Immunologie. Virginie Robert. 18 décembre 2012

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1 Université Toulouse III Paul Sabatier (UT3 Paul Sabatier) Immunologie Virginie Robert 18 décembre 2012 Implication des canaux CaV1 dans la signalisation calcique des lymphocytes Th2 murins et humains : possibles applications thérapeutiques dans l'asthme Biologie, Santé, Biotechnologies (BSB) Inserm U1043 Lucette Pelletier Marc Moreau Thierry Capiod Pierre Launay M : Pr. Joost van Meerwijk - président Dr. Thierry Capiod - rapporteur Dr. Pierre Launay - rapporteur Dr. Aubin Penna - examinateur Dr. Marc Moreau - co-directeur Dr. Lucette Pelletier - co-directrice

2 Remerciements Je tiens tout d abord à remercier le Docteur Lucette Pelletier, ma directrice de thèse, pour m avoir offert la possibilité de travailler dans son équipe. Je lui suis reconnaissante pour son aide, son écoute, sa confiance et son accompagnement tout au long de mes années de thèses. Merci également à mon co-directeur Dr. Marc Moreau ainsi qu à Catherine Leclerc pour leur aide dans la conception de mon projet de thèse mais également pour leur œil non immunologique et leurs conseils. Merci au Docteur Jean-Charles Guéry pour m avoir initiée à la recherche mais également pour les conseils et l aide apportés au cours de mes années passés à l Inserm. Je remercie Emily pour l aide et la collaboration qu elle a apportées sur le projet Th2 humains. Je te souhaite plein de bonnes choses pour ta nouvelle vie néerlandaise. Merci à Magali Savignac pour son implication dans les projets et son aide. Je voudrais remercier Sophie Laffont et Nelly Rouquié pour leurs conseils toujours très avisés, leur sympathie et leurs encouragements. Merci à Laure Garnier et Pascal Azar pour leur bonne humeur et leur gentillesse. Merci à Joris à qui je souhaite bon courage pour cette année dense. Merci également à Pierre-Emmanuel Paulet et José Enrique Meija. Bien sûr un énorme merci à la Dream Team sans qui mes années passées à l Inserm n auraient pas eu la même saveur. Que de bons souvenirs, de bons moments passés ensemble. Aucun merci ne sera à la hauteur de ce que vous m avez apporté. Petite pensée émue quant au souvenir de nous tous dans les murs de l Inserm. La vie a fait que cette équipe de choc a été plus ou moins dispatchée. Certains ont choisi des voies différentes, d autres villes voire des pays différents mais vous avez toujours était là dans les moments importants et c est à cela qu on reconnaît de véritables amis.

3 Cyril, il y en aurait des choses à dire et ça m est bien difficile de t exprimer aujourd hui toute ma gratitude et ma reconnaissance. Tout d abord soit rassuré, les km qui nous séparent n ont pas affaibli notre lien d amitié qui s est étendue bien au-delà du cadre professionnel. J ai en mémoire toutes les soirées passées ensemble, les délires partagés, les prises de bec parfois, mais tu as toujours été d un soutien infaillible même encore aujourd hui. Merci d être là pour moi. Eliane, si l Inserm savait tout ce qu il s était passé dans ses murs Je pense bien évidemment aux «manips du soir», concoctés avec Cyril, dont les protocoles plus que douteux resteront à jamais graver dans ma mémoire. Bosseuse acharnée et passionnée, tu as également été d un soutien inébranlable. Tu as quitté l Institut depuis quelques années maintenant mais au moindre problème ou appel au secours, tu es là quelque soit l heure ou le jour. Mille mercis à toi. Marie-Laure, nous avons initié ensemble le projet Th2 humains et je garde un très bon souvenir de nos Ficoll matinaux. Tu m as également aidée à faire mes premiers pas dans l équipe de Lucette et tu as su me soutenir et me remotiver dans cette année de M2R ô combien difficile. Même dans d autres équipes à Toulouse ou Paris, tu as toujours gardé contact et su entretenir cette amitié. Lise, dernière rescapée de l Inserm. Je vais t abandonner à mon tour mais je sais que tu es entre de bonnes mains. Merci d avoir pris le temps de m écouter quand je venais me plaindre dans ton bureau. Ton soutien m a également été d une importance capitale tout au long de ces années. Fanny merci également à toi et à ta bonne humeur pétillante. J espère que ta nouvelle équipe t apportera des amitiés comme celles que nous avons créées. Bonne humeur également largement diffusée par Delphine. Merci pour ton soutien. Ta vie va bientôt prendre un autre tournant et je te souhaite tout le bonheur du monde. Je souhaiterais également remercier Nabila et Julie pour leur oreille attentive, leurs conseils et leur soutien. Merci à tous les membres de l Inserm pour les bons souvenirs, les échanges scientifiques ou non que nous avons partagés. Enfin j associe à ces remerciements ma famille et mes amis pour leur soutien, leur «remontage de moral» et leur écoute. Un grand merci à mon mari pour sa patience, sa compréhension et son amour.

4 Sommaire LISTE DES ABREVIATIONS...3 RESUME...5 ABSTRACT...6 INTRODUCTION...7 I. LES LYMPHOCYTES TH2...8 A. Différenciation des lymphocytes Th Facteurs influençant la différenciation Th L IL-4 et induction de facteurs de transcription Instruction par les cellules dendritiques...12 B. Les lymphocytes Th2 dans l asthme allergique Initiation de l asthme allergique Cellules dendritiques et présentation antigénique Rôle de TSLP dans la polarisation Th Rôle de l IL-33 et l IL-25 dans la polarisation Th Rôle de l IL-4 dans la polarisation Th Rôle effecteur des lymphocytes Th2 dans l asthme L IL L IL L IL II. LA SIGNALISATION CALCIQUE DANS LES LYMPHOCYTES T...24 A. Rôle du calcium dans la biologie des lymphocytes T Activation et prolifération des lymphocytes T Apoptose des lymphocytes T...25 B. Les canaux régulant la concentration calcique intracellulaire Les canaux CRAC Autres canaux modulant l influx calcique Les canaux TRP...29 Les canaux TRPC...30 Les canaux TRPM...30 Les canaux TRPV Les canaux potassiques Les canaux purinorécepteurs P2X...33 III. LES CANAUX CALCIQUES CA V A. Description des canaux Ca V La sous-unité! La sous-unité!2" La sous-unité # La sous-unité $...37 B. Transduction du signal calcique par les canaux Ca V 1- mode d action Rôle des canaux Ca V1 dans les cellules excitables Activation des canaux Ca V Stimulation des canaux Ca V1 par les protéines kinases

5 Stimulation des canaux Ca V1 par les tyrosines kinases...43 Stimulation des canaux Ca V1 par la calmoduline kinase (CaM) Inactivation des canaux...44 Inactivation dépendante du Ca 2+ (CDI)...44 Inactivation dépendante du voltage (VDI) Les canaux Ca V1 dans les cellules immunitaires Syndrome de Timothy Ca V1 et lymphocytes B Ca V1 et lymphocytes T natural killer Ca V1 et macrophages Ca V1 et cellules dendritiques Ca V1 et lymphocytes T...49 RESULTATS...52 I. ARTICLE II. ARTICLE DISCUSSION ET PERSPECTIVES...57 REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES...74 ANNEXES

6 LISTE DES ABREVIATIONS A D AMP Adénosine Mono-phosphate DAG Diacyglycérol AP1 Activator Protein DC Cellule Dendritique ARN Acide Ribonucléique DHP Dihydropyridine ATP Adénosine Tri-Phospate DL Delta-Like B Ba 2+ BCRB C Ca 2+ [Ca 2+ ]i CaM CBD CD CDI CICR CMH Cn CPA Barium Cell Receptor Calcium Concentration calcique intracellulaire Calmoduline CaM-Binding Domain Cluster of Differentiation Ca 2+ dependant inactivation Ca 2+ Induced Ca 2+ Release Complexe majeur d Histocompatibilité Calcineurine Cellule Présentatrice d Antigène CRAC Ca 2+ Release-Activated Ca 2+ Channels CREB Cycli-AMP-responsive element-binding protein C-ter C-terminal F FcR Récepteur des Fragments fmlp N-formyl-methionyl-leucylphenylalanine Foxp3 Forkhead box P3 G GATA3 GATA binding protein 3 GM-CSF Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor H HEK Human Embryonic Kidney I IBD Inflammatory Bowel Disease ICD Intracellular Domain IFN Interféron Ig Immunoglobuline IL Interleukine IP 3 Inositol 1, 4, 5-triphosphate IP 3 R Récepteur à l IP 3 L LT Lymphocyte T 3

7 M R MAPK Mitogen-activated protein RBPJk Recombinant signal binding kinase protein Jk MEF2 Myocyte Enhancer Factor 2A RE Réticulum Endoplasmique Mg 2+ Magnésium RS Réticulum Sarcoplasmique Myd88 Myeloid Differenciation RTSLP Récepteur au TSLP primary-response gene RyR Récepteur à la Ryanodine N Na 2+ Sodium NDPK-B Kinase B Diphosphatase Nucléoside NF-%B Nuclear Factor kappa B NFAT Nuclear Factor of Activated T cell NK Natural Killer N-ter N-terminal P PAA Phénylalkylamine PAMP Pathogen-Associated Molecular Pattern PiP2 Phosphatidylinositol 4, 5- biphosphate PK Proteine Kinase PLC Phospholipase C Plg-R Récepteur du plasminogène PRD Prolin Rich Domain PRR Pattern Recognition Receptor PTK Proteine Tyrosine Kiinase S SCID SOCE STAT STIM T TCR T FH TFN Th TLR Treg TRP TSLP V VCAM VDI Severe Combined Immunodeficiency Store-Operated Ca 2+ Entry Signal Transduction and Activator of Transcription Stromal Interaction Molecule TCell Receptor TFollicular Helper Tumor Necrosis Factor Lymphocyte T Helper Toll Like Receptor T régulateur Transient Receptor Potential Thymic Stromal Lymphopoietin Vascular Cell Adhesion Molecule Voltage dependant Inactivation 4

8 Virginie Robert Directeurs de thèse : Lucette Pelletier et Marc Moreau Thèse soutenue le 18 décembre 2012 à l hôpital Purpan, Toulouse RESUME L activation des LT induit une entrée de Ca 2+ par les canaux CRAC/ORAI. Cette augmentation de la concentration calcique intracellulaire ([Ca 2+ ]i) est nécessaire à l expression de gènes tels que ceux codant pour les cytokines. Il existe des différences au niveau de la [Ca 2+ ]i entre les sous-populations de LT suggérant que les composants de la signalisation calcique diffèrent entre les populations. Des récentes études ont montré que d autres canaux pouvaient être impliqués dans la biologie des LT, notamment les canaux calciques Ca V 1. Ma thèse a consisté à étudier le rôle des canaux Ca V 1 dans le fonctionnement des LT. Nous avons montré que les isoformes Ca V 1.2 et Ca V 1.3 étaient exprimés par les Th2, une population produisant de l IL-4 et impliquée dans l asthme allergique. L inhibition de l expression de ces canaux par des oligonucléotides anti-sens (Ca V 1AS) a montré qu ils permettaient l augmentation de la [Ca 2+ ]i et la production de cytokines. Les Th2 ayant un rôle central dans la physiopathologie de l asthme, nous avons également testé l effet de l inhibition de ces canaux dans les Th2 dans un modèle d asthme expérimental. Les Th2 transfectés avec Ca V 1AS ne permettaient plus le développement de l asthme. De plus, l administration des Ca V 1AS par voie aérienne prévenait le développement de l inflammation et de l hyperréactivité bronchique. D autre part, nous avons montré que les Th2 humains exprimaient également les canaux Ca V 1.2 et Ca V 1.3 contrairement aux Th1, une population produisant de l IFN-#, responsables de l élimination des pathogènes intracellulaires. Leur inhibition pharmacologique et par les AS ont révélé l importance de ces canaux dans la signalisation calcique induite par l engagement du TCR et la production de cytokines. Nous avons également démontré que la sous-unité $ des canaux Ca V 1 était importante pour l expression du canal et sa localisation à la membrane. De plus, il semblerait que le fonctionnement de Ca V 1 soit sous le contrôle de la PKC, puisqu un inhibiteur pharmacologique réduit fortement l entrée de Ca 2+ après activation, et la production de cytokines associée. Nos travaux montrent qu il existe une expression différentielle des canaux Ca V 1 entre les sous-populations de LT puisqu ils sont présents et fonctionnels dans les Th2 et sont absents des Th1. De plus ces canaux s avèrent être indispensables au fonctionnement des Th2. Mots clés : lymphocytes Th2, canaux calciques Ca V 1, calcium, signalisation calcique, asthme. Discipline : Immunologie Inserm U1043, Centre de Physiopathologie Toulouse Purpan, CHU Purpan, BP3028, Toulouse Cedex 3 5

9 ABSTRACT LT activation induce Ca 2+ entry by CRAC channels. This increase in intracellular calcium concentration ([Ca 2+ ]i) is necessary for the expression of genes such as those encoding cytokines. There are differences in the [Ca 2+ ]i between subsets of LT suggesting that calcium signaling components differ between populations. Recent studies have shown that other channels could be involved in the biology of LT, including Ca V 1 calcium channels. My thesis was to investigate the role of Ca V 1 channels in the biology of LT. We have shown that Ca V 1.2 and Ca V 1.3 isoforms were expressed by Th2. The inhibition of the expression of these channels by antisense oligonucleotides (Ca V 1AS) showed that they allowed the increase in [Ca 2+ ]i and production of cytokines. Th2 having a central role in the pathophysiology of asthma, we also tested the effect of inhibition of these channels in a Th2 in a model of experimental asthma. Th2 transfected with Ca V 1AS no longer allowed the development of asthma. In addition, the administration of Ca V 1AS by intranasal route prevents the development of inflammation and bronchial hyperreactivity. On the other hand, we have shown that human Th2 also expressed Ca V 1.2 and Ca V 1.3 channels in contrast to Th1. Their pharmacological inhibition by AS revealed the importance of these channels in calcium signaling induced by TCR engagement and cytokine production. We also demonstrated that the! subunit of Ca V 1 channels is important for the expression of the channel and its location at the plasma membrane. In addition, it appears that the function of Ca V 1 is under the control of PKC, since pharmacological inhibitor strongly reduced Ca 2+ entry after activation and cytokine production associated. Our work shows that there is a differential expression of Ca V 1 channels between subsets of LT since they are present and functional in Th2. In addition, these channels appear to be essential to the functioning of Th2. 6

10 INTRODUCTION 7

11 Mon travail porte sur l identification de molécules clés sélectivement exprimées par les lymphocytes CD4 + de type 2 et jouant un rôle-clé dans la biologie de ces cellules. Ce travail a une portée thérapeutique puisque les Th2 sont une souspopulation impliquée dans la lutte contre les helminthes mais aussi capables d induire des pathologies allergiques. Dans ce manuscrit, j ai choisi de décrire brièvement les lymphocytes Th2 et les facteurs favorisant leur différenciation. Je me suis attachée ensuite à rapporter la place des lymphocytes Th2 dans l asthme allergique. Puisque j ai identifié l expression sélective dans les Th2 de souris des canaux calciques Ca V 1, canaux normalement activés par dépolarisation de la membrane plasmique et caractéristiques des cellules excitables, je parlerai des données récentes consensuelles en ce qui concerne la signalisation calcique dans les lymphocytes T. Je tâcherai de donner des connaissances rendant compte de la régulation des canaux Ca V 1 dans les cellules excitables avant de discuter du rôle possible des canaux Ca V 1 dans la signalisation calcique des lymphocytes T. I. Les lymphocytes Th2 Après l engagement du récepteur T (TCR) par le complexe majeur d histocompatibilité (CMH)-peptide, les lymphocytes T (LT) CD4 + vont rapidement rentrer en différenciation programmée. Les lymphocytes T naïfs peuvent se différencier en plusieurs sous-populations. Les sous-populations de lymphocytes effecteurs «helper» CD4+, Th1 et Th2 ont été décrites, chez la souris, pour la première fois par Mossman et Coffman (Mosmann et al., 1986). Ces deux classes cellulaires sont distinguées par leur sécrétion de cytokines ; interféron-gamma (IFN-#) pour les Th1 et les interleukines (IL) 4, 5 et 13 pour les lymphocytes Th2. La différence entre ces deux populations s observe également par le type de réponse immunitaire dans lequel elles sont impliquées. En effet, Locksley et son équipe ont montré que les lymphocytes Th1 participaient à l élimination du pathogène Leishmania major tandis que les Th2 ne le faisaient pas (Heinzel et al., 1989). Depuis, il est établi que les lymphocytes Th1 sont 8

12 impliqués dans la défense contre des pathogènes intracellulaires alors que les lymphocytes Th2 contribuent à l éradication des pathogènes extracellulaires tels que les helminthes. Plus récemment d autres populations de lymphocytes T ont été décrites. Il existe donc de multiples sous-populations de lymphocytes T effecteurs mais également des populations régulatrices contrôlant l homéostasie des populations effectrices. Ces populations ne seront pas abordées dans ce manuscrit, je me focaliserai principalement sur les lymphocytes Th2 et Th1. A. Différenciation des lymphocytes Th2 La différenciation des lymphocytes T helper est définie par l acquisition de la capacité à produire, sélectivement, de larges quantités de cytokines après rencontre avec un antigène. Lors du développement des différents lignages de lymphocytes T, les instructions reçues par les LT naïfs lors de la rencontre avec la cellule présentatrice d antigène (CPA) seront converties en changements intrinsèques cellulaires. Ces changements consistent en l interaction et la localisation de différents facteurs de transcription qui conduiront à la modification de l expression de gènes. 1. Facteurs influençant la différenciation Th2 La décision de lignage Th1 ou Th2 est influencée par de nombreux facteurs. Un des processus de différenciation des lymphocytes Th2 est lié à l action de cytokines et notamment l IL-4 aboutissant à l expression de facteurs de transcription plus ou moins spécifiques des lymphocytes Th2. D autre part, les cellules dendritiques ont également un rôle dans le contrôle de la différenciation. Ces cellules vont être instruites et vont conduire, grâce à des signaux moléculaires, les lymphocytes T vers le phénotype Th1 ou Th2. Nous parlerons 9

13 ici des principaux mécanismes et voies de signalisation mis en place lors de la différenciation Th L IL-4 et induction de facteurs de transcription Dans les études in vitro, les lymphocytes Th2 sont généralement générés après activation des lymphocytes T naïfs avec un antigène en présence d IL-4. Le récepteur à l IL-4 est exprimé par ces cellules. Si un certain niveau d IL-4 est atteint lors de l initiation de la réponse immune, les lymphocytes Th2 peuvent se différencier et devenir des producteurs importants d IL-4 (figure 1). Les souris invalidées pour le gène Il-4 présentent un défaut majeur de la différenciation Th2 en réponse à de nombreux stimuli (Kopf et al., 1993) (Kuhn et al., 1991). La fixation de l IL-4 à son récepteur mène à l activation de STAT6 (signal transduction and activator of transcription 6). Cette voie est fonctionnelle dans les Th2 mais pas dans les Th1 (Kubo et al., 1997). La surexpression de STAT6 constitutivement actif dans les lymphocytes T activés induit efficacement l activation du locus Il-4 (Zhu et al., 2001) alors que les souris déficientes pour ce gène présentent une réponse Th2 réduite (Kaplan et al., 1996) (Shimoda et al., 1996). Bien que STAT6 se lie directement au promoteur Il-4, son importance physiologique pour la différenciation Th2 est largement attribuée à sa capacité à coopérer avec les signaux émis par le TCR pour induire l expression de GATA-3. Ouyang (Ouyang et al., 2000) a démontré que STAT6 n est pas indispensable à la différenciation Th2, puisqu une minorité de cellules STAT6 -/- était capable de produire de l IL-4 tout en surexprimant GATA-3. L importance de GATA-3 dans la différenciation Th2 a été établie par plusieurs équipes. Les lymphocytes T naïfs expriment le gène Gata-3. Celui-ci est surexprimé lors de la différenciation Th2, tandis qu il est réprimé au cours de la différenciation Th1 (Lee et al., 2000) (Ouyang et al., 1998) (Zheng and Flavell, 1997). Le gène Gata-3 est une cible de la signalisation STAT6, cependant la 10

14 surexpression de Gata-3 dans des lymphocytes T primaires est bloquée par un inhibiteur de NF-%B, SN50, suggérant que NF-%B est également impliqué dans la régulation de GATA-3 (Das et al., 2001). Le rôle de GATA-3 dans la production de cytokines de type 2 a été démontré en surexprimant ce facteur dans des lymphocytes T primaires ce qui conduisait à une augmentation de la production d IL-4 (Lee et al., 2000) (Ouyang et al., 1998) (Zheng and Flavell, 1997) mais également d IL-5 et Il-13 (Zhang et al., 1998) (Kishikawa et al., 2001). De plus, GATA-3 semble jouer un rôle important dans les changements de chromatine dans le locus Il-4 au cours de la différenciation Th2 (Ouyang et al., 2000) (Lee et al., 2000) (Yamashita et al., 2004) (Zhu et al., 2003). Le proto-oncogène c-maf, un membre de la famille des protéines b-zip (basicregion leucine-zipper) a été initialement décrit comme le facteur de transcription spécifique des lymphocytes Th2. Il est connu maintenant que ce facteur intervient en aval de GATA-3. Le groupe de Ho (Ho et al., 1998) a démontré que la surexpression de c-maf chez la souris favorisait une réponse immune de type Th2, résultant en une production accrue de cytokines Th2 et d immunoglobulines (Ig) G1 et IgE dépendantes de l IL-4. L expression ectopique de c-maf dans les lymphocytes Th1 ne leur confère pas la capacité à produire de l IL-4 mais diminue la production d IFN-# atténuant ainsi la différenciation en Th1. De plus, d autres études ont montré que les souris dépourvues du facteur c-maf présentaient un défaut de production d IL-4 (Kim et al., 1999). L expression de c- Maf est induite par les signaux transmis par le TCR et permet la production d IL-4 en se fixant sur le site MARE du promoteur IL-4 (Ho et al., 1996). La différenciation Th2 fait également intervenir d autres facteurs de transcription moins spécifiques de ces cellules que GATA-3 ou c-maf. Parmi ces facteurs NFAT a un rôle essentiel. Il se lie aux promoteurs des gènes IL-4, IL-5 et IL-13, associé à d autres éléments activateurs pour permettre leur transcription. Les lymphocytes T expriment plusieurs isoformes de NFAT : NFATc1, NFATc2 et NFATc3. NFATc2 agirait comme un rétrocontrôle négatif limitant la transcription 11

15 du gène IL-4 au cours de l activation, puisque l absence de NFATc2 est associée à une réponse Th2 prononcée (Xanthoudakis et al., 1996) (Ranger et al., 1998). AP1 (activator protein-1) est également un facteur nécessaire à la différenciation des lymphocytes Th2. Ces molécules sont constituées d homo ou d hétérodimères entre les protéines des membres de la famille Jun (c-jun, JunB et JunD) et de la famille Fos (c-fos, FosB, Fra1 et Fra2). Les sites de fixation pour AP1 sont souvent adjacents à ceux de NFAT. D ailleurs, plusieurs membres des familles Jun et Fos ont été identifiés comme partenaires des complexes NFAT/AP1 après activation du TCR. De plus, il a été montré que JunB pouvait se fixer directement en synergie avec le facteur c-maf pour activer l expression de l IL-4 (Li et al., 1999). 1.2 Instruction par les cellules dendritiques Les cytokines ne sont pas les seuls signaux influençant la différenciation des lymphocytes T. Les molécules présentent à la surface des cellules dendritiques sont également capables d instruire les lymphocytes T (figure 1). Par exemple, des études ont rapporté un rôle complexe de régulation de la différenciation Th1/Th2 par la voie de signalisation Notch. Il existe quatre récepteurs Notch pouvant se lier à cinq ligands : Delta-like (DL)1, DL3, DL4, Jagged1 and Jagged2. Il a été montré que la différenciation Th2 dépendait de la combinaison Notch1/2-Jagged1/2. Les lymphocytes T CD4 naïfs expriment Notch1 et Notch2, tandis que les cellules dendritiques expriment les ligands Jagged1 et Jagged2. Lors de la rencontre des lymphocytes T avec les cellules dendritiques, la liaison du ligand à son récepteur permet le relargage du domaine intracellulaire (ICD) de Notch par clivage protéolytique. L ICD va ensuite entrer dans le noyau et transactiver des gènes grâce à son association avec le facteur de transcription RBPJk (recombinant signal binding protein Jk). Notch semble jouer un rôle important dans la différenciation Th2 puisque les souris dépourvues 12

16 du facteur RBPJk présentent un défaut de différenciation Th2 (Amsen et al., 2004) (Tanigaki et al., 2004). De plus, l expression du domaine ICD de Notch dans les lymphocytes T CD4 + augmente la production d IL-4 concomitante à l augmentation de l expression de GATA-3 (Amsen et al., 2004). Notch peut agir directement sur des gènes cibles pour promouvoir la différenciation Th2. Deux gènes cruciaux, ll-4 et Gata-3, ont été identifiés comme cibles de Notch et RBPJk (Amsen et al., 2004) (Kato et al., 1996). De plus, un activateur présent en 3 sur le gène ll-4 contient plusieurs sites de liaison à RBPJk (Amsen et al., 2004). L action de Notch est indépendante de STAT6 car Notch est capable d initier la différenciation Th2 indépendamment de l IL-4. Cependant, une production optimale d IL-4 est observée en présence seule de STAT6 suggérant que Notch initierait la différenciation Th2 et que l IL-4 la renforcerait. 13

17 Figure 1 : Voie de différenciation des lymphocytes Th2. La différenciation des lymphocytes T vers un lignage Th2 implique l induction de GATA- 3. L activation de GATA-3 est médiée par le facteur d activation STAT6 lui-même activé par l IL-4. Le lymphocyte T reçoit également un signal via les cellules dendritques par l intermédiaire de la voie de signalisation Jagged/Notch. Le domaine intracellulaire de Notch convertit le facteur RBPJk en activateur transcriptionnel. Ces différents signaux conduisent à la production d IL-4 amplifiant le système de façon autocrine. L activation de GATA-3 permet également la production des autres cytokines de type 2, IL-5 et IL

18 B. Les lymphocytes Th2 dans l asthme allergique L asthme est une maladie respiratoire touchant 5 à 10% de la population et en constante progression au cours des dernières décennies. L asthme allergique est caractérisé par une sensibilité exagérée à des pneumallergènes tels que les poussières de mites domestiques ou les pollens. Cette maladie chronique inflammatoire se définit par une inflammation pulmonaire importante caractérisée par un recrutement massif de cellules inflammatoires et en majorité des éosinophiles. L intégrité des bronches est également atteinte, puisqu une hyperplasie des cellules productrices de mucus est observée, entraînant une hypersécrétion de mucus. Associée à un épaississement des fibres musculaires, cette hypersécrétion conduit à un encombrement bronchique responsable de l hyperréactivité bronchique observée chez les patients asthmatiques. 1. Initiation de l asthme allergique 1.1 Cellules dendritiques et présentation antigénique Des cellules présentatrices d antigènes comme les cellules dendritiques sont présentes au niveau de l épithélium respiratoire. Ces cellules possèdent des récepteurs PRR (pattern recognition receptor) reconnaissant des motifs microbiens conservés appelés les PAMP (pathogen-associated molecular pattern). Les signaux émis par les PRR conduisent à l activation des cellules dendritiques en permettant la surexpression du complexe majeur d histocompatibilité de classe II (CMHII) et des molécules de co-stimulation. Ces cellules vont donc acquérir la capacité de capter les allergènes et de les présenter aux lymphocytes T via le CMHII. Chez les individus allergiques, ce processus est facilité par l interaction des allergènes avec les immunoglobulines de type E (IgE) reconnues par le récepteur de haute affinité au fragment Fc des IgE (Fc&R) (Sallmann et al., 2011). Il semblerait que les cellules dendritiques ne 15

19 soient pas présentes dans l épithélium respiratoire à la naissance (Nelson et al., 1994). Les dommages engendrés par les microorganismes ou autres substances irritantes seraient le principal stimulus responsable de la migration des cellules dendritiques dans ces tissus (McWilliam et al., 1994). Il a été montré que Derp1, l allergène majeur de la poussière de mite, augmente la perméabilité de l épithélium bronchique en clivant les protéines de jonctions, permettant l accès aux DC (Wan et al., 1999) (figure 2). Ces agressions déclencheraient la production de diverses chimioattractants tels que CCL19, CCL20 et CCL27 (Hammad et al., 2010). Les cellules dendritiques et l épithélium bronchique sont en perpétuel dialogue. L activation des PRR, tels que les récepteurs Toll-like (TLR), les lectines de type C, par les allergènes entraînent la production de divers médiateurs et cytokines de l immunité innée programmant des DC pro-th2. Des études ont montré que la sécrétion de GM- CSF par les cellules épithéliales conduisait à la maturation des DC et à la rupture de la tolérance pulmonaire (Cates et al., 2004). 1.2 Rôle de TSLP dans la polarisation Th2 TSLP est une cytokine produite par l épithélium bronchique, ayant les capacités de moduler les DC (figure 2). Le rôle crucial de TSLP dans l asthme, a été mis en évidence grâce à l utilisation de souris sur-exprimant le transgène de cette cytokine sous le contrôle du promoteur SPC (surfactant protein C) dans les poumons. Les travaux de Zhou (Zhou et al., 2005) et Headley (Headley et al., 2009) ont montré que ces souris présentaient une réponse Th2 très importante dirigée contre un allergène, l ovalbumine, dans les voies respiratoires dans un modèle d asthme expérimental. A. Al-Shami et col. ont étudié l impact de l absence du récepteur à TSLP (RTSLP) sur le développement d un asthme expérimental induit par immunisation avec de l ovalbumine dans de l alun et exposition ultérieure à l ovalbumine par voie aérienne. Les souris dépourvues du RTSLP n ont pas de réaction inflammatoire et une production diminuée d IL-4 16

