes immuns (mettant en jeu des IgE) et de l activation du complément. Les principales manifestations sont un érythème, un prurit, une urticaire et surtout un oedème du larynx pouvant entraîner une asphyxie

98 c-réactions d hypersensibilité retardée Les réactions d hypersensibilité retardée sont observées après la soixantedouzième heure et sont les plus fréquentes des réactions à la pénicilline (de 80 à 90 % des cas). Elles résultent de l activation de lymphocytes T sensibilisés exerçant une activité cytotoxique. La manifestation la plus fréquente est une éruption morbilliforme, accompagnée de prurit, mais d évolution toujours favorable. Plus exceptionnellement peuvent survenir un syndrome de Stevens- Johnson, une épidermolyse nécrotique ou une dermite exfoliative. d-maladie sérique La maladie sérique est une réaction cutanée systémique d hypersensibilité survenant après une période de latence de 4 à 12 jours correspondant au délai de production des anticorps. Elle se caractérise par un prurit suivi d un érythème au point d injection de l antibiotique et de manifestations systémiques : fièvre, éruption cutanée, arthrite, lymphadénopathie. Les manifestations systémiques de la maladie sérique sont liées aux IgG, alors que les IgE et l activation des mastocytes et des basophiles par le complément sont à l origine des lésions cutanées. e-autres effets d origine immunologique La fièvre, parfois isolée, souvent associée à d autres manifestations, ainsi que diverses manifestations hématologiques comme une anémie hémolytique, une neutropénie, une éosinophilie ou une thrombopénie sont d ordre immunologique

99 f-manifestations non liées à l hypersensibilité En dehors de manifestations allergiques communes à l ensemble des pénicillines, le groupe de la pénicilline G montre plus de neurotoxicité (crises convulsives, myoclonies, obnubilation, coma). Elle se rencontre lors de l utilisation de doses élevées par voie intraveineuse, au-delà de 30 MUI par jour, ou en cas d insuffisance rénale. La notion d antécédents convulsifs doit rendre prudent l emploi des β-lactamines. La réaction de Herxheimer (fièvre, frisson, sudations, hypertension artérielle, aggravation des lésions cutanées) a été décrite lors du traitement des syphilis secondaires après la première injection. Elle résulte de la libération d endotoxine par les tréponèmes lysés. g-manifestations digestives Compte tenu de leur spectre, les aminopénicillines et surtout l association amoxicilline-acide clavulanique ainsi que les céphalosporines orales sont susceptibles d induire un déséquilibre de la flore digestive, avec des manifestations à type de diarrhée, nausées, vomissements, douleurs abdominales, qui surviennent dans 5 à 10 % des cas. Avec la clindamycine, les b-lactamines, en particulier les aminopénicillines avec et sans inhibiteurs et les céphalosporines, sont les antibiotiques les plus susceptibles d induire des diarrhées et colites à C. difficile. h-pseudolithiase biliaire Cette manifestation est décrite avec la ceftriaxone et correspond à la précipitation de l antibiotique dans la bile en relation avec des concentrations élevées

100 VI.1.2. Effets indésirables liés aux formes parentérales Les douleurs aux points d injection sont fréquentes avec les céphalosporines injectables. Les thrombophlébites et les réactions locales de type veinite sur les trajets perfusés justifient le recours à des perfusions intraveineuses courtes (de 30 à 60 minutes). VI.2. Interactions médicamenteuses [99] Avec les β-lactamines, les interactions médicamenteuses pouvant avoir un retentissement clinique significatif sont peu nombreuses et résumées dans le Tableau XXIA. Tableau XXIA. β-lactamines et interactions médicamenteuses [99]. Seule l association pénicilline et méthotrexate est déconseillée du fait du risque augmenté de toxicité hématologique. Dans d autres cas, l interaction est à prendre en compte avec éventuellement une surveillance adaptée. Ainsi, pour les molécules possédant le radical méthyl-thio-tétrazole comme le moxalactam, le céfamandole, la cefopérazone ou le céfotétan, il peut apparaître un effet

101 Antabuse lors de l utilisation concomitante d alcool ou de médicaments à substrat alcoolique, jusqu à 72 heures après l arrêt du traitement, ou des troubles de la coagulation avec signes hémorragiques par chute du taux de prothrombine. Ces problèmes hémorragiques sont liés à la réduction de la synthèse des procoagulants vitamine K-dépendants et justifient une surveillance régulière de l hémostase, en particulier lors de la prise concomitante d anticoagulants oraux. VII. Conclusion L utilisation des antibiotiques a largement contribué à améliorer la santé des populations dans les 60 dernières années. Parmi ces antibiotiques, la famille des β -lactamines a toujours tenu une place de choix dans l arsenal thérapeutique et prophylactique contre les maladies infectieuses bactériennes. Comme pour la plupart des antibiotiques, leur utilisation intensive, trop souvent excessive, a créé une «pression antibiotique» à laquelle a rapidement répondu le génie bactérien avec l émergence et l extension rapide des résistances acquises permettant la survie bactérienne en présence de l antibiotique. Cette évolution a créé un problème majeur de santé publique, d autant plus que la course de vitesse entre le développement de nouvelles molécules antibiotiques et l apparition de nouveaux mécanismes de résistance a tourné à l avantage du génie bactérien. Il en résulte une plus grande difficulté à traiter les patients infectés, des hospitalisations prolongées et des coûts significatifs pour la collectivité. La stratégie qui s impose aujourd hui est donc une utilisation plus rationnelle de cette arme thérapeutique et prophylactique majeure à travers la mise en œuvre, aussi bien en ville qu à l hôpital, de bonnes pratiques d antibiothérapie. De cette façon, la famille des β-lactamines, comme d autres familles d antibiotiques, pourra conserver toute son efficacité

102 .. 3 ème partie : Entérobactéries et mécanisme de résistance aux β -lactamines

103 Citrobacter diversus [100] Famille des Enterobacteriaceae, également connue sous les noms de Citrobacter koseri ou Levinea malonatica. I- Pouvoir pathogène Les souches de Citrobacter diversus sont impliquées dans des épidémies de méningites néonatales, de septicémies et diverses infections intestinales. II- Principaux caractères biochimiques Citrobacter diversus appartient au groupe des bactéries ONPG-positives et VP-négatives. Fermentation des sucres : glucose + Réduction des nitrates en nitrites + Métabolisme du tryptophane en indole + ONPG + Ornithine décarboxylase ODC + H2S - UREASE - TDA - VP - III- Résistance naturelle [101, 102, 103, 104, 105] C. diversus est naturellement résistant aux pénicillines (amoxicilline, ticarcilline) par production d une β-lactamase de classe A chromosomique

104 inductible et inhibée par l acide clavulanique. L enzyme, codée par le gène cdia. L analyse de la séquence nucléotidique de CdiA indique que cette enzyme présente un degré de similarité élevé avec l enzyme chromosomique K1 de Klebsiella oxytoca pour laquelle deux sous-types distincts ont également été identifiés (OXY-1 et OXY-2). IV- Résistance acquise [106,107] β-lactamases de classe A à spectre étendu (BLSE) : Des souches de C. diversus productrices de BLSE SHV-4 ou TEM-3 ont été isolées

