IMMUNOLOGIE AVIAIRE. Equipe IMAV IASP 213 INRA, Nouzilly. (Création: novembre 2005, Financement Jeune Equipe)

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1 IMMUNOLOGIE AVIAIRE Equipe IMAV IASP 213 INRA, Nouzilly P Quere, CR1 I Munoz, post-doc AC Lalmanach, CR1 C Derache, Thèse P Sibille, CR1 V Robert, CDD (Création: novembre 2005, Financement Jeune Equipe) 1

2 Objectifs Global: Etude des premières lignes de défense et orientation de la réponse immunitaire anti-infectieuse chez les oiseaux portes d entrée digestive et respiratoire modèles d étude: infection par le virus influenza et portage des salmonelles (Impact sur la santé publique) Spécifiques: 1. générer connaissances spécifiques et obtention d outils pour l étude des partenaires (cellulaires et moléculaires) impliqués dans la défense anti-microbienne 2. établir les conditions d une immunomodulation (trois 1ères semaines de vie) 3. établir de nouvelles stratégies vaccinales (en ciblant les muqueuses) 2

3 Immunité des muqueuses chez le poulet: Mécanismes moléculaires et cellulaires Muqueuses: interaction du pathogène avec épithélium et du système immunitaire (granulocytes, macrophages, dendritiques, [ NK, T γ/δ, NKT ] ) 1. Isolement et caractérisation des effecteurs cellulaires et moléculaires de la réponse innée 2. Intérêt pour des mécanismes effecteurs de l immunité innée à large spectre: NO (macrophages: poumon) et défensines (granulocytes:intestin) 3. Recrutement des effecteurs cellulaires: chimiokines (défensines) 4. Induction de la réponse immune adaptative 3

4 Développement d outils génériques cellulaires et moléculaires aviaires 3 thématiques: dialogue intercellulaire (chimiokines/défensines) Obtention et caractérisation de cellules dendritiques Culture et immortalisation de cellules épithéliales (respiratoires, digestives) 4

5 THEMATIQUE 1: CHIMIOKINES et DEFENSINES AVIAIRES 5

6 dialogue intercellulaire chimiokines et récepteurs Origine cellulaire: grande diversité des chimiokines [en terme de protéines différentes et de leur production par les tissus ou cellules] Structure : 2 sous-familles majeures selon des 2 cystéines en région NH2 terminale CXC et CC Et 2 sous-familles mineures = 1 seule cystéine La plupart des chimiokines sont des protéines sécrétées de AA Réponse cellulaire aux chimiokines induite par des récepteurs hétérodimériques couplés protéines G Classification en sous-famille selon leur fonction: Chimiokines inflammatoires = recrutement infection, inflammation, dommage tissulaire, tumeurs / spécificité large / réponse immune innée et adaptative Chimiokines homéostasiques = circulation des leucocytes hématopoïese (moelle osseuse thymus) / initiation réponse immune adaptative rate, gglions lymph, plaques de Peyer) / immunosurveillance (tissus périphériques sains) Chimiokines à dualité d activité: réponse immune inflammatoire / dirigent leucocytes non-effecteurs (précurseurs et matures au repos) vers les lieux de développemen (ex thymus) et de surveillance immune 6

7 Initiation de la réponse immune par les produits microbiens au niveau des muqueuses cellules présentatrices des antigènes macrophages et cellules dendritiques Cellules de l épithélium Via les TLR induction de la production de chimiokines/défensines induction de la migration leucocytaire et recrutement Luster AD et al, Curr Op Immunol 7

8 induction de la migration des leucocytes: chimiokines/modulation des recepteurs Maturation des cellules dendritiques Luster AD et al, Curr Op Immunol,