20 après stimulation des lymphocytes des ganglions péri-bronchiques avec de l ovalbumine (Al-Shami et al., 2005). Les travaux d Ito montrent que les DC activées par TSLP expriment la molécule de co-stimulation OX40L, molécule requise pour la polarisation des lymphocytes T naïfs en faveur des lymphocytes Th2 et leur production d IL-4, IL-5 et IL-13. De plus, TSLP permettrait la production des chimiokines CCL17 et CCL22 par les DC (Ito et al., 2005). 1.3 Rôle de l IL-33 et l IL-25 dans la polarisation Th2 D autres cytokines, décrites plus récemment, produites par l épithélium bronchique, interviennent également dans la polarisation des lymphocytes Th2, comme l IL-33, appartenant à la famille de l IL-1 (figure 2). Bien que la présence du récepteur à l IL-33 à la surface des lymphocytes T naïfs soit controversée, Kurowska-Stolarska a décrit, qu en présence d allergène, l IL-33 était capable de polariser des lymphocytes T naïfs murins comme humains en une population de lymphocytes T producteurs d IL-5 mais pas d IL-4 (Kurowska-Stolarska et al., 2008). Cette polarisation serait dépendante de la voie MyD88 et ferait intervenir les MAPK et le facteur de transcription NF-%B. Cependant, ni l IL-4 ni la voie STAT-6 ne seraient impliquées, et il n y aurait aucune induction du facteur de transcription GATA-3. L IL-25 appartenant à la famille de l IL-17 est également capable d induire la polarisation des lymphocytes Th2 (figure 2). Angkasekwinai a montré dans ses travaux que les Th2 exprimaient plus fortement le récepteur à l IL-25 que les autres T effecteurs. De plus, le blocage de cette cytokine réduit l inflammation respiratoire et la production de cytokines de type Th2 dans un modèle d asthme murin. Cette cytokine promeut la différenciation des lymphocytes Th2 de manière IL-4 et STAT-6 dépendante. Durant les phases précoces de l activation des lymphocytes T, l IL-25 potentialise l expression du facteur de transcription NFATc1 et JunB conduisant à l augmentation de la production d IL-4 et l expression de GATA-3 (Angkasekwinai et al., 2007). 17

21 1.4 Rôle de l IL-4 dans la polarisation Th2 Après activation, les DC des voies respiratoires migrent vers les ganglions lymphatiques drainants où elles contrôlent l activation et la différenciation des lymphocytes T spécifiques de l antigène. Le processus par lequel les lymphocytes T naïves se différencient en Th2 au cours de cette sensibilisation reste mal connu, notamment en ce qui concerne la source d IL-4 obligatoire pour activer les facteurs de transcription GATA-3 et STAT-6. Plusieurs hypothèses ont été émises quant au processus responsable de la différenciation en Th2. Plusieurs études ont montré que la réponse Th2 s établissait par défaut en absence de cytokines de type Th1 ou Th17 lors de l interaction T-DC (Stumbles et al., 1998). D autres études ont montré qu une faible interaction entre le CMHII et le TCR et le degré de costimulation favorisait le développement de Th2 (Constant et al., 1995) (Lambrecht et al., 2000) (Jankovic et al., 2004). Ces études suggèrent ainsi que le lymphocyte T serait sa propre source d IL-4 nécessaire à sa différenciation en Th2. D autre part, certains auteurs ont montré que la production d IL-4 serait assurée par d autres cellules comme les mastocytes ou les basophiles (van Panhuys et al., 2011). 18

22 Figure 2: Activation des lymphocytes Th2 par les cellules dendritiques dans l asthme Les cellules dendritiques (DC) de la moelle osseuse vont être attirées au niveau de l épithélium bronchique en réponse à des chimiokines (CCL20, CCL19 et CCL27) produites en réponse à l agression de l épithélium par divers agents extérieurs comme les polluant, les bactéries ou encore les virus. Ces stimuli vont conduire à leur maturation, moment à partir duquel les DC vont acquérir leur capacité à capturer des antigènes. Dans le cas de l asthme, les DC vont capturer des allergènes, migrer dans les ganglions lymphatiques où elles permettront la différenciation des lymphocytes T naïfs en Th2. 2. Rôle effecteur des lymphocytes Th2 dans l asthme Les lymphocytes Th2 ont été décrits comme les cellules orchestrant la réponse inflammatoire dans l asthme allergique. Une fois activées, ces cellules migrent vers le site de l inflammation où elles peuvent être restimulées par des DC 19

23 activées. Toutes les cytokines produites par les lymphocytes Th2 ont été décrites comme ayant un rôle dans la physiopathologie de l asthme (figure 3). 2.1 L IL-4 Des études utilisant un fragment du récepteur à l IL-4 neutralisant l IL-4 ont montré que ce traitement présentait un bénéfice thérapeutique (Borish et al., 1999). L IL-4 contribue au développement de l asthme allergique au travers de plusieurs mécanismes (figure 3). Cette cytokine induit la commutation de classe vers les IgE sécrétées par les lymphocytes B. L IL-4 permet également la surexpression des récepteurs aux IgE à la surface des mastocytes (Pawankar et al., 1997). Cela a également été démontré avec des lymphocytes B stimulés par des IgM solubles et cultivés en présence d IL-4 (Defrance et al., 1987). Le même effet de l IL-4 a été observé sur des monocytes humains où l induction de l expression des récepteurs aux IgE a été observée jusqu à 72 heures après incubation des cellules avec de l IL-4 recombinante (Vercelli et al., 1988). L IL-4 est aussi connue pour induire l expression des molécules d adhésion VCAM-1 (vascular cell adhesion molecule-1) à la surface de l endothélium, permettant ainsi l extravasation des éosinophiles (Schleimer et al., 1992) (Moser et al., 1992). Enfin, un des rôles primordial de l IL-4 est de promouvoir la différenciation des lymphocytes T naïfs en lymphocytes Th2 sécrétant de l IL-4, IL-5 et IL-13 et contrôle négativement la différenciation en lymphocytes Th1 (Abehsira-Amar et al., 1992) (Seder et al., 1992). En absence d IL-4, la différenciation des lymphocytes Th2 est inhibée ainsi que la sécrétion d IL-4 et d IL L IL-5 L IL-5 produite par les lymphocytes Th2 est sélective, chez l Homme, des éosinophiles et basophiles, populations cellulaires prédominantes dans l asthme allergique, tandis qu elle agit aussi sur les lymphoyctes B chez la souris. Associée à son récepteur, cette cytokine permet la croissance et la 20

24 différenciation des éosinophiles à partir de la moelle osseuse (Clutterbuck et al., 1989) (Clutterbuck and Sanderson, 1990) (Yamaguchi et al., 1988), leur migration (Resnick and Weller, 1993) (Warringa et al., 1992), leur activation et leurs fonctions effectrices (Carlson et al., 1993) (Kita et al., 1992), ainsi que leur survie (Yamaguchi et al., 1991) (figure 3). Plusieurs études ont démontré une corrélation entre l activation des lymphocytes T, l augmentation de la concentration d IL-5 dans le sérum et le liquide de lavage broncho-alvéolaire et la sévérité de la réponse asthmatique (Robinson et al., 1992) (Robinson et al., 1993) (Motojima et al., 1993) (Zangrilli et al., 1995). Son rôle dans la physiopathologie de l asthme a été démontré en bloquant cette cytokine grâce à l utilisation d anticorps anti-il-5. L étude de Leckie a montré qu un anticorps monoclonal humanisé anti-il-5 réduisait efficacement le nombre d éosinophiles dans la circulation et dans les voies respiratoires de patients asthmatiques, bien que l hyperréactivité bronchique ne soit pas diminuée (Leckie et al., 2000). L infiltration d éosinophilies dans les voies respiratoires après sensibilisation à l allergène est une caractéristique des personnes asthmatiques (Durham and Kay, 1985) (Wardlaw et al., 1988). L IL-5 est retrouvée majoritairement dans les phases tardives de la réponse immunitaire contre l allergène (Robinson et al., 1993). En effet, l IL-5 n est pas détectable dans les liquides de lavages bronchoalvéolaires juste après la sensibilisation à l allergène chez les personnes asthmatiques (Sedgwick et al., 1991). L IL-5 est importante pour le recrutement et la survie des éosinophiles (Ohnishi et al., 1993) (Robinson et al., 1993). Elle est également responsable du passage du sang vers les tissus des éosinophiles, puisque l administration d IL-5 recombinante dans les voies nasales induit une accumulation de ces cellules dans le mucus nasal (Terada et al., 1992). Il semblerait que l IL-5 permette également l activation des éosinophiles présents au site inflammatoire. Il est cependant possible que cet effet puisse être attribué à l IgA sécrétoire (Corrigan et al., 1993). 21

25 2.3 L IL-13 L IL-13 possède une action similaire à celle de l IL-4, en ce qui concerne la production d IgE, mais elle ne permet pas la différenciation des lymphocytes Th2 (figure 3). Des études murines ont identifié l IL-13 comme un médiateur clé de la réponse allergique (Wills-Karp et al., 1998) (Grunig et al., 1998) (Zhu et al., 1999). Plusieurs groupes ont montré que le blocage de l IL-13 endogène, par administration de récepteurs à l IL13 solubles dans des souris sensibilisées, réduisait l hyperréactivité bronchique et l hyperplasie des cellules productrices de mucus (Wills-Karp et al., 1998) (Zhu et al., 1999). De plus, l injection d IL-13 recombinante ou sa surexpression dans les poumons de souris induit le développement d un asthme très similaire à celui observé chez l Homme, caractérisé par une inflammation éosinophilique, une hyperréactivité bronchique, une hyperplasie des cellules productrices de mucus et une fibrose sousépithéliale (Wills-Karp et al., 1998) (Grunig et al., 1998) (Zhu et al., 1999). L ensemble de ces résultats démontre que l IL-13 est une cytokine au rôle crucial dans la phase effectrice de l asthme allergique dans les modèles expérimentaux. L importance de l IL-13 dans l asthme humain a également été rapportée par de nombreuses études démontrant un niveau élevé de cette cytokine dans les poumons de patients asthmatiques (Humbert et al., 1997) (Naseer et al., 1997). Devant l importance du rôle des cytokines produites par les lymphocytes Th2 dans la physiopathologie de l asthme, chaque cytokine représente une cible thérapeutique potentielle. Des anticorps anti-ige, anti-il-5, et anti-tnf" ont été utilisés dans des essais cliniques. Les anticorps anti-ige auraient un certain effet bénéfique mais uniquement dans les asthmes à concentration élevée d IgE et les anticorps anti-il-5 donnent des résultats cliniques décevants. Des stratégies visant à inhiber l IL-4 et l IL-13 sont en cours. Il est possible que l inhibition de plusieurs cytokines Th2 soit plus intéressante que de tenter d inhiber isolément l une d entre elles. Une autre optique serait d inhiber des molécules clés impliquées dans la fonction des Th2. De ce point de vue, l inhibition d expression de GATA-3, de kinases importantes pour la signalisation des Th2 comme itk ou 22

26 des composants de la voie NFkB s est avérée efficace dans des modèles d asthme expérimental. Figure 3 : Rôle des lymphocytes Th2 dans la physiopathologie de l asthme Toues les cytokines produites par le lymphocyte Th2 après son activation ont un rôle dans l asthme. L IL-4 permet la différenciation des lymphocytes T naïfs en Th2 et contribue aussi à la production d IgE par les lymphocytes B (LB) conduisant à la dégranulation des mastocytes. L IL-13, comme l IL-4 agit sur les LB et a également un effet sur l épithélium bronchique où elle entraîne une hypersécrétion de mucus conduisant à une hyper-activité bronchique. L IL-5 agit sur les éosinophiles permettant leur génération, leur survie et leur activation. 23

27 II. La signalisation calcique dans les lymphocytes T Dans les lymphocytes T, les ions calcium (Ca 2+ ) contrôlent leur activation, leur développement, leur différenciation, mais également leur mort et de nombreuses autres fonctions effectrices. Ce contrôle se fait au travers de la régulation de divers programmes transcriptionnels (figure 4). A. Rôle du calcium dans la biologie des lymphocytes T 1. Activation et prolifération des lymphocytes T Dans un lymphocyte T au repos, la concentration calcique intracellulaire [Ca 2+ ]i est aux alentours de nm. Lorsque le TCR rencontre l antigène pour lequel il est spécifique dans le contexte de présentation antigénique par le CMHII, la [Ca 2+ ]i augmente rapidement pour atteindre les 1µM. L entrée de Ca 2+ dans le lymphocyte T est majoritairement dépendante des stocks calciques contenus dans le réticulum endoplasmique (RE). Ce phénomène est nommé «store-operated Ca 2+ entry» (SOCE). L engagement du TCR va entraîner l activation de diverses protéines conduisant à l activation de la phospholipase C gamma 1 (PLC#1) permettant le clivage du phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PiP2) en inositol 1,4,5-trisphosphate (IP 3 ) et diacylglycérol (DAG). L IP 3, via son récepteur présent à la surface du RE, induit la vidange des stocks calciques contenus dans le RE, entraînant ainsi l entrée de Ca 2+ au travers de la membrane plasmique. En raison de cet influx calcique, plusieurs voies de signalisation vont être induites en aval, aboutissant à l activation de facteurs de transcription nécessaires à l expression de gènes (figure 4). La dépendance au Ca 2+ des facteurs de transcription NFAT, CREB (cyclic-ampresponsive element-binding protein), MEF2 (myocyte enhancer factor 2A, NF- %B/I-%B, régule l ensemble des cytokines nécessaires à la prolifération et les 24

28 différenciations des lymphocytes T (Feske, 2007). Une des voies majeures est celle de la calcineurine-nfat (Hogan et al., 2003). La calcineurine est une sérine/thréonine phosphatase dépendante de la calmoduline. Elle est constituée d une sous-unité catalytique A (CnA) et d une sous-unité régulatrice B (CnB). L augmentation de la [Ca 2+ ]i permet l activité phosphatase de la calcineurine après sa liaison au complexe calmoduline-ca 2+. La déphosphorylation du facteur de transcription NFAT cytoplasmique va dévoiler sa séquence de localisation nucléaire, permettant ainsi sa translocation dans le noyau et l expression de gènes (Macian, 2005). La dépendance au Ca 2+ de NFAT est influencée par l amplitude et la durée du signal calcique. L activation des NFAT nécessite une élévation soutenue de Ca 2+ tandis que le facteur de transcription NF-%B peut-être activé par une augmentation forte mais transitoire de la concentration calcique intracellulaire (Dolmetsch et al., 1997). La fréquence des oscillations calciques influence donc l activité des différents facteurs de transcription contrôlant ainsi l activité transcriptionnelle des lymphocytes T (Dolmetsch et al., 1998) (Quintana et al., 2005). 2. Apoptose des lymphocytes T Le Ca 2+ ne permet pas uniquement l activation et la prolifération des lymphocytes T, il est également impliqué dans l apoptose de ces cellules. Le maintien de l homéostasie du compartiment des lymphocytes T est nécessaire au bon fonctionnement de la réponse immunitaire. Il s agit de maintenir un nombre approprié de lymphocytes T, processus finement régulé par la balance prolifération/apoptose. L apoptose, contrairement à la nécrose, est un mécanisme actif programmé qui permet entre autres d éliminer les lymphocytes T potentiellement dangereux lors de la sélection thymique. Deux voies d apoptose ont été décrites, la voie extrinsèque et intrinsèque. La voie extrinsèque est initiée par l engagement des récepteurs de mort cellulaire tels que CD95/Fas en réponse à des signaux pro-apoptotiques, conduisant à l activation en cascade de caspases entraînant la mort cellulaire. Il est connu que 25

29 l activation de CD95/Fas conduit à un signal calcique soutenu. Les travaux d Oshimi (Oshimi and Miyazaki, 1995) dans une lignée lymphocytaire B humaine, décrivent les signaux calciques après traitement des cellules avec un anticorps anti-fas. La réponse typique obtenue se décline en plusieurs phases : 1) augmentation précoce de la [Ca 2+ ]i, 2) élévation soutenue de la [Ca 2+ ]i, 3) une seconde augmentation de la [Ca 2+ ]i, et enfin 4) une importante augmentation de la [Ca 2+ ]i maintenue entre 2 et 4h après ajout de l anticorps anti-fas. Les étapes 1, 3 et 4 ont été attribuées à l entrée de Ca 2+, tandis que la réponse 2 impliquerait la libération des stocks calciques intracellulaires. Dans les lymphocytes T Jurkat, il a été montré que l engagement de CD95/Fas conduisait à un relargage en deux temps des stocks calciques contenus dans le RE. Dans une première phase, l élévation de Ca 2+ est associée à l activation de la PLC-#1 conduisant à la production d IP 3 et la vidange des stocks du RE après liaison aux récepteurs IP 3 R. La seconde phase s étale plus dans le temps et fait intervenir la liaison du cytochrome c aux récepteurs IP 3 (Wozniak et al., 2006). Au début de l apoptose, le cytochrome c est transloqué de la mitochondrie au RE où il se fixe aux IP 3 R entraînant une augmentation soutenue de la [Ca 2+ ]i (Boehning et al., 2003). B. Les canaux régulant la concentration calcique intracellulaire 1. Les canaux CRAC Les canaux, les mieux décrits, permettant l entrée de Ca 2+ sont connus sous le nom de canaux CRAC (Ca 2+ release-activated Ca 2+ channels). La molécule ORAI compose ces canaux. Il existe trois isoformes ORAI1, ORAI2 et ORAI3 pouvant s associer en homo- ou hétéromères. ORAI1 semble être, à ce jour, la forme prédominante dans les lymphocytes T. L étude de patients présentant un syndrome d immunodéficience sévère (SCID) associé à une perte fonctionnelle des canaux CRAC et de la SOCE dans les lymphocytes T (Feske et al., 2001) (Feske et al., 1996) (Feske et al., 2005) (Le Deist et al., 1995) (Partiseti et al., 26

30 1994) combinée à l utilisation de ARN interférant permettant de déceler les régulateurs de SOCE et de l activation de NFAT, a permis d identifier le gène ORAI1 codant pour les canaux CRAC (Feske et al., 2006) (Vig et al., 2006) (Zhang et al., 2006). ORAI1 est une glycoprotéine de surface composée de quatre domaines transmembranaires et d une partie N-terminale et C-terminale intracellulaire. L activation des canaux CRAC implique la molécule STIM (Stromal intreaction molecule) présente à la surface du RE. Cette molécule existe sous deux isoformes STIM1 et STIM2 découvertes grâce au RNAi screening réalisé chez la drosophile et l Homme (Roos et al., 2005) (Liou et al., 2005). L expression de STIM1 est élevée et constante dans les lymphocytes T alors que STIM2 est faiblement détectable dans les LT naïfs mais son expression augmente après stimulation du TCR. La partie N-terminale des molécules STIM se trouve dans la lumière du RE et contient un domaine de liaison au Ca 2+ de type EF-hand capable de ressentir les changements de la concentration calcique du RE (Liou et al., 2005) (Cahalan, 2009). La partie cytosolique carboxy-terminale est constituée de deux domaines «coiled-coil» : une région riche en sérine et une autre riche en proline, ces deux régions facilitant le recrutement de STIM à la membrane plasmique et son interaction à la région C-ter de ORAI1 permettant l ouverture du canal (Stathopulos et al., 2008) (Muik et al., 2008) (Park et al., 2009). Au repos, le Ca 2+ contenu dans le RE est fixé au motif EF-hand de la molécule STIM. Lors de l engagement du TCR et liaison de l IP 3 sur ses récepteurs, le Ca 2+ est dissocié de la molécule STIM entraînant un changement de conformation et son oligomérisation. Les molécules STIM vont ainsi être transloquées au niveau de la membrane plasmique où l activation de ORAI va avoir lieu (figure 4). Les patients SCID et les souris déficientes pour les gènes codant pour ORAI et/ou STIM ont démontré un rôle important de ces molécules dans les fonctions des lymphocytes T. Il a été rapporté, chez les patients présentant une mutation 27

31 du gène ORAI1, l absence de SOCE dans diverses cellules immunitaires, associée à une importante immunodéficience caractérisée par des infections sévères et récurrentes (Schlesier et al., 1993) (Feske et al., 1996) (Feske et al., 2000). Bien que le nombre de lymphocytes T et B soit normal chez ces patients, suggérant que le développement et la sélection des lymphocytes T soient indépendants de la molécule ORAI1, l activation en périphérie de ces cellules est fortement compromise, avec un défaut de prolifération et de production de cytokines (Feske et al., 1996) (Partiseti et al., 1994). L absence d expression de STIM1 chez l Homme est également caractérisée par une immunodéficience associée à des infections virales et bactériennes (Picard et al., 2009). Le nombre de lymphocytes B et T effecteurs n est pas affecté, cependant le compartiment des lymphocytes T régulateurs CD4 + CD25 + Foxp3 + est diminué, expliquant la fréquence élevée de maladies autoimmunes chez ces patients (Oh-Hora et al., 2008). Les travaux réalisés chez les souris déficientes ont montré des différences dans le rôle de ORAI et STIM dans la fonction des lymphocytes T murins par rapport aux cellules humaines. En effet, dans les souris ORAI1 -/-, l entrée de Ca 2+ dépendante des stocks est partiellement affectée dans les lymphocytes T CD4 + et CD8 + naïfs alors que les canaux CRAC fonctionnent normalement. Ces résultats indiquent que ORAI1 est essentiel pour l entrée de Ca 2+ dans les lymphocytes T murins et que l influx calcique résiduel dans les lymphocytes T naïfs pourrait faire intervenir ORAI2 ou ORAI3 (Vig et al., 2008) (McCarl et al. 2010). Cependant des effets variables sur les fonctions des lymphocytes T ont été observés. Gwack décrit dans ses travaux un léger défaut de production de cytokines de type Th1 et Th2 dans les souris ORAI -/- (Gwack et al., 2008) tandis que d autres études ne rapportent aucun effet sur la prolifération ou la production de cytokines (Vig et al., 2008). À l instar de l Homme, le nombre des lymphocytes n est pas affecté par l absence d ORAI, confirmant l hypothèse que cette molécule n est pas indispensable pour leur développement (Gwack et al., 2008). 28

32 La perte de STIM1 chez la souris, contrairement à STIM2, abolit la fonction des canaux CRAC ainsi que l entrée de Ca 2+ (Oh-Hora et al., 2008). Cependant, STIM1 ne suffit pas à lui seul à maintenir les niveaux de Ca 2+ dans les lymphocytes T de souris STIM2 -/-. Les travaux de Oh-Hora montrent également que l absence de l une ou l autre molécule dans les lymphocytes T, réduit la production de cytokines de type 1 et 2, suggérant que ces deux molécules sont importantes pour le maintien de l entrée calcique ainsi que pour l activation des LT. Bien que ces canaux soient bien décrits dans la littérature et leur rôle majeur dans l entrée de Ca 2+ des lymphocytes T soit admis, il reste plusieurs zones d ombres quant aux rôles respectifs des différentes isoformes des molécules ORAI et STIM. De plus, le fait que l absence de ORAI et STIM chez l Homme ne perturbe pas le compartiment des lymphocytes T, semble indiquer que d autres canaux sont également impliqués dans l influx calcique. 2. Autres canaux modulant l influx calcique 2.1 Les canaux TRP Les canaux TRP (transient receptor potential) se divisent en 6 sous-familles : les TRPA (ankyrine), les TRPC (canonique), les TRPM (mélastatine), les TRPML (mucolipine) les TRPP (polycystine) et les TRPV (vanilloïde). La plupart de ces canaux sont non-sélectifs et sont perméants à plusieurs cations incluant les ions calcium et sodium. Bien que leur diversité les implique dans de nombreuses voies de transduction du signal ou sensorielle, certains participent à l entrée de calcium au sein des cellules (figure 4). 29

33 Les canaux TRPC Bien que les études sur la présence des canaux TRP dans les lymphocytes T divergent, il semblerait que les canaux TRPC1 et TRPC3 soient les isoformes majoritairement exprimés par ces cellules (Gamberucci et al., 2002) (Philipp et al., 2003). TRPC1 a été initialement décrit comme participant à la formation des canaux dépendant des stocks (SOC). Ambudkar et son équipe ont en effet montré que TRPC1 peut s associer à STIM1 et Orai1 suggérant que TRPC1 serait une molécule clé de la régulation de la vidange des stocks calciques contenus dans le RE (Ambudkar et al., 2007). Cependant des études ultérieures ont décrit d autres modes d activation de ces canaux (Ramsey et al., 2006). Philipp, dans son étude, a montré que les canaux TRPC3, dans les cellules T Jurkat, étaient des canaux ioniques hautement sélectifs pour le Ca 2+ (Philipp et al., 2003). Ils participent à l entrée de Ca 2+ après engagement du TCR. Son activation dépend d une part de son interaction avec les récepteurs à l IP 3 mais également avec le complexe Ca 2+ /calmoduline. Les canaux TRPM Les canaux TRPM sont également exprimés dans les lymphocytes T, notamment TRPM2 et TRPM4. Les canaux TRPM2 permettent l influx de Ca 2+ et d autres cations. Ils sont principalement impliqués dans la mort cellulaire. L activation de cellules T Jurkat par la concavanaline A a démontré que l élévation d adénosine 5_-diphosphoribose (ADPR) activait les canaux TRPM2 et entraînait la mort cellulaire (Gasser et al., 2006). L étude de Wehage (Wehage et al., 2002) confirme également le rôle de TRPM2 dans la mort cellulaire, puisque les espèces réactives d oxygènes activent également les canaux TRPM2. Même s il n existe pas de preuves directes montrant que TRPM2 est requis pour l entrée de Ca 2+ dans les lymphocytes T et leur fonction, l engagement du TCR provoque le relargarge de ribose-cadp du RE activant potentiellement les canaux TRPM2 dans les lymphocytes T (Guse et al., 1999). 30

34 Les canaux TRPM4 sont également des canaux ioniques non sélectifs perméant au Na 2+ mais contrairement à TRPM2 il ne laisse pas passer le Ca 2+. Ces canaux sont activés par la mobilisation de calcium après activation du TCR. Ils contrôlent la concentration calcique intracellulaire. En effet, Launay et son équipe ont montré que TRPM4 modulait le potentiel de membrane et la force électrochimique conduisant à l entrée Ca 2+ par les canaux CRAC (Launay et al., 2002) (Launay et al., 2004). Les canaux TRPM7 sont exprimés de façon ubiquitaire et présentent une perméabilité au Ca 2+ et au Mg 2+ (Bates-Withers et al., 2011). In vivo, un rôle important de TRPM7 dans le développement des lymphocytes T a été identifié grâce aux souris possédant une délétion de ces canaux spécifiquement dans les lymphocytes T. Les souris TRPM7 -/- présentent un nombre réduit de lymphocytes T CD4 + CD8 + dans le thymus ainsi que T CD4 + dans la rate associés à une perte des cellules épithéliales thymiques médullaires (mtec) (Jin et al., 2008). De plus, ces souris présentent un influx de Mg 2+ et une concentration intracellulaire de Mg 2+ normale, suggérant que la principale fonction de TRPM7 dans le développement des lymphocytes T passe par l influx de Ca 2+ et non celui de Mg 2+. Les canaux TRPV Les canaux TRPV ont été moins étudiés dans les lymphocytes T. Cependant certaines études décrivent la présence des canaux TRPV6, hautement sélectifs pour le Ca 2+. Les études sur TRPV6 sont relativement contradictoires quant à sa fonction. Yue et Cui ont montré que TRPV6 constituait une sous-unité des canaux CRAC tandis que d autres études comme celles de Bödding et Voets décrivent des propriétés différentes entre les canaux CRAC et TRPV6 (Bodding et al., 2002) (Voets et al., 2001). 31

35 2.2 Les canaux potassiques Les canaux potassiques permettent d éviter une trop forte dépolarisation membranaire en créant un efflux de potassium (K + ) hyperpolarisant ainsi la membrane plasmique. Les canaux potassiques les mieux étudiés et décrits comme régulant le potentiel de membrane des lymphocytes T, sont les canaux voltage-dépendants K v 1.3 et canaux activés par le Ca 2+, K Ca 3.1 (figure 4). Le cana Kv1.3 est un homodimère de quatre sous-unités! activé par la dépolarisation membranaire. Celle-ci crée un changement de conformation permettant l ouverture du canal, la sortie de K+ et le maintien des concentrations ioniques à l intérieur de la cellule. Le canal K Ca 3.1 possède une structure similaire à Kv à l exception des senseurs au voltage. En revanche, il a été montré que le canal K Ca 3.1 était constitutivement lié à la calmoduline kinase, le canal s ouvrant dès la liaison du Ca 2+ à la calmoduline (Xia et al., 1998). Ce canal est impliqué dans la prolifération des LT CD4 + naïfs et mémoires (Srivastava et al., 2006). L engagement du TCR provoque une entrée de Ca 2+ dans la cellule. En réponse à cette augmentation de concentration calcique intracellulaire, les canaux KCa3.1 s activent et laissent sortir le potassium. Ils permettent ainsi de maintenir le potentiel membranaire de la cellule à un niveau très négatif, provoquant ainsi un gradient électrochimique pour l influx de Ca 2+. Outre son besoin en Ca 2+, son activité dépendrait également de sa phosphorylation par la kinase B diphosphate nucléoside (NDPK-B) et de sa déphosphorylation par la phosphatidylinositol-3 phosphatase (Srivastava et al., 2006). Les canaux K v 1.3 ( canaux/cellule) prédominent dans les lymphocytes T naïfs, les lymphocytes T centraux mémoires (T cm ) et effecteurs mémoires (T EM ). Le niveau d expression des canaux KCa3.1 augmente dans les LT naïfs et les T CM après activation (passant de 10 à 500/cellule), et ces canaux deviennent 32

36 les canaux prépondérants dans ces cellules durant l activation. En contraste, Kv1.3 est augmenté à canaux/cellule dans les T EM activés de sorte que la sous-population des T EM exprime majoritairement Kv1.3 à la membrane, et peu de canaux K Ca 3.1 (Hu et al., 2007). Ces canaux participent donc à l équilibre ionique de la cellule en contrebalançant l entrée massive de Ca 2+ lors de l activation de la cellule. De plus, le développement et l utilisation de drogues ciblant soit Kv1.3 soit K Ca 3.1 dans des pathologies immunes caractérisées pourraient donc permettre un effet clinique sans induire d immunosuppression globale. 2.3 Les canaux purinorécepteurs P2X Les récepteurs P2X sont des canaux ioniques non sélectifs, activés par l ATP extracellulaire et permettant entre autres l influx de Na 2+ et Ca 2+ (figure 4). A l heure actuelle, trois récepteurs P2X sont impliqués dans la signalisation calcique des lymphocytes T : P2X1, P2X4 et P2X7 (Woehrle et al., 2010) (Yip et al., 2009). Il a été montré que ces récepteurs, activés par le relargage autocrine d ATP en réponse à l engagement du TCR, permettaient l entrée de calcium, l activation de NFAT et la production de cytokines telles que l IL-2. De plus, les récepteurs P2X sont recrutés au niveau de la synapse immunologique où ils amplifient la signalisation calcique induite par le TCR (Woehrle et al., 2010) (Schenk et al., 2008). Ces récepteurs sont également capables de moduler les réponses T effectrices. Schenk a démontré que l inhibition des récepteurs P2X par de l ATP oxydé protégeait les souris du diabète après transfert de lymphocytes T spécifiques des cellules $ du pancréas, mais aussi de la colite dans un modèle d IBD (inflammatory bowel disease), suggérant que les récepteurs P2X sont importants pour la fonction des lymphocytes T pro-inflammatoires (Schenk et al., 2008). De plus, d autres travaux de Schenk (Schenk et al., 2011) révèlent que P2X7 aurait 33

