UE2 TD Cytosquelette (cours E. Cornillot) Protéines d adhérence / Jonctions intercellulaires (T. Maudelonde) N. Boulle Année

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1 UE2 TD Cytosquelette (cours E. Cornillot) Protéines d adhérence / Jonctions intercellulaires (T. Maudelonde) N. Boulle Année

2 La plupart des illustrations du TD proviennent de Molecular Biology of the Cell Alberts, Johnson, Lewis et al. (5ème édition)

3 Définition: Le cytosquelette Globulaire Fibreux 25 µm Microfilaments d actine MF 7 nm Microtubules MT 25 nm Filaments intermédiaires FI 10 nm

4 Caractéristiques générales du cytosquelette Cytosquelette dynamique: renouvellement ++ Permet le changement de forme de la cellule, son mouvement, le déplacement d organites, de molécules, l endocytose, l exocytose, la formation du fuseau mitotique Cytosquelette stable: Impliqué dans certaines structures cellulaires: microvillosités, sarcomère, cils, flagelles

5 Caractéristiques générales du cytosquelette MF, MT: Toutes les cellules eucaryotes FI : Apparus plus tardivement au cours de l évolution Pas de liaison covalente entre les monomères Pas de liaison covalente entre les monomères Renouvellement aux extrémités: polymérisation / dépolymérisation aux extrémités Formes globulaires (G) / Formes polymérisées (F) Polymères orientés: + / - Moteurs Liaison ATP/GTP ADP/GDP Renouvellement sur toute la longueur du filament (y compris aux extrémités) Sous-unités fibreuses Pas d orientation + / - Pas de moteurs Pas de liaison NTP/NDP Type de FI spécifique de tissu +++

6 Forme G (Globulaire) Forme libre G + - Forme F (Filament) Forme polymérisée F

7 Polymérisation des sous-unités globulaires (MF, MT) Polymères (F) ou Viscosité = Nombre et longueur des polymères [G] eq [G] diminue Équilibre [G] eq : Concentration à l équilibre Temps A l équilibre, à l extrémité, [G]eq où :V Polymérisation = V Dépolymérisation Polymérisation vs dépolymérisation? - [Sous unités globulaires] > concentration à l équilibre ([G]eq ) polymérisation. Formation et allongement des polymères - [Sous unités globulaires] < concentration à l équilibre ([G]eq ) Pas de polymères

8 Polymérisation des sous-unités globulaires (MF, MT) In vivo, équilibre modulé par: - La modification des sous unités globulaires (G) une fois polymérisées (ATP ADP / GTP GDP): Fragilise le polymère Les constantes cinétiques ne sont pas les mêmes aux 2 extrémités (+ et -) des MF et des MT [G]équilibre différentes aux 2 extrémités Polymérisation extrémité + et dépolymérisation extrémité - La présence de protéines de liaison, stabilisation, nucléation, coiffe

9 Actine et microfilaments 7 nm Rq: dans les cellules eucaryotes: [Actine G] soluble = 1000 fois [Actine G] eq? Cellules non musculaires: 50 % actine non polymérisée

10 QCM1 NTP NDP

11 QCM1 viscosité [G] [G] eq 4 Latence temps 1: initiation 2: nucléation

12 QCM1 Microfilaments d actine ofilaments Tapis roulant otubules Microtubules «catastrophe» «sauvetage» Instabilité dynamique

13 QCM2 Microfilaments d actine, Microtubules Forme libre G + - Forme polymérisée F

14 QCM3 Protéines liant l actine (AAP) Séquestre (- polymérisation) Echange ADP / ATP (+ polymérisation) Rq: Liaison non covalente entre monomères!

15 QCM 3 A connaître! Protéines liant l actine (AAP) Nucléation (ext (ext +) +) Nucléation (ext -) Séquestre (- polymérisation) Echange ADP / ATP (+ polymérisation) Protéines d ancrage Dégradation (lie actine ADP) Protéines à domaine FERM Spectrine Dystrophine Fragmentent Gel Solution (Ca++) Stabilisent Cap Z Stabilisent

16 QCM 3 A connaître! Protéines liant l actine (AAP) Nucléation (ext (ext +) +) Nucléation (ext -) Séquestre (- polymérisation) Echange ADP / ATP (+ polymérisation) Protéines d ancrage Dégradation (lie actine ADP) Protéines à domaine FERM Spectrine Dystrophine Fragmentent Gel Solution (Ca ++ ) Stabilisent Cap Z Stabilisent

