APPROCHE TRANSCRIPTOMIQUE DE L HEPATOTOXICITE

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1 APPROCHE TRANSCRIPTOMIQUE DE L HEPATOTOXICITE André Guillouzo et Fabrice Morel INSERM U620 Faculté de Pharmacie Université de Rennes 1

2 Médicaments HEPATOTOXICITE DES XENOBIOTIQUES - > 50 % des retraits du marché (US) - Fréquence : 1/1000 à 1/ (généralement toxicité idiosyncrasique) plus élevée chez les femmes 79 % des toxicités dues au paracétamol 73 % des réactions idiosyncrasiques - Un certain % des arrêts de développement (en phase préclinique clinique) Autres produits chimiques - Plusieurs centaines (CCl 4, diéthylnitrosamine thylnitrosamine,...) Métaux, Métalloïdes - Fer,, arsenic,...

3 HEPATOTOXICITE DES XENOBIOTIQUES - Le Foie est un organe cible : la toxicité peut être - dose-dépendante dépendante (paracétamol, cyclophosphamide, ) - cumulative (amiodarone( amiodarone, bromfenac,.) - immunoallergique (acide tiénilique, dihydralazine,, ) - Différents types de toxicité : - nécrose, apoptose - cholestase - stéatose - phospholipidose - tumeurs,..

4 HEPATOTOXICITE DES XENOBIOTIQUES - Différents mécanismes : - Métabolites réactifs, radicaux libres, espèces activées de l oxygène - Altérations : - de l homéostasie calcique, - de l excrétion biliaire, - de la fonction mitochondriale (béta-oxydation des acides gras, respiration oxydative) - Formation d adduits à l ADN ou aux protéines, -.

5 LE TRANSCRIPTOME L ensemble des ARNm des gènes activement transcrits

6 TRANSCRIPTOME APPLIQUE A LA TOXICOLOGIE Le composé Toxicité spécifique Puces à ADN Profil d expression génique caractéristique

7 DIFFERENTS TYPES DE PUCES A ADN Membrane Nylon Membrane Nylon Lame de verre Puce à oligonucléotides Matrice Densité Quantité d ARNm Type de Marquage Nombre d échantillons simultanés Acquisition d image Réutilisation Coût (Bertucci et al. 1999) Clone d ADNc (PCR) 1000/cm 2 qq ng Radioactivité Unique Radio-imageur imageur ou film Multiple Faible (Hoevel et al. 1999) Clone d ADNc (PCR) 1000/cm2 qq µg Colorimétrie Multiple Scanner Unique Faible (Shena et al.1995) Clone d ADNc 1000/cm2 qq µg Fluorescence Multiple Scanner laser confocal Unique Moyen (Lockart et al. 1996) ADNc (PCR) Oligonucléotides /cm2 qq µm Fluorescence Unique Scanner laser confocal Unique Elevé (Bertucci et coll. Bull. Cancer. 2001, 88, )

8 PUCES à ADN ADNc Oligonucléotides otides Séquence connue ou non Longueur variable (100 pb à ~2-3 kb) Produit de PCR Séquence connue Longueur variable (25 à 70 mers) Synthèse chimique

9 Sondes Amplification PCR PUCES À ADNC Cibles Extraction Purification Lecture et Analyse d imagesd Marquage Purification Spotting (Cy-5 dctp, laser λ rouge) (Cy-3 dctp, laser λ verte) Blocage Dénaturation Hybridation sur la Même puce Lavages Analyse

10 PHOTOLITHOGRAPHIC SYNTHESIS Lamp Mask Chip

11 SYNTHESIS OF ORDERED OLIGONUCLEOTIDE ARRAYS Light (deprotection) Mask O O O O O Substrate HO HO O O O T T T O O O Light (deprotection) T T O O O Mask Substrate C T T C C O REPEAT C A T A T A G C T G T T C C G

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13 PUCES A ADNc ET A OLIGONUCLEOTIDES Puces à ADNc Technologie relativement lourde, adaptée pour l élaboration de puces à façon Faible coût (hors équipement) Puces à oligonucléotides Technologie standardisée Plus spécifique Coûteuse