37 un rôle pro-inflammatoire en permettant la différenciation et la fonction des Th17 et en inhibant la stabilité des lymphocytes Treg. Il existe une multitude de canaux impliqués dans le maintien de la concentration calcique à l intérieur de la cellule. Ces canaux participent à la régulation de cette concentration et donc aux diverses fonctions des lymphocytes T. Toutefois, il reste de nombreuses zones d ombre quant aux rôles effectifs de chacun et si ces canaux sont capables de coopérer ensemble. Figure 4 : Canaux ioniques régulant la concentration calcique dans les lymphocytes T. Les canaux CRAC/ORAI sont activés suite à l engagement du TCR entraînant l activation de la phospholipase C# (PLC#) et la production d inositol-1, 4, 5 triphosphate (IP 3 ) permettant la vidange des stocks calciques contenus dans le réticulum endoplasmique (RE). Cette déplétion active la molécule STIM permettant l ouverture d ORAI. Les récepteurs P2X, comme P2X4 et P2X7 sont activés par l ATP extracellulaire. L influx calcique dépend de la concentration extracellulaire de Ca 2+ et de la concentration intracellulaire de K +, ce dernier étant maintenu grâce aux canaux potassiques K V 1.3 et K Ca 3.1. Les canaux TRP permettent également la régulation de la concentration calcique intracellulaire. L influx calcique va conduire à l activation de différents facteurs de transcription comme NFAT, NF-%B et MEF2. 34

38 III. Les canaux calciques Ca V 1 Les canaux calciques de type L pour «long lasting» sont activés par de fortes dépolarisations avec une inactivation lente (Fox et al., 1987). Ces canaux sont perméables au barium (Ba 2+ ) et au calcium (Ca 2+ ), sont constitués de 4 sousunités :!1,!2", $ et #. L ouverture de canaux de type L se situe à un potentiel membranaire compris entre -40mV et -20mV (Forti and Pietrobon, 1993) et leur constante de temps d inactivation est supérieure à 500ms. Ces canaux ont une capacité accrue à laisser passer les ions. En effet 105 ions calcium passent par ces canaux par seconde, alors que les canaux ORAI en laissent passer 10 fois moins. Cette famille se caractérise par leur sensibilité à trois classes de molécules : les dihydropyridines (DHP), les phénylalkylamines et les benzothiazépines qui se lient à des sites présents sur les sous-unités!1. A. Description des canaux Ca V 1 La sous-famille des canaux Ca V 1, sensibles aux DHP, compte 4 membres caractérisés par l expression de la sous-unité!1. En effet, cette sous-unité est représentée par 4 isoformes (de Ca V 1.1 à Ca V 1.4). Les canaux Ca V 1.1 sont principalement retrouvés dans les cellules dans les muscles striés (Curtis and Catterall, 1984) (Tanabe et al., 1987), tandis que Ca V 1.2 est exprimé par les cellules neuronales, cardiaques et du muscle lisse (Biel et al., 1990). L isoforme Ca V 1.3 est exprimée par les tissus neuronaux et endocriniens (Seino et al., 1992) (Williams et al., 1992) et Ca V 1.4 par la rétine (Bech-Hansen et al., 1998) (Strom et al., 1998). 1. La sous-unité!1 Structuralement, la sous-unité!1 comporte quatre domaines homologues connectés par trois boucles intracytoplasmiques. Chaque domaine est constitué 35

39 de six segments transmembranaires (S1-S6). Les boucles relient les segments S5 et S6 pour constituer le pore du canal (Guy and Conti, 1990). Cette sous-unité contient également les senseurs au voltage contenus dans les segments S4 de chaque domaine dont les acides aminés sont chargés positivement. Le site de fixation des DHP se situe, quant à lui, dans la boucle S5- S6 et dans le segment S6 du troisième domaine (figure 5). 2. La sous-unité!2" Cette sous-unité se décline en 4 isoformes (!2"1 à!2"4) (Gao et al., 2000) (Klugbauer et al., 1999) (Qin et al., 2002). Codée par un seul gène, cette sousunité subit un clivage post-traductionnel conduisant à la formation des protéines!2 et ", reliées ensuite par un pont disulfure (De Jongh et al., 1990) (Jay et al., 1991) (figure 5).!2" est décrite comme l une des sous-unités régulatrices des canaux Ca V 1. La forte glycosylation de!2 permet en effet une interaction stable avec le 3 ème domaine transmembranaire de la sous-unité!1 (Gurnett et al., 1997). Cette interaction permet d une part, l adressage de!1 à la membrane mais également la modulation des propriétés biophysiques du canal en augmentant l amplitude (Felix et al., 1997) du courant et en accélérant la cinétique d activation et d inactivation du canal. 3. La sous-unité # Huit isoformes ont été décrites pour la sous-unité # (#1-#8) (Chu et al., 2001) (Sharp et al., 2001). Cette sous-unité est constituée de 4 domaines transmembranaires liés par une boucle intracellulaire et deux boucles extracellulaires. Toutefois, cette sous-unité n est pas présente dans tous les tissus. 36

40 La sous-unité # est également capable de se lier à la sous-unité!1 via son domaine N-terminal. Les propriétés biophysiques de cette sous-unité ainsi que son rôle sont à l heure actuelle encore mal connus. Les études portant sur la sous-unité # sont contradictoires. Certaines l impliquent dans l adressage des canaux à la membrane (Moss et al., 2002) ainsi que dans des modifications des paramètres biophysiques des courants (Ursu et al., 2001) (Rousset 2001 J Neuroscience / Ursu 2001 J Physio ), d autres décrivent une absence totale d effet (Varadi et al., 1991). 4. La sous-unité $ Quatre gènes codent les différentes isoformes des sous-unités ($1-$4).La sousunité $ est composée de 5 domaines (figure 5). Cette sous-unité permet, d une part, le contrôle de l assemblage et de l adressage à la membrane de la sous-unité!1. Birnbaumer (Birnbaumer et al., 1998) a démontré que la sous-unité $ était impliquée dans l augmentation de l expression fonctionnelle de la sous-unité!1. Dans le réticulum endoplasmique, la sous-unité!1 est maintenue dans un état immature. Bichet et son équipe (Bichet et al., 2000) ont montré que la sous-unité $ était capable de masquer le signal de rétention endoplasmique localisé sur la boucle I-II de la sous-unité!1 permettant ainsi l assemblage du canal. La sous-unité $ possède plusieurs sites d interaction comme le domaine SH3 (src homology 3) permettant l interaction protéine-protéine avec des régions riches en proline et un site BID ($ interaction domain) capable de se lier au domaine AID (! interact domain) de la sous-unité!1. L adressage à la membrane du canal est ensuite assuré grâce au domaine d ancrage à la membrane MAS (membrane anchoring sites) de la sous-unité $ (Bogdanov et al., 2000). 37

41 D autre part, la sous-unité $ permet également la modulation des propriétés biophysiques du canal. L expression seule de la sous-unité!1 génère des courants de faibles intensités. Par contre, lorsque l association des sous-unités $ et "1 augmente l amplitude du courant observé. Cette facilitation s explique par le fait que la sous-unité $ augmente la probabilité d ouverture des canaux (Cens et al., 1996). La diversité des canaux Ca V 1 dépend de la multiplicité possible d association des sous-unités "1 avec les différentes sous-unités auxiliaires qui sont souvent coexprimées dans les mêmes cellules. De plus, de nombreux variants d'épissage alternatif ont été décrits pour les sous-unités "1, ce qui augmente encore cette diversité. Toutefois, les conséquences fonctionnelles de cette diversité sont mal connues. Figure 5 : Structure des canaux Ca V 1 (d après A. Dolphin, Nature Review, 2012) La sous-unité!1 des canaux calciques CaV1 est composé de 4 domaines homologues. Le quatrième segment de chaque domaines (en rouge) contient des acides aminés chargés positivement conférant la sensibilité au voltage de ces canaux. La sous-unité $ est constituée d un domaine d homologie Scr (SH3 : en rose) et d un domaine guanylate cyclase (en violet). Cette sous-unité est connectée à une région linker. La sous-unité!2" comprend une sous-unité extracellulaire!2 et d une sous-unité associée à la membrane : la sous-unité ". 38

42 B. Transduction du signal calcique par les canaux Ca V 1- mode d action 1. Rôle des canaux Ca V 1 dans les cellules excitables De part leur diversité d expression tissulaire, les canaux Ca V 1 sont impliqués dans de nombreux mécanismes. Leur mode d action est particulièrement bien décrit dans les cellules musculaires, où les canaux Ca V 1 permettent le couplage excitation-contraction. La propagation du potentiel d action le long de la fibre musculaire permet l activation des canaux Ca V 1 qui sont en contact avec les canaux récepteurs à la ryanodine de type 1 (RyR1) présents à la surface du réticulum sarcoplasmique (RS). L activation des canaux Ca V 1.1 entraîne l ouverture des canaux RyR1 et la vidange des stocks calciques contenus dans le RS. Les ions Ca 2+ ainsi relâchés vont se fixer sur la troponine C et permettent l activatino de la mise en place des complexes actine-myosine d où la contraction musculaire. Les canaux Ca V 1.2 sont également impliqués dans les phénomènes d excitationcontraction mais au niveau du muscle cardiaque. En effet, les canaux Ca V 1.2 participent au phénomène de «Ca 2+- induced Ca 2+ release» (CICR), dans lequel ils contribuent à l augmentation de la concentration calcique intracellulaire en induisant le relargage du Ca 2+ contenu dans le RS via les récepteurs canaux RyR2. Cette augmentation de [Ca 2+ ]i permet le couplage excitation-contraction du muscle cardiaque (Perez-Reyes et al., 1998). Le canal Ca V 1.2 est également capable de réguler les propriétés des neurones en activant des voies de signalisation permettant la transcription de certains gènes. Il a été décrit deux mécanismes direct et indirect permettant la transcription de certains gènes. Des études ont montré que les canaux Ca V 1.2 contrôlaient la transcription de gènes en activant la protéine CREB (Cre-binding protein) via leur interaction avec la calmoduline kinase (Dolmetsch, 2003). 39

43 Un mécanisme alternatif a également été proposé par le groupe de Dolmetsch. Sous l influence des changements de [Ca 2+ ]i, l extrémité C-terminal CCAT du canal Ca V 1.2 serait clivée, pourrait se localiser dans le noyau où il se comporterait comme un régulateur transcriptionnel de nombreux gènes impliqués dans la signalisation et l excitabilité neuronale (Gomez-Ospina et al., 2006). Il n est pas exclu qu un site alternatif de transcription génère la partie carboxyterminale de la sous-unité "1 de Ca V 1.2 (CCAT) ayant ces fonctions de régulation de la transcription. Trois états distincts : fermé, inactivé, activé décrivent l état des canaux ioniques (Yellen, 1998) (figure 6). Figure 6 : Etats conformationnels des canaux calciques Le mécanisme d activation/inactivation des canaux Ca V 1 est formé de deux composantes distinctes : le senseur de voltage et le pore. Le canal peut se trouver sous plusieurs états : - fermé : le pore est fermé et le senseur au voltage au repos le maintient fermé - ouvert : le senseur au voltage activé permet l ouverture du pore - inactivé : le senseur au voltage revient au repos alors que le pore est toujours ouvert. 40

44 Les cellules excitables humaines ont un potentiel de repos de l ordre de -80mV. A ce potentiel les canaux Ca V 1 sont majoritairement fermés. Lors de la dépolarisation amenant la membrane à un potentiel plus positif, les canaux Ca V 1 vont subir un changement de conformation les amenant à l état activé laissant ainsi passer les ions. Après un certain temps dépendant des propriétés intrinsèques des canaux, ceux ouverts subiront un changement de conformation pour passer à l état inactivé, état différent de l état fermé, mais durant lequel les canaux ne laisseront plus passer les ions. 1.1 Activation des canaux Ca V 1 L activation des canaux Ca V 1 correspond au passage de l état fermé à l état activé laissant passer les ions. Chaque hélice S4 de la sous-unité!1 contient des résidus chargés positivement qui se déplacent sous l effet de la dépolarisation membranaire. Ce déplacement induit un changement de conformation permettant l ouverture des hélices S6 et le passage des ions (Yellen, 1998). Stimulation des canaux Ca V 1 par les protéines kinases La partie C-terminale a été révélée comme importante dans la régulation de l ouverture des canaux Ca V 1.2. En effet la transfection de mutant dans la partie C-ter de la sous-unité!1 dans des oocytes de Xenope et leur analyse par patchclamp entraîne une augmentation des courants calciques (Wei et al., 1994). En effet, plusieurs études ont mis en évidence la présence, en C-terminal, d un site de phosphorylation (Ser1928) par la protéine kinase A (PKA) (De Jongh et al., 1996), de deux sites de liaison à la calmoduline (CaM) et d un domaine riche en proline (PRD). 41

45 La PKA, activée par l adénosine monophosphate cyclique (AMPc), joue un rôle important dans la facilitation de l entrée de Ca 2+ par les canaux Ca V 1. Plusieurs études ont montré que suite à l application d agonistes $-adrénergiques augmentant la production d AMPc, la phosphorylation par la PKA du canal Ca V 1 dans les muscles squelettiques, entraînait une augmentation de l amplitude du courant calcique (Sculptoreanu et al., 1993) (Tsien et al., 1986). Ces résultats ont également été confirmés à l aide d inhibiteurs de la PKA. Ishikawa (Ishikawa et al., 1993) et Ruiz-Valesco (Ruiz-Velasco et al., 1998) ont montré que l augmentation des courants calciques induit par le 8-Br-AMPc était bloquée par l ajout d inhibiteurs de la PKA dans les cellules de muscles lisses. L action de la PKA sur la sous-unité!1 est toutefois controversée, notamment en raison du clivage d une portion de C-ter dans les cellules cardiaques (Chang and Hosey, 1988) (De Jongh et al., 1991). La PKA pourrait également phosphoryler la sousunité $ (Kimura et al., 2000) (Gao et al., 1997). De nombreuses études ont montré que la PKC modulait l activité des canaux Ca V 1 (Dolphin, 1995) (Schuhmann and Groschner, 1994) (Obejero-Paz et al., 1998). La phosphorylation par la PKC entraîne une modification des propriétés intrinsèques des canaux car elle s accompagne d une augmentation de la probabilité d ouverture des canaux (Yang and Tsien, 1993). Bien qu il ait été montré que les sous-unités!1 et $2 pouvaient être phosphorylées par la protéine kinase C (PKC) (Puri et al., 1997), le site de phosphorylation de la PKC n est toujours pas défini. Il est connu que les 46 premiers acides aminés de la partie N-terminale inhibent l activité des canaux Ca V 1, il a donc été suggéré que la PKC pouvait augmenter l activité des canaux Ca V 1 en supprimant l inhibition en N-terminal (Shistik et al., 1998) (Blumenstein et al., 2002). 42

46 Stimulation des canaux Ca V 1 par les tyrosines kinases La phosphorylation des tyrosines est un important régulateur des fonctions biologiques des cellules. Il a été montré que des inhibiteurs des protéines tyrosine kinases (PTK) réduisaient les courants calciques (Yokoshiki et al., 1996) (Chiang et al., 1996). L effet des src-kinases sur la régulation des canaux Ca V 1.2 dans les muscles lisses a été particulièrement bien étudié. Les src-kinases se lient au domaine PRD de Ca V 1.2 par leur domaine SH3 (Gerhardstein et al., 2000). La régulation du canal Ca V 1.2 par les src-kinases a été démontrée d une part grâce aux inhibiteurs des src kinases mais également au fait que les inhibiteurs des tyrosine phosphatases amplifiaient les courants calciques (Hatakeyama et al., 1996) (Wijetunge et al., 1992). De plus, la co-transfection de Ca V 1.2 avec une src-kinase constitutivement active dans des cellules embryonnaires de reins (HEK) a montré une amplification des courants (Jin et al., 2002). Stimulation des canaux Ca V 1 par la calmoduline kinase (CaM) Le phénomène de facilitation de l entrée de Ca 2+ par les canaux Ca V 1 a été décrit par l équipe de McCarron (McCarron et al., 1992) dans les cellules stomacales de crapaud. Une succession d impulsions dépolarisantes suivant une seule impulsion, a mis en évidence une augmentation de l amplitude des courants calciques. Ce processus est dépendant du Ca 2+ puisque l utilisation du Ba 2+ ou la chélation du Ca 2+ par le BAPTA n a pas d effet sur l amplitude des courants. De plus, des études ont montré que la facilitation était bloquée en présence d inhibiteur de la CaM et requiert l activation de la calmoduline kinase II (CaMK) (Dzhura et al., 2000). La CaM est une protéine ubiquitaire comprenant 4 motifs EF-hand regroupés en deux lobes de forte et de faible affinité pour le Ca 2+. La partie carboxyterminale de la sous-unité!1 des canaux Ca V 1.2 contient deux sites de liaison à la calmoduline, le motif IQ et en amont le motif LA ou CBD 43

47 (CaM-binding domain). En condition de repos, la CaM non liée au Ca 2+ interagit avec le CBD et permet de maintenir le pore du canal fermé. En revanche, lorsque la [Ca 2+ ]i augmente, le Ca 2+ se lie à la CaM entraînant son transfert du domaine CBD au motif IQ, présentant une très forte affinité pour le complexe Ca 2+ -CaM (Zuhlke et al., 2000). 1.2 Inactivation des canaux L état inactivé est un état intermédiaire entre l état fermé et l état activé. Dans cette conformation, les canaux calciques ne laissent pas passer les ions en dépit de la dépolarisation de la membrane. Cet état permet entre autre d éviter la surcharge d ions calciques dans la cellule lors de son activation. Il existe deux modes d inactivation : dépendante du Ca 2+ et dépendante du voltage. Voltage-dépendant Inactivation dépendante du Ca 2+ (CDI) Des expériences ont montré que les courants provenant des canaux Ca V 1.2 n étaient inhibés que partiellement en présence de Ba 2+ alors que la présence de Ca 2+ extracellulaire inhibait complètement ces courants. La CDI des canaux de type L est caractérisée par une diminution de la probabilité d ouverture de ces canaux en réponse à une longue dépolarisation. Bien que la CDI puisse être induite par un changement global de la concentration intracellulaire de Ca 2+ comme la vidange de stocks intracellulaires ou l activité d autres canaux calciques, Imredy and Yue ont montré que l influx calcique généré par l ouverture d un seul canal était suffisant pour entraîner une CDI (Imredy and Yue, 1992). Dans un premier temps, le site de détection du Ca 2+ fut décrit comme un motif de type «EF hand» présent dans la partie C-terminale du canal (de Leon et al., 44

48 1995). Cependant, cette hypothèse fut abandonnée et à l heure actuelle, la calmoduline (CaM) représente le principal senseur de Ca 2+ responsable de la CDI (Peterson et al., 1999). Les sites de liaison à la CaM, IQ et LA, présents dans la partie C-terminale de la sous-unité!1 des canaux, ont été impliqués dans la CDI. En effet, Soldatov propose un modèle dans lequel le transfert du complexe Ca 2+ -CaM du motif LA vers le motif IQ après l entrée du Ca 2+ conduit à l inactivation du canal. Ce phénomène permettrait ainsi de réguler les canaux (Soldatov, 2003). Lorsque le canal s ouvre, la quantité de calcium augmente et pour empêcher que cette dernière ne soit trop élevée, le calcium exerce alors un rétrocontrôle négatif sur le canal en l inactivant plus rapidement. Inactivation dépendante du voltage (VDI) Ce mode d inactivation a été moins étudié que le précédent. Cependant, les hypothèses actuelles se basent sur le principe de «bal land chain» déjà décrit pour les canaux potassiques et sodiques. Dans ce modèle, la partie N-terminale se replie de façon à obstruer le pore du canal. Ainsi les courants sont inhibés malgré la conformation ouverte du canal. Les premiers déterminants moléculaires de la VDI furent identifiés par le groupe de Tsien. A l aide de chimères des canaux Ca V 1.2 et des canaux de type Ca V 2, ils identifièrent la boucle entre le domaine I et II de la sous-unité!1 comme importante pour la VDI (Zhang et al., 1994). Plusieurs équipes ont ensuite montré que cette boucle se liait aux domaines II et III du segment 6, permettant ainsi l obstruction du pore (Parent et al., 1995) (Spaetgens and Zamponi, 1999) (Bernatchez et al., 2001) (Berrou et al., 2002). La sous-unité!1 n est pas la seule sous-unité participant à la VDI. La sous-unité $ joue un rôle régulateur de l inactivation du canal. 45

49 2. Les canaux Ca V 1 dans les cellules immunitaires Il a longtemps été pensé que les canaux Ca V 1 étaient une caractéristique propre aux cellules excitables. Cependant, des approches pharmacologiques, moléculaires et génétiques ont révélé l existence de canaux Ca V 1 fonctionnels dans divers types de cellules hématopoïétiques. 2.1 Syndrome de Timothy L importance fonctionnelle des canaux Ca V 1.2 dans les cellules immunitaires a été mise en avant dans le syndrome de Timothy. Cette maladie génétique rare est causée par une mutation spontanée dans le canal Ca V 1.2 entraînant un gain de fonction. Les patients atteints de ce syndrome souffrent de dysfonctionnement impliquant plusieurs organes, incluant des désordres neurologiques (autisme, retard mental), des troubles du rythme cardiaque mais aussi une immunodéficience. En effet, dans son étude, Liao a rapporté que 75% des patients atteints du syndrome de Timothy présentaient des infections chroniques et notamment des bronchites, suggérant que le système immunitaire est également affecté par une mutation du canal Ca V 1.2 (Liao and Soong, 2010). 2.2 Ca V 1 et lymphocytes B L équipe de Sadighi Akha a montré en 1996, à partir des lymphocytes B fraîchement isolés, la présence de la sous-unité!1ca V 1.3 et!2 par cytométrie de flux (Sadighi Akha et al., 1996). De plus, les résultats obtenus avec des inhibiteurs des canaux Ca V 1 comme la nicardipine et le Bay K 8644 ont appuyé l idée que des canaux fonctionnels étaient exprimés par les lymphocytes B. Cette équipe a également démontré l insensibilité au voltage des canaux Ca V 1 des lymphocytes B en traitant ceux-ci entre autres avec du KCl. Ces résultats ont ensuite été confirmés par les travaux du groupe de Gordon (Grafton et al., 2003), 46

50 lesquels ont montré que les canaux calciques exprimés par des lignées cellulaires de lymphocytes B partageaient les caractéristiques des canaux Ca V 1 conventionnels. De plus, leur étude a révélé que l «ouverture de ces canaux» dépendait de l activation du récepteur des lymphocytes B pour l antigène (BCR). Une autre étude, à partir de lymphocytes B de rat, a mis en évidence une régulation des canaux Ca V 1.3 par le GMP cyclique (Sadighi Akha et al., 1996). En effet, cette étude a montré que l oxyde nitrique (NO) induit une réponse calcique comparable à celle induite par des anticorps anti-ig. Le NO étant connu pour induire le GMPc en activant des guanylyl cyclases, les auteurs ont montré qu un analogue du GMPc entraîne une réponse calcique inhibée par la nicardipine, antagoniste des canaux Ca V 1. De plus, ils ont montré qu un inhibiteur de la guanylyl cyclase retarde et diminue la réponse calcique induite par la stimulation des lymphocytes B par des anticorps anti-ig. Ces résultats indiquent un rôle possible du GMPc dans la régulation des canaux Ca V 1 dans les lymphocytes B. 2.3 Ca V 1 et lymphocytes T natural killer L utilisation d un dérivé fluorescent de la phénylalkylamine (PAA) se liant à la sous-unité!1 a révélé l expression des canaux Ca V 1.2 dans les lymphocytes natural killer (NK) humains (Zocchi et al., 1998). La sous-unité $1 a également été mise en évidence dans des lysats de NK. Ce groupe a démontré la fonctionnalité des canaux Ca V 1. Les NK traitées par des inhibiteurs pharmacologiques de ces canaux ont montré une diminution de l entrée de Ca 2+ suite à une stimulation par CD11a ou CD Ca V 1 et macrophages Les canaux Ca V 1 ont été identifiés dans les macrophages. L équipe de Das a mis en évidence la présence de transcrits codant la sous-unité!1 Ca V 1.2 ainsi 47

51 que sa forme protéique dans les macrophages murins et humains (Das et al., 2009). De plus, elle a montré que la différenciation des monocytes en macrophages était associée à l augmentation de l expression de Ca V 1.2. Un rôle fonctionnel de ces canaux a été mis en évidence. Le blocage de canaux par des inhibiteurs pharmacologiques comme l amlodipine ou le verapamil ou par des sirna ont montré une diminution de la mobilisation calcique, suite à la stimulation par le N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine (fmlp), ainsi qu une diminution de l expression des récepteurs du plasminogène (Plg-R) 2.5 Ca V 1 et cellules dendritiques Leur présence et leur rôle ont particulièrement été bien décrits dans les cellules dendritiques. Le groupe de Zocchi a été le premier à mettre en évidence l expression des sous-unités!1 et $1 des canaux calciques de type L dans les cellules dendritiques humaines (Poggi et al., 1998). De plus, ils ont montré que l influx calcique était bloqué dans les DC traitées avec une dihydropyridinie, la nifédipine, conduisant à une perte de l endocytose de corps apoptotiques et la production d IL-12. Plus tard, les travaux de Vukcevik ont confirmé les résultats de Poggi en montrant que la sous-unité!1 Ca V 1.2 était exprimée par ces cellules et qu elle interagissait fonctionnellement avec les récepteurs à la ryanodine de type 1 (RyR1) (Vukcevic et al., 2008). Ce couplage, semblable à celui décrit dans les cellules de muscles squelettiques, serait induit par l augmentation de K+ conduisant à une dépolarisation membranaire des DC, ressentie par les canaux Ca V 1.2. Ce couplage permettrait ensuite une libération des stocks calciques contenus dans le RE responsable de l expression des molécules de type 2 du complexe majeur d histocompatibilité. 48

52 2.6 Ca V 1 et lymphocytes T Les premières études montrant la présence de canaux calciques dépendant du voltage dans les lymphocytes T remontent aux années Densmore en 1992 a montré, en utilisant la technique du patch-clamp, un courant calcique entrant dans les lymphocytes T Jurkat suite à une dépolarisation de la membrane..de plus, la stimulation du TCR et la déplétion des stocks calciques intracellulaires amplifiaient l amplitude des courants observés. Ces résultats suggèrent que l entrée de Ca 2+ induite par le récepteur à l antigène peut être médiée par un canal calcique régulé par le voltage (Densmore et al., 1992). Il complètera ses travaux quatre ans plus tard en montrant que l amiloride et le Mn 2+, bloquant les courants non voltage-dépendants, n ont aucun effet sur l entrée de Ca 2+ ou sur les courants dépendants du voltage. De plus, l amiloride n altère pas la prolifération des cellules T Jurkat dépendante du Ca 2+. Il en conclut donc que ces canaux dépendant du voltage ont des propriétés différentes des courants I CRAC et qu ils participent à la prolifération des lymphocytes (Densmore et al., 1996). Plusieurs études pharmacologiques ont apporté des preuves quant à l existence de canaux voltage-dépendants fonctionnels dans les lymphocytes T. L étude de la prolifération des LT par incorporation de thymidine tritiée a démontré que 0,001 à 100uM de nifédipine inhibait la prolifération de lymphocytes T humains en réponse à des signaux mitogènes comme la phytohémaglutinine ou la concanavaline A (Birx et al., 1984). De plus, l utilisation d agoniste comme le Bay K 8644 ou d antagoniste comme la nifédipine module non seulement l influx calcique mais aussi l activité de NFAT et la production de cytokines dans les lymphocytes T (Savignac et al., 2001) (Kotturi et al., 2003). L identification exacte des isoformes des canaux Ca V 1 présentes ou non dans les lymphocytes T humains comme murins fait encore débat. Une des 49

53 explications est qu il existe de nombreux variants d épissage alternatif de chaque isoforme des sous-unités, rendant la famille des canaux Ca V 1 très complexe. L équipe de Brereton a été la première à mettre en évidence la présence de transcrits codant pour les sous-unités!1ca V 1.1 et Ca V 1.2 dans les lymphocytes T Jurkat (Brereton et al., 1997). De plus, notre équipe a montré que des cellules T d hybridomes murins exprimaient également des ARNm codant pour des canaux calciques de type L ainsi que leur forme protéique (Savignac et al., 2001). La sous-unité!1 Ca V 1.2 est également identifiée dans les lymphocytes T humains du sang périphérique et dans d autres lignées cellulaires telles que MOLT-4 et CEM, avec, selon les équipes, une séquence entière ou tronquée (Stokes et al., 2004) (McRory et al., 2004). Kotturi et al. ont mis en évidence de l ARNm codant pour la sous-unité!1ca V 1.4 dans les cellules Jurkat ainsi que dans des lymphocytes T humains issus du sang périphérique (Kotturi et al., 2003) (Kotturi and Jefferies, 2005). Bien que cette sous-unité soit jusqu ici décrite uniquement dans la rétine, l équipe de McRory confirmera les résultats de l équipe de Kotturi en décrivant une distribution de Ca V 1.4 étendue au thymus, à la rate et la moelle osseuse humaine. Dans ces travaux, Kotturi identifie 2 variants d épissage présentant une absence du domaine sensible au voltage IVS4 pour le variant Ca V 1.4(a) et le linker IV S3-S4 pour le variant Ca V 1.4(b), pouvant expliquer l insensibilité au voltage de ce canal dans les lymphocytes T. Il démontre toutefois un rôle fonctionnel des canaux Ca V 1.4 puisque l agoniste Bay K 8644 (+/-) et la nifédipine, antagoniste du canal peuvent moduler les événements précoces et tardifs de la signalisation calcique au cours de l activation et de la prolifération des lymphocytes T. L équipe de Richard Flavell a également identifié la présence des canaux Ca V 1.4 dans les lymphocytes T (Jha et al., 2009). L utilisation de souris dont le gène codant la sous-unité Ca V $3 a été invalidé, montre que l absence de cette sous- 50

54 unité conduit à la perte d expression de la sous-unité!1ca V 1.4. De plus, ces souris présentent un défaut de survie en raison de la probable augmentation de l expression de la molécule pro-apoptotique Fas. Ils ont également montré que l augmentation de la [Ca 2+ ]i suite à l engagement du TCR était réduite dans les lymphocytes T CD8+ provenant des souris $3-/-, suivie d une diminution de la translocation nucléaire de NFAT et de l expression protéique de NFATc1. Les auteurs démontrent que Ca V 1.4 est associé à la sous-unité!3 avec des partenaires de signalisation comme Lck (lymphocyte-specific protein tyrosine kinase) et Vav dans des complexes préformés avant même l engagement du TCR. Selon ces auteurs, l interaction entre le TCR et les molécules du CMH qui présentent des peptides du soi induit une signalisation calcique basale dépendant de Ca V 1.4 et responsable de la survie. Récemment, une étude portant sur des souris invalidées pour le canal Ca V 1.4 a apporté de nouveaux éléments sur son mécanisme d action. Le groupe d Omilusik a confirmé les résultats obtenus par Flavell en montrant un défaut de survie des lymphocytes T provenant des souris Ca V 1.4 -/-. Contrairement à ce qu avait avancé Kotturi, leurs travaux ont montré un courant calcique imputable aux canaux Ca V 1.4 après dépolarisation de la membrane des lymphocytes T CD4 + stimulés par le TCR. De plus, Ca V 1.4 semble requis pour l augmentation de la [Ca]i après stimulation par le TCR ou la vidange des stocks calciques intracellulaires, particulièrement dans les LT CD4 + naïfs. 51