105 Citrobacter freundii [100] Famille des Enterobacteriaceae. Bacille à Gram négatif, mobile. I- Pouvoir pathogène Citrobacter freundii peut être responsable d infections urinaires, d infections de plaies ou encore de septicémies. Germe fréquemment isolé en milieu hospitalier. II- Principaux caractères biochimiques C. freundii appartient au groupe des bactéries ONPG-positives, VP négatives. Fermentation des sucres : glucose + Réduction des nitrates en nitrites + Métabolisme du tryptophane en indole - ONPG + H2S généralement + Urease - TDA - VP - III- Résistance naturelle [108, 109, 110, 111] C. freundii est naturellement résistant à l amoxicilline, à amoxicillineclavulanate et à la céfoxitine par production d une β-lactamase chromosomique de classe C, inductible AmpC. Les souches sauvages restent sensibles à la

106 ticarcilline, à ticarcilline clavulanate, à la pipéracilline et au céfamandole, et présentent une résistance de niveau intermédiaire à la céfalotine. IV- Résistance acquise [112, 113, 114, 115, 116] IV.1. β-lactamases chromosomiques de classe C : des mutations conduisant à la synthèse constitutive à haut niveau de la beta-lactamase chromosomique AmpC entraînent la résistance de C. freundii à la ticarcilline, à ticarcilline-clavulanate, à la pipéracilline, au céfamandole, aux céphalosporines de troisième génération et, à un degré moindre, à l aztréonam. Ces mutations touchent le système complexe de régulation de l expression du gène ampc qui comprend trois gènes : ampr, ampd et ampg. a. ampr code pour une protéine qui joue le rôle de régulateur de transcription de AmpC. AmpR est un activateur de type LysR, c est à dire qu il active l expression d AmpC en présence de β-lactamine, mais se comporte comme un répresseur de l expression d AmpC en absence de β-lactamine. AmpR se fixe au niveau du site opérateur localisé dans le motif LysR situé en amont du gène ampc. Des mutations dans le gène ampr (G102E) peuvent transformer la protéine AmpR en activateur constitutif de l expression de AmpC, même en absence de β-lactamine. La régulation de l expression d AmpC via AmpR est également dépendante du métabolisme du peptidoglycane. En effet, un des précurseurs du peptidoglycane (l UDP-MurNAc-pentapeptide) diminue la capacité de la protéine AmpR à activer l expression d AmpC, alors que les produits de dégradation du peptidoglycane (anhmurnac-tripeptide) ont un effet inverse

107 b. ampd code pour une protéine cytosolique qui agit comme répresseur de l expression d AmpC. La protéine AmpD est une N-acétylmuramyl-Lalanine amidase qui contribue au métabolisme du peptidoglycane. En particulier, AmpD reconnait et détruit spécifiquement les produits de dégradation du peptidoglycane qui sont des activateurs de l expression de la β-lactamase AmpC. En absence d AmpD, il y a accumulation de ces produits de dégradation et augmentation de l expression d AmpC. Différentes mutations ont été caractérisées dans ampd à 95-codon stop) peuvent entraîner l inactivation totale d AmpD. On observe partir de souches mutantes de C. freundii. Certaines (Val-33-Gly, Asp-164-Glu, Trp-alors une augmentation de l expression d AmpC. D autres (Trp- 95- Arg, Tyr-102-Asp, Ala-158-Asp, Asp-121-Gly) entraînent un phénotype hyperinductible. c. ampg est une protéine transmembranaire de 53-Kda qui pourrait jouer le rôle de transducteur de signal dans le système d induction de la beta lactamase AmpC. d. β-lactamases de classe A à spectre étendu (BLSE) : des BLSE de type TEM ont été décrites chez C. freundii. Enfin, il faut noter que des souches hébergeant une β-lactamase chromosomique AmpC mutée ont été étudiés (mutation en position Glu-219 dans la betalactamase). L enzyme se caractérise par une activité enzymatique plus élevée pour les céphalosporines de troisième génération. IV.2. Résistance aux carbapénèmes [117] : elle est due à une hyperproduction de la β-lactamase chromosomique de classe C et à une

108 altération de la perméabilité membranaire (diminution du niveau de synthèse des porines) Enterobacter [100] Famille des Enterobacteraceae, comprenant de nombreuses espèces comme Enterobacter aerogenes ou Enterobacter cloacae. Bacilles à Gram négatif, mobiles, I- Pouvoir pathogène Les souches du genre Enterobacter sont souvent responsables d infections nosocomiales. E. cloacae et E. aerogenes peuvent être isolés à partir d infections urinaires ou de plaies. II- Principaux caractères biochimiques E. cloacae et E. aerogenes sont des bactéries mobiles, ONPG-positives, VP-positives. Fermentation des sucres : glucose + Reduction des nitrates en nitrites + Métabolisme du tryptophane en indole - ONPG + H2S - Urease - TDA - VP

109 III- Résistance naturelle [118, 119,120] E. cloacae et E. aerogenes sont naturellement résistants à l amoxicilline, à amoxicilline-clavulanate, à la céfalotine et à la céfoxitine par production d une β-lactamase chromosomique de classe C, inductible AmpC. Les souches sauvages restent sensibles à la ticarcilline, à ticarcilline-clavulanate et à la pipéracilline et au céphamandole. IV- Résistance acquise [121, 122, 123, 124] IV.1.mutants de céphalosporinases de classe C : la production constitutive à haut niveau de la betalactamase chromosomique de classe C est un mécanisme fréquent chez Enterobacter. Elle entraîne une résistance additionnelle à la ticarcilline, à ticarcilline-clavulanate, au céfamandole, aux céphalosporines de troisième génération et à l aztréonam. IV.2. β-lactamases de classe A à spectre étendu (BLSE) : des β- lactamases à spectre de substrat étendu sont de plus en plus fréquemment identifiées dans les isolats cliniques d Enterobacter aerogenes. Des enzymes comme SHV-2, CAZ-6 et CTX-1, codées par des gènes plasmidiques, ont été décrites. La détection d une synergie avec le clavulanate nécessite souvent la réalisation d un antibiogramme complémentaire. IV.3. Résistance aux carbapénèmes : elle est encore rare. On peut l observer lorsqu il y a dans une même souche hyperproduction constitutive de la β-lactamase de classe C chromosomique et altération de la perméabilité par diminution du niveau de synthèse d une porine. IV.4. carbapénèmases de classe A [125, 126, 127] : Elles ont été décrites dans deux souches cliniques d E. cloacae qui présentaient une résistance

110 de haut niveau à l imipénème. Une synergie est observée à l antibiogramme entre l imipénème et le disque amoxicillineclavulanate. Les deux enzymes décrites à ce jour (Nmc-A et Imi-1) se caractérisent par une activité d hydrolyse élevée vis-àvis des carbapénèmes et une sensibilité à l inhibition par l acide clavulanique. Génétiquement, elles sont plus proches des β-lactamases de classe A (type TEM, SHV par exemple) que des enzymes chromosomiques de classe C. Escherichia coli [100] I- Introduction Famille des Enterobacteriaceae. On trouve Escherichia coli en abondance dans la flore commensale, en particulier dans le tube digestif. II- Caractères culturaux Bacille aérobie, à Gram négatif, oxydase négatif, nitrate positif et qui fermente le glucose. III- Pouvoir pathogène 1. infections urinaires (impliqué dans 80 % des infections urinaires) 2. septicémies 3. méningites néonatales 4. infections intestinales (gastroentérites) ; on distingue 5 pathovars : a. E. coli entéropathogène (diarrhées infantiles) b. E. coli entérotoxinogène (turista)