17 QCM 3 Protéines liant l actine (AAP) Protéines associées à l actine: Les protéines d'assemblage MF + α-actinine MF + fimbrine Dimère de filamine Faisceau contractile Disposition lâche permet d intercaler la myosine II Faisceau parallèle Disposition serrée ne permet pas d intercaler la myosine II Réseau type gel Réseau tridimensionnel mécaniquement résistant D après cours de S. Delbecq ( )

18 QCM 3 Protéines liant l actine (AAP) plaquettes Contacts Focaux (intégrines) Fimbrine, villine α-actinine et Formine (ext +) Faisceau contractile antiparallèle Fibres de stress (Fibres de tension) Réseau, struct. type gel Faisceau serré parallèle filamine

19 QCM 3 Actine et microfilaments Lamellipode lamellipode Arp2/3 à la périphérie Réseau de type gel: filamine

20 QCM Protéines associées et leurs fonctions + Stabilisation des MF - Stabilisation double hélice : tropomyosine MF Actine + Tropomyosine (dans le sillon) Tropomyosine Protéine fibreuse

21 QCM 4 Cytosquelette et signalisation cellulaire 2.2. Protéines associées et leurs fonctions + Association aux membranes. - Signalisation cellulaire -> Réorganisation et ancrage. Dérivés du phosphatidylinositol (PI) Inositol est phosphorylé : PI -> PIP, PIP2, PIP3 Partie lipidique P Signal extracellulaire Phosphatidylinositol phosphorylé Schéma pour information Kinase Signal intracellulaire Protéine recrutée

22 QCM 4 Cytosquelette et signalisation cellulaire 2.2. Protéines associées et leurs fonctions + Association aux membranes. - Signalisation cellulaire -> Réorganisation et ancrage. Dérivés du phosphatidylinositol (PI) Inositol est phosphorylé : PI -> PIP, PIP2, PIP3 Partie lipidique P. Petites protéines G monomériques (sous-famille Rho) Protéine G inactive : GDP Signal cellulaire GEF Protéine G active : GTP Schéma pour information RhoA Rac Cdc42

23 Le système des petites GTPAses monomériques Ras (signalisation), Rho (réorganisation du cytosquelette), Ran (transport nucléo-cytoplasmique) Hydrolyse GAP Pi GAP: GTPase- Activating Protéin Petite GTPase GTP Petite GTPase GDP GTP GEF Echange GDP GEF: Guanine nucleotide Exchange Factor

24 QCM 4 Actine et microfilaments Dans les cellules non musculaires Assemblages permanents Ancrage à la membrane plasmique (MI) Microvillosités: MF stables! Myosine I

25 QCM 4 Cytosquelette et signalisation cellulaire Recrutement de protéines + Association aux membranes. - Signalisation cellulaire -> Réorganisation et ancrage Recrutement de protéines ex: Ezrine Recrutement à la membrane plasmique + Spectrine / Dystrophine Phosphorylation extrémité C-terminale P Recrutement de MF d actine Forme globulaire P Forme allongée Signal cellulaire

26 25 nm Microtubules

27 QCM 5 Tubuline et Microtubules 13 protofilaments Structure polarisée. Orientation dimères tubuline Extrémité + -> Tubuline β Extrémité -> Tubuline α. Orientation protofilaments 13 protofilaments α GT P Lumière Protofilament β GT P α GT P Dimère de tubuline Tubuline β Extrémité + β:activité GTPase GTPase activée dans le microtubule Microtubule Extrémité -

28 QCM 5 A connaître! 3.2. Microtubules cytosoliques Instabilité dynamique des MT cytosoliques + Médicaments/drogues affectant les MT cytosoliques - Empêchent polymérisation MT Fixation sur dimères de tubuline Colchicine (antigoutte), Vinblastine (anticancer), Nocodazol (en recherche) - Stabilisation MT (pas de dépolymérisation) Alcaloïdes de l écorce d ifs -> Interaction tubuline β Pervenche de Madagascar (source wikipedia) Anticancéreux : Paclitaxel (Taxol TM ) et Docétaxel (Taxotere TM )

29 QCM 5 Phalloïdine Actine Marquage du cytosquelette d actine par la phalloïdine-af680 (gris) Phalloïdine: Stabilisatrice (Idem Jasplakinolide) Cytochalasine B Latrunculine Bruno SAUBAMEA EA3621 Service de Biologie Cellulaire Service Commun d Imagerie Cellulaire et Moléculaire Université Paris Descartes