55 RESULTATS 52

56 I. Article 1 Knocking down Ca V 1 calcium channels implicated in Th2 cell activation prevents experimental asthma Cabral MD*, Paulet PE*, Robert V*, Gomes B, Renoud ML, Savignac M, Leclerc C, Moreau M, Lair D, Langelot M, Magnan A, Yssel H, Mariamé B, Guéry JC, Pelletier L. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine Jun 15;181(12): * Marilena Djata Cabral, Pierre-Emmanuel Paulet and Virginie Robert contributed equally to this work 53

57 L asthme allergique est orchestré par les lymphocytes Th2 et leur production de cytokines IL-4, IL-5 et Il-13. L entrée de Ca 2+ dans la cellule est indispensable à l activation et la production de cytokine. Des travaux précédents de l équipe ont montré que les lymphocytes T exprimaient des canaux calciques voltagedépendants, les canaux Ca V 1. L objectif de ce travail a été de déterminer le rôle de ces canaux dans les fonctions des lymphocytes T. Tout d abord, nous avons montré que les lymphocytes Th2 (LTh2) expriment aussi bien les ARNm codant les isoformes Ca V 1.2 et Ca V 1.3 que les protéines, contrairement aux lymphocytes Th1. Afin de déterminer le rôle de ces canaux, nous avons inhibé leur expression grâce à la transfection d oligonucléotides antisens spécifiques (Ca V 1AS). Les LTh2 transfectés avec Ca V 1AS présentent une diminution de la réponse calcique suite à la stimulation par le TCR associé à un défaut de production d IL-4. Au vu du rôle des LTh2 dans l asthme, nous avons testé l impact de l inhibition de l expression de Ca V 1 sur le développement d un modèle d asthme expérimental. Des LTh2 transfectés avec les Ca V 1AS et possédant un TCR transgénique spécifique de l ovalbumine ont été transférés chez des souris sensibilisées quotidiennement avec de l ovalbumine administrée par voie aérienne. Il a été observé chez ces souris, une diminution de recrutement des cellules inflammatoires dans les poumons comme dans les liquides de lavage bronchoalvéolaire, ainsi qu une diminution de production de cytokines de type 2 par les lymphocytes CD4 + des ganglions drainants après culture en présence de cellules présentatrices d antigène et d ovalbumine. Nous avons également testé l effet des Ca V 1AS administrés par voie intra-nasale en présence d ovalbumine à des souris pré-sensibilisées. Nous avons démontré que le traitement par les Ca V 1AS prévient la réaction inflammatoire typique de l asthme allergique et l hyperréactivité bronchique. Ces résultats indiquent que les canaux Ca V 1 sont exprimés sélectivement par les lymphocytes Th2 et qu ils peuvent être une cible thérapeutique dans le traitement de l asthme allergique. 54

58 Knocking Down Ca v 1 Calcium Channels Implicated in Th2 Cell Activation Prevents Experimental Asthma Marilena Djata Cabral 1,2,3,7 *, Pierre-Emmanuel Paulet 1,2,3,7 *, Virginie Robert 1,2,3,7 *, Bruno Gomes 1,2,3, Marie-Laure Renoud 1,2,3, Magali Savignac 1,2,3,5, Catherine Leclerc 2,4,5, Marc Moreau 2,4,5, David Lair 7, Marie Langelot 7, Antoine Magnan 7, Hans Yssel 8, Bernard Mariamé 1,2,3, Jean-Charles Guéry 1,2,3,6, and Lucette Pelletier 1,2,3,5,6 1 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM), U563, Centre de Physiopathologie de Toulouse Purpan, Toulouse, France; 2 Université Paul Sabatier, Toulouse, France; 3 Institut Fédératif de la Recherche Bio-Médicale de Toulouse, Toulouse, France; 4 Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS), UMR 5547, Centre de Biologie du Développement, Toulouse, France; 5 CNRS Groupement de recherche, GDR 2688, France; 6 Centre Hospitalier Universitaire, Toulouse, France; 7 INSERM, U915, L institut du thorax, Equipe AVENIR, Faculté de Médecine, Université de Nantes, CHU Nantes, L institut du thorax, Service de Pneumologie, Plate-Forme Transversale d Allergologie, Nantes, France; 8 INSERM, U844, Montpellier, France Rationale: Th2 cells orchestrate allergic asthma and the cytokines they produce (IL-4, IL-5, and IL-13) are deleterious in allergy. Therefore, it is important to identify key signaling molecules expressed by Th2 cells that are essential for their function. We have previously shown that dihydropyridines selectively modulate Th2 cell functions. Objectives: Because dihydropyridines bind to and modulate voltagedependent calcium (Ca v 1) channel in excitable cells, we aimed at showing that Th2 cells selectively express functional Ca v 1-related channels, the inhibition of which may prevent asthma. Methods: We looked for Ca v 1 channel expression in Th2 and Th1 cells by real-time polymerase chain reaction and Western blotting. We sequenced the isoforms expressed by Th2 cells and tested whether Ca v 1 antisense oligodeoxynucleotides (Ca v 1AS) affected Ca 21 signaling and cytokine production. Finally, we tested the effect of Ca v 1AS in the passive asthma model by injection of ovalbuminspecific Th2 cells transfected with Ca v 1AS into BALB/c mice challenged with intranasal ovalbumin and in the active model of asthma by intranasal delivery of Ca v 1AS together with soluble ovalbumin in BALB/c mice previously immunized with ovalbumin in alum. Measurements and Main Results: We show that mouse Th2 but not Th1 cells expressed Ca v 1.2 and Ca v 1.3 channels. Th2 cells transfected with Ca v 1AS had impaired Ca 21 signaling and cytokine production, and lost their ability to induce airway inflammation on adoptive transfer. Furthermore, intranasal administration of Ca v 1AS suppressed airway inflammation and hyperreactivity in an active model of asthma. Conclusions: These results indicate that Th2 cells selectively express Ca v 1 channels that may be efficiently targeted in T lymphocytes to prevent experimental asthma. Keywords: Th2 cells; voltage-dependent calcium channels; allergic asthma; antisense oligonucleotides (Received in original form July 30, 2009; accepted in final form February 17, 2010) * These authors contributed equally to this study. Supported by grants from the Agence Nationale de la Recherche (ANR-07-BLAN- 0102), from the Ligue Contre le Cancer, and from the association 111 des Arts. We also thank the Fondation Genavie, the Region Pays de La Loire, and the Fondation pour la Recherche Médicale. M.D.C. was supported by the ANR and by the Conseil Régional de Midi-Pyrénées; M.L.R. was supported by the ANR. Correspondence and requests for reprints should be addressed to Lucette Pelletier, M.D., Ph.D., INSERM U563, Bâtiment A, Place du Dr Baylac, BP 028, 31024, Toulouse Cedex 3, France. [email protected] This article has online supplement, which is accessible from this issue s table of contents at Am J Respir Crit Care Med Vol 181. pp , 2010 Originally Published in Press as DOI: /rccm oc on February 18, 2010 Internet address: AT A GLANCE COMMENTARY Scientific Knowledge on the Subject Ca 21 is an intracellular second messenger that is differentially regulated in T-cell subsets and especially in Th2 lymphocytes. Whereas store-operated calcium channels CRAC/Orai are now admitted as the channels responsible for Ca 21 influx in T cells, the role of other calcium channels including voltage-dependent Ca 21 (Ca v 1) channels is still a matter of debate. What This Study Adds to the Field We show that Ca v 1.2 and Ca v 1.3 channels are selectively expressed in murine Th2 cells and that Ca v 1-specific antisense oligonucleotides block specifically TCR-driven Ca 21 signalling and Th2 cytokine production. Moreover, intranasal delivery of these oligonucleotides prevented the development of asthma, offering a rationale for developing drugs targeting these channels in Th2 lymphocytes. Effector T-cell subsets produce distinct sets of cytokines and may cause different immune-mediated diseases. Among them, Th2 cells that produce IL-4, -5, and -13 are key mediators of allergic asthma both in experimental models and in asthmatic patients (1, 2). However, the inhibition of one or the other Th2 cytokine was disappointing in the treatment of asthma as shown by the low impact of anti IL-4 (1) or anti IL-5 antibody administration on the course of allergic diseases (3). Intracellular Ca 21 is a second messenger essential for numerous T-cell functions (4). The fact that the regulation of intracellular Ca 21 concentration ([Ca 21 ] i ) is different in various T-cell effectors (5 9) may offer the opportunity to target key intermediates of Ca 21 signaling to inhibit specifically the functions of one given T-cell subset. It is classically admitted that stimulation through the T-cell receptor (TCR) induces inositol triphosphate production that binds to its receptors on the membrane of the endoplasmic reticulum (ER) leading to the release of ER Ca 21 stores into the cytosol. Stim-1, considered as the sensor of the ER Ca 21 depletion, redistributes toward the cell membrane activating the store-operated Ca 21 channels (SOC) CRAC/Orai, resulting in Ca 21 entry from the external medium (reviewed in [10]). However, other calcium channels at the cell membrane (11, 12) might contribute to sustained calcium signaling in activated T cells. Among them, several groups reported the expression of some Ca v 1-related Ca 21 channels in T cells and showed that dihydropyridines known to antagonize Ca v 1 channels may inhibit

59 Cabral, Paulet, Robert, et al.: Ca v 1 Channels in Th2 Lymphocytes 1311 T-cell functions (13 15). However, the molecular identity of these channels was not clear and direct evidence for a functional role of these channels in T-cell activation is lacking (13 19). We have previously shown that Th2 cells expressed dihydropyridine receptors (DHPR) (20, 21) defined as Ca v 1 channels in excitable cells (22) and that inhibitors of DHPR prevented experimental asthma (21). Herein, we show that differentiation in Th2 cells but not in Th1 cells was associated with the upregulation of Ca v 1.2 and Ca v 1.3 channels both at the mrna and protein level. The sequences of these channels presented high homology to neuronal isoforms of Ca v 1.2 and Ca v 1.3 channels. In addition, transfection with Ca v 1-specific antisense (Ca v 1AS) oligodeoxynucleotides (ONs) suppressed DHPR expression, calcium signaling, and the production of cytokines by Th2 cells with no impact on Th1-cell functions. Moreover, ovalbumin (OVA)-specific transgenic Th2 cells transfected with Ca v 1AS were no longer able to induce asthma on adoptive transfer in BALB/c mice given intranasal OVA. Finally, intranasal administration of Ca v 1AS at the time of intranasal challenge with OVA was effective in active experimental asthma, preventing airway inflammation, Th2-cell activation in the lung draining lymph nodes, and airway hyperreactivity. Some of the results of these studies have been previously reported in the form of an abstract (23). METHODS Mice Seven- to ten-week-old female BALB/c mice (Janvier Ets, Le Genest St. Isle, France) and DO11.10 BALB/c mice, which express a transgenic TCR specific for the OVA peptide, were bred and maintained in our animal facility. Our institutional review board for animal experimentation (Ethical Committee of the Institut Federatif de Recherche 50, Toulouse, France) approved all aspects of animal care. In vitro T-Cell Differentiation CD4 1 T cells were isolated from spleens of DO11.10 BALB/c mice. They were stimulated weekly in the presence of irradiated BALB/c as a source of antigen-presenting cells (APCs), 0.3 mm OVA peptide, and IL-4 plus anti IFN-g antibody or IL-12 and anti IL-4 antibody to achieve Th2- and Th1-cell differentiation, respectively ([21] see the online supplement). Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction and Real-Time Polymerase Chain Reaction Reverse transcriptase polymerase chain reaction (PCR) and real-time PCR were performed by using various primers listed in the online supplement. PCR products obtained by using primers specific for Ca v 1.2 and Ca v 1.3 encoding genes (see Table E1 in the online supplement) were cloned and sequenced. Immunoblotting Transfection experiments were performed as indicated in the online supplement. Th1 or Th2 cells specific for OVA peptide were transfected with Ca v 1.2 or Ca v 1.3 sense (S), mismatched, or antisense (AS) ONs the sequences of which are given in Table E2. Because similar results were obtained by using sense or mismatched ONs, only results obtained with T cells transfected with sense ONs were shown. A total of 50 mg of lysates from Th1, Th2, or Th2 cells transfected with control or AS ONs 48 hours before were immunoblotted with anti-ca v 1.2 or anti-ca v 1.3 polyclonal or monoclonal antibodies (see online supplement). Confocal Microscopy Cells were stained with monoclonal anti-ca v 1.2 antibody, and with Alexa-fluor-555 labeled anti-igg2b mouse immunoglobulin (Invitrogen; Carlsbad, CA). Single-Cell Intracellular Ca 21 Measurements These measurements were done as previously described (21, 24) in cells loaded with 5 mm Fura2/AM before being stimulated with anti-tcr plus anti-cd28 antibodies, thapsigargin or ionomycin. Th1 and Th2 Transfer Experiments Th1 and Th2 cells transfected as described in the online data supplement were injected intravenously into BALB/c mice ( cells/ mouse) and the mice were then given intranasal OVA protein (50 mg in phosphate-buffered saline) once per day for 7 days. Bronchoalveolar lavage fluid (BALF) was collected 24 hours after the final OVA administration. In Vivo Administration of Ca v 1-specific ONs BALB/c mice primed intraperitoneally with OVA in alum (Sigma- Aldrich; St. Louis, MO) were challenged 15 days later through intranasal route with a mixture of OVA (50 mg in phosphate-buffered saline) and 200 mg of Ca v 1.2 and Ca v 1.3 AS ONs or controls in phosphatebuffered saline for 5 days. The doses of ONs, corresponding to 15 nmol/ day, were chosen according to previous works (25). Twenty-four hours after the final OVA administration, the mice were anesthetized and BALF was collected by cannulation of the trachea and lavage with phosphate-buffered saline. Airway Inflammation and Stimulation Assays Cells from the BALF were stained with May-Grünwald Giemsa and lung sections with hematoxylin and eosin (21). CD4 1 T cells were purified from peribronchial lymph nodes and stimulated with OVA and APCs as described in the online supplement. Airway Hyperresponsiveness This was assessed 24 hours after the final OVA as previously described in conscious (21) and ventilated animals (see online supplement). Statistical Analysis Data are presented as means 1 SD. Data were analyzed by using the Mann-Whitney test or the Kruskal-Wallis test when more than one group was compared. A P value, 0.05 was considered significant. RESULTS Th2 But Not Th1 Cells Express Ca v 1.2 and Ca v 1.3 Channels Th2 cells were previously shown to express DHPR (20), defined as Ca v 1 channels in excitable cells, leading us to look for the expression of Ca v 1 channel family members in this T-cell subset. Four genes encode Ca v 1 channels (Ca v 1.1 Ca v 1.4) that make up the Ca 21 pore. Whereas PCR products for Ca v 1.2 and Ca v 1.3 were obtained from fully differentiated Th2 cells, Ca v 1 transcripts were undetectable in Th1 cells (Figure 1A). Neither Th1 nor Th2 cells expressed Ca v 1.4 transcripts, whereas they were easily evidenced in retina (not shown). The cdnas encoding the four b subunits that may associate with the Ca v 1 channels were also present in Th2 cells but not in Th1 cells (Figure 1A). We then used real-time PCR to quantify Ca v 1.2 and Ca v 1.3 expression during T-cell differentiation. Low levels of Ca v 1 products were measured in naive CD4 1 T cells and expression of both Ca v 1.2 and Ca v 1.3 increased progressively during Th2- cell differentiation from the end of the first stimulation (Figure 1B, right panel). Notably, the expression of GATA-3, the Th2 lineage-specific transcription factor, preceded the expression of Ca v 1 channels (Figure 1B, left panel), suggesting that commitment to the Th2 lineage is required for induction of Ca v 1 gene expression in T lymphocytes. Conversely, Ca v 1 products became undetectable in differentiating Th1 cells (Figure 1C, right panel) that express the transcription factor T-bet, characteristic of Th1 cells (Figure 1C, left panel). Notably, the up-regulation of Ca v 1 channels in differentiating Th2 cells paralleled the

60 1312 AMERICAN JOURNAL OF RESPIRATORY AND CRITICAL CARE MEDICINE VOL Figure 1. Ca v 1.2 and Cav1.3 are up-regulated in Th2 but not in Th1 cells. (A) cdnas from OVA-specific D Th1 and Th2 cells collected after three rounds of stimulation were tested for the expression of Cav1 isoforms (Cav1.1 to Cav1.4) and b actin (left panel). cdnas from Th2 cells, Th1 cells, and brain used as a positive control were tested for expression of auxiliary Cav1 b subunits and b actin (right panel). One representative experiment out of the 10 performed. (B and C) We analyzed the expression of transcripts for GATA-3 (dark gray bars) and T-bet (light gray bars) (left panels), and Cav1.2 (white bars) and Cav1.3 (black bars) (right panels) by real-time PCR in CD4 1 T cells, Th2 cells (B), and Th1 cells (C) collected 3 and 7 days (d) after the first stimulation (st1) and thereafter 3 days after the second (st2), third (st3), and fourth stimulation (st4). Data were normalized to levels of the housekeeping gene HPRT. They represent the mean 1 1SD from seven experiments; * P, 0.01 compared with CD4 1 T cells. nd 5 not detectable. expression of DHPR (Figures 2A and 2C), whereas this expression was barely detectable and undetectable in CD4 1 and in Th1 cells, respectively (Figures 2B and 2C). To determine whether differentiated Th2 cells express classical Ca v 1 channels (for which numerous splice variants have been described), we performed reverse transcriptase PCR that amplified two overlapping products, each of more than 3 kbp, encompassing the entire cdna sequences encoding Ca v 1.2 and Ca v 1.3. The sequence coding Ca v 1.3 was identical to the neuronal Ca v 1.3a (Genbank accession AJ ). Figure 2. The expression of Ca v 1 channels correlates with the detection of DHPR in differentiating Th2 cells. cdnas from OVA-specific D Th2 (A) and Th1 cells (B) were collected at different days after the first stimulation and tested for the expression of Ca v 1.2 (open squares) and Ca v 1.3 (open circles) mrna by realtime quantitative PCR. Data were normalized to levels of the housekeeping gene HPRT. The stars indicate the time of restimulation with APCs and OVA. At the timepoints indicated by the arrows, the cells were labeled with ST-BODIPY-DHP (C and D). The fluorescence intensity was quantified by using the Image J software and the intensity per cell was averaged (open bars). The staining was abolished by preincubation with an excess of unlabelled DHP (black bars) showing the specificity of the staining. * P, 0.01 compared with controls.

61 Cabral, Paulet, Robert, et al.: Ca v 1 Channels in Th2 Lymphocytes 1313 Figure 3. Ca v 1.2 and Ca v 1.3 expression is reduced by transfection with specific antisense oligodeoxynucleotides. (A) Real-time PCR was performed to quantify the expression of Ca v 1.2 (n 5 7), Ca v 1.3 (n 5 7), stim1 (n 5 5), Orai1 (n 5 5), K v 1.3 (n 5 3), and Kca3.1 (n 5 3) in Th2 cells transfected with a mixture of Ca v 1.2 and Ca v 1.3 antisense (black bars) or sense (white bars) ONs. The numbers in parentheses represent the number of experiments performed. Data were normalized to levels of the housekeeping gene HPRT. * P, 0.01 compared with controls. (B) Th2 cells treated with lipofectin (lipo), or transfected with Ca v 1.2 (1.2), Ca v 1.3 (1.3) sense (S) or antisense (AS) were analyzed 48 hours after transfection by Western blotting with anti-ca v 1.2 or Ca v 1.3 monoclonal antibodies. Actin was used as a loading control. The intensity of bands was quantified and normalized to the level of actin. The histograms in C represent the expression of Ca v 1.2 (white bars) and Ca v 1.3 (black bars) in lysates from cells treated as in B relative to the expression in Th2 cells transfected with control ONs (mean 1 1SD from six experiments; * P, 0.02 compared with Th2 cells transfected with control ONs). Multiple splice variants may encode Ca v 1.2 channels with some exons that characterize the cardiac form, such as the exon 1a instead of the exon 1b, and the use of exons 34a, 41a, and 45 that were excluded in other forms (26). We found that the sequences of Ca v 1.2 cloned from Th2 cells did not express cardiac-specific exons and differed from the Genbank accession L01776 sequence (cloned from the BALB/c brain) only by the use of the exon 8 instead of the exon 8a (exons that are known to be exclusive) (26) and by the absence of exon 33 (see Figure E1). However, the Th2-cell sequences were found to contain the sequences reported to encode the four voltage sensors in classical Ca v 1 channels (27). As shown in Figure E2 in the online supplement, Western blots of Th2-cell extracts probed with anti-ca v 1.2 and anti- Ca v 1.3 polyclonal antibodies revealed polypeptides of about 210 and 240 kd, respectively. These bands corresponded to the expected sizes for classical Ca v 1 channels found in the brain (not shown). Preincubating anti-ca v 1.2 or anti-ca v 1.3 antibody with the antigenic peptides markedly decreased the band intensity as expected. By contrast, none of these channels were detected in cell lysates from differentiated Th1 cells (see Figure E2). Ca v 1AS Alter TCR-dependent Calcium Signaling and IL-4 Production by Th2 Cells With no Impact on Th1 Cell Functions To investigate the function of Ca v 1 channels in Th2 cells, we used Ca v 1AS ONs to reduce translation of the mrnas. As shown in Figure 3A, transfection of Th2 cells with a mixture of Figure 4. Ca v 1AS reduce the TCR-dependent Ca 21 response and cytokine production by Th2 but not by Th1 cells. (A) Th2 cells transfected with Ca v 1.2 sense (S), Ca v 1.2 antisense (AS), or a mixture of Ca v 1.2 and Ca v 1.3 AS ONs were loaded with Fura-2/AM. Intracellular Ca 21 levels were recorded for 2 minutes before stimulation with anti-tcr mab (arrow) and for 7 8 minutes after stimulation. At least 45 cells were recorded and [Ca 21 ] i calculated for each cell were averaged at each time-point. Standard errors are not indicated, but they were less than 10% of the mean. One representative experiment out of six is shown. (B and C) The mean peak values of [Ca 21 ] i and cytokine production elicited by TCR stimulation were measured in Th2 (B) and in Th1 (C) cells treated with lipofectin or transfected with Ca v 1.2 or Ca v 1.3 S or AS ONs. The relative Ca 21 response represents the percentage of the peak [Ca 21 ] i value relative to the data obtained from T cells treated with lipofectin alone; they represent the mean 1 1SD of six experiments; * P, 0.01 compared with controls.

62 1314 AMERICAN JOURNAL OF RESPIRATORY AND CRITICAL CARE MEDICINE VOL Ca v 1.2 and Ca v 1.3AS reduced Ca v 1.2 and Ca v 1.3 gene expression with no effect on stim1, Orai1, or the potassium channels K v 1.3 and KCa3.1 described as required for Ca 21 entry into memory and activated naive T cells, respectively (28). Ca v 1.2 and Ca v 1.3AS also reduced the amounts of proteins as shown by Western blotting (Figures 3B and 3C). Transfection with Ca v 1AS significantly reduced the binding of the Ca v 1 ligand DHP to Th2 cells, as shown by staining cells with the fluorescent dye BODIPY-DHP (see Figure E3). Thus, Ca v 1AS reduce expression of the channels and so reduce the amount of DHP binding to Th2 cells showing the molecular identity of DHPR in Th2 cells. The [Ca 21 ] i increase (Figure 4A) and IL-4 synthesis (Figure 4B) that are exquisitely Ca 21 -dependent (29, 30) were lower on TCR activation in Th2 cells transfected with Ca v 1.2 or Ca v 1.3 AS and especially in Th2 cells transfected with both AS, compared with Th2 cells transfected with control ONs. The analysis of Th2 cells transfected with Ca v 1.2 and Ca v 1.3 AS showed that the [Ca 21 ] i rise was reduced in about 80% of cells compared with controls as exemplified in Figure E4. Among these cells, an oscillatory pattern without plateau was observed in 15% of cells and 10% of cells did not respond at all. This reduction in Ca 21 signaling was not caused by global alterations in Th2-cell functions because the proliferation of Th2 cells transfected with Ca v 1AS was comparable with that of control Th2 cells (see Figure E5). Transfection of Th1 cells with Ca v 1AS modified neither the Ca 21 response nor IFN-g synthesis on TCR stimulation (Figure 4C; see Figure E4). Ca v 1AS also did not affect SOC channels in Th2 cells as indicated by the absence of effect on the Ca 21 response induced by thapsigargin, an inhibitor of the intracellular Ca 21 pump, SERCA, which activates SOC channels through the depletion of ER Ca 21 stores (see Figure E6A). Accordingly, transfection with Ca v 1AS, which inhibited TCR-triggered IL-4 secretion in Th2 cells, had no effect on IL-4 production induced by PMA plus ionomycin or thapsigargin (see Figure E6B). Thus, Ca v 1AS impedes specifically the increase in [Ca 21 ] i and cytokine production induced by TCRmediated stimulation of Th2 cells. Th2 Cells Transfected with Ca v 1AS Lose Their Ability to Induce Asthma To investigate whether Ca v 1 is involved in allergic inflammationinducing activity of Th2 cells in vivo, OVA-specific transgenic Th2 cells were transfected with Ca v 1AS (Th2AS) or Ca v 1S (Th2S) and injected into BALB/c mice that were given intranasal OVA to induce airway inflammation. Mononuclear cells were purified from the lungs of mice injected with Th2AS or control Th2 cells and were labeled with T and B lymphocyte specific antibodies. Similar numbers of transgenic CD4 1 T cells, identified by staining with anti-kj1.26 antibodies, were found in the lungs of mice after the transfer of either Th2AS or Th2S, whereas the number of B cells and of CD4 1 T cells that did not express the transgenic TCR were reduced in the lungs of mice transferred with Th2AS (see Figure E7), suggesting that Th2AS can localize into the lungs but have a reduced capacity to induce the recruitment of other T and B cells. The number of inflammatory cells, in particular eosinophils, was dramatically reduced in the BALF of mice injected with Th2AS compared with the controls (Figure 5A). This was consistent with the absence of or minor lung inflammation in these animals compared with controls (Figure 5B). The lack of lung inflammation in mice injected with Th2AS was accompanied by a decrease in the IL-4 concentration in the BALF (Figure 5C) and a reduction in the number of lymphocytes in the lungdraining lymph nodes (Figure 5D) compared with controls. Figure 5. Th2 cells transfected with Ca v 1AS lose their ability to induce asthma. (A and B) OVA-specific Th2 cells transfected or not with Ca v 1.2 and Ca v 1.3 sense (Th2S) or antisense (Th2AS) oligonucleotides were transferred into BALB/c mice that were exposed to intranasal OVA for 7 days. (A) The number of inflammatory cells was reduced in the BALF of mice transferred 7 days before with Th2AS (black bars) compared with mice injected with Th2 (gray bars) or Th2S (white bars) (* P, 0.01). Data represent the mean 1 1SD from five mice and are representative of four experiments with five mice per group. Tot 5 total; eos 5 eosinophils; mono 5 monocytes/ macrophages; ly 5 lymphocytes; neu 5 neutrophils. (B) Unlike untreated Th2 and Th2S, Th2AS did not induce airway inflammation when injected in BALB/c mice given intranasal OVA as shown on lung sections stained with H&E. Bars, 100 mm. (C) IL-4 concentration was reduced in the BALF of mice transferred with Th2AS (black bars) compared with mice injected with Th2 or Th2S (white bars). Data represent the mean 1 1SD from five mice and are representative of five experiments. The number of cells in the lung-draining lymph nodes of mice injected with Th2AS (D) and the capacity of CD4 1 T cells isolated from these lymph nodes to produce cytokines after in vitro stimulation with APCs and OVA (E) was reduced compared with controls (* P, 0.01; n 5 five independent experiments).