111 c. E. coli entéroinvasif (invasion des cellules intestinales) d. E. coli entérohémorragique (diarrhées sanglantes) e. E. coli entéroadhérent (diarrhée du voyageur) IV- Principaux caractères biochimiques Fermentation des sucres : glucose+ lactose+ Réduction des nitrates en nitrites : NO3+ Métabolisme du tryptophane en indole : ind+ V- Résistance naturelle Souches sensibles à toutes les β-lactamines, malgré la présence d une céphalosporinase chromosomique d espèce de classe C qui est exprimée à très bas niveau (présente mais non détectable). VI- Résistance acquise [128, 129, 130, 131] VI.1. β-lactamase de classe A haut niveau (pénicillinase) Résistance haut niveau à AMX, TIC ; inhibition de l activité enzymatique par l acide clavulanique (activité de AMC et TCC > AMX et TIC) ; activité réduite pour les uréidopénicillines (PIP) et les C1G (CF) et les C2G. En milieu hospitalier, 50 % des souches de E. coli produisent une pénicillinase [132]. ) [133, 134,135] VI.2. β-lactamase de classe A TRI (pénicillinase TRI Même phénotype que E. coli pénicillinase haut niveau, excepté la résistance haut niveau à AMC et TCC (pas d activité d inhibition de l acide

112 clavulanique). En milieu hospitalier, on peut trouver jusqu à 5 % des souches de E. coli résistantes au clavulanate. VI.3. β-lactamase de classe A à spectre étendu Résistance à l ensemble des pénicillines et céphalosporines, en particulier aux C3G (CTX, CAZ) et aux monobactames (ATM). L activité des céphamycines et de l imipénème n est pas modifiée. Une image de synergie (inhibition de l activité enzymatique par l acide clavulanique) est souvent détectée entre les C3G et AMC ou TCC [136]. Lorsque le niveau d expression de l enzyme est trop élevé, l image de synergie est plus difficile à mettre en évidence [119, 137, 138]. VI.4. Hyperproducteur de β-lactamase de classe C (céphalosporinase) [139, 140]. Résistance à AMX mais les carboxypénicillines (TIC) et les acyluréidopénicillines (PIP) restent actives. Pas d inhibition par le clavulanate résistance à AMC mais TCC reste actif. Résistance de haut niveau aux C1G (CF). Activité toujours diminuée (voir résistance de haut niveau) aux céphalycines (FOX). L activité des C2G, des C3G est légèrement diminuée, celle de l imipénème (IP) reste normale. On peut noter que l activité de l amoxicilline et des céphalosporines peut être restaurée en présence de BRL4215 qui est un inhibiteur puissant des β-lactamases de classe C

113 Klebsiella oxytoca [100] Famille des Enterobacteriaceae. Les caractères généraux de K. oxytoca sont identiques à ceux de K. pneumoniae, à l exception du métabolisme du tryptophane en indole qui est positif chez K. oxytoca. I- Pouvoir pathogène Infections urinaires, septicémies. A l hôpital, K. oxytoca est rencontrée moins fréquemment que K. pneumoniae. II- Principaux caractères biochimiques 1. Comme K. pneumoniae, sauf pour l indole 2. Métabolisme du tryptophane en indole : ind+ III- Résistance naturelle [141, 142, 143, 144, 145, 146] K. oxytoca est naturellement résistant aux pénicillines (amoxicilline, ticarcilline) par production d une β- lactamase de classe A chromosomique inhibée par l acide clavulanique. Cette β-lactamase, qui est appelée K1, est génétiquement différente de la β-lactamase chromosomique K2 de K. pneumoniae. L analyse d un grand nombre de souches de K. oxytoca a montré qu il existe deux soustypes différents d enzyme K1 : le groupe OXY-1 et le groupe OXY-2. Les enzymes des deux groupes présentent entre elles environ 90 % d homologie et sont caractérisées par une grande variabilité de points isoélectriques (de 5.2 à 8.8). OXY-1 et OXY-2 hydrolysent avec une bonne efficacité les amino- et carboxypénicillines, les céphalosporines de première et de deuxième génération, ainsi que la ceftriaxone et l aztréonam. Elles sont efficacement inhibées par le clavulanate. Les souches sauvages de K. oxytoca produisent à bas niveau

114 l enzyme chromosomique OXY-1 ou OXY-2. Elles sont de ce fait résistantes aux pénicillines (amoxicilline et ticarcilline, exemple : K. oxytoca 1821). L activité de ces antibiotiques est augmentée en présence d acide clavulanique (sensibilité à l augmentin et au claventin). Le niveau de production de l enzyme K1 (OXY-1 ou OXY-2) est trop faible pour que la résistance à l aztréonam soit détectable [147, 148]. IV- Résistance acquise [149,150]. IV.1. hyperproduction de la β-lactamase chromosomique K1 : des mutations ponctuelles dans la région du promoteur de transcription des enzymes chromosomiques K1 (type OXY-1 ou OXY-2) peuvent entrainer une augmentation du niveau de production de l enzyme. Cette augmentation du niveau d expression de la β-lactamase chromosomique se traduit in vivo par une résistance de haut niveau aux pénicillines, aux céphalosporines de première et deuxième génération, ainsi qu à l aztréonam (exemple : K. oxytoca 1001). Dans ce cas, une synergie peut être détectée entre les céphalosporines de troisième génération ou l aztréoname, et le clavulanate (exemple : K. oxytoca 1001). IV.2. β-lactamases de classe A à spectre étendu (BLSE) : La β-lactamase SHV-5 a été identifiée dans une épidémie de souches. Le gène blashv-5 était porté par un plasmide conjugatif

115 Klebsiella pneumoniae [100] Famille des Enterobacteriaceae. Germe commensal du tube digestif et des voies aériennes supérieures, ONPG-positive, VP-positive donnant des colonies d aspect muqueux. K. pneumoniae est fréquemment isolée de l environnement (eaux usées, sol, etc...) et de la flore commensale des muqueuses et des voies respiratoires supérieures. Bacille immobile, aéro-anaérobie, à Gram négatif, oxydase négatif, nitrate réductase positif et qui fermente le glucose I- Pouvoir pathogène Germe opportuniste impliqué dans des infections nosocomiales, généralement des infections urinaires, des pneumopathies et des septicémies. II- Principaux caractères biochimiques Fermentation des sucres : glucose+ Réduction des nitrates en nitrites : NO3+ Métabolisme du tryptophane en indole : ind- ONPG+ Ornithine décarboxylase : ODC- H2S- Urease+ TDA- VP+ (réaction de Voges-Proskauer)

116 III- Résistance naturelle [151,152] K. pneumoniae est naturellement résistant aux pénicillines (amoxicilline, ticarcilline) par production d une β-lactamase de classe A d espèce (chromosomique) appelée K2, inhibée par l acide clavulanique (exemple : Klebsiella pneumoniae 1189). IV- Résistance acquise IV.1. résistance aux inhibiteurs des β-lactamases [153,154,155,156,157] : des β- lactamases de classe A de type IRT insensibles à l acide clavulanique (mutants d enzymes TEM) ont été décrites. IV.2. β-lactamases de classe A à spectre étendu (BLSE) [158,159,160,161,162,163, 164] : de nombreuses souches de K. pneumoniae sont productrices de BLSE. Pour la plupart d entre elles, la production de BLSE se traduit par des images de synergie très caractéristiques entre les céphalosporines de troisième génération et l acide clavulanique (disque d augmentin ou de claventin) (exemple, K. pneumoniae 1249). On peut noter que certaines BLSE sont caractérisées par une activité faible vis-à-vis des céphalosporines de troisième génération. Dans ce cas, le niveau de résistance est bas et les images de synergies sont plus discrètes (exemple, K. pneumoniae 1112). La diversité des β-lactamases à spectre étendu décrites dans Klebsiella pneumoniae est très grande. Des BLSE telles que TEM-3, TEM-10 (ou MGH- 1), TEM-12 (ou YOU-2), TEM-24, TEM-26 (ou YOU-1) ont été décrites. De nombreux variants de type SHV sont également connus (SHV-4, SHV-5, SHV-6 ou SHV-8). Plus récemment, la BLSE TEM-52 a été caractérisée : elle présente