9 T1.1 :chimiokines et recepteurs aviaires P. Sibille I. Munoz P. Quéré Mise à disposition du génome du poulet: identification d un grand nombre de gène homologues des chimiokines et recepteurs de mammifères Nomenclature: Kaiser et al, 2005, à affiner et confirmer (étude de fonction) Programme de production de chimiokines recombinantes et d anticorps monoclonaux contre des récepteurs de chimiokines Objectif: - étude de l expression des récepteurs en fonction des cellules dans nos modèles d infection au niveau des muqueuses - étude de l activité chimiotactique des chimiokines selon le type cellulaire Choix: chimiokines inflammatoires MIP-1α (CCL3) MIP-1β (CCL4) et MIP-1α MIP-3α (CCL20) CCR6 (idc, Tact, B) CCR1 (Mo, MΦ, idc, NK) CCR5 (Mo, MΦ, Th1, Tact, NK) [ MCP-1 CCR2 (Mo, idc, NK, Tact, B) SLC (CCL21) CCR7 (mdc, T naive, T act) ] 9

10 Dialogue intercellulaire: défensines petits peptides cationiques (2-6 kda) à activité antimicrobienne structure= 3 paires de ponts disulfure intramoléculaires + structure en feuillet β 2 groupes majeurs selon arrangement et espacement des ponts disulfure chez les mammifères (défensines α et défensines β) Mais poulet = seulement défensines β (12 Gallinacines identifiées génome) origine: épithélium intestinal, kératinocytes, neutrophiles, macrophages Production constitutive et/ou induite Rôle: activité anti-microbienne directe Activité chimiotactique = similitude chimiokines défensines-β et CCR6 (idc, T mémoire) 10

11 Mécanismes possibles de promotion de l activation de immunité anti-microbienne adaptative par les défensines Recrutement des cellules dendritiques immatures à partir du sang Effet sur la présentation de l antigène : complexes défensines-antigène pour délivrer l antigène via l internalisation par les récepteurs (cellules dendritiques) Induction de la maturation des cellules dendritiques : effet direct ou indirect (TNF-α, Il-1) Recrutement de lymphocytes naifs ou mémoire: défensines α : chimiotactisme sur LT CD4+ naifs et LT CD8+ défensines β : chimiotactisme sur LT CD4+ mémoire (par CCR6) 11

12 T1.2 : défensines aviaires AC Lalmanach Projet d étude de la relation structure fonction des gallinacines 1 et 2 Etude de l expression in vivo par hybridation in situ: origine des gallinacines 1 et 2 dans l intestin Purification des gallinacines natives à partir des granulocytes hétérophiles isolés du sang Expression des gallinacines recombinantes (E. coli, Adénovirus CELO, levure Pichia pastoris) Tests fonctionnels in vitro: chambre de migration Etude de la structure tri-dimensionnelle Modélisation moléculaire par homologie: hypothèse de récepteurs candidats (CCR6?) Finalité: alternative aux antibiotiques? CNRS UPR 4301, Orléans) F. Voyelle et C Landon 12

13 THEMATIQUE 2: cellules épithéliales aviaires P. Quéré Source: appareil respiratoire (trachée, bronches et capillaires aériens) [intestin] Réplication des pathogènes et premières lignes de défense ( production de chimiokines/défensines): cf mammifères virus influenza et [ Salmonella] Pour pouvoir étudier l interaction hôte-pathogène au niveau de l épithélium, projet: mise au point de culture de cellules primaires + essai d immortalisation (protocole efficace chez les aviaires?) Pathogénie Bactérienne INRA-IASP, Nouzilly P. Germon N. Chanteloup Télomérase et lymphome INRA-IASP, Nouzilly D. Rasschaert 13

14 THEMATIQUE 3: CELLULES DENDRITIQUES 14

15 Cellules dendritiques Agents de l immunosurveillance et adjuvant du système immunitaire (en devenant des inducteurs puissants de l immunité adaptative en réponse aux pathogènes) Notion de DC immatures et matures Propriétés innées des CD in vivo ie fonctionnelles au stade repos: qui dépendent de Position anatomique, en particulier au niveau des tissus lymphoides expression de CCR6 Capacité à prendre l antigène et à l apprêter pour le présenter et induire la réponse immune spécifique Capacité à répondre très rapidement à des stimuli de différenciation ou de maturation pour initier et contrôler la réponse immune Fonctions affectées lors de maturation des CD Production de cytokines : Il-1, TNF, Il-6, IFNs, Il- 12, Il-18 Production de chimiokines : Il-8, MIP-1α,β, MCP- 1, RANTES Altération des récepteurs aux chimiokines ie CCR7 de la pinocytose et de la phagocytose, et de +s endocytose R de l apprêtement de l antigène et de l expression du complexe CMH-peptide de l expression des molécules co-stimulatrices B7 et de la famille des TNF de l expression de CD40 15