14 PUCES A ADNc Gautier J.C., Sanofi-Aventis

15 Gautier J.C., Sanofi-Aventis

16 GENES IMPORTANTS POUR L ETUDE DE L HEPATOTOXICITE DES XENOBIOTIQUES - Métabolisme des xénobiotiques phase 1 : CYPs,, phase 2 : (GST,( époxyde hydrolases,, ) - Transporteurs membranaires - Apoptose (caspases, ) - Stress oxydant (GSH( peroxydase,, ) - Choc thermique - Réparation de l ADN (ERCC( 1, ) - Cycle cellulaire (MAP( kinases, ) - Facteurs de transcription - Cytokines - Gènes suppresseurs de tumeurs (p53( p53, ) et oncogènes - Récepteurs nucléaires - Facteurs de croissance -

17 PROBLEMES RENCONTRES ET LIMITATIONS DE L APPROCHE TRANSCRIPTOMIQUE Problèmes de reproductibilité : - Interessai (surtout pour les faibles taux de modulation de l expression des gènes) - Interplateforme : puces d origine différente (séquences de gènes différentes, erreurs de séquences ) - Méthodes d annotation et d analyse bioinformatique différentes - Interlaboratoire Limitations : - Difficulté d interprétation des résultats - Les niveaux d expression d ARNm peuvent ne pas être corrélés à ceux des protéines - Les modifications post-traductionnelles traductionnelles ne sont pas étudiées - Les résultats doivent être confirmés par d autres techniques (RT-PCR PCR, northern-blot)

18 EFFETS DE L OLTIPRAZ, L UN AGENT CHIMIOPROTECTEUR SUR L EXPRESSION L DES GENES DANS DES HEPATOCYTES HUMAINS EN CULTURE PRIMAIRE - Traitement des hépatocytes à partir de 24 h pendant 72 h - Puce à ADN commerciale : Clontech

19 EFFETS DE L OLTIPRAZ SUR L EXPRESSION DES GENES HEPATIQUES HUMAINS MRP2 GPX CYP1A1 Prothymosine Alpha UGT1A3 UGT1A4 FKBP5 UGT1A1 MRP2 Témoin GPX CYP1A1 Prothymosine Alpha OPZ UGT1A3 UGT1A4 FKBP5 UGT1A1

20 Copyright Société Française Piton et de al, Toxicologie. Carcinogenesis, Tous droits, in réservés press

21 EFFETS DE L OLTIPRAZ SUR L EXPRESSION DES GENES HEPATIQUES HUMAINS Cytochrome P450 Phase II Enzymes CYP1A1 CYP1A2 CYP2B6 CYP2E1 CYP4A11 UDP-glucuronosyltransferase 1A1 UDP-glucuronosyltransferase 1A3 UDP-glucuronosyltransferase 1A4 UDP-glucuronosyltransferase 1A6 NADP(H)-quinone Reductase Microsomal Epoxide Hydrolase Mean of ratio obtained from Microarrays analysis ( ) Mean of ratio resulted from qpcr analysis on at least five human hepatocyte populations 24h ( ) and 72h ( ) 5<n<13 Glutathione-S-Transferase A1/A2 Xenobiotic transporters Paraoxonase 3 Multidrug Resistance Protein 2 Multidrug Resistance Protein Fold variations

22 EFFETS DU METHAPYRILENE SUR L EXPRESSION L DES GENES DANS LE FOIE DE RAT : ETUDE INTERLABORATOIRE - Méthapyrilène : induit une nécrose périportale et des carcinomes hépatocellulaires par un mécanisme non mutagénique - Traitement des animaux en un mêmeme lieu à 2 doses : 10 et 100 mg/kg - Distribution des ARN à 5 laboratoires pharmaceutiques* - Puces affymetrix (8.799 probe sets) *HESI hepatotoxicity group - Waring J. et al. Env.. Health Persp., 2004, 112,