117 une activité inhabituelle vis-à-vis du moxalactame, ainsi qu une synergie entre cet antibiotique et le clavulanate. IV.3. β-lactamases plasmidiques de classe C [136,165,166,167,168,169,170] : chez Klebsiella pneumoniae, on connait un grand nombre de β-lactamases plasmidiques de classe C qui dérivent des céphalosporinases chromosomiques. On peut citer FOX-1 et MOX-1 (homologues à AmpC de P. aeruginosa), et LAT-1 et CMY-2 (homologues à AmpC de Citrobacter freundii). IV.4. résistance au céfépime et au cefpirome [171,172] : Elle a été récemment décrite chez K. pneumoniae et semble liée à la combinaison de deux mécanismes : la production à haut niveau d une BLSE SHV-5 et une diminution de la perméabilité de la membrane externe. IV.5. résistance à l imipénème [173, 174] : elle peut être due à l association d une imperméabilité de la membrane externe (perte d une porine de 42 Kda) à une production à haut niveau d une β-lactamase plasmidique de classe C (ACT- 1, homologue à AmpC de E. cloacae et MIR-1). On a également décrit au Japon une souche de K. pneumoniae résistante à l imipénème et à la ceftazidime et hébergeant le gène d une métallo-β-lactamase IMP sur une structure de type intégron

118 Morganella morganii [100] Famille des Enterobacteriaceae. Bacille à Gram négatif, initialement appelé Proteus morganii. I- Pouvoir pathogène Morganella morganii est souvent isolée d urines. Elle peut également être impliquée dans de nombreuses infections chez l homme. II- caractères biochimiques Morganella morganii appartient au groupe des bactéries ONPG-négatives. Fermentation Principaux des sucres : glucose + Réduction des nitrates en nitrites + Métabolisme du tryptophane en indole + ONPG - H2S - Urease + TDA + VP - Gélatinase - III- Résistance naturelle [175] Morganella morganii est naturellement résistante à la colistine. L amoxicilline, amoxicilline-clavulanate et céfalotine n ont pas d activité car Morganella morganii produit une β-lactamase chromosomique de classe C

119 inductible de type AmpC (exemple M. morganii 509). La séquence nucléotidique du gène ampc de M. morganii a été déterminée et présente environ 50 % d homologie avec les beta-lactamases chromosomiques de classe C de Pseudomonas aeruginosa (et enzymes plasmidiques apparentées CMY-1, FOX-1 et MOX-1), de Citrobacter freundii (et enzymes plasmidiques apparentées CMY-2, BIL-1 et LAT-1), et d Enterobacter cloacae (et enzyme plasmidique apparentée MIR-1). Les souches sauvages restent sensibles à la ticarcilline, à ticarcillineclavulanate, à la pipéracilline, à l imipénème, aux céphalosporines de troisième génération et à l aztréonam. Elles présentent une sensibilité diminuée au céfamandole et à la céfoxitine. IV- Résistance acquise [176] IV.1. β-lactamases chromosomiques de classe C : comme chez Citrobacter freundii, des mutations entraînant la production constitutive à haut niveau de la céphalosporinase chromosomique de type AmpC peuvent être responsable de la résistance acquise de M. morganii à la ticarcilline, à ticarcilline-clavulanate, aux céphalosporines de troisième génération et à l aztréonam. IV.2. β-lactamases de classe A à spectre étendu (BLSE) : une β-lactamase de type SHV a été décrite dans une souche clinique de M. morganii

120 Proteus mirabilis [100] Famille des Enterobacteriaceae. Germe commensal du tube digestif, ONPG-négative, TDA-positive, qui envahit la surface des milieux gélosés. Bacille très mobile, aéro-anaérobie, à Gram négatif, oxydase négatif, nitrate positif et qui fermente le glucose. I- Pouvoir pathogène Germe impliqué dans des infections urinaires (10 % des infections urinaires en ville) et d autres infections. II- Principaux caractères biochimiques Fermentation des sucres : glucose+ Réduction des nitrates en nitrites : NO3+ Métabolisme du tryptophane en indole : ind- ONPG- Ornithine décarboxylase : ODC+ H2S+ Urease+ TDA+ III- Résistance naturelle P. mirabilis est naturellement résistant à la colistine. Souches sensibles à toutes les β-lactamines (pas de céphalosporinase chromosomique de classe C, exemple : Proteus mirabilis 1761)

121 IV- Résistance acquise Mécanismes identiques à ceux décrits pour E. coli. IV.1. β-lactamase de classe A haut niveau (pénicillinase) : des carbénicillinases (type PSE-4) ont été décrites [177]. IV.2. résistance aux inhibiteurs des β-lactamases : un mutant de type TEM, IRT-2 (Arg244Ser), a été décrit en association avec TEM-1 dans une souche insensible aux inhibiteurs des β-lactamases de classe A [178]. IV.3. β-lactamases de classe A à spectre étendu (BLSE) : une souche produisant TEM-10 a été décrite [179]. IV.4. résistance à l imipénème : chez P. mirabilis, elle n est pas d origine enzymatique. La résistance à l imipénème semble associée à une altération des PLP1A et 2 (protéines liant la pénicilline) [180]

122 Proteus vulgaris [100] Famille des Enterobacteriaceae. Germe commensal du tube digestif. Bacille très mobile, aéro-anaérobie, à Gram négatif, oxydase négatif, nitrate positif, qui fermente le glucose et qui envahit la surface des milieux gélosés. Proteus penneri forme un biogroupe de P. vulgaris. I- Pouvoir pathogène Germe impliqué dans des infections urinaires, mais aussi d infections nosocomiales diverses. II- Principaux caractères biochimiques Fermentation des sucres : glucose+ Réduction des nitrates en nitrites : NO3+ Métabolisme du tryptophane en indole : ind+ ONPG- Ornithine décarboxylase : ODC- H2S+ Urease+ TDA+ III- Résistance naturelle P. vulgaris est naturellement résistant à la colistine. P. vulgaris produit une β-lactamase chromosomique inductible de classe A qui présente 68 la β-lactamase de classe A de Klebsiella oxytoca. De ce fait, P. vulgaris est naturellement résistant à l amoxicilline, à la céfalothine et au

123 céfamandole, mais reste sensible à la ticarcilline et aux associations amoxicilline + clavulanate et ticarcilline + clavulanate (exemple : P. vulgaris 613, P. penneri 1584). En raison de l induction, on note souvent une image d antagonisme entre CTX et MA. On peut voir également des images de synergie entre les céphalosporines de troisième génération et le clavulanate (par exemple, entre CTX, CAZ et AMC). La spécificité de substrat particulière vis à vis des oxyiminocéphalosporines de l enzyme de P. vulgaris, codée par le gène cuma, est due en particulier à la présence d un résidue de type sérine en position 237. L induction de la β-lactamase est liée à la présence d un gène régulateur, cumr (ou encore blaa) qui appartient à la famille des régulateurs de type LysR. In vitro, CumR se fixe à une séquence inversée répétée qui se trouve juste en amont du gène de la β-lactamase. IV- Résistance acquise Des mutants hyperproducteurs de la β-lactamase chromosique de classe A sont résistants aux céphalosporines de troisième génération, des images de synergie pouvant être observées avec le clavulanate