63 Cabral, Paulet, Robert, et al.: Ca v 1 Channels in Th2 Lymphocytes 1315 Figure 6. Ca v 1AS impair the development of asthma. (A and B) BALB/c mice immunized with OVA in alum were exposed 15 days later to daily doses of intranasal OVA for 5 days. CD4 1 T cells were purified from the lungs. An intracellular staining with the monoclonal anti-ca v 1.2 antibody was performed (A). In parallel, cdnas were prepared and analyzed for the expression of Ca v 1.2 (white bars) and Ca v 1.3 (gray bars) by real-time PCR (B). Data were normalized to levels of the housekeeping gene HPRT and represent the mean 1 SD from three independent experiments. Results obtained with cdnas from Th2 cells obtained after three rounds of stimulation were shown for comparison. (C to G) BALB/c mice were immunized with OVA and were exposed 15 days later to daily doses of intranasal OVA mixed with Ca v 1.2 plus Ca v 1.3 sense (Ca v 1S) (white bars) or antisense (Ca v 1AS) (black bars) for 5 days. (C) Ca v 1AS reduced the number of inflammatory cells in the BALF compared with controls (* P, 0.01; five mice per group). Tot 5 total; eos 5 eosinophils; mono 5 monocytes/ macrophages; ly 5 lymphocytes; neu 5 neutrophils. One representative experiment out of four is shown. (D) Few signs of lung inflammation were evidenced on lung sections from mice treated with Ca v 1AS (H&E staining), whereas numerous inflammatory cell infiltrates indicated by the arrows were found in the lungs of controls. Bar, 200 mm. (E) Serum IgE concentration was measured in mice that received intranasal administration of OVA and Ca v 1S(open bars) or AS (black bars) ONs for 5 days (five mice per group). IL-4 concentration (F) was reduced in the BALF of mice given Ca v 1AS (black bars) compared with controls (white bars) and the capacity of CD4 1 T cells isolated from the lymph nodes of mice given Ca v 1AS (G) to produce IL-4, IL-5, and IL-13 after in vitro stimulation with APCs and OVA compared with controls (* P, 0.01; n 5 5 independent experiments). Moreover, CD4 1 T cells from the draining lymph nodes produced less IL-4, -5, and -13 when stimulated with APCs and OVA compared with controls (Figure 5E). Thus, knockingdown Ca v 1 channels in Th2 cells strongly inhibits their ability to induce airway inflammation on adoptive transfer. Intranasal Delivery of Ca v 1AS Prevents Experimental Active Asthma We showed that around 30 50% of CD4 1 T cells that infiltrated the lungs of asthmatic mice were stained with anti-ca v 1.2 mab (Figure 6A), which is in agreement with the expression of Ca v 1.2 and Ca v 1.3 in these cells as assessed by reverse transcriptase PCR (Figure 6B) and with the detection of DHPR on these cells (21). To assess whether inhaled Ca v 1AS might be beneficial directly in experimental asthma, we immunized BALB/c mice with OVA and then challenged them with a mixture of intranasal OVA and Ca v 1AS. The number of inflammatory cells (mainly eosinophils; Figure 6C) was reduced in the BALF of mice treated with Ca v 1AS and these mice developed only mild lung inflammation (Figure 6D). The analysis of cells from the lungs recovered after Ficoll isolation showed a reduction in the number of CD4 1 T cells and of B cells in the lungs of mice given Ca v 1AS compared with controls, whereas the number of NK, NKT, or CD8 1 T cells remained unchanged (not shown). In addition, total serum IgE concentration was significantly lower in mice treated with Ca v 1AS ONs compared with controls (Figure 6E). The concentration of IL-4 in the BALF of mice given Ca v 1 AS was reduced (Figure 6F) and CD4 1 T cells isolated from their lung-draining lymph nodes produced less IL-4, -5, -13 (Figure 6G), and -10 (not shown) on stimulation in vitro with APCs and OVA than did similar cells isolated from control mice. Mice treated with Ca v 1AS showed reduced alterations of the pulmonary functions in response to the acetylcholine analog methacholine compared with the controls (Figure 7; see Figure E8). Thus, intranasal administration of Ca v 1AS prevents antigen-specific recalled Th2 cell responses, IgE production, lung eosinophil infiltrates, and airway hyperreactivity, demonstrating their in vivo efficacy to prevent asthma. DISCUSSION Ca v 1-related molecules have been detected at the mrna or protein level in various nonexcitable tissues including dendritic cells (31, 32), mast cells (33), B lymphocytes (34, 35), and T lymphocytes (13 17). However, their molecular identity is not established and the demonstration of their role in calcium signaling is unclear. For some authors, the presence of Ca v 1.4- related sequences (Ca v 1.4 opening at more negative cell membrane potentials than the other Ca v 1 types) (14, 15) or differences in Ca v 1 sequences relative to classical channels, and especially truncated forms (13 15), were presumed to be responsible for the absence of voltage-sensitivity in immune cells. This work demonstrates conclusively that Th2 cells express full-length Ca v 1.2 and Ca v 1.3 channels. Notably, the deletion of exon 33 observed in all the Ca v 1.2 coding sequences

64 1316 AMERICAN JOURNAL OF RESPIRATORY AND CRITICAL CARE MEDICINE VOL Figure 7. Ca v 1AS improve respiratory functions in an experimental model of active asthma. BALB/c mice were immunized with OVA in alum and were exposed 15 days later to daily doses of intranasal OVA mixed with Ca v 1.2 plus Ca v 1.3 sense (Ca v 1S) or antisense (Ca v 1AS) ONs for 5 days. Mice treated with Ca v 1AS (black squares) displayed better airway compliance and reduced airway resistance on inhalation of increasing concentrations of methacholine compared with mice treated with Ca v 1S (open squares). * P, ** P, 0.05, five mice per group. cloned from Th2 cells was already reported in epithelial cells (36) and in smooth muscle cells in which this variant would open for more hyperpolarized cell potential than channels that express exon 33 (37). Other laboratories failed to demonstrate the presence of voltage-gated channels in T lymphocytes including Th2 cells (7), which is consistent with our own data (not shown). The absence of voltage sensitivity in Th2 cells could be related to the capacity of Ca v 1 channels to cluster into signaling complexes (38), where they can interact with proteins, such as the scaffolding protein AHNAK (17, 39, 40) or protein kinase C (41, 42). Such interactions have already been shown to enhance Ca 21 entry and to diminish or suppress the voltage dependence of Ca v 1 channels (38, 41 44). Ca v 1.2 and Ca v 1.3 expression seems to be constitutive in effector Th2 cells. However, an increase in the expression of these channels following T-cell activation cannot be ruled out, which could account for a relatively lower expression at Day 7 after stimulation compared with the level at Day 3 of stimulation, as exemplified in Figure 2. It is also possible that TCR stimulation promotes the localization of Ca v 1 channels at the cell membrane, favoring the interaction with signaling components regulating the opening of the channels. In our experiments, transfection with Ca v 1AS had a major impact on the shape and amplitude of the TCR-dependent Ca 21 response but did not affect the rise in [Ca 21 ] i induced by thapsigargin, which activates SOC channels. Accordingly, Ca v 1AS did not alter the expression of CRAC/Orai channels in T cells. Likewise, the effect of Ca v 1AS was not the consequence of a nonspecific effect of the antisense ONs on the expression of potassium channels responsible for the K 1 efflux out of the cell, which maintains the electrochemical driving force required for Ca 21 influx. Surprisingly, Ca v 1AS did not alter the capacity of Th2 cells to proliferate suggesting that this process was relatively calcium-insensitive in these cells or that the residual TCR-driven intracellular Ca 21 rise observed in Th2AS is sufficient for proliferation. Altogether, we provided evidence that Ca v 1 channels in Th2 cells do not behave like SOC channels. These data are therefore consistent with the sequential involvement of several types of Ca 1 channels during TCR-driven Th2-cell activation. Our hypothesis is that the activation of Ca v 1 channels would precede the opening of other Ca 21 channels, such as CRAC/Orai. Why this would occur in Th2 but not in Th1 cells remains puzzling. We could speculate that Ca v 1 channels contribute to generate a calcium signature that is clearly different in Th2 and Th1 cells (as exemplified in Figure E4), which could contribute to activate distinct gene expression patterns. Th2 cells are continuously active in the lungs of asthmatics (45), which may play a prominent role in the persistent inflammation and airway remodeling seen in this disease. The suppression of Th2-mediated airway inflammation by Ca v 1AS is likely to result from preventing both in situ Th2-cell activation and the amplification of Th2-cell responses from a newly recruited pool of antigen-specific naive CD4 1 T cells, defined as IL-4 dependent in experimental models (46, 47). Moreover, we cannot exclude that intranasal delivery of Ca v 1AS affects other cells in addition to Th2 cells in the lung. From this point of view, it will be interesting to assess the expression of Ca v 1 channels in lung-infiltrating immune cells, such as eosinophils, basophils, mast cells, and B cells. An effect on bronchial smooth muscle cells might also contribute to the effect on airway hyperreactivity. Whether or not this is the case, targeting Ca v 1 channels in Th2 cells might prove particularly effective in asthma because of the simultaneous blockade of all Th2 effector functions. Preliminary data suggest that Ca v 1 channel expression is detected in human Th2-cell clones and that an antagonist of DHPR decreased calcium entry in these clones (see Figure E9). It will be necessary to identify which Ca v 1 channels are expressed and to demonstrate that they selectively regulate human Th2-cell effector functions. If this is the case, targeting these channels should selectively impair Th2-cell activation without inducing generalized immunosuppression, thus sparing other effector T cells, such as Th1 cells, thereby preserving immune responses against infectious agents. Conflict of Interest Statement: M.D.C. does not have a financial relationship with a commercial entity that has an interest in the subject of this manuscript. P-E.P. does not have a financial relationship with a commercial entity that has an interest in the subject of this manuscript. V.R. does not have a financial relationship with a commercial entity that has an interest in the subject of this manuscript. B.G. has been employed full-time as a veterinarian by Pierre Fabre since M-L.R. does not have a financial relationship with a commercial entity that has an interest in the subject of this manuscript. M.S. does not have a financial relationship with a commercial entity that has an interest in the subject of this manuscript. C.L. does not have a financial relationship with a commercial entity that has an interest in the subject of this manuscript. M.M. does not have a financial relationship with a commercial entity that has an interest in the subject of this manuscript. D.L. does not have a financial relationship with a commercial entity that has an interest in the subject of this manuscript. M.L. is an employee of Stallergènes. A.M. received $1,001 $5,000 from Merck and $1,001 $5,000 from Novartis for serving on an advisory board, up to $1,000 from Stallergènes, up to $1,000 from ALK-Abello, up to $1,000 from Merck and $1,001 $5,000 from AstraZeneca in lecture fees. H.Y. does not have a financial relationship with a commercial entity that has an interest in the subject of this manuscript. B.M. does not have a financial relationship with a commercial entity that has an interest in the subject of this manuscript. J-C.G. does not have a financial relationship with a commercial entity that has an interest in the subject of this manuscript. L.P. does not have a financial relationship with a commercial entity that has an interest in the subject of this manuscript. Acknowledgment: The authors thank M. Calise for taking care of our animals, S. Allart for confocal microscopy, and F. Capilla and T. Al Saati for histologic examination. References 1. Holgate ST, Polosa R. Treatment strategies for allergy and asthma. 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65 Cabral, Paulet, Robert, et al.: Ca v 1 Channels in Th2 Lymphocytes Fowell DJ, Shinkai K, Liao XC, Beebe AM, Coffman RL, Littman DR, Locksley RM. Impaired NFATc translocation and failure of Th2 development in Itk-deficient CD41 T cells. Immunity 1999;11: Fanger CM, Neben AL, Cahalan MD. Differential Ca21 influx, KCa channel activity, and Ca21 clearance distinguish Th1 and Th2 lymphocytes. J Immunol 2000;164: Weber KS, Miller MJ, Allen PM. Th17 cells exhibit a distinct calcium profile from Th1 and Th2 Cells and have Th1-like motility and NF-AT nuclear localization. J Immunol 2008;180: Fowell DJ. Signals for the execution of Th2 effector function. Cytokine 2009;46: Vig M, Kinet JP. Calcium signaling in immune cells. Nat Immunol 2009; 10: Gomes B, Savignac M, Moreau M, Leclerc C, Lory P, Guery JC, Pelletier L. Lymphocyte calcium signaling involves dihydropyridinesensitive L-type calcium channels: facts and controversies. Crit Rev Immunol 2004;24: Oh-hora M, Rao A. 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J Immunol 2004;172: Dittrich AM, Chen HC, Xu L, Ranney P, Connolly S, Yarovinsky TO, Bottomly HK. A new mechanism for inhalational priming: IL-4 bypasses innate immune signals. J Immunol 2008;181:

66 II. Article 2 Ca V 1 calcium channels control Calcium and cytokine response in human Th2-lymphocytes Virginie Robert*, Emily Triffaux*, Pierre-Emmanuel Paulet, Jean-Charles Guéry, Lucette Pelletier, Magali Savignac Article soumis à Journal of Allergy and Clinical Imunology * R.V. and T.E. contributed equally to this work 55

67 Cet article porte sur l étude du rôle des canaux Ca V 1 dans les lymphocytes T humains. Nous avons voulu déterminer si de tels canaux étaient présents dans les cellules immunitaires humaines et quel était leur rôle. Les canaux Ca V 1 sont caractérisés par la sous-unité!1 et des sous-unités auxiliaires $ et!2". Dans un premier temps, nous avons isolé différentes populations de cellules immunitaires et recherché la présence par PCR quantitative de ces canaux des différentes sous-unités et leurs isoformes. Nous avons montré que la sous-unité!1ca V 1.4 était exprimée dans les lymphocytes T CD4 +. Les isoformes Ca V 1.2 et Ca V 1.3 prédominent dans les lymphocytes Th2 (LTh2) alors que leur expression est perdue dans les lymphocytes Th1 (LTh1). Toutes les sous-unités auxiliaires nécessaires au bon fonctionnement des canaux Ca V 1 sont également présentes dans les lymphocytes T CD4 + et LTh2. Nous avons par la suite, étudié le rôle de ces canaux dans la biologie des LTh2. Les LTh2, traités avec un antagoniste pharmacologique de ces canaux, la nicardipine ne montrent aucun défaut de survie ni de prolifération. En revanche, l augmentation de la concentration calcique intracellulaire, en réponse à l engagement du TCR, est fortement réduite ainsi que la production de cytokines. Ca V 1.2 étant la forme majoritairement exprimée par ces cellules, nous avons inhibé son expression à l aide d oligonucléotides anti-sens. et observé les mêmes effets sur la concentration calcique ainsi que sur la production de cytokines qu avec la nicardipine. D autre part, nous avons également montré que l inhibition des sous-unités $ réduit l expression de la sous-unité!1ca V 1.2 et sa localisation membranaire suggérant un rôle important de cette sous-unité dans la stabilité de l expression de Ca V 1.2 dans les LTh2. De plus, la PKC!/$ semble contrôler la régulation des canaux Ca V 1 puisque son inhibition pharmacologique diminue la réponse calcique et la production de cytokines par les Th2 sans affecter la réponse des LTh1. Cette étude montre que le canal Ca V 1.2 joue un rôle important dans la signalisation calcique nécessaire aux fonctions effectrices des LTh2. Ce canal représente donc une cible thérapeutique dans l asthme allergique. 56

68 anuscript Robert Ca V 1 CALCIUM CHANNELS CONTROL CALCIUM AND CYTOKINE RESPONSE IN HUMAN TH2-LYMPHOCYTES Virginie Robert, MSc, a* Emily Triffaux, Msc, a* Pierre-Emmanuel Paulet, BSc, a Jean-Charles Guéry, PhD, a Lucette Pelletier, MD, PhD, a,b** Magali Savignac, PhD, a,b** 7 8 a INSERM U1043, CNRS U5282, University Paul Sabatier, Centre of Physiopathology from Toulouse Purpan, Toulouse, France b European Group of Research (GDRE) «Ca 2+ toolkit coded proteins as drug targets in animal and plant cells» * V.R. and E.T. contributed equally; ** L.P. and M.S. contributed equally Correspondence: Lucette Pelletier, INSERM UMR1043, Centre Hospitalier Universitaire Purpan, Place du Dr Baylac, Toulouse Cedex 3 : [email protected], Phone , Fax Funding: The French National Institute for Health and Medical research (INSERM), a grant from the Association 111 des Arts, and a grant from the French Society of Allergology supported this work. V.R. was supported by MENRT, and E.T. by INSERM/DGOS allocation. L.P. is the recipient of Contrat d'interface from Toulouse University Hospital and INSERM. 23 1

69 Robert Abstract: 249 words Background: Besides CRAC/ORAI, other calcium channels such as voltagegated calcium channels (Ca V 1) might also contribute to Ca 2+ influx in activated T- lymphocytes. Ca v 1 channels are formed by the ion forming-pore!1 (Ca V 1.1- Ca V 1.4) and auxiliary subunits including Ca V ". We previously demonstrated that mouse Th2-cells selectively expressed Ca V 1.2 and Ca v 1.3!1 channels. Knocking-down these channels with Ca v 1 specific antisense oligonucleotides (AS) inhibited Th2-functions and experimental asthma. Objective: We investigated whether Ca V 1!1 channels are a functional marker of human Th2-cells. Methods: We analyzed the expression of Ca V 1 transcripts coding for the Ca v 1 subunits in various leukocyte populations including T-lymphocytes and highly polarized human Th1 and Th2-cells. Using pharmacological inhibitors and AS, we then assessed the functional role of Ca v 1 channels on the TCR-driven calcium response and cytokine production in Th2-cells. Results: We showed Ca V 1.4!1 expression in human resting T-lymphocytes. Conversely, Ca V 1.2 and Ca V 1.3 predominated in Th2 cells and were lost in Th1- cells. Ca V 1 channel-inhibitor, Ca V 1.2!1AS and Ca V "AS all decreased calcium signaling and cytokine production in human Th2 without any impact on Th1-cells. Moreover, Ca V "AS decreased the Ca V 1.2 content suggesting that Ca V " is required for Ca V 1.2 stability in Th2-cells. Finally, selective PKC!/" inhibition decreased calcium response and cytokine production by Th2, but not Th1-cells suggesting that PKC may contribute to Ca V 1 regulation in Th2-cells. 2

70 Robert Conclusion: This study highlights that human Th2-cells selectively express Ca v 1.2 calcium channels playing a critical role in calcium response and cytokine production. Thus, Ca v 1 channels represent new potential therapeutic targets to selectively inhibit human Th2-cell functions in allergic diseases. 51 3

71 Robert Clinical implications The Ca V 1 channel subunits and PKC!/" might provide potential therapeutic targets selectively involved in Ca 2+ signaling and cytokine regulation by human Th2-cells Capsule summary The identification of Ca v 1 channel subunits and their associated regulatory molecules as functional markers of human Th2-cells may offer the opportunity to selectively target these cells as important players of allergic diseases Key words CRTH2; asthma; Calcium; Ca v 1 channels; Th2 cytokines; PKC!/" Abbreviations Ca v 1: voltage-dependent calcium channels, CRAC: Calcium-release activated calcium channels, Th: T helper, Ca 2+ : calcium, CRTH2: chemoattractant receptor-homologous molecule expressed on Th2, PKC: protein kinase C, TCR: T-cell receptor, ER: endoplasmic reticulum, STIM: stromal interaction molecule, DHP: dihydropyridine; IL: interleukin, AS: antisense, IFN: interferon, NFAT: nuclear factor of activated T cells, ODN: oligodeoxynucleotides. 72 4

72 Robert Total word count: 3488 words Introduction 75 The influx of Ca 2+ through the calcium channels CRAC/ORAI at the plasma 76 membrane plays a major role in TCR-driven gene expression. 1-3 TCR engagement induces the formation of inositol 1, 4, 5-triphosphate 4 that binds to its receptor at the membrane of the endoplasmic reticulum (ER) resulting in the release of Ca 2+ from the ER into the cytosol. The ER Ca 2+ sensor stromal 80 interaction molecules (STIM) sense the decreased ER Ca 2+ concentration, oligomerize, and come in apposition with the ORAI calcium channels at the plasma membrane. 5 ORAI channels then open and sustain Ca 2+ influx needed for 83 full-blown T-cell activation. However, other calcium channels 4 are likely to contribute to Ca 2+ entry in lymphocytes including voltage-dependent Ca v 1 channels also defined as dihydropyridine receptors. The!1 subunit that can be encoded by four genes (from Ca v 1.1 to Ca v 1.4), auxiliary Ca v " (Ca v "1 to "4) and Ca v!2-# (Ca v!2-#1 to!2-#4) subunits form the channel. 6 The inhibitory effect of 88 dihydropyridine antagonists on Ca 2+ response, the detection of Ca v 1 mrna related products in T-cells and the immune phenotype observed in mice with genetic ablation of Ca v 1.4!1, 7 Ca v "3 or Ca v "4 subunits 8, 9 support a role of Ca v 1 channels in T-cell functions. 10, 11 Ca v 1.1, Ca v 1.2 and/or Ca v 1.3 related channels were also reported as implicated in calcium signaling of T-lymphocytes raising the question of the respective contribution of each isoforms in human and murine T cell activation Furthermore, patients with mutated Ca v 1.2 suffering from Timothy Syndrome display among other disorders increased susceptibility to 5

73 Robert recurrent infections. 15, 16 We previously reported that mouse Th2-lymphocytes, a Th-cell subset that produces interleukin (IL)-4, IL-5 and IL-13 and orchestrates allergic diseases, expressed high levels of Ca v 1.2 and Ca v 1.3 channels, as 99 compared to naïve CD4+ T-cells and polarized Th1-cells. 17 We showed that murine Th2-cells transfected with Ca v 1 specific antisense oligonucleotides (Ca v 1AS) displayed impaired TCR-driven Ca 2+ response and cytokine production, and were unable to induce asthma in adoptive transfer experiments. In addition, Ca v 1AS inhalation prevented the development of actively-induced experimental 104 asthma. 17 These data prompted us to determine whether human Th2-cells selectively expressed functional Ca v 1!1 channel isoforms and to identify regulatory molecules as potential therapeutic targets in allergic diseases

74 Robert Methods Purification of human leukocyte populations PBMCs were obtained from the «Etablissement Français du Sang» and all human participants gave written informed consent. PBMCs were isolated from buffy coat by Ficoll-Paque PLUS density gradient (Amersham Biosciences). CD8 + T-cells, naive CD4 + T-cells and B-cells were sorted (FacsAria sorter, BD Bioscience). The monocytes were purified with the human monocyte enrichment kit (Stem Cell, Grenoble, France). Eosinophils and neutrophils were purified from Ficoll-Paque PLUS gradient pellet with the eosinophil negative selection kit (StemCell, Grenoble, France). The negative fraction contained eosinophils and the positive one contained neutrophils. Generation of human Th2 and Th1-lymphocytes CD4 + T-cells were purified from PBMCs with Dynabeads Untouched CD4 T-cell kit (Invitrogen, Carlsbad, CA). CRTH2 + CD4 + T-cells, enriched in memory Th2- cells 18, 19 were isolated from CD4 + T-cells by using a CRTH2 positive isolation kit (Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany). The purity of CD4 + CRTH2 + population was 70 ± 5% by flow cytometry. Complete medium was RPMI 1640 supplemented with 10% fetal calf serum (Lonza,!""#$%&"#'( )*), 1% pyruvate, % non-essential amino acids, 2 mm glutamine, 100 U/ml penicillin, 100!g/ml streptomycin, and 50!M "-mercaptoethanol. CD4 + CRTH2 + cells (2 x 10 5 in 96 well-plate) were expanded for 15 days with anti-cd3/anti-cd28 coated beads (Invitrogen, 1 bead for 4 cells) in complete medium containing IL-2 (5 ng/ml, Peprotech, London, UK), IL-4 (5 ng/ml, Peprotech) and anti-ifn-! antibodies (5 7

75 Robert µg/ml, BD Bioscience), which resulted in a 4-7 fold expansion of Th2-cells. Th1-132 cells were obtained by stimulating CRTH2 - CD4 + T-cells for 7 days with anti CD3/anti-CD28 coated beads (1 bead per cell) in complete medium containing IL-12 (5 ng/ml, Peprotech), IL-2 (5 ng/ml) and anti-il-4 (5 µg/ml, BD Bioscience) antibodies. Effective T cell polarization of Th2 and Th1 cells was demonstrated by intracellular cytokine staining (Fig. E1). RNA preparation and RT-PCR Total RNA was isolated with the Qiagen kit (Hilden, Germany) and retrotranscribed in cdna by reverse transcription using the SuperScript III (Invitrogen). Ca V 1 channel subunit (!1, ",!2#), cytokine (IL-4, -5, -13, and IFN$) and GAPDH transcripts were measured by real-time quantitative PCR using the LightCycler 480 Instrument (Roche Diagnostics). Primers sequences designed using the Primer Express 2.0 software (Applied Biosystems, Foster City) were listed in Table E1. The results were expressed as (2 -(Ct interest gene Ct GAPDH) ) x Ct = numbers of cycle for which fluorescence is detectable. A value < to 1.5 was the limit of PCR product detection. Antisense transfection experiments After expansion of Th1 and Th2-cells, 10 6 cells per well in 24 well-plates were transfected in presence of IL-2 (5 ng/ml) during 72 hours with 8 µm of 5 -cct-cgtgtt-ttc-att-gac-cat-3 Ca V 1.2 specific antisense (Ca v 1.2AS) or 5 -ctc-aca-gcc-ctcctt-cac-ca-3 Ca v! antisense (Ca v!as) or 5 -gtt-ctt-cac-acg-ggg-tct-ca-3 sense oligodeoxynucleotides (ODN) by using Turbofect (Fermentas) according to the 8

76 Robert manufacturer s recommendations. FACS analysis showed that transfection with Alexa688-conjugated AS labeled 60 70% of cells. Intracellular cytokine staining 10 6 cells were activated with PMA (50 ng/ml, Sigma-Aldrich, St Louis, MO) and ionomycin (500 ng/ml, Sigma-Aldrich) for 4 hours, and brefeldin A (5 µg/ml, ebioscience) was added for the final 2 hours or with anti-cd3/anti-cd28 coated beads during 6 hours and brefeldin A was added for the final 3 hours. Cells were then fixed with paraformaldehyde 2% and permeabilized with 0.5% saponin. Samples were analyzed on a FacsCalibur (BD Biosciences). Data were analyzed using Flowjo software (Tree Star, Ashland, OR). Cytokine measurements After expansion of Th1 and Th2-cells, the anti-cd3/anti-cd28 coated beads were removed with a magnet. T cells were seeded (5 x 10 4 cells/well) into 96-well flatbottom plates and incubated in the presence of IL-2 for 3 days. The cells were then stimulated with 1 bead per 4 cells for 24 hours and we quantified cytokine production by ELISA (see the Methods section in this article s Online Repository). Sensibility for all ELISAs was 50 ng/ml. IL-2 production was measured by bioassay using the CTLL-2 cell line. Proliferation and cell viability Cell division was assessed in cells (0.5 x 10 6 cell per well in 24 well-plates) stained with 2.5 µm of CFSE (Invitrogen) during 10 minutes and stimulated by anti-cd3/anti-cd28 coated beads during 72 hours before analysis by flow cytometry. Resting CFSE-labeled cells were used to determine the initial labeling. 9

77 Robert We evaluated cell viability by incubating 10 5 cells with 0.25 µg of 7-AAD for 10 minutes before analysis by flow cytometry. Fluorescence microscopy NFAT and Ca v 1.2 staining was performed as described in the Methods section in this article s Online Repository. Staining with secondary antibody only or control isotype did not result in detectable fluorescence. The fluorescence intensities were determined with ImageJ software. The percentages of cells whose NFAT were translocated in the nucleus were defined as cells having a nuclear/cytosol ratio superior to the mean + 2SD of resting cells. Calcium intracellular measurements [Ca] i was measured ratiometrically at the single cell level in Fura2-AM loaded cells as previously described (see the Methods section in this article s Online Repository). 20 Results were expressed as the mean of fluorescence of cells and were representative of 4-8 experiments from 2-4 donors. The standard deviations were not indicated but were less than 10% of the means. The area under the curve over the mean + 2SD of the baseline ratio was measured with the GraphPad Prism software and was an indicator of the amplitude and duration of the Ca 2+ response. Cells for which the ratio F340/F380 was superior to the mean + 2SD of basal level were considered as responsive cells. Statistical Analysis Results were expressed as the mean + 1SD. The significance of differences was calculated using the t test or Mann Whitney U test. A p value <0.05 was considered as significant. 10

78 Robert Results Resting and activated human T lymphocytes express all the subunits required to form functional Ca v 1 channels. Cumulative evidence supports the notion that non-excitable cells and especially hematopoietic cells may express Ca v 1 channels. 10 Therefore, we looked for the expression of Ca v 1!1 in various immune cell types isolated from buffy coats of healthy blood donors. Ex vivo purified B-lymphocytes, CD4 + or CD8 + T- lymphocytes expressed readily detectable Ca v 1.4!1 transcripts (Fig. 1A). CD4 + and to a lesser degree CD8 + T-lymphocytes also expressed Ca v 1.2!1 transcripts, which were barely detectable in B-lymphocytes, monocytes, eosinophils and neutrophils (Fig. 1A). Ca v 1.3!1 transcripts were detectable at low levels in neutrophils, CD4 + and CD8 + T-lymphocytes and highly expressed in eosinophils (Fig. 1A). Ca v 1.1!1 transcripts were not detected in any hematopoietic cell subsets whereas they were readily detected in human skeletal 213 muscle samples (not shown). Whereas stimulation of CD4 + T-cells with anti CD3/anti-CD28 coated beads during 4 hours down-regulated Ca v 1.4!1 transcript levels, the expression of Ca v 1.2 and Ca v 1.3!1 transcripts was maintained or even up-regulated (Fig. 1B). We then analyzed the expression of the auxiliary subunits Ca v " and Ca v!2#, which are needed for cell membrane expression and optimal regulation of Ca v 1!1 subunits Resting CD4 + T-lymphocytes expressed mainly transcripts coding for "1, "3 and!2#2 auxiliary subunits (Fig. 1C). After TCR engagement, the expression of these three isoforms was 11

79 Robert increased (Fig. 1C). We detected low levels of!1,!4, "2#1, "2#3 and "2#4 transcripts in resting or stimulated CD4 + T lymphocytes (data not shown). These data indicate that all the subunits required to compose functional Ca v 1 channels are expressed in resting and activated CD4 + engagement controls their expression profile. T-lymphocytes and that TCR Nicardipine, an antagonist of Ca v 1 channels, decreases IL-2 production without affecting CD4 + T cell proliferation. We then investigated the role of Ca v 1 channels in CD4 + T-lymphocyte activation by using nicardipine, a dihydropyridine that binds to, and antagonizes Ca v 1 calcium channels. Although it was shown that Ca v 1.4 promoted naive mouse T cell survival 7, nicardipine had no effect on the survival (Fig. 2A), the proliferative response (Fig. 2B), CD25 expression (Fig. 2C) induced by TCR stimulation of CD4 + T-cells. However, TCR cross-linking induced a rapid [Ca] i increase followed by a plateau in CD4 + T-cells, which were strongly diminished by nicardipine (Fig. 2D). The residual TCR-driven [Ca] i increase in nicardipine-treated cells was only 26% of the values observed in untreated CD4 + cells as shown by the analysis of the area under the curve (Fig. E2A). Nicardipine also lowered significantly the production of IL-2, IFN$ and IL-4 after TCR stimulation as shown by intracellular staining (Fig. 2E and 2F) or by measuring cytokine production (Fig. 2G). Altogether these data support a role of Ca v 1 channels in calcium signaling and cytokine production in human CD4 + T-cells

80 Robert The expression of Ca v 1.2 channels discriminates between human Th2 and Th1-cells. We have previously shown that Ca v 1.2 and Ca v 1.3!1 subunits were selectively up-regulated in mouse Th2-cells and nearly undetectable in Th1-cells. 17 As in activated non-polarized CD4 + T-cells, the expression of Ca v 1.4!1 was greatly reduced in Th1 and Th2-cells compared to resting CD4 + T-cells (Fig. 3A). Both Ca v 1.2 and Ca v 1.3!1 subunits were expressed at higher levels in Th2-cells than in CD4 + or Th1-cells (Fig. 3A). The expressions of Ca v 1.2 and of Ca v 1.3 in Th2- cells corresponded to 20% and 105% of the expression levels found in control neuroblastoma cells (Fig. E3). Ca v 1.1 expression was not detected in differentiated T-lymphocytes (not shown). The auxiliary subunits Ca v "1, Ca v "3,!2#2 and at a lesser degree Ca v "4 were detectable in Th2-cells (Fig. 3A and Fig. E3). The exons 1/1a, 8/8a, 9a, 41a and 45 discriminate between the cardiac and the neuronal Ca v 1.2 isoforms. 16, 24 Sequencing PCR products from human Th2-cells showed expression of the exons 1 and 8, whereas exons 1a, 8a, 9a, 41a and 45 were not found. These data indicated that human Th2-cells expressed the neuronal isoforms of Ca v 1.2!1 at the mrna level. Sequence analysis of the exons 5, 13, 24 and 34 (not shown) demonstrated that human Th2 Ca v 1.2 was not structurally devoid of the voltage sensors in agreement with our findings in mouse Th2- cells. 17 The Ca v 1.2!1 protein was also detected by confocal microscopy (Fig. 3B and Fig. E4). No staining was observed by replacing the primary antibody with an isotype control antibody demonstrating the specificity of the staining. 13