30 QCM 6 Protéines motrices: kinésines / Myosines Domaine moteur (ATPase) Kinésines (microtubules) Domaine moteur (ATPase) Myosines (microfilaments d actine) Activation par phosphorylation - Hydrolyse de l ATP changement conformationnel mouvement NB: Dynéine: famille différente

31 QCM 6 Tubuline et Microtubules Moteurs moléculaires des microtubules Golgi: près du noyau vésicule Exocytose, Membrane plasmique KINESINES (~ myosines) Microtubule Endocytose, Mouvements des cils, flagelles DYNEINES - RE vers le Golgi vésicule - Flux vectoriel permanent - Flux rétrograde : Golgi vers le RE

32 QCM 6 Tubuline et Microtubules Moteurs moléculaires des microtubules Golgi: localisé près du noyau!

33 QCM 6 Centrosome: COMT = Centre Organisateur des Microtubules Centrosome = principal COMT des cellules animales Les microtubules croissent à partir des sites de nucléation (anneaux de tubuline γ) (pas des centrioles!)

34 QCM 7 Tubuline et Microtubules Centriole: appartient au centrosome Centriole ~ Corpuscule basal (cils, flagelles) - 9 triplets de microtubules (A, B, C) - Seul A est complet - Ponts de nexine entre les triplets - Structure protéique en «rayons de roue» reliant les microtubules A Nexine! Triplets A B C Complexe de liaison

35 QCM 7 Structure des cils / Flagelles Structures stables (résistants au froid, agents chimiques) - Corpuscule basal (~ centriole) 9 triplets de microtubules qui se prolongent dans l axonème - Axonème = 9 paires de microtubules entourés de membrane plasmique ± 2 microtubules centraux (9+0; 9+2) + nexine, dynéine ! paires Paire centrale de MT Doublet de MT périphériques Axonème = MT périphérique + Paire centrale MT rayon Gaine interne Microtubule central (simple) Bras de dynéine e Nexine nexine Corpuscule basal Membrane plasmique Bras de dynéine in Racine ciliaire Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008) Paire de microtubule périphérique

36 QCM 7 Cils et flagelles Nexine Dynéine ATP ADP Hydrolyse de l ATP (dynéine) = mouvement vers -

37 Exercice

38 QCM 8 Figure 1A

39 QCM 8 A connaître! 3.2. Microtubules cytosoliques Instabilité dynamique des MT cytosoliques + Médicaments/drogues affectant les MT cytosoliques - Empêchent polymérisation MT Fixation sur dimères de tubuline Colchicine (antigoutte), Vinblastine (anticancer), Nocodazol (en recherche) - Stabilisation MT (pas de dépolymérisation) Alcaloïdes de l écorce d ifs -> Interaction tubuline β Pervenche de Madagascar (source wikipedia) Anticancéreux : Paclitaxel (Taxol TM ) et Docétaxel (Taxotere TM )

40 QCM 8 Figure 1A

41 Méthodologies: Transfection d ADN Production de protéines «recombinantes» «Extinction» de l expression d un gène Cellule eucaryote Bactérie ADN (Transfection) Protéine rec. Protéine rec. Purification Lysat Western blot IP

42 Méthodologies: Interactions Antigène-Anticorps - TAG Anticorps protéine TAG TAG = GFP, anti-tag GST - Western-blot Lysat (protéines) Bleu de coomassie + Gel d électrophorèse PM Anticorps dirigé contre la protéine d intérêt Western-blot

43 Méthodologies: Interactions Antigène-Anticorps - Immuno-histochimie, immunofluorescence - Immuno-précipitation Anticorps fixé sur une bille de résine Billes de résine Lysat (protéines) Lavages, centrifugation

44 Méthodologies: Interactions protéine-protéine - «Pull down» Protéines purifiées ou domaines protéiques - Immuno-précipitation Protéines produites dans la cellule

45 QCM 9 Figure 1B

46 QCM 9 «Mock» Figure 1B Si α- adaptin

47 QCM 10 Figure 2A: immunoprécipitation GFP Clathrine

48 Cellules Hela Cellules Hela IP GFP Anticorps anti GFP Western-blot Western-blot Qu attrape-t-on avec α-tat1? «PROIE»

49 QCM 10 Figure 2A: immunoprécipitation GFP

50 QCM 11 Figure 2B: GST-Pull Down

51 QCM 11 Bactérie ADN 1 GST Alpha-TAT1 3 Ac anti- GST GST GST Alpha- TAT1 Alpha-TAT1 Lysat 2 GST Alpha- TAT1 GST Cellule Hela GST