124 Providencia [100] Famille des Enterobacteriaceae. Bacille à Gram négatif. Le genre Providencia comprend de nombreuses espèces dont Providencia stuartii, Providencia rettgeri. I- Pouvoir pathogène P. stuartii et P. rettgeri peuvent être responsables d infections urinaires et autres infections chez l homme. II- Principaux caractères biochimiques Providencia stuartii appartient au groupe des bactéries ONPG-négatives. Fermentation des sucres : glucose + Réduction des nitrates en nitrites + ONPG - H2S - Urease variable TDA + VP - Gélatinase - P. rettgeri est urease + III- Résistance naturelle Providencia stuartii est naturellement résistante à la colistine. Providencia stuartii produit une β-lactamase chromosomique de classe C inductible de type

125 AmpC (exemple P. stuartii 2341). Les souches sauvages sont donc naturellement résistantes à l amoxicilline, à amoxicilline-clavulanate et à la céphalotine. Elles restent généralement sensibles aux autres β-lactamines. IV- Résistance acquise β-lactamases chromosomiques de classe C : comme chez Citrobacter freundii, des mutations entraînant la production constitutive à haut niveau de la céphalosporinase chromosomique de type AmpC peuvent être responsable de la résistance acquise de P. stuartii à la ticarcilline, à ticarcilline-clavulanate, au céfamandole, aux céphalosporines de troisième génération et à l aztréonam. Exceptionnellement, on peut isoler des souches ayant perdu la β-lactamase chromosomique de classe C mais ayant acquis à la place une β-lactamase de classe A inhibée par le clavulanate (exemple P. stuartii 812)

126 Serratia marcescens Famille des Enterobacteriaceae, qui peut produire des pigments. [181] I- Pouvoir pathogène [182], Les souches de Serratia marcescens sont souvent retrouvées lors d infections nosocomiales. II- Principaux caractères biochimiques [181] Serratia marcescens appartient au groupe des bactéries ONPG-positives, VP-positive. Fermentation des sucres : glucose + Réduction des nitrates en nitrites + Métabolisme du tryptophane en indole - ONPG + H2S - Urease - TDA - VP + III- Résistance naturelle [182,183,184] S. marcescens est naturellement résistant à l amoxicilline, à amoxicillineclavulanate, à la céfalotine et au céfamandole par production d une β- lactamase chromosomique de classe C inductible AmpC: (exemple : S. marcescens 1825). Les souches sauvages présentent une résistance de niveau intermédiaire à la céfoxitine mais restent sensibles à la ticarcilline, à ticarcilline-clavulanate et à la

127 pipéracilline. La séquence du gène codant pour AmpC a été déterminée (dans la souche SR50). Elle présente environ 40 % d identité avec les séquences des autres gènes ampc connues chez E. coli, C. freundii et P. aeruginosa. L enzyme se caractérise par une faible activité pour les céphalosporines de troisième génération, en particulier la ceftazidime et l aztréonam. IV- Résistance acquise IV.1. β-lactamases de classe A à spectre étendu (BLSE) [185, 186] : des variants de type TEM et SHV ont été décrits (par exemple, SHV-5a). Un nouveau mutant de type TEM a également été caractérisé dans une souche de S. marcescens. L enzyme présente un nombre inhabituel de mutations. Ce variant a une activité d hydrolyse élevée pour la ceftazidime et l aztréonam, et il est peu sensible à l action inhibitrice de l acide clavulanique. D autres enzymes à spectre étendu ont été décrites, par exemple la BLSE de classe A CKH-1 de pi 8,2. IV.2. mutants de céphalosporinases de classe C [187, 188] : on a récemment décrit une β-lactamase chromosomique, appelée SRT-1, dans une souche de S. marcescens résistante aux céphalosporines de troisième génération, en particulier à la ceftazidime et au céfuroxime. L enzyme, de pi 8,6, est 96 % identique à l enzyme chromosomique décrite dans S. marcescens SR50. Elle se caractérise par une activité d hydrolyse élevée vis-à-vis des oxyiminocéphalosporines. Cette activité serait liée à la présence d un résidu lysine à la position 213 (motif DAKS) au lieu d un acide glutamique (DAES) présent dans l enzyme chromosomique sauvage de SR50. IV.3. carbapénèmases de classe A [189, 190, 191] : une enzyme de classe A, Sme- 1, capable de conférer la résistance aux carbapénèmes, a été décrite chez S

128 marcescens. L expression de cette enzyme est contrôlée par un gène régulateur Sme-R (activateur positif). IV.4. métallo-β-lactamases [192, 193, 194, 195, 196, 197] : en 1994, une métallo-βlactamase à zinc, IMP-1, a été décrite chez une souche de S. marcescens isolée au Japon. Elle est caractérisée par une activité d hydrolyse élevée des carbapénèmes, et est inhibée par le mercure, l EDTA. Sa séquence peptidique est proche de celles des métallo-β-lactamases de Bacteroides fragilis, Bacillus cereus, et Aeromonas hydrophila. Le site actif possède le motif His-95, His-97, Asp-99, Cys-176, et His-215 impliqué dans la fixation de l atome de zinc. Le gène de l enzyme IMP-1 est maintenant trouvé en position plasmidique, sur un intégron de type inti3, ce qui facilite considérablement sa dissémination (il a été retrouvé chez P. aeruginosa, S. marcescens, K. pneumoniae et P. putida au Japon). IV.5. Autres mécanismes de résistance [198,199] : La résistance par hyperproduction constitutive de la céphalosporinase chromosomique AmpC a été décrite (exemple, S. marcescens 451). Ce mécanisme peut être trouvé en association avec la production d une autre beta-lactamase, par exemple une pénicillinase (S. marcescens 897). Des mutants de porines ont également été décrits dans des souches hyperproductrices de la β-lactamase chromosomique de classe C

129 Salmonella [100] Famille des Enterobacteriaceae. Bactéries pathogènes, à transmission orofécale, agents des fièvres typhoïde et paratyphoïde, et d infections intestinales. Bacille mobile aéro-anaérobie, à Gram négatif, oxydase négatif, nitrate positif et qui fermente le glucose. I- Pouvoir pathogène Il est différent pour les salmonelles majeures (que l on ne trouve que chez l homme) et les salmonelles mineures (ubiquistes). Salmonella majeures : Salmonella Typhi, S. Paratyphi, respectivement responsables des fièvres typhoïdes et paratyphoïdiques. La transmission se fait par les selles des malades. Après infection, l hémoculture se positive avant la coproculture (passage dans le sang, puis retour dans l intestin grêle). Salmonella mineures : Salmonella, responsables de gastroentérites (bactéries entéropathogènes invasives). Ces germes sont portés par l homme et l animal. Les salmonelles mineures sont impliquées dans 30 à 60 % des infections alimentaires. Un manque d hygiène est très souvent à l origine de la transmission. II- Principaux caractères biochimiques Fermentation des sucres : glucose+ lactose- Réduction des nitrates en nitrites : NO3+ Métabolisme du tryptophane en indole : ind- H2S+ Urease- TDA