81 Robert Consistent with mrna data (Fig. 3A), Th1-cells were not or faintly labeled with anti-ca v 1.2 antibody and CD4 + T-cells expressed lower level of Ca v 1.2 protein than Th2-cells (Fig. 3B and Fig. E4). Therefore, Ca v 1.2 transcripts and protein were present in steady state CD4 + T-cells, up-regulated in Th2, but were barely detectable in Th1-lymphocytes Nicardipine strongly reduces TCR-driven intracellular calcium increase, type 2-cytokine transcription and production in Th2-cells. Nicardipine altered neither Th2-cell viability (Fig. 3C) nor their proliferative response (Fig. 3D) after TCR-stimulation. However, it dramatically reduced the TCR-driven rise in [Ca] i (Fig. 3E). The residual TCR-driven [Ca] i increase in nicardipine-treated cells was only 23% of the values observed in untreated Th2- cells (Fig. E2B). Among nicardipine-treated Th2 cells, 14% of cells did not show any increase in [Ca] i while all control Th2-cells responded upon TCR-stimulation. TCR engagement induced the nuclear translocation of NFAT, the major Ca 2+ - dependent transcription factor (Fig. 3F, Fig. E5A), Th2 cytokine gene transcription (Fig. E5B) and protein secretion (Fig. 3G) which were all inhibited by nicardipine (Fig. 3 and E5). In contrast, nicardipine had no effect on TCRdriven [Ca] i increase and IFN! production by Th1-cells (Fig. 4 and Fig. E2C) Knocking-down Ca v 1.2 impaired Th2 but not Th1-cell functions. Ca v 1.2 and Ca v 1.3"1 channel expression discriminates between Th1 and Th2- cells and Ca v 1.2 channel expression predominates over Ca v 1.3. Therefore, we 14

82 Robert knocked down Ca v 1.2!1 channel with Ca v 1.2AS as we previously did in mouse Th2 lymphocytes. 17 Transfection of Th2-cells with Ca v 1.2AS decreased Ca v 1.2 mrna and protein expression (Fig. E6) but it altered neither T-cell viability (not shown) nor their proliferative response (Fig. 5A) after TCR-stimulation. However, knocking-down Ca v 1.2 in Th2-cells resulted in a profound decrease in the calcium response upon TCR-stimulation (Fig. 5B). The TCR-dependent rise in [Ca] i was reduced by 57% in Ca v 1.2AS transfected Th2-cells (Fig. E2D). Whereas 20% of Th2 cells transfected with Ca v 1.2AS did not display any significant increase in [Ca] i upon TCR stimulation, more than 90% of Th2 cells transfected with control sense ODN were responsive. Th2 cytokine production was also decreased in Ca v 1.2AS-transfected Th2-cells (Fig. 5C). Consistent with the low level of Ca v 1.2 in Th1 cells, Ca v 1.2AS had no significant effect on TCRdriven Ca 2+ response (data not shown) and on IFN" production by Th1-cells (Fig. 5D) Ca v # auxiliary subunit knockdown decreases Ca v 1.2!1 expression, TCRinduced Ca 2+ response and cytokine production by Th2-lymphocytes. We designed Ca v #AS ODN that reduced the expression of all Ca v # mrna by more than 50 % in neuroblastoma cells (not shown). Knocking-down Ca v # subunits in Th2 cells strongly inhibited the TCR-elicited increased in [Ca] i (Fig. 6A and Fig. E2E), as well as Th2-cytokine production (Fig. 6B). By confocal microscopy, we found a reduction in the total amount of Ca v 1.2!1 protein (Fig. 6C, Fig. E7) and in the fraction of Ca v 1.2 at the cell membrane in Ca v!as- 15

83 Robert transfected Th2-cells (Fig. 6D, Fig. E7). These data strongly suggest that Ca v!as impair Ca v 1 channel availability at the cell surface in Th2-lymphocytes leading to a strong reduction in the TCR-driven calcium response and in Th2- cytokine production Inhibition of PKC"/! isozyme selectively hampers the TCR-driven responses in Th2-cells. We have previously shown that PKC was required for Ca v 1-mediated, TCR- 321 dependent calcium influx in mouse IL-4 producing T-cell hybridoma. 25 We therefore examined the role of PKC"/! on human Th2-cell activation using Gö 6976, a specific pharmacological inhibitor. This inhibitor reduced TCR-driven calcium signaling (Fig. 7A, Fig. E2F) and cytokine production in Th2-cells (Fig. 7B). By contrast, inhibition of PKC"/! had no effect on Th1 functions (Fig. 7C-D, Fig. E2G), consistent with a selective regulation of calcium signaling by classical PKC in human Th2-cells

84 Robert Discussion Herein, we have characterized the expression profile of Ca v 1 channels in blood leukocyte populations and we provide evidence for a critical role of Ca v 1.2!1 channels and Ca v " auxiliary subunits in the TCR-driven Ca 2+ response and cytokine production by human Th2-lymphocytes. We showed that among circulating blood cells, lymphocytes and eosinophils were the only cells expressing Ca v 1!1 transcripts. In the steady state, unstimulated CD4 + T-cells expressed Ca v 1.4 and lower levels of Ca v 1.2 and Ca v 1.3!1. These cells also express the auxiliary Ca v! and Ca v!2-" subunits required for a functional Ca v 1 channel. Nicardipine, a DHP antagonist of all the Ca v 1 channels, strongly decreased the [Ca] i rise, NFAT nuclear translocation and cytokine production in TCR-activated CD4 + T cells, arguing for a participation of Ca v 1 channels in the integration of calcium response over time in naïve T-cells. The absence of effect of nicardipine on the expression of CD25 or on the 343 proliferation of CD4 + T suggests that the residual calcium response in the presence of nicardipine is sufficient to promote some degree of T cell activation. Accordingly, 10% of the calcium response elicited by TCR engagement seems sufficient for T-cell proliferation. 26, 27 Ca v 1.4 predominates in resting CD4 + and CD8 + T-cells, in agreement with recent data 7 showing that Ca v 1.4 was implicated in the homeostatic proliferation of naïve T-cells, in the maintenance of intracellular calcium stores and in the TCR-dependent calcium responses. Whether Ca v 1.4 could be involved in the regulation of calcium signaling in human naïve CD4 + T-cells remains to be investigated. However, since we showed that 17

85 Robert TCR-mediated activation of non-polarized CD4 + T-cells induced a fast decrease in Ca v 1.4 expression, we believe that Ca v 1.4 may play a more prominent role in the initial activation of naïve T-cells, rather than in antigen-experienced memory T-lymphocytes. Ca v 1.2!1 was over-expressed in Th2-cells compared to unpolarized CD4 + T-cells whereas its expression was lost in Th1-cells, consistent with our previous data in mice. 17 The reasons for such differences in the expression pattern of Ca v 1 channels between polarized Th1 and Th2-cells could be related to disparity in the TCR-driven calcium signaling required to turn on appropriate genetic programs and effector functions in a given effector subtype. Accordingly, the calcium response has been described as higher in mouse Th1 as compared to 363 Th2-cells The DHP antagonist, nicardipine selectively inhibited the TCR driven calcium response and cytokine production in Th2 but not in Th1-cells, which is in favor of a specific effect of nicardipine on Ca v 1 channel functions in Th2-cells. Moreover, knocking-down Ca v 1.2!1 also markedly reduced the TCRdriven calcium response and type-2 cytokine production strongly suggesting that the inhibitory effect of nicardipine on Th2-cells results from antagonizing Ca v 1.2 functions. Transfection of Th2-cells with Ca v 1.2AS inhibited around 50% of Ca v 1.2 mrna and protein in Th2-cells as efficiently as previously described for Ca v 1.2- specific sirna in cardiomyocytes. 31 The partial inhibition of Ca v 1.2 expression was sufficient to strongly diminish the TCR-elicited calcium response, suggesting that an even limited reduction in the pool of Ca v 1.2 molecules is sufficient to 18

86 Robert hamper calcium signaling in Th2-cells and also their functions. By contrast, transfection with Ca v 1.2AS did not affect human Th1-cell functions, consistent with the absence of detection of Ca v 1.2 in these cells, in agreement with our previous data in mice. 17 In addition to the Ca v 1.2!1 subunit, we detected the auxiliary subunits Ca v "1, "3 and at a lower extent "4, as well as the Ca v!2#2 subunits in Th2-cells. This indicates that all the components required for the correct trafficking of Ca v 1.2 at the cell membrane and for optimal Ca v 1 functions 22 were present in human Th2-cells. Ca v "AS-transfected Th2-cells present a strong reduction not only in their Ca v 1.2!1 content, but also in the remaining fraction of Ca v 1.2!1 located at the cell membrane. This is consistent with the critical role of Ca v " subunit in preventing Ca v 1.2!1 degradation 32, 33 and in Ca v 1.2!1 trafficking at the cell membrane, as shown for excitable cells. 34 In agreement with the effect of Ca v 1.2AS on Th2 effector functions, Ca v "AS reduced the calcium response and cytokine production in Th2-cells. The sequences of overlapping Ca v 1.2-specific PCR products from human Th2-cells were compatible with expression of neuronal forms of the channels as in mouse Th2-cells. 17 Moreover, the sequences coding the four putative voltage sensors that characterize classical Ca v 1 channels were found in human Th2- cells, strongly suggesting that absence of voltage sensitivity (data not shown) was not related to structural alterations in the lymphocyte-associated Ca v 1 form. Ca v 1 channel opening might be regulated by kinases independently of cell 397 membrane potential In this respect, Navedo et al. demonstrated the 19

87 Robert presence of Ca v 1 channels constitutively active at the resting cell membrane potential in arteriolar smooth muscle cells, due to physical interactions with PKC! We also previously reported that PKC contributed to Ca v 1 channeldependent calcium entry in mouse IL-4-producing T-cell hybridoma. 25 Likewise, we now show that a selective inhibitor of PKC!/" decreases the calcium response and Th2 cytokine production in human Th2 but not in Th1-lymphocytes. Altogether these data show that calcium signaling is differentially regulated 405 between human unpolarized CD4 + T-cells, and differentiated Th2 and Th1-406 lymphocytes. We identified Ca v 1.2 and Ca v " subunits as critical regulators of the 407 Ca 2+ response and cytokine production in human highly polarized Th2-cells Targeting such molecules may offer new and selective therapeutic avenues in the treatment of Th2-mediated allergic diseases, thereby preserving the responses of Th1-lymphocytes that are important effectors of the adaptive immune responses against pathogens and tumors

88 Robert Acknowledgments The authors thank Dr. B. Constantin (UMR CNRS 6187, University of Poitiers, France) for providing cdna samples from human skeletal muscle, Sophie Allart and Astrid Canivet (Cellular Imaging facility, CPTP), the cytometry facility for their technical assistance

89 Robert References Feske S, Giltnane J, Dolmetsch R, Staudt LM, Rao A. Gene regulation mediated by calcium signals in T lymphocytes. Nat Immunol. 2001; 2: Feske S, Gwack Y, Prakriya M, Srikanth S, Puppel SH, Tanasa B, et al. A mutation in Orai1 causes immune deficiency by abrogating CRAC channel function. Nature. 2006; 441: Hogan PG, Lewis RS, Rao A. Molecular basis of calcium signaling in lymphocytes: STIM and ORAI. Annu Rev Immunol. 2010; 28: Vig M, Kinet JP. Calcium signaling in immune cells. Nat Immunol. 2009; 10: Feske S, Skolnik EY, Prakriya M. Ion channels and transporters in lymphocyte function and immunity. Nat Rev Immunol. 2012; 12: Catterall WA, Perez-Reyes E, Snutch TP, Striessnig J. International Union of Pharmacology. XLVIII. Nomenclature and structure-function relationships of voltage-gated calcium channels. Pharmacol Rev 2005; 57: Omilusik K, Priatel JJ, Chen X, Wang YT, Xu H, Choi KB, et al. The Ca(v)1.4 calcium channel is a critical regulator of T cell receptor signaling and naive T cell homeostasis. Immunity. 2011; 35: Badou A, Jha MK, Matza D, Mehal WZ, Freichel M, Flockerzi V, et al. Critical role for the beta regulatory subunits of Cav channels in T lymphocyte function. Proc Natl Acad Sci U S A. 2006; 103:

90 Robert Jha MK, Badou A, Meissner M, McRory JE, Freichel M, Flockerzi V, et al. Defective survival of naive CD8+ T lymphocytes in the absence of the beta3 regulatory subunit of voltage-gated calcium channels. Nat Immunol. 2009; 10: Suzuki Y, Inoue T, Ra C. L-type Ca2+ channels: A new player in the regulation of Ca2+ signaling, cell activation and cell survival in immune cells. Mol Immunol. 2010; 47: Robert V, Triffaux E, Savignac M, Pelletier L. Calcium signalling in T- lymphocytes. Biochimie. 2011; 93: Brereton HM, Harland ML, Froscio M, Petronijevic T, Barritt GJ. Novel variants of voltage-operated calcium channel alpha-1subunit transcripts in a rat liver-derived cell line: deletion in the IVS4 voltage sensing region. Cell Calcium. 1997; 22: Stokes L, Gordon J, Grafton G. Non-voltage-gated L-type Ca2+ channels in human T cells: pharmacology and molecular characterization of the major alpha pore-forming and auxiliary beta-subunits. J Biol Chem. 2004; 279: Epub 2004 Feb Matza D, Badou A, Jha MK, Willinger T, Antov A, Sanjabi S, et al. Requirement for AHNAK1-mediated calcium signaling during T lymphocyte cytolysis. Proc Natl Acad Sci U S A. 2009; 106: Splawski I, Timothy KW, Sharpe LM, Decher N, Kumar P, Bloise R, et al. Ca(V)1.2 calcium channel dysfunction causes a multisystem disorder including arrhythmia and autism. Cell. 2004; 119:

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94 Robert Navedo MF, Amberg GC, Nieves M, Molkentin JD, Santana LF. Mechanisms underlying heterogeneous Ca2+ sparklet activity in arterial smooth muscle. J Gen Physiol. 2006; 127: Santana LF, Navedo MF. Natural inequalities: why some L-type Ca 2+ channels work harder than others. J Gen Physiol. 2010; 136:

95 Robert Authorship Contributions V.R. and E.T. designed and performed the research and interpreted the results; P-E.P. performed the research; V.R., E.T. and L.P. performed statistical analyses; M.S. and L.P. designed the research and interpreted the results; L.P., M.S. and J-C.G. wrote the manuscript with input from the coauthors Conflict-of-interest disclosure 544 The authors declare no competing financial interests

96 Robert Figure Legends Figure 1. Expression profile of Ca v 1 subunits in human leukocyte populations. Expression of Ca v 1!1 (A and B) and auxiliary subunits (C) by qpcr in various immune cell types (A, n=6-8) and in purified CD4 + stimulated with anti-cd3/anti-cd28-coated beads (B and C, n=3). All values inferior to 1.5 were considered as undetectable PCR products. *p< Figure 2. Nicardipine, a DHP antagonist of Ca V 1!1, inhibits TCR-driven calcium response and cytokine production in human CD4 + T-cells. Viability (A), CFSE-dilution (B), CD25 expression (C), [Ca] i variations (D), cytokineproducing cell frequency (E and F) and cytokine production (G) by CD4 + T-cells, plus or minus nicardipine (5µM), and stimulated with anti-cd3/ anti-cd28-coated beads. A-C representative of n=4; E-G, n=5. *p<0.05; **p< Figure 3. Th2-cells selectively over-express Ca V 1.2 channels and nicardipine impairs calcium signaling and Th2-cytokine production. Ca v 1 subunit mrna (A), Ca v 1.2!1 protein expression (B) in CD4 +, Th1 and Th2-cells. Effect of nicardipine on cell viability (C), CFSE-dilution (D), [Ca] i (E), NFAT nuclear translocation (F) and cytokine production (G) in activated Th2-cells. A: n=5; C-D: n=4; G: n=5. *p< 0.05, **p<0.01 and ***p<

97 Robert Figure 4. Nicardipine does not modify the TCR-driven calcium response and IFN! production by Th1-cells. Intracellular Ca 2+ measurement (A) and IFN! production (B) by Th1-cells treated by nicardipine and stimulated with anti- CD3/anti-CD28-coated beads. B: n= 4-6 from 3 donors Figure 5. Knocking-down Ca v 1.2"1 reduces TCR-driven calcium response and cytokine production by Th2-cells without affecting IFN! production by Th1-cells. CFSE-dilution (A), [Ca] i variations (B), cytokine production (C and D) in Ca v 1.2AS-transfected Th2 (A, B and C) and Th1 (D) cells stimulated with anti- CD3/anti-CD28-coated beads. n=10 from 5 donors. **p< Figure 6. In Th2-cells, Ca v #AS decreases Ca v 1.2"1 subunit expression and impairs TCR-induced calcium response and cytokine production. [Ca] i variations (A), cytokine production (B), quantification of the total fluorescence intensity of Ca v 1.2 staining (C) and of the fraction of membrane Ca v 1.2 relative to the total amount (D) in Ca v #AS-transfected Th2-cells stimulated with anti- CD3/anti-CD28-coated beads. B: n=8 from 3 donors. **p<0.01; ***p< Figure 7. PKC"/# inhibitor strongly decreases calcium response and cytokine production upon TCR engagement in Th2 but not in Th1-cells. [Ca] i variations (A and C) and cytokine production (B and D) in Th2 (A and B) or Th1 (C and D) cells pre-incubated with Gö 6976 (1 µm) and stimulated with anti- CD3/anti-CD28-coated beads. n=4 from 2 donors. *p<

98 Robert Footnotes The online version of this article contains a data supplement. 31

99 Figure No.1 Click here to download high resolution image

100 Figure No.2 Click here to download high resolution image

101 Figure No.3 Click here to download high resolution image

102 Figure No.4 Click here to download high resolution image

103 Figure No.5 Click here to download high resolution image

104 Figure No.6 Click here to download high resolution image

105 Figure No.7 Click here to download high resolution image

106 Repository Text Online Repository Materials Reagents Nicardipine was purchased from Novartis (Basel, Switzerland) and Gö6976, the inhibitor of PKC!"/! from Calbiochem (San Diego, CA). The following antibodies were purchased from BD Bioscience (San Jose, CA) anti-cd8-pe, anti-cd4-fitc and anti-cd19-pe. Anti-IL-4-APC, anti-il-2-pe and anti-ifn-#-fitc from BD Bioscience. Anti-IL-5-PE and anti-il-13-percp-cy5.5 were purchased from BioLegend. ELISA Plates were coated with 3$g/mL anti-il-4 or anti-ifn# (Ozyme), 2$g/mL IL-5 or 1$g/mL anti-il-13 (ebioscience). Cytokine were revealed by incubation with biotinylated anti-il-4 (2.5$g/mL), IFN-# (3$g/mL), IL-13 (1.5$g/mL) and IL-5 (0.5$g/mL), followed by alkalin phosphatase-streptavidin and its PA-substrate (Sigma). The absorbance was read at 650nm. Fluorescence microscopy For NFAT translocation measurement, Th2 cells (10 6 cell per well in 24 well-plates) were stimulated with "-CD3/"-CD28 coated beads for 24h, transferred onto poly-dlysine-coated slides and fixed with 4% paraformaldehyde. After permeabilization, cells were stained with anti-nfatc1 antibody (BD Bioscience) and then with goat anti-mouse IgG1 antibody (Molecular Probes, Eugene, OR). Nuclei were stained with 5$g/mL of DAPI (Invitrogen). For intracellular Ca V 1.2 staining, cells were labeled with anti-ca V 1.2 monoclonal antibody (Neuromab, Davis, CA) and with 555-Alexa Fluorlabeled goat anti-mouse IgG2b. In some cases, cell surface staining with anti-cd2 antibody (BD Bioscience) was performed before intracellular anti-ca V 1.2 staining. 1

107 Images were acquired with LSM 710 inverted confocal microscope (Carl Zeiss AG, Jena, Germany) equipped with a Plan Apochromat X63 (1.4 oil). Calcium intracellular measurements The fluorescence was measured at the emission wavelength of 510 nm for excitation at 340 and 380nm wavelengths. The ratio (F 340 /F 380 ) was indicative of [Ca] i. Resting cells were recorded for about 1 minute before adding anti-cd3/anti-cd28 coated beads (5 beads per cell). The response was then recorded for 15 minutes before the addition of ionomycin (10µM) used as a positive control. At least 30 cells were recorded by sample. Images were analyzed with MetaFluor imaging software. 2

108 Figure E1. Characterization of human CRTh2 cells. A) PBMCs were stained with PE-coupled anti-crth2 antibody and FITC-coupled anti-cd4 antibody. The CRTH2 + cell proportion in PMBCs was estimated by flow cytometry. B) CD4 + CRTH2 + cells were purified from PBMCs by negative selection of CD4 + cells followed by positive selection of CRTH2 + cells. C) CRTH2 + cells were expanded with anti-cd3/anti-cd28 coated beads in the presence of IL-4, IL-2 and anti-ifn! antibody for 15 days. At that time, cells were stimulated with PMA and ionomycin for 4 hours. Brefeldin A was added for the last two hours. Intracellular IL-4, IL-5, IL-13 and IFN! staining was then performed. One representative experiment out of 6 donors is shown. D) CRTH2 - cells were expanded with anti-cd3/anti-cd28 coated beads in the presence of IL-12, IL-2 and anti-il-4 antibody for 7 days. At that time, cells were stimulated with PMA and ionomycin for 4 hours. Brefeldin A was added for the last two hours. Intracellular IL-4 and IFN! staining was then performed. E) The graph represents the mean of percentage of cytokine producing cells of 6 donors. Bars represent SD. nd= not done. Figure E2. Inhibition of Ca v 1.2, Ca v " and PKC#/" reduces the calcium response in Th2 cells. CD4 + (A), Th2 (B) or Th1 (C) cells were pre-incubated or not with nicardipine (5$M). Th2 cells were transfected by Ca v 1.2 AS (D) or Ca v " AS (E) or sense ODNs. Th2 (F) or Th1 (G) cells were pre-incubated or not with PKC#/" inhibitor (1 µm). All the cells were loaded with Fura-2AM and recorded in baseline conditions and after stimulation with anti-cd3/anti-cd28 coated beads. Results were expressed as the area under the curve after stimulation as described in Methods. Each symbol represents one cell and the results are representative of 4-8 experiments from 2-4 donors. *** p<

109 Figure E3. Comparative expression of Ca V 1!1 and auxiliary subunits between Th2 cells and the neuroblastoma. RNA was extracted from Th2 cells and from the SHY5Y neuroblastoma cell line used as a positive control. They were retrotranscribed in cdna and the expression of Ca V 1.2, Ca V 1.3!1 subunits as well as the expression of auxiliary "1, "2, "3, "4,!2#1 and!2#2 subunits were quantified by qpcr. The histogram represents the mean of three experiments. Bars represent SD. The dotted line indicates the limit of qpcr product detection. Figure E4. Ca v 1.2 protein levels are selectively up regulated in Th2 and not in Th1 cells, compared to CD4 + T cells. CD4 +, Th1 and Th2 cells were permeabilized and stained with anti-ca v 1.2 mab followed by incubation with secondary AlexaFluor 555 goat anti-mouse IgG2b antibody. Nuclei were stained with DAPI and were analyzed by confocal microscopy. One experiment representative out of 2 donors is shown. Bars represent 10 µm. Figure E5. Nicardipine reduces NFAT nuclear translocation and cytokine expression in Th2 cells. A) Th2 cells were stimulated or not with anti-cd3/anti- CD28 coated beads in the presence or not of nicardipine (5$M) for 24h. Then, these cells were permeabilized and stained with anti-nfatc1 antibody and with secondary AlexaFluor 488 goat anti-mouse IgG1 antibody. Nuclei were distinguished by DAPI staining. Cells were analyzed by confocal microscopy. One experiment representative out of 2 donors is shown. Bars represent 10 µm. B) Th2-cells were stimulated or not with anti-cd3/anti-cd28 coated beads in the presence or not of 4

110 nicardipine (5!M) for 4h. Cytokine mrna expression was assessed by qpcr. Results were expressed as mean of 3 donors. Bars represent SD. Figure E6. Ca v 1.2AS decreases Ca v 1.2 "1 expression at the mrna and protein level. Th2 cells were transfected with Ca v 1.2AS or sense ODNs during 72 hours. A) Ca v 1.2AS transfected-th2 cells were then assessed for Ca v 1.2 mrna expression by qpcr. Results are expressed as mean of 6 donors. Bars represent SD. B) Intracellular Ca v 1.2 staining was performed in sense and Ca v 1.2AS transfected-th2 cells. The histogram shows quantification of the total fluorescence intensity. Each symbol represents one cell. One experiment representative out of four from two donors is shown. Bars represent 5!m. * p<0.05; *** p< Figure E7. Ca v #AS decreases the expression of Ca v 1.2 "1 subunit protein in Th2 cells. Th2 cells were transfected with Ca v #AS or sense ODNs. Th2-cells were surface labeled with anti-cd2 antibody and intracellular Ca V 1.2 staining was performed. The white dots represent the colocalization of CD2 and Ca V 1.2 pixels!"#$%&'()*%#+)#+'),-$.'/)012.%&)34!1!5$1%6$#%!&)7%&('89:));+')8'<21#)%<)8'08'<'&#$#%=') of 2 experiments from 2 donors. Bars represent 5!m. 5

111 Repository E Tables Click here to download Repository E Tables: RepositoryTable.doc Table E1. List of primers used Genes Forward (5'-3') Reverse (5'-3') Ca V 1.1 CAG-GCT-TGA-ACA-AAA-TCA-TCC-A CTT-CAC-GAT-GTC-ATG-GCA-CTT-C Ca V 1.2 GGC-TAC-CTG-GAT-TGG-ATC-ACT-C GTG-AGA-CCG-AGT-CCG-TCA-ACA Ca V 1.3 AAG-TCT-CTG-GTG-CTG-GTG-GA GCC-CTA-CAT-CTT-CTG-CGA-TT Ca V 1.4 GTT-CCA-TGA-CAG-AGA-CCC GCG-GCA-GAC-TCT-GGT-TTT-CA!1" TCG-AGC-CCA-AAG-ACT-TCC-T CGA-AGG-CTG-TCC-AGT-TTG-A!2" GCC-ATC-TCA-TTC-GAA-GCA-A GCT-GCA-GCC-TCA-TGT-TTT-C!3" GCC-CAT-CTC-TGG-ACT-CAG-AC AGC-TGA-CAT-TGG-TCC-TCA-CC!4" CGG-ATC-CAG-CAA-GAA-CAA-A GGG-AGT-TGC-TCG-GAA-TGT-C #2$1" AAT-TGC-AGC-CAG-GGA-TAT-TG CAC-TGG-TGA-GCT-GCT-TGA-AC #2$2" TGC-TGC-AGA-GAA-CTT-CCA-GA TCC-TCA-CTC-TCA-GGG-TCG-C #2$3" TGA-CGT-CCA-AGT-ACC-AAC-GA GAT-GGG-TCA-CGG-TCA-AAG-TT #2$4" GAG-GAC-ATG-GAG-AAC-ATG-CTG TTC-TCG-TCCTC-TCG-TTG-AT IL-4 TCT-GTG-CAC-CGA-GTT-GAC-CGT-AAC-A AGC-CCG-CCA-GGC-CCC-AGA IL-5 GCT-TCT-GCA-TTT-GAG-TTT-GCT-AGC-T TGG-CCG-TCA-ATG-TAT-TTC-TTT-ATT-AAG IL-13 AAC-CAG-AAG-GCT-CCG-CTC-TGC-AA AGT-TGA-GTC-CCT-CGC-GAA-AAA IFN% GCA-TCC-AAA-AGA-GTG-GGA-GAC-CAT-CA CTG-GGA-TGC-TCT-TCG-ACC-TTG-AAA-CA GAPDH AGC-ACC-AGG-TGG-TCT-CCT-CT CCA-AAT-TCG-TTG-TCA-TAC-CAG

112 epository E Figure No.1 lick here to download high resolution image

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117 epository E Figure No.6 lick here to download high resolution image

118 Repository E Figure No. 7 Click here to download high resolution image

119 DISCUSSION ET PERSPECTIVES 57

120 Nos travaux ont mis en évidence des canaux calciques voltage-dépendants Ca V 1 dans les lymphocytes T en particulier Th2. Les propriétés de ces canaux sont en grande partie conférées par les sous-unités "1. Il existe quatre isoformes des sous-unités "1 codant les canaux Ca V 1. Elles sont codées par des gènes différents, s expriment plus ou moins dans des tissus différents, ont des sensibilités différentes pour les dihydropyridines, s activent pour des potentiels de membrane plus ou moins positifs avec une gradation dans la sensibilité au voltage des canaux Ca V 1.4, Ca V 1.3 et Ca V 1.2 du potentiel le moins positif vers le plus positif. Il est connu depuis de nombreuses années que des agents pharmacologiques comme la nifédipine, le verapamil ou le diltiazem, inhibent la prolifération voire la production d IL-2 par des lymphocytes humains ou des lymphocytes de souris. Néanmoins de nombreux doutes entachent ces travaux car ces agents et en particulier les dihydropyridines peuvent agir à fortes doses sur des canaux potassiques (K Ca et K v ) dont l activation est nécessaire pour maintenir le gradient électrochimique. De plus, il est estimé que la membrane du lymphocyte dont le potentiel serait autour de -50 mv ne se dépolarise pas après engagement du TCR (voir P. Hogan 2010 Callahan M). Ces données ont conduit les auteurs à rejeter l idée que les canaux Ca V 1 puissent être fonctionnels dans les lymphocytes même si plusieurs groupes ont rapporté la présence d ARN messagers dont la séquence correspondait au moins à des fragments de sousunités "1 de canaux Ca V 1. Depuis 2006, l utilisation de souris dont le gène codant les sous-unités!3,!4 ou la sous-unité "1Ca V 1.4 est déficient ou a été invalidé, a permis de montrer l importance de sous-unités de canaux Ca V 1 dans le développement des LT, leur signalisation calcique et la production de cytokines. De par la singularité de trouver des canaux voltage-dépendants dans des cellules non excitables, de nombreuses questions restent en suspens quant à la présence, au fonctionnement et au rôle des canaux Ca V 1 dans les lymphocytes. 58