52 QCM 11 Figure 2B: GST-Pull Down GST GST GST Alpha-TAT1 Alpha- TAT1 FI Alpha-TAT1 GST GST GST Alpha- TAT

53

54 Filaments intermédiaires 10 nm ~ corde

55 QCM 12 Filaments intermédiaires: Sous-unités fibreuses Monomère Région en hélice alpha Aa Hydrophobes Dimère Même orientation Renouvellement: Tetramère Dimères en orientation opposée Décalage Orientation inverse - constant -sur toute la longueur Protofilament (protofibre): Plusieurs tétramères bout à bout Un filament intermédiaire = 8 protofilaments

56 QCM 12 Filaments intermédiaires 4.2. Différents types de filaments intermédiaires + Classement - env. 50 protéines différentes - 6 groupes ou types de sous-unités Type I II III IV V VI Protéine Cytokératines acides Cytokératines neutres ou basiques Vimentine Desmine Protéines fibrillaires acides gliales (GFAP) Protéines de neurofilaments Lamines nucléaires Nestine Localisation / type cellulaire Cellules épithéliales Cellules épithéliales Fibroblastes, Cellules endothéliales, Muscle lisse Cellules musculaires Cellules gliales (astrocytes, ) Axones et dendrites des neurones Noyau Cellules souches neuronales et neurones immatures! Utilisé en anatomopathologie pour identifier l origine d une tumeur

57 QCM 12 MF FI

58 QCM 12 Filaments intermédiaires Les lamines + Les lamines (Type V) - Dans les cellules animales - Localisation : le noyau Réseau sous-mb Nucléoplasme - Lamines A, B, C LMNA -> Lamines A et C LMNB1 et LMNB2 (même gène) -> Lamines B - CDK phosphorylation des lamines disparition de l enveloppe nucléaire (cf S. Carillo & P. Pujol)

59 QCM 12 Filaments intermédiaires / MT

60 Protéines d adhérence Jonctions Cours T. Maudelonde

61 Jonctions Actine / Filaments intermédiaires Epithelium Pôle apical Cadhérines Actine (jonctions adhérentes) Filaments intermédiaires (desmosomes) Contacts focaux Intégrines Pôle basal

62 Protéines d adhérence

63 QCM 13 Les protéines d adhérence: 1- Famille des Cadhérines Ex: E-Cadhérine, Desmoglein 2- Famille des Integrines Ex: α5β1 3- Famille des Sélectines Ex: L - E - P- Sélectines 4- Famille des Immunoglobulines Ex: N-CAM

64 QCM Les cadhérines Distribution des domaines dans différentes cadhérines Cadhérine T Glycosylphosphatidylinositol d ancrage (GPI) RET Tyrosine kinase Desmocolline-1a Desmogléine-1 ICS ICS Interaction avec les filaments intermédiaires Cadhérine E ICS Fixation de la caténine Domaine CAD

65 QCM Les Cadhérines Interactions cellule / cellule Interactions homophiliques le plus souvent+++

66 QCM Cadhérines et jonction adhérente (Actine) (Ceinture d adhérence / zonula adherens) α- catenine Actine Filament bipolaire de Myosine II MF Cadhérine Alpha-actinine Signalisation cellulaire Jonction d adhérence Ceinture d adhérence Jonction d adhérence Zone d adhérence

67 QCM Cadhérines et desmosomes (filaments intermédiaires) «boutons» Protéines d ancrage Filaments intermédiaires (ex: cytokératine des cellules épithéliales)

68 QCM 13 Jonctions Cellule / Matrice extracellulaire: Intégrines

69 2- Molécules d adhérence - les Intégrines: Dimère α/β Toujours hétérophilique Interactions : - Cellule / Matrice extracellulaire Cellule / Cellule - 18 chaine α - 8 chaines β Sur la membrane de toutes les cellules sauf les GR

70 2- Les Intégrines: Signal Dimère α/β Activation «pince» Signal

71 2- Les Intégrines: Interactions Cellule / Matrice extracellulaire Actine Contacts focaux Extracellulaire fibronectine Fibronectine Appartient à la matrice extracellulaire Séquence RGD Actine Signaux cellulaire Intracellulaire