130 Il existe trois types d antigènes, urilisés pour le diagnostic : 1. l antigène de paroi «somatique» (O) 2. l antigène flagellaire (H) 3. l antigène d enveloppe (Vi) III- Résistance naturelle Souches sensibles à toutes les β-lactamines (pas de céphalosporinase chromosomique de classe C, exemple : Salmonella xxxx). IV- Résistance acquise Mécanismes identiques à ceux décrits pour E. coli. IV.1. β-lactamase de classe A haut niveau (pénicillinase) : Exemple : Salmonella 1409, S. Typhi IV.2. résistance aux inhibiteurs des beta-lactamases : l hyperproduction de beta-lactamase TEM a été décrite. IV.3. β-lactamases de classe A à spectre étendu (BLSE) : TEM-27, plasmidique et associée à un haut niveau de résistance à la ceftazidime et à l aztréonam. PER-1, qui n appartient pas à la famille des enzymes TEM/SHV et qui a été détectée lors d une épidémie en Turquie. IV.4. β-lactamases plasmidiques de classe C (céphalosporinases) : a. CMY-2, plasmidique, homologue à AmpC de C. freundii. b. DHA-1, plasmidique et conférant la résistance aux céphalosporines et aux céphamycines

131 4 ème partie : Partie pratique

132 I. Méthodes et matériel : Cette étude a été réalisée au laboratoire de microbiologie du centre hospitalier IBN-SINA de Rabat. Il s agit d une étude statistique rétrospective effectuée au cours de trois dernières années et ayant pour objectifs de suivre l évolution de la résistance des entérobactéries vis-à-vis des β-lactamines. Pour cela, nous nous sommes basés sur les résultats fournis par les registres des archives du laboratoire de bactériologie des années que nous avons analysés. Pour ce faire, nous avons pris en considération les éléments suivants : I.1. Les prélèvements : Dans ce travail nous ne considérons que les cultures positives (présence de germe dans les prélèvements). Le laboratoire de microbiologie a reçu en trois ans 4519 prélèvements positifs d urines (ECBU), de pus, LCR et d Hémoculture. Nous regroupons sous le terme de «Pus» les prélèvements suivants : Pus, cathéter, écouvillon, sonde vésicale, sonde d intubation, drain pleural, liquide d ascite, liquide pleurale, liquide digestive, prélèvement vaginal, prélèvement d otite, prélèvement nasal, prélèvement d os, abcès, crachats, sécrétion bronchique, PDP, tissus cutanée. I.2. Sensibilité aux antibiotiques : La sensibilité a été déterminée par un antibiogramme standard selon la méthode de diffusion en milieu gélosé de Mueller-Hinton

133 Les souches bactériennes ont été classées en trois catégories clinique : sensible (S), intermédiaire (I) et résistante (R). Les souches I ont été groupées avec les souches R pour l ensemble des analyses. La résistance des germes isolés aux antibiotiques est déterminée selon la formule suivante : % de résistance = Nombre de souches résistantes à un antibiotique Nombre total de souches testées du même germe I.3. les antibiotiques étudiés : On a fixé pour cette étude les antibiotiques suivants : Pénicilline A : Pénicillines : Ampicilline [Ampicilline, Totapen ] Amoxicilline (AMX) [Cipamox, Clamox ] Amoxicilline + acide clavulanique (AMC) [Amoclavin, Augmentin ] Uréidopénicillines : Piperacilline Piperacilline + tazobactam (PTZ) Carboxypénicillines : Ticarcilline (TIC) Ticarcilline + acide clavulanique (TICC) Céphalosporines : Céphalosporines de première génération (C1G) : Cefalotine [Keflin ] Cefazoline [Céfacidal, Kefzol ] Cefalexine [Céporéxine, Kéforal ] Céphalosporines de deuxième génération (C2G) :

134 Cefamandol Cefuroxime [Zinacef ] Cefoxitine Céphalosporines de troisième génération (C3G) : Cefotaxime[Claforan ] Ceftazidime[Fortum ] Ceftriaxone[Rocephine ] Cefexime Cefpodoxime [Proxétil ] Céphalosporines de quatrième génération (C4G) : Cefpirone Cefepine Carbapénèmes : Imipenème IPM [Tiénam ] II. RESULTATS : Le laboratoire de Bactériologie-sérologie de l'hôpital Avicenne du CHU Sina de Rabat a reçu en trois ans, des prélèvements d'urines, de sang de PDP et autre types (liquide d'ascites, liquide pleural, cathéter, sonde d'intubation, crachats, prélèvements vaginaux etc.). Parmi toutes ces cultures nous distinguons des : Cultures négatives : Absence de germes dans le prélèvement. Cultures positives à entérobactéries : +++ Cultures positives contenant des BGN autres que les entérobactéries : Acinétobacter, pseudomonas

135 Cultures positives contenant des germes divers : Staphylocoques, lactobacillus, levures etc. Cultures positives contenant des associations : Entre 2 entérobactéries ou bien entre entérobactérie et autres germes divers Cependant notre travail se consacrera à l'étude des cultures positives à entérobactéries. II.1. Distribution des Entérobactéries en genres : II.1.1. Résultats globaux a- Fréquence relative des entérobactéries isolées en trois ans Tableau NºIB : Fréquence d'isolement des entérobactéries en trois ans Germes Total de souches isolées En nombre En % Escherichia ,17 Klebsiella ,22 Providencia 49 1,08 Citrobacter 64 1,42 Salmonella 16 0,35 Serratia 81 1,8 Morganella 29 0,64 Enterobacter ,03 Proteus 416 9,25 Total des souches

136 Histogramme Nº1 : Escherichia est le genre le plus fréquemment isolé avec une fréquence moyenne de 42,17%. Le genre Klebsiella vient en deuxième position (32,22%), suivis du genre Enterobacter (11,03%), puis le genre Proteus (9,25%). 9,259jk

137 b- Fréquence annuelle d'isolement des entérobactéries : Tableau NºIIB : Fréquence d'isolement des différents Genres d'entérobactéries au cours des trois ans : Genre Année 2005 Année 2006 Année 2007 En nombre En % En nombre En % En nombre En % Escherichia , , ,1 Klebsiella , , ,17 Providencia 15 1,23 5 0, ,86 Citrobacter 21 1, , ,41 Salmonella 1 0,08 6 0,34 9 0,58 Serratia 24 1, , ,19 Morganella 3 0, , ,03 Enterobacter 115 9, , ,41 Proteus , , ,22 Total Histogramme Nº2 :

138 Cet histogramme illustre parfaitement la fréquence d'isolement de différents genres d'entérobactéries au cours des trois dernières années. On constate une forte augmentation sur le taux global d'isolement des Entérobactéries entre 2005 et 2006 avec respectivement 1221 souches isolées en 2005 contre 1724 souches en l'an Cependant nous notons une baisse sur le taux d'isolement en 2007 par rapport à l'an

139 III. Resistance des Entérobactéries aux β-lactamines : III.1. Escherichia Antibiotiques Testés III.1.1. Résistance d'escherichia aux β-lactamines : Tableau N IIIB- Résistance des différentes souches d'escherichia aux β-lactamines. Année 2005 Année 2006 Année 2007 Total Souches R Total Souches R Total Souches R Des En Des En Des En En % En % souches nombre souches nombre souches nombre En % Ampicilline , , ,76 AMX , , ,16 AMC , , ,27 IPM , , ,78 TIC , TICC ,9 Piperacilline , ,42 PTZ