121 Les canaux Ca V 1 sont-ils sensibles au voltage? La sensibilité au voltage, telle qu elle est décrite dans les canaux Ca V 1 des cellules excitables, est due à des acides aminés chargés positivement présents dans les segments S4 de chaque domaine de la sous-unité!1. De la structure du canal dépend donc directement sa sensibilité au voltage. Bien que la présence de ces canaux dans les lymphocytes T soit confirmée par plusieurs équipes, la structure des canaux Ca V 1 n a jamais été clairement établie. Une des raisons à ces débats s explique par le fait qu il existe un nombre important de variants d épissage alternatifs associés à chaque isoforme de chaque sous-unité. Une structure incomplète du canal pourrait expliquer l insensibilité au voltage. Cette hypothèse a été postulée par plusieurs équipes. Le groupe de Grafton (Stokes et al., 2004) a identifié dans les lymphocytes T Jurkat des formes tronquées de Ca V 1.2 et Ca V 1.3 d une centaine de kda contre 210kDa attendus pour une forme entière de Ca V 1.2 et 240kDa pour Ca V 1.3. De plus, l usage alternatif d exon a été décrit dans les canaux Ca V 1 des cellules non-excitables. Le groupe de Jefferies a identifié deux variants de Ca V 1.4 différents au sein d une même population lymphocytaire (Kotturi and Jefferies, 2005). L absence de l exon 33, dans la première isoforme, conduirait à la délétion du domaine IVS4 sensible au voltage avec absence des acides aminés basiques nécessaires pour la sensibilité au voltage dans ce domaine. La deuxième isoforme présente la perte de l exon codant pour le linker IVS3-S4 ce qui empêcherait les mouvements du domaine S4 induit normalement par la dépolarisation dans les cellules rétiniennes. Ces exemples sous-entendraient que les cellules nonexcitables comme les lymphocytes T exprimeraient des canaux Ca V 1 dont la structure serait altérée. Cette séquence unique serait donc adaptée au fonctionnement de telles cellules bien qu elle conserve une identité proche de celle des canaux présents dans les cellules excitables. 59

122 Cependant d autres équipes, dont la nôtre, a mis en évidence des canaux structurellement proches des formes décrites dans les cellules excitables. Chez la souris, nous avons montré que les lymphocytes Th2 murins et humains exprimaient les canaux Ca V 1.2. Nous avons réalisé un western-blot à partir de lysat de lymphocytes Th2 murins, montrant une protéine aux alentours des 250kDa, proche de celles observées dans les cellules excitables. Après séquençage, nous avons identifié la protéine Ca V 1.2 murine et humaine comme la forme neuronale. Cependant, à l instar des travaux de Kotturi, nous avons également remarqué l absence de l exon 33 dans la séquence des canaux Ca V 1.2 exprimés par les lymphocytes Th2 murins. Afin de vérifier sa sensibilité au voltage, le plasmide codant cette séquence a été co-transfecté dans des HEK, avec des plasmides codant pour les outils nécessaires au fonctionnement du canal, à savoir les sous-unités $ et!2". Nous avons ensuite montré par patch-clamp, que la dépolarisation membranaire des HEK induisait l ouverture des canaux et l entrée de Ca 2+. Cette approche montre que malgré l absence de l exon 33, le canal Ca V 1.2 issu des lymphocytes Th2 est capable de s ouvrir en réponse au voltage. Ces résultats suggèrent donc que le canal Ca V 1.2 possède une structure lui permettant d être sensible au voltage : résultats en contradiction avec les travaux de Kotturi. Toutefois, nous avons également testé la dépendance au voltage des canaux Ca V 1.2 directement dans les lymphocytes Th2 murins au repos. Bien que leur membrane ne se dépolarise pas, nous avons forcé cette dépolarisation en présence de KCl. Nos résultats n'ont montré aucune entrée du Ca 2+ en réponse au KCl. Il semblerait donc que malgré sa capacité à être sensible au voltage, ce canal ne s ouvre pas suite à la dépolarisation membranaire dans le lymphocyte T, supportant l idée que le canal présent dans les lymphocytes T fait appel à un mécanisme alternatif pour laisser entrer le calcium et qu il existerait un système de régulation de ce canal propre aux cellules non excitables. 60

123 Comment le canal Ca V 1 est-il régulé dans les lymphocytes T? Au vu de nos résultats préliminaires, les canaux Ca V 1 présents dans les lymphocytes T ne semblent pas être régulés par le voltage. D autres équipes confortent nos résultats, notamment l équipe de Flavell. En effet, leurs travaux ont montré que la dépolarisation artificielle de la membrane de lymphocytes T CD4 au repos, n induisait pas d influx calcique (Badou et al., 2006). Plusieurs hypothèses peuvent être émises quant aux mécanismes de régulation permettant l ouverture du canal Ca V 1 et l entrée de calcium. L ouverture du canal nécessiterait sa relocalisation du canal à la membrane après engagement du TCR Les expériences citées ci-dessus ont été effectuées à partir de lymphocytes T au repos. Il se pourrait que la stimulation par le TCR soit nécessaire à l activation du canal en favorisant par exemple sa localisation à la membrane. Les marquages d immunofluorescence réalisés sur les lymphocytes Th2 murins et humains à l aide d un anticorps monoclonal anti-ca V 1.2 ont montré la présence de ce canal principalement dans le cytoplasme. Une très faible partie du marquage avec l anticorps anti-ca v 1.2 co-localise avec un marquage de la membrane plasmique, suggérant que très peu de canaux sont disponibles à la membrane du Th2 au repos. Il serait d ailleurs intéressant de localiser précisément ce canal dans le cytoplasme et déterminer s il est sous-membranaire et/ou contenu dans des organelles comme le réticulum endoplasmique. Des résultats préliminaires semblent indiquer que les canaux Ca V 1.2 sont recrutés à la membrane plasmique après stimulation des lymphocytes Th2 en présence de billes recouvertes d anticorps anti-cd3 et anti-cd28. Le recrutement à la membrane pourrait ainsi favoriser l ouverture de ces canaux. Les travaux de Dixon (Dixon et al., 2012) montrent que dans les cardiomyocytes, les canaux Ca V 1.2 s oligomérisent à la membrane via leur partie C-terminale, 61

124 amplifiant ainsi l influx calcique et le couplage excitation-contraction de ces cellules. De plus, les travaux de Badou (Badou et al., 2006) ont montré que la stimulation des lymphocytes T par leur TCR induisait une légère dépolarisation de la membrane inhibée par la nifédipine, un antagoniste des canaux Ca V 1. Si cette idée est transposée aux lymphocytes T, il pourrait être imaginé que l engagement du TCR induise un recrutement des canaux Ca V 1.2 à la membrane augmentant leur nombre et donc leur interaction afin d obtenir un influx calcique significatif même en présence d une faible dépolarisation membranaire. Deux sous-unités auxiliaires des canaux Ca V 1 sont connues pour intervenir dans le trafic de la sous-unité!1 constituant le pore du canal. Dans les neurones, la sous-unité!2" est localisée au niveau des radeaux lipidiques présents dans les membranes (Davies et al., 2006) (Davies et al., 2010). Cette localisation suggère que cette sous-unité est restreinte à des micro-domaines spécifiques de la membrane neuronale et pourrait induire des associations avec les sous-unités!1 (Davies et al., 2006). Par exemple, la mutation de la sous-unité!2"2 entraîne une rétention intracellulaire de la sous-unité!1 (Davies et al., 2006). L autre sous-unité impliquée dans le trafic de la sous-unité!1 est la sous-unité $. Il a été, tout d abord, suggéré que la sous-unité $ intervenait dans le trafic de!1 en masquant le signal de rétention du réticulum endoplasmique contenu dans le linker I-II (Bichet et al., 2000) (Cornet et al., 2002). Cependant des expériences de mutations dans ce linker ont révélé que le manque d interaction de la sousunité!1 avec $ résultait de la dégradation protéasomale de!1 plutôt que sa rétention dans le RE (Altier et al., 2011). A partir de ces données, un modèle a pu être proposé. Les sous-unités!1 et $ seraient synthétisées dans le RE. La sous-unité $ permettrait une acquisition conformationnelle correcte du linker I-II de la sous-unité!1 évitant ainsi sa dégradation et permettant sa sortie du RE vers la membrane plasmique. La sous-unité!2" s associerait à un stade plus tardif à la sous-unité!1, par exemple dans l appareil de Golgi pour promouvoir son trafic vers la membrane 62

125 ou réduire son endocytose. La sous-unité!2" semble être capable d atteindre la membrane plasmique en absence du canal calcique. Un tel trafic n a jamais été montré dans les lymphocytes T. Toutefois nous avons montré, dans les lymphocytes T CD4+ humains, la présence des sous-unités $1, $3 et!2"2. De plus, l expression d ARN messagers codant pour les sous-unités!1 et $ est augmentée lors de la stimulation par le TCR, alors que celle de!2"2 reste inchangée, suggérant que les signaux émis par le TCR augmenteraient le nombre de canaux calciques fonctionnels. Nous avons également montré qu en absence de sous-unité $, la sous-unité!1ca V 1.2 est moins exprimée et sa localisation à la membrane réduite. Ces résultats corrélèrent avec ceux observés dans les cellules neuronales. Il serait donc intéressant d étudier, dans nos cellules, l effet de l inhibition de!2" sur le trafic de la sous-unité!1. Nous pourrions également déterminer si la signalisation du TCR est requise pour le recrutement des canaux Ca V 1 à la membrane plasmique. L interaction du canal avec d autres protéines faciliterait son ouverture Le recrutement à la membrane des canaux Ca V 1.2 pourrait également favoriser l interaction de ce canal avec d autres protéines pour promouvoir son ouverture. Les protéines kinases sont capables de jouer ce rôle. Il a été montré que la PKA et la PKC avaient la capacité de se lier à la sous-unité!1 des canaux Ca V 1 (De Jongh et al., 1996) (Puri et al., 1997). Les travaux de Navedo ont montré que la PKC! régulait la fonction des canaux Ca V 1.2 dans le muscle lisse. L activation de la PKC! par la protéine AKAP40 résulte en une activité calcique persistante, suggérant que la PKC! augmente la probabilité d une activité des canaux Ca V 1.2 persistante (Navedo et al., 2008). De plus l activation de la PKC! augmenterait la probabilité d une ouverture couplée entre les canaux Ca V 1.2 augmentant ainsi l influx calcique. La PKC! est également présente dans les lymphocytes T. Notre équipe a montré, en 2001 que la PKC était transloquée à la membrane plasmique après 63

126 engagement du TCR précédant l augmentation de la concentration calcique intracellulaire dans un hybridome T (Savignac et al., 2001). De plus, cette réponse calcique dépendante de la PKC était inhibée par l utilisation d une dihydropyridine antagoniste des canaux Ca V 1, suggérant une régulation de ces canaux par cette protéine. Le rôle de la PKC!/$ a été confirmé dans les lymphocytes Th2 humains où l utilisation d un inhibiteur spécifique de cette protéine diminue la réponse calcique et la production de cytokines de type 2, alors qu aucun effet n a été observé dans les lymphocytes Th1 dépourvus de canaux Ca V 1. Pour aller plus loin dans ces investigations, il faudrait mettre en évidence une interaction des la PKC avec les canaux Ca V 1 dans les lymphocytes Th2. Les canaux Ca V 1 seraient pré-activés dans les lymphocytes Le mécanisme d activation des canaux Ca V 1 est formé de deux composantes distinctes : le senseur de voltage et le pore. Le canal peut se trouver sous plusieurs états : - fermé : le pore est fermé et le senseur au voltage au repos le maintient fermé - ouvert : le senseur au voltage activé permet l ouverture du pore - inactivé : le senseur au voltage revient au repos alors que le pore est toujours ouvert. Classiquement les canaux calciques doivent passer par l état fermé avant de passer à l état ouvert. Dans les lymphocytes B de rat, il a été décrit un autre état conformationnel des canaux Ca V 1.3 pouvant expliquer leur ouverture sans qu ils soient dépendants du voltage. Dans ces travaux, Sadighi et ses collègues ont utilisé un anticorps reconnaissant un épitope extracellulaire de la sous-unité!1 de Ca V 1.3. Cet anticorps marque les cellules excitables uniquement si leur membrane a été dépolarisée au préalable. Ceci suggère que cet anticorps cible un épitope 64

127 uniquement exposé lorsque le canal a changé de conformation en réponse à une dépolarisation. De façon surprenante, ces auteurs montrent un marquage des lymphocytes B avec cet anticorps dans des conditions basales. Ces résultats sous-entendent qu il existerait dans ces cellules un pool de canaux Ca V 1.3 dans un état conformationnel «pré-activé» en absence de toute dépolarisation. Un analogue du GMPc suffit à induire un influx de calcium dans les lymphocytes B ; du GMPc est produit dans les lymphocytes B après stimulation du récepteur B pour l antigène (BCR) et l influx calcique généré par activation du BCR est bloqué par un inhibiteur de la guanylyl cyclase. Ces résultats suggèrent que l ouverture des canaux Ca v 1.3 pourrait dépendre du GMPc. Trois mécanismes sont théoriquement possibles 1) Les canaux Ca v 1.3 se comporteraient comme des canaux régulés par des nucléotides («cyclic nucleotide gated channels») 2) Le GMPc peut réguler des phosphodiestérases (PDE) et ainsi moduler le niveau d AMPc et donc d activation de la PKA. Ainsi le GMPc peut inhiber la dégradation d AMPc via son action sur la PDE3 3) Le GMPc active la protéine kinase G qui pourrait réguler l ouverture des canaux Ca v 1.3 comme cela a été décrit dans des cellules excitables. Cette dernière hypothèse était privilégiée mais non démontrée par les auteurs. Bien que Sadighi n ait pas obtenu de marquage des lymphocytes T totaux avec son anticorps, il serait intéressant de vérifier qu un tel modèle est transposable aux lymphocytes Th2. De plus, notre équipe a publié des travaux dans lesquels un rôle de la PKG, activé par le GMPc a été mis en évidence dans la signalisation calcique et la production de cytokines (Gomes et al., 2006). Gomes a montré dans cet article que la concentration de GMPc augmente suite à la stimulation du TCR dans les lymphocytes Th2. L!augmentation du calcium due à la stimulation via le TCR peut être abolie par un antagoniste des Ca V 1. De plus, des lymphocytes Th2 générés à partir de souris PKG1 -/- ont un défaut de signal calcique et de sécrétion d!il-4. 65

128 Pour répondre aux questions sur la régulation des canaux Ca V 1 dans les lymphocytes T nous sommes actuellement en train de développer la microscopie à ondes évanescentes (TIRFM) sur un hybridome T proche produisant de l IL-4 et exprimant les canaux Ca V 1.2. Cette technique permet de visualiser et d analyser uniquement les phénomènes calciques se produisant à la membrane des cellules, grâce à une sonde liant le calcium. Nous pouvons ainsi déterminer la probabilité et le temps d ouverture caractéristiques de chaque canal calcique. Des résultats préliminaires montrent, en réponse à la stimulation par le TCR, un nombre d événements calciques diminué dans les cellules dont l expression des canaux Ca V 1.2 a été inhibée par oligonucléotides anti-sens contrairement aux cellules non traitées. Ceci suggère qu il existe bien des canaux Ca V 1.2 présents à la surface des cellules et que ces canaux sont capables de s ouvrir dans les minutes suivant l engagement du TCR. Quel est le rôle des canaux Ca V 1 dans le fonctionnement des lymphocytes T? L existence des canaux Ca V 1 dans les lymphocytes T n est plus à démontrer, cependant leur rôle dans le fonctionnement de ces cellules nécessite encore des éclaircissements. Nous avons montré que, dans les lymphocytes T, ces canaux avaient un rôle très important dans la signalisation calcique. Les canaux Ca V 1.4 ont été décrits par notre équipe dans les lymphocytes T CD4 non différenciés et dans les lymphocytes T naïfs. Nous avons montré que le traitement des cellules par la nicardipine inhibe la réponse calcique due à l engagement du TCR ainsi que la production de cytokines, notamment en réduisant la translocation nucléaire du facteur de transcription NFAT. Ces résultats démontrent l importance de ces canaux dans l activation des lymphocytes T. Toutefois nous n'avons noté aucun défaut de survie ou de prolifération de ces cellules sous-entendant que les canaux Ca V 1.4 ne seraient pas impliqués dans ces mécanismes. 66

129 D autre part, Omilusik et col. ont montré la présence des canaux Ca V 1.4 dans les lymphocytes T naïfs. L utilisation de souris Ca V 1.4 déficientes a permis de démontrer que ces canaux étaient importants pour la survie des lymphocytes T naïfs, mais également leur développement et leur fonction. En effet, les lymphocytes T issus des souris Ca V 1.4 -/- présentent une activation aiguë conduisant à l expression importante des molécules CD44 et CD122 ainsi que du facteur de mort programmée PD-1. De plus, cette équipe a mesuré les courants Ca V 1 dans les lymphocytes T naïfs et montré qu ils étaient absents dans les cellules déficientes pour Ca V 1.4 lors de la stimulation par le TCR. Les auteurs ont donc émis l hypothèse que les interactions du TCR avec des antigènes du soi conduisent les lymphocytes T naïfs à ouvrir les canaux Ca V 1.4, répondant à des faibles seuils d activation. L influx calcique dépendant de Ca V 1.4 induit probablement une cascade de signalisation contribuant à remplir les stocks calciques intracellulaires requis pour la survie cellulaire. Nous avons également démontré le rôle des canaux Ca V 1.2 et Ca V 1.3 dans l activation des lymphocytes Th2. L inhibition de ces canaux, pharmacologique ou par des oligonucléotides anti-sens, réduit dramatiquement l augmentation de la concentration calcique intracellulaire en réponse à la stimulation par le TCR ainsi que la production de cytokines de type 2. Des effets similaires sont constatés en absence de la sous-unité $ nécessaire à l expression correcte de la sous-unité!. De plus, nous avons montré chez la souris, que l altération de la réponse calcique induite par la perte des canaux Ca V 1 dans les lymphocytes Th2, entraînait l incapacité de ces cellules à induire un asthme allergique Ces résultats démontrent bien la nécessité des canaux Ca V 1.2 et Ca V 1.3 dans les fonctions effectrices des lymphocytes Th2. Bien que le rôle de ces canaux dans la biologie des lymphocytes T semble établi, peu de choses sont connues quant à leur place dans la signalisation calcique et une possible interaction avec d autres canaux. Les canaux ORAI en coopérant avec les molécules STIM sont décrits comme l entrée principale de calcium dans 67

130 les lymphocytes T. Deux récentes publications ont montré que la molécule STIM1 pouvait à la fois contrôler l ouverture ORAI mais était également capable d interagir avec le canal Ca V 1.2 (Park et al., 2010) (Wang et al., 2010). En effet, le domaine d activation du canal (CAD) de STIM1 inhiberait l activité du canal Ca V 1.2. La diminution de la concentration de STIM1 permettrait de retrouver l activité de ces canaux surexprimés dans des lymphocytes T Jurkat (Park et al., 2010). Niemeyer, dans son commentaire à l article d Omilusik, émet l hypothèse d une interaction entre Ca V 1.4 et STIM1 à l instar de celle existante avec Ca V 1.2 (Niemeyer and Hoth, 2011)). Elle explique l activité des canaux Ca V 1.4 par le fait qu à de faibles concentrations de la molécule STIM1 dans les lymphocytes T naïfs, la majorité de cette molécule serait liée à ORAI et que très peu interagirait avec Ca V 1.4 conduisant ainsi à son activation suite à la dépolarisation induite par ORAI. En revanche, dans les lymphocytes T effecteurs et mémoires, la concentration de STIM1 étant plus élevée, la proportion de STIM1 «libre» inhiberait l activité des canaux Ca V 1.4. Toutefois ce modèle proposé n est pas en adéquation avec les résultats que nous avons obtenus. D une part, très rapidement après engagement du TCR, l expression du canal Ca V 1.4 diminue fortement dans les lymphocytes T CD4 + humains et une faible expression de ce canal est retrouvée dans les lymphocytes différenciés Th2, suggérant une régulation des canaux Ca V 1 en fonction de l état d activation de la cellule. D autre part, nous avons montré une importante altération de l influx calcique dans les lymphocytes Th2 transfectés avec les Ca v 1AS, indiquant que les canaux Ca V 1 interviendraient en amont d une potentielle entrée de Ca 2+ via les canaux ORAI. L inhibtion des canaux Ca V 1 par la molécule STIM, comme proposée par les travaux de Park et Wang, ne pourrait donc pas s appliquer aux lymphocytes Th2. Pour éclaircir ce sujet, nous envisageons de déterminer quelle est la part de l influx calcique revenant aux canaux ORAI et aux canaux Ca V 1. Pour cela, l inhibition des molécules ORAI et/ou STIM dans les lymphocytes T permettrait d identifier s ils sont partenaires inhibiteurs ou activateurs des canaux Ca V 1. 68

131 Y a-t-il une relation entre l expression différentielle des canaux calciques et le phénotype des lymphocytes T? Les lymphocytes T CD4+ se divisent en plusieurs sous-populations présentant des facteurs de transcription spécifiques, ce qui est associé à une production de cytokines et un rôle dans le système immunitaire propres à chaque population. La «signature calcique» régulant en grande partie l expression génique des lymphocytes T via entre autres le facteur de transcription NFAT pourrait être responsable ou contribuer à l hétérogénéité des LT. En effet, chaque souspopulation de lymphocytes T est associée à une signature calcique propre. Par exemple, les lymphocytes Th2 ont une concentration calcique intracellulaire basale plus élevée que celle des lymphocytes Th1. En revanche, la stimulation par le TCR entraîne une élévation de cette concentration plus importante dans les Th1 que dans les Th2. Ceci peut s expliquer en partie par le fait que les lymphocytes Th2 présentent entre autres des courants K Ca plus faibles (Fanger et al., 2000) et par conséquent une clairance du calcium du cytosol vers le milieu extracellulaire moins rapide dans les Th2 que dans les Th1. Nos travaux ont montré une différence d expression des canaux calciques Ca V 1 entre les Th2 et les Th1. De plus, chez l Homme, nous avons observé une expression du canal Ca V 1.4 très forte dans les lymphocytes T CD4+ non manipulés et particulièrement dans les LT CD4 + naïfs. Après engagement du TCR, cette expression diminue très rapidement au profit de celles de Ca V 1.2 et Ca V 1.3. Lorsque les lymphocytes T sont différenciés en LTh1 et Th2, une forte expression de Ca V 1.2 et Ca V 1.3 est observée dans les lymphocytes Th2, tandis que les Th1 n expriment que très peu ou pas ces canaux. Ces résultats nous amènent naturellement à la question de la raison de cette plasticité d expression au cours de la différenciation et de l activation des lymphocytes T CD4 +. Arrol et ses collègues ont comparé l influx calcique dans les lymphocytes T CD4 + naïfs et mémoires humains (Arrol et al., 2008). Ils montrent que les lymphocytes 69

132 T naïfs ont un signal calcique soutenu après stimulation mais moins élevé que les lymphocytes T mémoires. De plus, lors de la différenciation des T naïfs en T mémoires, le niveau de réponse calcique augmente au début, puis diminue au cours des différents cycles de stimulation. Ces résultats démontrent que le profil de la réponse calcique dans les lymphocytes T est corrélé à la finalité fonctionnelle de ces cellules. En effet, une élévation forte et soutenue est requise pour la translocation nucléaire de NFAT, la production d IL-2 et la prolifération des lymphocytes T naïfs au cours de leur différenciation (Timmerman et al., 1996) (Wacholtz and Lipsky, 1993) (Wulfing et al., 1997). La présence prédominante de la forme Ca V 1.4 dans les lymphocytes T non différenciés par rapport aux T différenciés pourrait expliquer cette différence de signal calcique. Ces canaux sont connus pour s ouvrir à des potentiels d action plus proches de ceux de la membrane plasmique des LT que Ca V 1.2 et Ca V 1.3. Cette «facilité» d ouverture pourrait donner aux lymphocytes T naïfs un influx calcique fort et soutenu répondant aux besoins accrus de l expression génique en vue d une différenciation. Les lymphocytes Th2 et Th1 diffèrent de par leur composition en canaux Ca V 1, seuls les Th2 exprimant Ca V 1.2 et Ca V 1.3. La biologie des lymphocytes Th1 et Th2 leur confère des propriétés uniques adaptées à des fonctions précises dans la défense de l organisme. Les lymphocytes Th1 engendrent des réponses immunes «explosives» visant à éliminer des pathogènes intracellulaires. Les lymphocytes Th2, en revanche, sont plutôt impliqués dans des réponses immunes chroniques, telles que l élimination des helminthes. Le fait que ces populations soient différemment sollicitées corrèle avec leur susceptibilité à l apoptose. En effet, la mort cellulaire dépendante de Fas est impliquée dans la perte préférentielle des lymphocytes Th1. Les clones de cellules Th1 sont très sensibles à l'apoptose induite par l activation, à l'inverse des clones de type Th2 (Lynch et al., 1995). L apoptose est un phénomène régit par la signalisation calcique. Puisque les lymphocytes Th2 et non les Th1 expriment Ca V 1.2 et 70

133 Ca V 1.3, il semble légitime de se demander si ces canaux ne seraient pas également impliqués dans la susceptibilité aux processus apoptotiques. Il serait également intéressant de déterminer le rôle des canaux Ca V 1 dans le contrôle de l expression génique. Pour cela, nous pourrions étudier le devenir des lymphocytes Th1 transfectés avec les canaux Ca V 1.2 et/ou Ca V 1.3 tant au niveau du signal calcique, du remodelage de la chromatine que de l apoptose. Le lymphocyte Th1 modifierait-il ses fonctions en acquérant des caractéristiques proches des lymphocytes Th2, ou serait-il moins susceptible à la mort cellulaire programmée suite à l activation par le TCR face à des modifications de sa signalisation calcique? D autre part, les canaux Ca V 12 et Ca V 1.3 sont exprimés tous les deux dans les lymphocytes Th2. Bien que le canal Ca V 1.2 semble plus exprimé que CaV1.3, nous souhaitons déterminer le rôle respectif de ces canaux. Nous possédons actuellement des souris déficientes pour les canaux Ca V 1.2 et Ca V 1.3 dans les lymphocytes T CD4 +. Dans un futur proche, nous analyserons la différenciation des différentes sous-populations issues de ces souris ainsi que les réponses T. Grâce à ses outils, nous pourrons déterminer la contribution respective de ces canaux dans le développement et les fonctions effectrices des lymphocytes T. Si les canaux Ca V 1 interviennent dans le phénotype des sous-populations de lymphocytes T, il se peut qu il y ait un lien entre un défaut d expression de ces canaux et le rôle pathologique des lymphocytes T dans certaines situations. Quelle est la relevance de l expression des canaux Ca V 1 par les LTh2 et/ou des cellules inflammatoires dans l asthme allergique? Les lymphocytes Th2 ont un rôle majeur dans la physiopathologie de l asthme allergique. Par leur sécrétion de cytokines IL-4, IL-5 et IL-13, ils orchestrent toute la réponse inflammatoire des voies respiratoires. 71

134 Les traitements actuellement disponibles pour les patients asthmatiques se cantonnent à traiter les symptômes de la maladie et non les causes. Toutefois, il existe certains traitements comme les corticoïdes qui inhibent l ensemble du système immunitaire. Il serait donc important d inhiber spécifiquement l activation des lymphocytes Th2 sans affecter les autres populations lymphocytaires. Les canaux Ca V 1 représenteraient donc une cible de choix dans le traitement de l asthme allergique. Exprimés spécifiquement par les lymphocytes Th2 murins et humains, nous avons montré que l inhibition de ces canaux entraîne une diminution de la réponse calcique et la production de cytokines par les lymphocytes Th2 sans affecter les Th1 chez la souris comme chez l Homme. De plus, l inhalation d oligonucléotides anti-sens spécifiques des canaux Ca V 1.2 et Ca V 1.3 prévient le développement de la maladie dans un modèle murin d asthme expérimental. L utilisation des anti-sens anti-ca V 1.2 et anti-ca V 1.3 pourrait ainsi être envisagée en thérapie. Dans le traitement de l asthme allergique, la technique des oligonucléotides anti-sens a déjà testé pour inhiber l expression de gène codant pour plusieurs molécules cibles, comme des protéines de membrane, des cytokines, des protéines kinases ou des facteurs de transcription comme GATA-3 ou STAT6 (Popescu, 2005). La pharmacocinétique des oligonucléotides anti-sens dépend du système et du mode d administration. L administration locale des AS dans les voies respiratoires par inhalation permet d utiliser des doses plus faibles mais toute aussi efficaces, comparées à celles utilisées dans d autres modes d administration. De plus, l inhalation des AS permet de cibler directement les poumons, minimisant ainsi la toxicité et les effets secondaires dus à une distribution systémique (Tanaka and Nyce, 2001). D autre part, il serait intéressant d étudier si l expression des canaux Ca V 1 est augmentée dans les lymphocytes Th2 et/ou les cellules inflammatoires présentes dans le poumon de les patients asthmatiques. Dans cette optique, nous avons établi un projet clinique visant à comparer le pourcentage de cellules CRTH2+ et le niveau d expression des canaux Ca v 1 dans les lymphocytes T de personnes asthmatiques et non-asthmatiques. Nous souhaitons également analyser s il est 72

135 possible de mettre en évidence l expression des canaux Ca V 1 dans l expectoration induite par inhalation de sérum salé hypertonique chez des enfants asthmatiques (ce qui donne accès aux cellules inflammatoires présentes dans les voies aériennes inférieures ; cette procédure non invasive donne les mêmes informations que le lavage broncho-alvéolaire). De plus, nous voulons déterminer s il existe une corrélation entre l expression des canaux Ca V 1, la production de cytokines de Th2 et la fréquence d éosinophiles. 73