72 Interactions Cellule / Matrice extracellaire Contacts Focaux (Intégrines) Fibres de stress = Fibres de tension

73 Cellule épithéliale 2-Les Intégrines: Interactions Cellule / Matrice extracellulaire Filaments intermédiaires Hémidesmosomes Intracellulaire Cytokératine (FI) Hemidesmosome Lame basale Cytokératine (FI) Protéines d Ancrage Intégrines Laminine = lame basale Extracellulaire

74 2- Les Intégrines: Interactions Cellule / Cellule hétérophiliques Leucocyte CAM Intégrine (Immunoglobuline) Cellule endothéliale (vaisseaux)

75 QCM Les Sélectines: Glycoprotéines membranaires - Toujours hétérophilique Se lient aux sucres (via domaine lectine) Cellules spécialisées: E- endothéliales P- Plaquettes L- Leucocytes

76 QCM Les Sélectines: Sélectines Signaux mécaniques et chimiques Ca++ Exocytose Membrane plasmique N Cytosol C Cytosol C Activées par les médiateurs de l inflammation

77 Rôle des sélectines dans les mouvements du leucocyte leucocyte sucres E-Selectine Cellule endothéliale Leucocyte Cellule endothéliale 1- Sucres (mucines) 2- E-Sélectine Liaisons faibles - roulement 3- Intégrine activée 4- Ig-CAM Liaisons fortes - ouverture jonctions/passage

78 Non dépendantes du Ca++ 4- Les Immunoglobulines

79 4- Les Immunoglobulines hétérophiliques homophiliques Dans les jonctions Leucocyte CAM Intégrine (Immunoglobuline) Cellule endothéliale (vaisseaux)

80 Jonctions intercellulaires

81 Jonctions intercellulaires Importance des interactions: Cellule / cellule Cellule / matrice extracellulaire Jonctions cellulaires signaux intracellulaires: survie cellulaire, division, migration La cellule cancéreuse «s affranchit» de ses jonctions perturbations +++ des molécules d adhérence Exemple: perte de E-cadhérine

82 QCM 15 Concours

83 QCM 15 Les jonctions dans la cellule épithéliale Complexe de jonction: cellule épithéliale polarisée Jonction étanches (occludines / claudines) Jonction adhérente Desmosome (en «bouton») Jonction communicante (connexons) Contacts focaux Hemi-desmosome actine Filament intermédiaire

84 QCM 15 Les jonctions dans la cellule épithéliale Jonction Étanche (serrée) Jonction adhérente Desmosome

85 QCM 15 Espace étroit: Les jonctions étanches Définit la polarité cellulaire Protéines «spécifiques»: occludines / claudines tout autour de la cellule Jonctions étanches (serrées)

86 QCM 15 Espace étroit: Les jonctions étanches Définit la polarité cellulaire Protéines «spécifiques»: occludines / claudines

87 Ex Les molécules d adhérence Dépendance Ca++ Interactions Homophiliques ou hétérophilique Adhésion cellule / cellule Cytosquelette Jonctions cellulaires Cadhérines «classiques» E-Cadhérine Oui Homophiliques * Filaments d actine via les catenines (α et β) Jonction adhérente Cadhérines des desmosomes Desmoglein, desmocollin Oui Homophiliques * Filaments intermédiaires (cytokératine...) Desmosomes Immunoglobulines N-CAM Non Les 2 Sélectines Cellules spécialisées: L-E- et P-sélectines Oui Hétérophiliques Filaments d actine Adhésion cellule / matrice Intégrines α5β1 Oui Hétérophiliques Intégrines Filaments d actine via talin, vinculin, α- actinin Oui Hétérophiliques Filaments intermédiaires? Jonctions serrées, Desmosomes Contacts focaux Hemi-desmosomes

88 Les Jonctions Jonctions cellulaires Jonction adhérente Molécules d adhérence Adhésion cellule / cellule Cadhérines «classiques» Cytosquelette Filaments d actine via les caténines (α et β) Desmosomes Jonctions étanches Cadhérines des desmosomes (desmoglein, desmocollines ) Occludines, Claudines, Filaments intermédiaires (cytokératine...) Filaments d actine Jonctions communicantes Autres Connexines Selectine / CAM Ig / Integrine Leucocyte / endothélium (des vaisseaux) ; immunité Points d adhésion focaux Hemi-desmosomes Adhésion cellule / matrice Intégrines α5β1 Intégrines Filaments d actine via talin, vinculin, α- actinin Filaments intermédiaires