140 HistogrammeN 3 Nous remarquons une forte résistance des différentes souches d'escherichia à l'ampicilline 69,01% à l'amoxicilline 66,65%, à la Piperacilline 57.23% à la Ticariclline 54,60%, à l'association Ticarcilline-Clavulanate 47,96%, une résistance moindre à l'association Amoxicilline+Clavulanate 17,53 %, mais cette résistance va doubler en 2007 est devient 31,27%, une sensibilité de 98,97% à l'imipénème et de 100% à l'association Piperacilline-Tazobactam en

141 III.1.2. Résistance d'escherichia aux Céphalosporines : Tableau N IVB- Résistance du genre Escherichia aux Céphalosporines. % des souches résistantes en 2005 % des souches résistantes en 2006 % des souches résistantes en 2007 C1G 43,85(n=358) 45,56(n=338) 63,58(n=162) C2G 50(n=2) 29,28(n=140) 18,86(n=106) C3G 7,43(n=1292) 10,03(n=1585) 12,17(n=1158) C4G 9,8(n=51) 10,44(n=249) 20,11(n=169) Histogramme N

142 La résistance du genre Escherichia aux C1G, 2G, 4G augmente légèrement de 2005 à l'an 2007 : cependant elle est plus élevée pour les C1G (43,85% en 2005 et 63,58% en l'an 2007). Par contre cette résistance diminue pour les C2G. III.2. Groupe KES : Le groupe KES est constitué des trois genres suivants : - Genre Klebsiella - Genre Enterobacter - Genre Serratia

143 III.2.1. Résistance du groupe KES aux β-lactamines : Tableau N VB- Résistance du groupe KES aux différentes β-lactamines Antibiotiques Testés Année 2005 Année 2006 Année 2007 Total Souches R Total Souches R Total Souches R des En des En des En En % En % souches nombre souches nombre souches nombre En % AMC , , ,34 IPM , , ,97 TIC , , ,11 TICC , ,65 Piperacilline , ,85 PTZ ,

144 Histogramme N 5 Le niveau de résistance atteint par le groupe KES varié d'une β-lactamines à l'autre : La résistance est forte vis-à-vis de l'association Amoxicilline clavulanate et de la Ticarcilline. La résistance est moyenne vis-à-vis de la Piperacilline et de l'association Ticarcilline- clavulanate. Elle est très faible à l'association Piperacilline-Tazobactam. Une forte efficacité vis-à-vis de l'imipenème

145 III.2.2. Résistance du groupe KES aux Céphalosporines : Tableau N VIB : Résistance du groupe KES aux Céphalosporines % des souches résistantes en 2005 % des souches résistantes en 2006 % des souches résistantes en 2007 C1G 76,37 (n=436) 73,41 (n=346) 74,67 (n=233) C2G 70 (n=10) 54,4 (n=125) 32,72 (n=110) C3G 48,63 (n=1466) 40,95 (n=1631) 39,2 (n=1515) C4G 46,29 (n=54) 31,03 (n=232) 47,09 (n=155) Histogramme N

146 La résistance atteinte par le groupe KES aux Céphalosporines varié d'une classe à l'autre : Forte est stable durant les trois ans pour les C1G (74,81%), et de degré moindre pour les C4G (41,47%). Une diminution faible des C3G et remarquable pour les C2G presque de la moitié, elle passe de 70% en 2005 à 32,72% en 2007,

147 III.3. Groupe Proteus-Providencia-Morganella (PPM) : III.3.1. Résistance du Groupe PPM aux β-lactamines : Antibiotiques testés Total des souches Année 2005 Année 2006 Année 2007 Souches R Total Souches R Total Souches R En des des En En % En nombre En % nombre souches souches nombre En % Ampicilline , , ,66 AMX , ,66 AMC , , ,43 IPM , , ,96 Piperacilline , ,85 PTZ TIC , , TICC , ,33 Tableau N VIIB : Résistance des Entérobactéries du groupe Proteus-Providencia-Morganella aux β-lactamines

148 Histogramme N 7 Nous notons une résistance forte du groupe Proteus-Providencia- Morganella vis-à-vis de l'ampicilline (79,7%), de l'amoxicilline (78,14%), de la Ticarcilline (79,71%) et de l'association Amoxicilline clavulanate (54,25%). De degré moindre pour la Piperacilline (40,17%), l'association Ticarillineacide clavulanique (33,33%), et un très faible niveau de résistance pour l'imipénème

149 III.3.2. Résistance du Groupe PPM aux Céphalosporines : Tableau N VIIIB : Résistance du groupe PPM aux Céphalosporines : % des souches résistantes en 2005 % des souches résistantes en 2006 % des souches résistantes en 2007 C1G 69,29(n=114) 61,85(n=97) 70,21(n=47) C2G 0(n=2) 32,43(n=37) 41,93(n=31) C3G 24,75(n=416) 20,92(n=411) 24,92(n=317) C4G 40(n=10) 27,77(n=54) 33,33(n=24) Histogramme N

150 III.4. Résistance du genre Salmonella aux β-lactamines : Tableau N IXB : Résistance des salmonella aux β-lactamines : Antibiotiques testés Total de souches testées en trois ans Souches R en nombre Ampicilline 8 2 AMX 8 2 AMC 15 1 IPM 16 0 TICC 2 0 Piperacilline 2 0 C1G : Cefalotine 2 0 C2G : Cefuroxime Cefoxitime C3G : Cefotaxime Ceftazidime Ceftriaxone C4G : Cefpirome Cefepine L'effectif des souches de Salmonella isolées en trois ans est toujours inférieur à 20 : Ces résultats ne peuvent pas être illustrés sous forme d'histogramme, car ils sont statistiquement non interprétables. Néanmoins, ce tableau ne nous donnera qu'un bref aperçu concernant le niveau de résistance atteint par le genre Salmonella aux différentes β-lactamines testées : La plus parts des souches de Salmonella isolés ont montré une sensibilté à toutes les β-lactamines testées. Toutes les espèces du genre Salmonella sont sensibles à l'imipénème

151 Quelque espèce a une résistance à l'ampicilline (1/8), à l'amoxicilline (2/8), à l'association Amoxicilline clavulanate (1/15). Une parmi trois est résistante à la céfoxtime (C2G). Trois souches de Salmonella parmi 37 sont résistantes aux C3G (Cefotaxime, Ceftazidine, Ceftriaxone) III.5. Résistance des souches de citrobacter isolées en trois ans: Tableau N XB : Résistance de citrobacter aux différentes β-lactamines : β-lactamines testées Total de souches isolées en trois ans Nombre de souches R souches R en % Ampicilline ,17 AMX ,05 AMC ,81 IPM ,61 TIC ,33 TICC Piperacilline

152 Histogramme N 9 L'étude de la résistance du genre Citrobacter aux différentes β-lactamines téstées nous mène aux constatations suivantes : Une Forte résistance à l'ampicilline (87,17%), à l'amoxicilline (82,05%) et à l'association Amoxicilline-clavulante (61,81%). Une sensibilité très forte à l'imipénème. Pour la TIC, TICC et la Piperacilline, les résultats sont statistiquement interprétables (n <20)

153 Tableau N XIB : Résistance de citrobacter aux Céphalosporines : Total de souches isolées en trois ans Nombre de souches R Souches R en % C1G ,87 C2G ,14 C3G ,02 C4G ,64 Histogramme N 10 On a une forte résistance des différentes souches de citrobcter aux C1G (83,87%), aux C2G (57,14%) et de degré moindre pour les C3G (27,02%) et de C4G (17,64%)