23 NOMBRE DE GENES REGULES PAR LE METHAPYRILENE DANS LES DIFFERENTS LABORATOIRES A PARTIR D ARN D POOLES Laboratoires BI NOV PFI RO SCH EN COMMUN Augmentés Diminués Valeurs du cut-off : variation de 2 fois ; p < 0.05

24 APPROCHE TRANSCRIPTOMIQUE DE L HEPATOTOXICITE DES RESULTATS

25 DISTINCTION ENTRE EFFETS PHARMACOLOGIQUES ET TOXICOLOGIQUES Composé X EFFETS SUR GENES CIBLES EFFETS SECONDAIRES (toxiques) Signature moléculaire A Signature moléculaire B La distinction peut nécessiter l étude de : - plusieurs concentrations de composés - plusieurs temps de traitement

26 APPROCHE TRANSCRIPTOMIQUE DE L HEPATOTOXICITE Mécanistique : - Identification des gènes impliqués dans la toxicité d un composé - Hypothèses à tester pour préciser le mécanisme - Approche lente Prédictive : - Reconnaissance des profils d expression spécifiques d un type de d toxicité - Utilisation des bases de données de profils d expression de gènes connus (+ESTs ESTs) - Approche rapide EST : Expressed Sequence Tag

27 EVALUATION D UN DEFICIT EN GLUTATHION DANS LE FOIE DE RAT - BSO : L-Buthionine L sulfoximine,, inhibiteur de la synthèse de glutathion - BHA : Butylated hydroxyanisole,, un antioxydant - Traitement de 4 jours - Puces Affymétrix - 69 gènes corrélés à un déficit en glutathion - 14 gènes augmentés avec BSO si comparaison avec le profil obtenu avec BHA Kiyosawa et al. Biochem Pharmacol,, 2004, 68:

28 Gene expression profiles of rat livers treated with BSO or BHA

29

30 Principal component analysis of gene expression profiles of BSO, BHA, APAP, PB- or CLO-treated rat livers at various time points. Each spot represents the gene e expression profile of individual rats. Solid and dashed arrows represent the e time-course of changes in gene expression profiles of rat livers treated with APAP or PB, P respectively.

31 EFFETS DE TOXIQUES HEPATIQUES INDUISANT UN STRESS OXYDANT OU GENERANT DES METABOLITES REACTIFS SUR L EXPRESSION DES GENES DANS LE FOIE DE RAT - 15 toxiques - Traitement de 24 heures - Puces à ADNc (3434 gènes) - 69 gènes choisis pour différencier ces toxiques des activateurs de macrophages et des proliférateurs de peroxysomes (à partir d une base de données) -McMillian et al. Biochem Pharmacol,, 2004, 68 :

32 Principal component analysis plot to separate OS/RM, macrophage activators, peroxisome proliferators from each other and from controls and other compounds

33 EFFETS DE TOXIQUES HEPATIQUES SUR L EXPRESSION DES GENES DANS DES HEPATOCYTES DE RAT EN CULTURE PRIMAIRE - 15 toxiques - Traitement de 24 heures - Puces Affymétrix - Les profils d expression de gènes obtenus avec des toxiques ayant t le même mécanisme de toxicité forment des clusters Waring et al. Tox Lett,2001, 12 :

34 Graph showing the gene changes occurring in livers from rats treated with the 15 known hepatotoxins.. A total of 179 genes were shown to be regulated at least two-fold by at least one compound. Some of these genes are shown to the right of the figure.

35 Dendrogram showing the clustering of the hepatotoxins based on gene regulation. The clustering was hierarchical using correlation as the distance.

36 Gautier J.C., Sanofi-Aventis

37 CONCLUSIONS Approche transcriptomique de hépatotoxicité : - Problèmes et limitations - Apports importants tant au niveau mécanistique que prédictif Perspectives : - Banque de données - Toxicité aiguë vs chronique - Extrapolation Animal - Homme In vitro - In vivo In vitro (cellules hépatiques humaines) - Homme