16 T3: cellules dendritiques aviaires P. Quéré P. Sibille Caractérisation phénotypique et fonctionnelle des CD de poulet Obtention de cellules dendritiques de poulet : - par isolement à partir de différents organes (rate ou tonsilles cécales, puisqu il n y a pas de ganglions lymphatiques proprement dits chez les oiseaux) - in vitro à partir de monocytes du sang ou de la moelle osseuse: GM-CSF + Il-4 (production en Ad CELO rec) Caractérisation morphologique et expression de marqueurs de surface (actuellement disponibles pour le poulet, en particulier des récepteurs aux chimiokines) Etude de certaines de leurs propriétés in vitro : capacités de phagocytose et de pinocytose, de présentation des antigènes, de migration en réponse à des chimiokines, de maturation UMR 0483 Université-INRA (UFR Sci Pharm, Tours) I. Dimier IAH, Compton,UK P. Kaiser AFSSA, Ploufragan P. Langlois 16

17 T3: cellules dendritiques aviaires P. Quéré Objectif finalisé: Vaccinologie étude in vivo des possibilités de cibler les cellules dendritiques par association entre un antigène d intérêt et chimiokines/défensines et donc d induire une immunité de protection, et ceci dans le cadre des modèles infectieux développés par l équipe: essai: vaccination ADN Problème du ciblage des muqueuses: Vectorisation/voie de délivrance 17

18 MODELES INFECTIEUX Etude de la réponse immune in vivo: qrt-pcr pour de nombreuses cytokines et chimiokines Anticorps monoclonaux contre des marqueurs de membrane des leucocytes (en particulier récepteurs des chimiokines) Etude de l interaction hôte-pathogène in vitro: Isolement leucocytes: granulocytes (sang), lymphocytes et macrophages pulmonaires Obtention de culture primaire: épithélium de l appareil respiratoire et digestif Immortalisation (?) Production de cytokines/chimiokines/défensines recombinantes 18

19 SALMONELLA: Portage intestinal AC Lalmanach Salmonella enteritidis (sérotype principal) Volaille = hôte majeur (portage asymptomatique) source de contamination par produits dérivés (viande, œufs) Mécanismes de persistance intestinale = dysfonctionnement du système immunitaire Comparaison de lignées de volailles divergentes ie fortement ou faiblement porteuses de salmonelles Analyse de l expression différentielle des gènes de la réponse immune innée Résultats selon l âge et la lignée pour les défensines (peptides antimicrobiens à activité chimiotactique des leucocytes chez les mammifères) ie gallinacines 1 et 2 Signalisation, Portage et Virulence Bactérienne INRA-IASP, Nouzilly P. Velge Génétique Avicole INRA, SRA, Nouzilly C. Beaumont 19

20 VIRUS INFLUENZA P. Quéré, P. Sibille Modèle de contamination par voie aérienne Etude de la réponse innée = macrophages et cellules épithéliales de l appareil respiratoire [cibles de la réplication initiale du virus] Cytokines et chimiokines: recrutement et activation de la réponse inflammatoire Comparaison de lignées de poulet: sélection: phagocytose, réponse en anticorps, [production de NO] programme de caractérisation du CMH, protéine Mx, NRamp1 etc Comparaison de différentes souches virus influenza intérêt pour différence dans NS1 UMR INRA/INA-PG Génétique et diversité Animale M.H Pinard B. Bed hom Virologie Moléculaire INRA-IASP, Nouzilly JF Vautherot D. Marc AFSSA, Ploufragan V. Jestin 20