154 IV. Discussion et analyses des résultats obtenus : IV.1. Distribution des Entérobactéries en genres : Au cours de cette étude, nous avons dénombré 9 genres différents appartenant à la grande famille des Entérobactériaceae : ils sont représentés par Escherichia coli qui occupe la première place avec une fréquence moyenne d'apparition de 42,42% (tableau N IB et histogramme N 1) en trois ans. Klebsiella est la seconde bactérie énumérée (32,22%), suivi d'enterobacter et de Proteus (respectivement 39,63%, 44,02% et 42,10% pour Escerichia coli,34,88%, 32,19% et 30,17% pour Klebsiella et pour Enterobacter 9,41%,10,03% et 13,41%) (Tableau N IIB et histogramme N 2). Les genres Morganella, Citrobacter et Salmonella ne présentent qu'un faible pourcentage des germes isolés avec des taux moyen respectifs de 0,64%; 1,42% et 0,35% (Tableau N IB). Des résultats comparables ont été signalés lors d'une étude rétrospective réalisée par Mlle Mouhib au CHU de Rabat de 1999 à 2000 [200]. Escherichia coli est considéré alors comme étant le «leader» des infections à Entérobactéries. IV.2. Antibiorésistance : IV.2.1. Étude de la résistance d'escherichia coli aux β-lactamines (Tableau N IIIB et Histogramme N 3) : E.coli était l'espèce la plus sensible à tous les antibiotiques. Elle n'avait comme résistance naturelle spécifique que la production de Céphalosporinases chromososmique à très bas niveau sans effet sur l'action des Céphalosporines [201]

155 Actuellement le niveau de résistance des souches d'escherichia aux différentes β-lactamines ne cesse d'augmenter : a- Amino et carboxypénicillines : La résistance d'escherichia à l'ampicilline (qui est devenu l antibiotique le moins actif, cela a été confirmé aussi dans d autres études menées en Algérie et en Tunisie [202] ), et à l'amoxicilline est forte : Elle évolue d'une manière stable à partir de 1990 au CHU IBN SINA de Rabat. Voir Tableau N XIIB et Courbe n 1. Actuellement, elle est de l'ordre de 67,78 % (Tableau N IIIB), cette résistance est de 40 % en France [53]. La résistance à la Ticarcilline est également élevée et, est de l'ordre de 54,60 % ces trois dernières années, Cette résistance de haut niveau à l Amino et à la Carboxypénicilline est due à la production d'une β-lactamase de classe A (2b) [66]. b- Association Pénicilline + Inhibiteur des β-lactamases : L'adition d'un inhibiteur de β-lactamases (Acide clavulanique) a une pénicilline (Amoxicilline ou Ticarcilline) était bénéfique jusqu'à ce que des isolats cliniques d'escherichia coli commencèrent à produire des β-lactamases de classe A appelées TRI (TEM résistantes aux inhibiteurs) [100,203]. Cependant la résistance d'escherichia coli à l'amc est en progression, elle est passée de 17,53 % (n=462) en 2005 à 31,27 % (n=534) en l'an 2007 alors qu'elle n'était que de 15 % en 1993 au CHU de Rabat. En France, la résistance est de 30 % [53] (Tableau XVB)

156 Tableau N XIIB : Évolution en pourcentage de la résistance d'escherichia coli à l'amoxicilline et à l'association Amoxicilline-clavulanate de 1993 à l'an 2007 au CHU de Rabat : && Années 1993 [204] AMX 78 % % % % AMC 15 % % % % Courbe n 1 La différence de résistance entre les deux types d antibiotiques était très grande.l Acide clavulanique inhibait les β-lactamases produites par les souches d Escherichia coli. A partir de 2005 la résistance aux AMC devienne inquiétante ; puisqu elle arrive jusqu à 31,27% en 2007 contre seulement 15% : des souches d Escherihia commencèrent à produire des β-lactamases de classe A TRI TEM résistant aux inhibiteurs [133, 134,135]

157 c- Cephalosporines : Les Souches d'escherichia coli isolées sont résitantes au Cefalotine (C1G) (46,21% [n=258] en 2005 et, 66,66% [n=132] en l'an 2007), à la Cefazoline (C1G) (37,77 % [n=90] en 2005 et, 58,33 % [n=24] en 2007) et à la Cefoxitine (C2G) (29,68% [n=128] en 2006). Par hyperproduction de β-lactamase chromosomiques associée à une hyperexpression de système d efflux (AcrAB- TolC) [66]. Tableau N XIIIB : Évolution de la résistance d'escherichia aux Céphalosporines de troisième génération de 1996 à l'an 2007 au CHU de Rabat : Année 1996 [205] 1997 [205] 1999 [200] C3G 2,5 % 3% 6,31% 7,43% 10,03% 12,17% Courbe n

158 Durant cette période, le taux de résistance aux C3G a connu une augmentation statistiquement significative passant de 2,5 % en 1996 à 12,17 % en 2007 (Tableau N XIIIB et Courbe n 2). Ce taux est plus élevé que celui rapporté en France (5 %) [53]. Possibilité d hyperproduction de pénicillinase de type TEM ou de céphalosporinase [206]. De même pour les C4G, la résistance passe de 8,33 % [n=36] en 2005 à 23,59 % [n=89] en 2007 pour Cefpirone et 13,33 % [n=15] en 2005 à 16,25% [n=80] en 2007 pour Cefepine, ce début de résistance est du à des enzymes appartenant à la classe A ou D de la classification d Ambler [207]. IV.2.2. Etude de la résistance du groupe KES aux β-lactamines : a- Amino et carboxypénicillines : La résistance naturelle est due à la production d d une β-lactamase de classe A chromosomique appelée K2 (Klebsiella pneumoniae) ou à la production d une β-lactamase chromosomique de classe C inductible AmpC (Serratia marcescens et Enterobacter). b- Association pénicilline Inhibiteurs de β-lactamases : La résistance à l AMC est passée de 49 % en 1992 (Tableau XVB) à 63,34 % (Tableau N VB) en l an 2007 au niveau de l hopital IBN SINA de Rabat. Cette augmentation est liée sûrement à la production par Klebsiella pneumoniae de β-lactamases de classe A de type IRT (mutants d enzymes TEM). Serratia marcescens et Enterobacter quant-à-eux, sont naturellement résistants à l AMC par hyperproduction d une β-lactamases de classe C inductible AmpC [66]

159 Voir Tableau N XIVB et Courbe n 3 Tableau N XIVB : Évolution en pourcentage de la résistance du groupe KES à l association Amoxicilline-Acide clavulanique de 1992 à l an 2007 CHU Rabat 1992 [204] CHU Rabat 1993 [204] CHU Rabat 1995 [208] CHU Rabat 1996 [208] CHU Rabat 1997 [208] CHU Rabat 2000 [200] CHU Rabat 2005 CHU Rabat 2006 CHU Rabat % 52% 67,50% 68 % 74 % 82,10% 64,15% 59,9% 63,34% Courbe n 3 Nous notons une augmentation rapide de la résistance des Entérobactéries du groupe KES à l association Amoxicilline-clavulanate de 1992 à l an 2000, de l an 2005 à 2007 on a remarqué une dimunition vis-à-vis de cette association qui s est enfin stabilisées à une moyenne de 62,46%