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157 ANNEXES 95

158 médecine/sciences médecine/sciences 2012 ; 28 : > La signalisation calcique est essentielle pour les fonctions des lymphocytes T (LT), y compris celles des lymphocytes Th2 (T helper 2). Les lymphocytes Th2 produisent les interleukines 4, 5 et 13 et sont impliqués dans les maladies allergiques. L activation des LT est à l origine d une entrée de Ca 2+ via les canaux ORAI, et vraisemblablement d autres canaux. Parmi eux, les canaux dépendant du voltage (Ca v 1) sont décrits dans certains LT dont les Th2 où leur rôle a été démontré. Comme corollaire, l inhibition des canaux Ca v 1 prévient l asthme allergique expérimental impliquant les Th2. Dans cette revue, nous discuterons la singularité des réponses calciques selon le type de LT. < Les lymphocytes T Les lymphocytes T (LT) orchestrent la réponse immunitaire. Ils comprennent les LT helper (Th), qui expriment la molécule de surface CD4, et les LT cytotoxiques, qui expriment la molécule de surface CD8. Après leur rencontre avec la cellule présentatrice d antigène chargée avec le peptide adéquat, les Th naïfs se différencient en cellules effectrices Th1, Th2 ou Th17 qui produisent des cytokines bien définies et exercent des fonctions différentes. Les Th1 produisent de l interféron-! et contribuent à l élimination des virus tandis que les Th2 synthétisent de l interleukine (IL)-4, de l IL-5 et de l IL-13 et contribuent à l éradication des parasites. Les Th17 produisent de l IL-17 et participent à la clairance des pathogènes. Les Th régulateurs (Teg), quant à eux, limitent la réponse immunitaire. Non seulement ces LT expriment des récepteurs pour des cytokines différentes qui induisent des voies de signalisation en aval qui sont donc différentes, mais aussi la signalisation en aval du récepteur T pour l antigène (TCR) n est pas identique dans les différents types de LT effecteurs. Voir également dans ce numéro le débat entre Alain Trautmann (page 781) et L. Pelletier et M. Moreau (GDRE 731) (page 783). Photo ci-dessus : lymphocytes Th2 exprimant des canaux Cav1.2 (encadré) pouvant causer un asthme expérimental marqué par des infiltrats pulmonaires d éosinophiles (flèches) ( Lucette Pelletier). La signalisation calcique dans les lymphocytes T Virginie Robert 1, Emily Triffaux 1, Magali Savignac 1,2, Lucette Pelletier 1,2 La signalisation calcique dans les LT 1 Inserm U1043, centre de physiopathologie de Toulouse Purpan, place du Docteur Baylac, BP 3028, Toulouse Cedex 3 ; CNRS U5282, université de Toulouse Paul Sabatier, Toulouse 31300, France ; 2 GDR 2688, calcium et régulation des gènes dans les conditions normales et pathologiques, France. [email protected] [email protected] Le Ca 2+ est un second messager qui contrôle la plupart des processus biologiques. La concentration de Ca 2+ dans le cytosol ([Ca] i ) est étroitement régulée dans les LT, que ce soit en condition basale (environ 50 nm) ou après activation du TCR (jusqu à 1 µm). Le réticulum endoplasmique (RE) contient la majorité des stocks de Ca 2+ intracellulaire et la concentration calcique y est d environ 400 µm [1], tandis que les mitochondries tamponnent le Ca 2+ cytosolique 1. L augmentation de la [Ca] i peut être induite par la libération des stocks de Ca 2+ du RE et/ou une entrée de Ca 2+ extracellulaire via des canaux calciques. Certains canaux calciques exprimés à la membrane plasmique sont activés par la déplétion des stocks intracellulaires de Ca 2+, tels que les canaux ORAI [31]. D autres sont activés en réponse à la dépolarisation de la membrane (canaux Ca v ). L activation du TCR induit le recrutement et l activation de tyrosine kinases (TK) permettant la formation d une plateforme de signalisation et l activation de voies de signalisation en aval [2, 3] (Figure 1). Parmi elles, la phospholipase C! (PLC!) est activée, générant de l inositol 1,4,5-triphosphate (IP3) et du diacylglycérol (DAG). L IP3 se fixe à ses récepteurs (RIP3) induisant la libération des stocks de Ca 2+ du RE dans le cytosol. La diminution de concentration de Ca 2+ dans le RE induit un changement conformationnel de STIM1 (stromal interaction molecule) - un senseur du Ca 2+ du RE -, son oligomérisation et sa migration au voisinage de la membrane plasmique. STIM1 va alors activer les canaux ORAI1 [31]. L augmention de la [Ca] i peut activer les calmoduline kinases et 1!On désigne ainsi le fait que la [Ca 2+ ] peut s élever au sein de la mitochondrie lors de la vidange du RE et que les mitochondries apposées au RE peuvent modifier le degré de l influx de Ca 2+ lors de la stimulation par un agoniste. PERSPECTIVE / HORIZONS REPÈRES m/s n 8-9, vol. 28, août-septembre 2012 DOI : /medsci/

159 CPA CMH Autres canaux Ca : Ca v? LT TCR PLC PIP 2 TK : src, ZAP70 Ras MAPK PI3K PKC DAG RIP3 NF B IL-2, etc. AP-1 NFAT NFAT Noyau NFAT-P Figure 1. Signalisation calcique dans les lymphocytes T. La reconnaissance du peptide antigénique en association avec les molécules du complexe majeur d histocompatibilité (CMH) à la surface de la cellule présentatrice d antigène (CPA) par le récepteur T pour l antigène (TCR) active les tyrosine kinases (TK) des familles src et syk (spleen tyrosine kinase) qui phosphorylent des enzymes incluant les MAP kinases, la phospholipase C! (PLC!). Cette dernière clive le PIP2 en IP3 et diacylglycérol (DAG). L IP3 se fixe sur ses récepteurs RIP3 à la membrane du RE ce qui libère les stocks de Ca 2+ du RE dans le cytosol. La déplétion est perçue par STIM qui s oligomérise et vient en apposition avec les canaux ORAI ce qui permet un influx de Ca 2+ du milieu extracellulaire dans le cytosol. D autres canaux calciques comme les canaux Ca v 1 pourraient contribuer à cet influx. L augmentation de [Ca]i active des calmoduline kinases et la calcineurine, une phosphatase qui déphosphoryle le facteur de transcription NFAT, permettant sa translocation nucléaire et l activation des gènes cibles. PKC" : protéine kinase C " ; AP-1 : activator protein-1. la calcineurine, une phosphatase dépendante du Ca 2+ qui déphosphoryle les facteurs de transcription NFAT (nuclear factor of activated T cells) permettant leur translocation nucléaire. Ces facteurs de transcription se fixent alors à leurs sites de liaison sur l ADN au niveau des promoteurs des gènes cibles. Le plus souvent, NFAT agit en coopération avec d autres facteurs de transcription pour déclencher la transcription de gènes définis selon la sous-population de LT. Il est maintenant classiquement admis que l activation de NFAT dépend d une entrée de Ca 2+ via les canaux ORAI dans les LT. Toutefois, ce schéma de la régulation de la [Ca]i ne tient compte ni de l existence d autres canaux calciques, ni des différences de régulation de la [Ca] i dans les populations de LT. Ainsi, la [Ca] i est plus basse au repos dans les Th1 que dans les Th2 mais après activation, l augmentation de [Ca] i est plus faible dans les Th2 que dans les Th1 [4]. Dans le même sens, Fanger et al. [5] ont montré que la clairance du Ca 2+ cytosolique est diminuée dans les Th2 par comparaison avec des Th1. Weber et al. [6] montrent que le pic initial de réponse calcique à la suite de l engagement du TCR est le même dans les Th1, Th2 et les Th17, IP3 RE Ik B / NF B Ca 2+ STIM1 Ca 2+ ORAI Ca 2+ Calmoduline Calcineurine mais la décroissance est plus rapide dans les Th2 que dans les Th1 avec des valeurs intermédiaires dans les Th17 (Figure 2). Il serait intéressant d explorer de façon plus systématique la réponse calcique dans les Th1, Th2 et Th17, en fonction de la façon dont ils ont été obtenus. En effet, les conséquences de ces différences de signaux calciques dans les populations de Th en termes de singularité de réponses biologiques ne sont pas non plus connues. Toutefois, ces données montrent que la régulation de la [Ca] i dépend du type de LT, ce qui pourrait s expliquer par des différences dans les voies de signalisation associées au TCR, et/ou à un équipement différentiel en canaux, pompes calciques ou autres canaux ioniques (cationiques non spécifiques, potassiques). Les canaux calciques dans les compartiments intracellulaires Récepteurs IP3, Ca 2+ blips et Ca 2+ puffs Les RIP3 sont exprimés dans la plupart des cellules animales et sont un lien essentiel entre de nombreux récepteurs à la membrane plasmique qui stimulent la PLC et la libération de stocks intracellulaires de Ca 2+ [7-9]. Chez les mammifères, les trois types de RIP3 sont structurellement proches et s assemblent en homo ou hétérotétramères pour former des canaux calciques intracellulaires. Le rôle majeur du RIP3 est lié à sa localisation dans la membrane du RE, où il permet le passage de Ca 2+ du RE dans le cytosol. Les RIP3 ont une sélectivité plutôt faible pour le Ca 2+ par rapport à d autres cations. Ce manque de sélectivité pourrait faciliter une libération rapide de Ca 2+ du RE dans le cytosol en échange du passage de K + dans la direction opposée, ce qui maintiendrait le flux électrogénique de Ca 2+ [10]. Chaque RIP3 pourrait permettre le passage de à ions Ca 2+ pendant son temps d ouverture d environ 10 ms [11]. Tous les RIP3 sont régulés à la fois par l IP3 et le Ca 2+. Ceci permet d enclencher et propager des signaux calciques intracellulaires. Les libérations élémentaires de Ca 2+ provoquées par l IP3 dans les cellules sont le fait d un très petit nombre de RIP3 actifs et de leurs interactions, qui dépendent du Ca 2+. Le Ca 2+ qui diffuse d un RIP3 actif favorise l ouverture des récepteurs voisins. Ce phénomène est appelé CICR (calcium-induced calcium release) et permet au signal calcique dû à l ouverture d un seul RIP3 (Ca 2+ blip, que l on pourrait traduire par un spot de 774 m/s n 8-9, vol. 28, août-septembre 2012

160 Ratio 340/380 nm [Ca 2+ ]i Th1 Th17 Th Temps (min) Figure 2. Analyse de la réponse calcique dans des lymphocytes Th1, Th2 et Th17. Des LT spécifiques d un peptide de l hémoglobine ont été différenciés en Th1, Th2 et Th17, chargés avec la sonde fluorescente sensible au Ca 2+ Fura-2 AM [6]. Les cellules ont ensuite été stimulées avec des cellules présentatrices de l antigène préincubées avec l hémoglobine. Les cellules sont excitées aux longueurs d onde 340 et 380 nm, et l émission est mesurée à la longueur d onde 510 nm. Le rapport de fluorescence obtenu en excitant à 340 nm et 380 nm est un indicateur de la concentration de Ca 2+ intracellulaire. Les courbes présentées ne sont pas les courbes réelles, mais s inspirent de celles publiées dans l article de Weber et al. [6]. calcium) de croître en provoquant l ouverture cordonnée de plusieurs RIP3 au sein d un cluster. Cette majoration localisée de la libération de calcium, qui s amplifie au fur et à mesure de l augmentation de la concentration d IP3, génère des «bouffées de calcium» (Ca 2+ puffs), et peut même atteindre un seuil suffisant pour envahir la cellule entière [8, 12]. Il est à noter que l augmentation de la libération de Ca 2+ générant les puffs n est pas due à une augmentation directe de la quantité de calcium libérée par les RIP3, mais à l augmentation de la fréquence d ouverture de ces canaux [7]. Signaux non calciques contrôlant les RIP3 À côté du Ca 2+ et de l IP3, d autres signaux intracellulaires peuvent réguler l activité des RIP3 comme la fixation de nucléotides (ATP) et la phosphorylation par des kinases [13]. De façon intéressante, des kinases susceptibles de moduler l activité des RIP3, comme la src kinase Fyn, sont activées par la stimulation du TCR et se localisent dans des complexes macromoléculaires contenant le RIP3 de type 1 (RIP3-1) qu elles phosphorylent. L aggrégation du RIP3-1 au site d activation du TCR est due à un mouvement propre du canal vers la plateforme de signalisation associée au TCR [13]. La phosphorylation du RIP3-1 par Fyn augmente son affinité pour l IP3 d un facteur 5 et l ouverture des canaux, même à des concentrations de Ca 2+ normalement inhibitrices. Ainsi, les récepteurs RIP3-1 continueraient à relâcher du Ca 2+ même quand la production d IP3 décline, permettant une entrée continue de Ca 2+ via les canaux ORAI et l activation de NFAT [13]. STIM et ORAI : le couplage entre le RE et la membrane plasmique STIM1 est une protéine liant le calcium qui couple la déplétion des stocks calciques du RE à un influx de Ca 2+ à partir du milieu extracellulaire via les canaux ORAI [14-16]. Ces canaux ont une sélectivité élevée pour le Ca 2+ mais une conductance unitaire faible (passage d environ 10 4 ions Ca 2+ par canal et par seconde à un potentiel de membrane de ~ 100 mv) [17]. La déplétion des stocks de Ca 2+ du RE libère le Ca 2+ de STIM. Il s ensuit l oligomérisation de STIM1 et sa migration vers des zones proches de la membrane plasmique où il interagit avec ORAI, permettant l ouverture du canal (Figure 1). STIM et ORAI sont surtout localisés à proximité de la synapse immunologique, une zone de contact entre le LT et la cellule présentatrice de l antigène qui est enrichie en molécules de signalisation [18]. L importance d ORAI est confirmée par l observation d une immunodéficience sévère chez l homme lorsqu existent des mutations spontanées dans le gène codant pour ORAI1 [15, 31]. Les souris invalidées pour les gènes codant ORAI ou STIM donnent des résultats déconcertants [17]. Ainsi, les souris invalidées à la fois pour STIM1 et STIM2 présentent une maladie auto-immune et inflammatoire sévère suggérant que l absence de ces molécules a un impact profond sur les LT régulateurs qui contrôlent la réponse immunitaire, et moindre sur les autres populations de LT. Les canaux Ca v 1 : des canaux à part entière dans les LT? Structure et régulation des canaux Ca v 1 Les canaux Ca v 1 sont caractéristiques des cellules excitables neurones, cellules cardiaques - où ils sont activés par de fortes dépolarisations de la membrane [19]. Ils sont formés par une sous-unité!1 qui constitue le pore calcique et donne au canal ses caractéristiques biophysiques. La séquence en acides aminés est organisée en quatre domaines répétés (de I à IV), chacun contenant six segments transmembranaires (de S1 à S6) et une boucle extracellulaire entre les segments transmembranaires S5 et S6 de chaque domaine. Les segments S4 de chaque domaine servent de senseurs du voltage, et induisent un changement de conformation en cas de dépolarisation, ce qui ouvre le pore. Le segment S6 comporte les sites de fixation aux molécules antagonistes des canaux Ca v 1 comme les dihydropyridines (DHP) couramment utilisées dans le traitement de l hypertension artérielle. La sous-unité!1 transmembranaire PERSPECTIVE / HORIZONS REPÈRES m/s n 8-9, vol. 28, août-septembre

161 CPA STIM Ca 2+ [Ca] RE RIP3 [Ca]i De base Survie TCR Ca v 1.4 LT 2+ TCR Ca 2+ Ca 2+ ORAI Ca v 1.4 Ca Ca 2+ IP3 RIP3 STIM Ca 2+ [Ca] RE IP3 RIP3 [Ca]i Ca 2+ LT src kinase, X, etc. Après activation par l'antigène Activation, production de cytokines, etc. Figure 3. Rôle des canaux Cav1.4 dans les lymphocytes T. D après les travaux des groupes de Flavell et Jefferies, les canaux Ca v 1.4 seraient nécessaires à la survie des LT et leur activation. De base, la stimulation du TCR a minima, probablement due à l interaction de molécules du complexe majeur d histocompatibilité (CMH) associées avec des peptides du soi, serait responsable d une entrée de calcium par des canaux Ca v 1.4 suffisante pour permettre la survie des LT. Ces canaux Ca v 1.4 se trouveraient au sein de complexes de signalisation déjà existants dans les LT avant toute activation. Ces complexes contiendraient une kinase src et d autres protéines (X) qui ne sont pas toutes encore identifiées. Lors de la reconnaissance du peptide antigénique spécifique, la stimulation du TCR entraînerait la production d IP3 qui, en se fixant sur les RIP3 à la membrane du réticulum endoplasmique (RE), causerait une sortie du Ca 2+ du RE vers le cytosol. Cette baisse de concentration de Ca 2+ dans le RE ([Ca] RE ) serait perçue par STIM avec pour conséquence une entrée de Ca 2+ du milieu extracellulaire dans le cytosol. Les canaux Ca v 1.4 contribueraient en partie à la réponse calcique en assurant une [Ca] RE correcte. Néanmoins, leur rôle exact reste à définir. La conséquence de l activation permettra au LT de produire des cytokines et d exercer ses fonctions. CPA est associée avec les sous-unités!2#, " et possiblement$ %. Quatre gènes codent pour les sous-unités!1 des canaux (de Ca v 1.1 à Ca v 1.4) dont l expression est relativement spécifique de tissus. La diversité des canaux calciques est encore augmentée par le fait que quatre gènes codent pour les sous-unités " [19] qui modulent les propriétés du canal. Les canaux Ca v 1 se répartiraient entre plusieurs états qualifiés de mode 0 (inactivables même après de fortes dépolarisations de la membrane dans des gammes physiologiques), mode 1 (probabilité faible d ouverture et temps d ouverture bref après dépolarisation de la membrane) et mode 2 (probabilité d ouverture plus élevée et temps d ouverture plus long). Par exemple, la protéine kinase A activée par la stimulation "-adrénergique augmenterait le courant calcique passant par les canaux Ca v 1.2 en modifiant la répartition des canaux en faveur des modes 1 et 2 [19]. src kinase, X1, X2, etc. Arguments en faveur d un rôle des canaux Ca v 1 dans la fonction des lymphocytes T et questions en suspens Plusieurs groupes ont montré que des inhibiteurs pharmacologiques comme les DHP, considérés comme spécifiques des canaux Ca v 1, diminuaient les fonctions biologiques de LT naïfs Th ou cytotoxiques (définis par l expression du marqueur de surface CD8 + ) in vitro [20-22]. Mais les drogues comme les DHP utilisées à des doses relativement élevées (> 1 µm) pourraient agir sur des canaux potassiques, ce qui expliquerait cet effet [23]. Des transcrits des sous-unités!1 des canaux Ca v 1 sont détectés dans les LT CD4 + et CD8 + humains et de souris. Parfois, certains auteurs ont rapporté des formes tronquées expliquant, de ce fait, l absence de sensibilité au potentiel des canaux dans les LT [21, 22]. Cependant, ces auteurs n ont pas démontré le rôle fonctionnel de ces canaux tronqués, et la relation structure fonction reste à déterminer [21, 22]. Ces dernières années, l étude de la réponse immunitaire de souris mutées spontanément dans le gène codant pour la sous-unité "4 [24], de souris "3 knockout [25] et, plus récemment, de souris invalidées pour la sous-unité!1 de Ca v 1.4 [26] plaident pour un rôle des canaux Ca v 1 dans les LT CD4 + et CD8 +, même si leur mode de fonctionnement n est pas compris. Le travail le plus abouti, celui de Flavell et al. [25], montre que la perte d expression de la sous-unité "3 cause la perte d expression de Ca v 1.4, prédominant dans les LT CD8 + qui n ont jamais été activés. Ceci est associé à un défaut de survie des cellules (Figure 3) probablement en raison d une trop forte expression de la molécule proapoptotique Fas. L augmentation de [Ca] i qui suit l activation du TCR est réduite dans les LT CD8 + "3 -/-. Le fait que la réponse calcique en réponse à l ionomycine soit inchangée dans 776 m/s n 8-9, vol. 28, août-septembre 2012

162 A [Ca 2+ ]i (nm) Sens AS 400 B Th2 spécifiques d'ova Ca v 1AS ou sens IL-4 (ng/ml) 2 1,5 1 0,5 0 OVA intranasal 7 j les LT!3 -/- suggère que les canaux Ca v 1 ne sont pas impliqués dans l entrée capacitative de calcium (associée à la déplétion des stocks intracytoplasmiques de Ca 2+ ). La translocation nucléaire de NFAT est diminuée et surtout l expression de la protéine NFATc1 est très réduite dans les LT CD8 + naïfs qui n expriment pas la sous-unité!3. Les auteurs démontrent que Ca v 1.4 est associé à la sous-unité!3 avec des partenaires de signalisation comme Lck (lymphocyte-specific protein tyrosine kinase) et Vav dans des complexes préformés avant même l engagement du TCR. Selon ces auteurs, l interaction entre le TCR et les molécules du CMH qui présentent des peptides du soi induit une signalisation calcique basale dépendant de Ca v 1.4 et responsable de la survie (Figure 3). Ce qui se passe lors de l activation et du passage d expression de Ca v 1.4 à Ca v 1.1, la forme présente dans les LT activés [27], n est pas explicité. Omilusik et al. [26] vont dans le même sens que Flavell et al. [25] mais explicitent des différences en ce qui concerne l interaction entre entrée capacitative et canaux Ca v 1.4. Omilusik et al. [26] montrent un défaut de survie des LT CD8 + chez des souris invalidées pour Ca v 1.4. Ces auteurs détectent des courants calciques après dépolarisation de la membrane dans des LT préstimulés par le TCR, attestant la présence de canaux Ca v 1 à la membrane dans des LT activés. Ces courants sont absents dans les LT de souris Ca v 1.4 -/-. Ca V 1.4 semble requis pour l augmentation de la [Ca] i après stimulation par le TCR ou la vidange des stocks calciques intracellulaires, C Nombre de cellules (x 10 5 ) LTh2 transfectés avec : Ca v 1AS Total Eos Monos Lymphos Neutros Ca v 1 sens Figure 4. La perte d expression des canaux Cav1 dans les Th2 abolit leurs fonctions et leur capacité à induire un asthme expérimental. A. Des lymphocytes T transgéniques pour un récepteur T (TCR) spécifique d un peptide de l ovalbumine (OVA) (souris DO11.10) ont été différenciés en Th2 et transfectés avec des oligonucléotides (ON) anti-sens (AS) spécifiques des canaux Cav1 (Ca v 1AS) ou des ON contrôles (sens). La transfection avec les Ca v 1AS réduit de 50 à 70 % l expression des canaux Ca v 1 (non montré). Ces LT ont été stimulés par un anticorps anti-tcr et nous avons analysé la [Ca] i et la production d interleukine (IL)-4, spécifique des Th2. La transfection avec Ca v 1AS réduit à la fois l augmentation de [Ca] i et la production d IL-4 après stimulation du TCR. B. Nous avons injecté ces Th2 transfectés avec Ca v 1AS ou les ON contrôles (sens) chez des souris BALB/c à qui nous avons fait respirer de l OVA. C. Nous avons collecté les liquides de lavage bronchoalvéolaire pour analyser l inflammation pulmonaire caractéristique de l asthme allergique. Le nombre total de cellules inflammatoires, d éosinophiles (Eos) et de monocytes (Mono) est significativement (*) réduit chez les souris injectées avec les Th2 transfectés avec Ca v 1AS par comparaison avec les souris injectées avec les Th2 contrôles (Ca v 1 sens). Lymphos : lymphocytes ; Neutros : polynucléaires neutrophiles. particulièrement dans les LT CD4 + naïfs et quasiment pas dans les LT CD4 + mémoires. L ouverture des canaux Ca V 1.4 dépendrait dans les LT de la signalisation via le TCR et servirait à remplir les stocks intracellulaires de Ca 2+ dans les LT naïfs et en cours de différenciation. La réponse calcique est aussi très diminuée dans les LT CD4 + mémoires de souris Ca v 1.4 -/- stimulés via le TCR, posant le problème de la part respective des canaux Ca v 1.4 et d ORAI. Les canaux Ca v 1 : marqueurs de LT effecteurs Notre groupe a montré que les canaux Ca v 1.2 et Ca v 1.3 sont sélectivement induits dans les Th2 différenciés (qui sécrètent de l IL-4), et disparaissent dans les Th1 producteurs d IFN-" [28, 29]. Les ARNm et les protéines de ces canaux sont détectables dans les Th2. La transfection des Th2 avec des oligodéoxynucléotides anti-sens (Ca v 1AS) spécifiques des canaux Ca v 1.2 et/ ou Ca v 1.3, entraîne la perte d expression de ces sousunités et une forte diminution de l augmentation de [Ca 2+ ] i et de la production de cytokines par les Th2 suite à l engagement du TCR (Figure 4), tout en n ayant aucun PERSPECTIVE / HORIZONS REPÈRES m/s n 8-9, vol. 28, août-septembre

163 effet sur les Th1. Les Th2 transfectés avec les Ca v 1AS perdent leur capacité à induire un asthme dans des expériences de transfert adoptif [29] (Figure 4). Des Th1 spécifiques de l ovalbumine, transfectés ou non avec les Ca v 1AS, induisent la même inflammation pulmonaire quand ils sont transférés chez des souris exposées à l ovalbumine par voie aérienne [29]. Enfin, l inhalation de Ca v 1AS prévient un asthme expérimental, indiquant que ces canaux pourraient représenter une nouvelle cible intéressante dans les maladies allergiques. L absence de sensibilité au voltage des canaux Ca v 1 dans les Th2 pourrait s expliquer par une régulation différente de celle classiquement établie dans les cellules excitables. Connexions entre canaux ORAI et canaux Ca v 1 dans les LT? Des travaux récents montrent une régulation coordonnée des canaux Ca v 1 et ORAI via STIM1 [30]. La déplétion des stocks intracellulaires de Ca 2+ qui induit la localisation de STIM1 juste sous la membrane plasmique permettrait l interaction du même domaine de STIM avec ORAI et Ca v 1.2. En conséquence, l activation d ORAI par STIM1 diminuerait l influx de Ca 2+ par les canaux Ca v 1.2. Ceci aurait des conséquences biologiques puisque l influx de Ca 2+ via les canaux Ca v 1.2 et ORAI n active pas les mêmes voies. Il sera important dans le futur de comprendre la dynamique d ouverture des canaux Ca v 1 et ORAI dans les cellules excitables et non excitables, y compris dans les LT. Il faudra comprendre pourquoi certains types de LT expriment des canaux Ca v 1, et l impact possible sur le programme génétique associé à leurs fonctions particulières. Il est possible que les flux de Ca 2+ via les canaux Ca v 1 induisent une signature calcique particulière, essentielle pour le remodelage de la chromatine au niveau des gènes codant pour les cytokines produites par les Th2 par exemple (un processus régulé par le Ca 2+ ). Il est concevable de pouvoir inhiber un maillon contrôlant sélectivement la signalisation calcique dans une population de LT responsable d un certain type de pathologie, ce qui permettrait de traiter des désordres immunologiques sans induire d immunosuppression globale. SUMMARY Calcium signaling in T lymphocytes Calcium signaling is essential for all the functions of T lymphocytes, including those of Th2 cells. Th2 lymphocytes producing interleukins 4, 5 and 13 orchestrate allergic diseases including asthma. T-cell activation induces an influx of Ca 2+ from the external medium through ORAI calcium channels although other calcium channels are likely to be involved. Among them, voltage-gated calcium (Ca v 1) channels have been reported in some T-cell subsets including Th2 cells. The inhibition of Ca v 1 channels abrogates T-cell receptor-driven calcium influx and interleukin production by Th2 cells. From a therapeutic point of view, the inhibition of Ca v 1 channels prevents Th2-dependent experimental allergic asthma. In this review, we will discuss the singularities of calcium responses depending upon the T-cell subset and its state of activation. LIENS D INTÉRÊT Les auteurs déclarent n avoir aucun lien d intérêt concernant les données publiées dans cet article. REMERCIEMENTS Ce travail a pu être réalisé grâce au financemement donné par l association 111 des Arts et par la Société française d allergologie (SFA). Virginie Robert est financée par une allocation du Ministère (MENRT) et Emily Triffaux par un projet de «Recherche clinique translationnelle» (Inserm-DGOS). RÉFÉRENCES 1. Brandman O, Liou J, Park WS, Meyer T. 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165 Biochimie 93 (2011) 2087e2094 Contents lists available at ScienceDirect Biochimie journal homepage: www. elsevier. com/ locate/ biochi Mini-review Calcium signalling in T-lymphocytes V. Robert a,b, E. Triffaux a,b, M. Savignac a,b,c, L. Pelletier a,b,c, * a INSERM, U1043, Centre de Physiopathologie de Toulouse Purpan, France b CNRS, U5282, Université de Toulouse, Paul Sabatier, Toulouse F-31300, France c GDR 2688 Calcium et régulation des gènes dans les conditions normales et pathologiques, France a r t i c l e i n f o abstract Article history: Received 26 April 2011 Accepted 14 June 2011 Available online 21 June 2011 Keywords: Calcium Lymphocytes IP-3 receptors Ryanodine receptors ORAI channels Ca v channels Calcium signalling is essential for most of the biological T-cell activities, including in Th2 lymphocytes, a T-cell subset that produce interleukin 4, 5 and 13 and which is involved in allergic diseases. T-cell receptor engagement induces the production of inositol trisphosphate that binds to its receptor, releasing intracellular Ca 2þ stores. STIM in the endo (sarco) plasmic reticulum (ER/SR) is a Ca 2þ sensor that perceives the depletion of intracellular Ca 2þ stores, localizes near the cell membrane and allows the activation of ORAI, the main calcium channels at the cell membrane. However, other calcium channels at the membrane of intracellular compartments and at the cell membrane can also contribute to the TCRdriven intracellular Ca 2þ rise. Among them, voltage-dependent calcium (Ca v 1) channels have been reported in several types of T-lymphocytes, although how they are gated in these non-excitable cells remains unsolved. We have shown that Cav1 channel expression was selectively up regulated in Th2 lymphocytes. In this review, we will discuss about the diversity of the Ca 2þ channels responsible for Ca 2þ homeostasis in the different cell subsets and the interactions between these molecules, which can account for the variety of the calcium responses depending upon the functions of effector T-cells. Ó 2011 Elsevier Masson SAS. All rights reserved. 1. General features of calcium signalling Calcium is a versatile, universal second messenger controlling numerous biological processes in all the cells. The intracellular calcium concentration in the cytosol ([Ca] i ) is tightly regulated in baseline conditions and even after activation increasing from 50 nm to around 1 mm upon stimulation through the T-cell receptor (TCR) in T-lymphocytes for example. Organelles such as endoplasmic or sarcoplasmic reticulum (ER/SR) constitute intracellular calcium stores with a Ca 2þ concentration estimated to be approximately 400 mm (300e500 mm values from the literature: discussed in [1]); and mitochondria buffer cytosolic calcium. Calcium influx and efflux modulate the [Ca] i. A release of ER/SR Ca 2þ stores and/or the entry of Ca 2þ through calcium channels at the cell membrane Abbreviations: CRAC channels, Calcium release activated Ca 2þ ; cadpr, Cyclic adenosine diphosphate ribose; IP3, Inositol 1,4,5-trisphosphate; IL, Interleukin; [Ca] i, Intracellular calcium concentration; ER, Endoplasmic reticulum; NAADP, Nicotinic acid adenine dinucleotide phosphate; SR, Sarcoplasmic reticulum; RyR, Ryanodine receptors; STIM, Stromal interaction molecule; SOCC, Store-operated calcium channels; SOCE, Store-operated calcium entry; Ca v 1, Voltage-dependent calcium channels; TCR, T-cell receptor. * Corresponding author. INSERM U1043 e CHU Purpan e BP 3028, Toulouse Cedex 3, France. Tel.: þ ; fax: þ address: [email protected] (L. Pelletier). from the external medium where the Ca 2þ concentration is 1e2 mm, increase intracellular Ca 2þ concentration. The calcium pump PMCA or calcium exchangers at the plasma membrane extrude Ca 2þ from the cytosol to the external medium while the SERCA pump in the ER/SR membrane allows Ca 2þ to go back in the ER/SR. Calcium channels expressed at the cell membrane encompass various calcium channels that can be activated by depletion of intracellular calcium stores (store-operated calcium channels SOCC, responsible for a store-operated calcium entry: SOCE), by cell membrane depolarization (voltage-operated calcium channels: Ca v channels), by activation of receptors (receptor operated calcium channels), by ionotropic receptors such as NMDA receptors, or by second messenger operated calcium channels (Fig. 1). The increase in [Ca] i may activate the calcium-calmodulin kinase pathways, and calcineurin, a Ca 2þ -dependent phosphatase that dephosphorylates the four members of nuclear factor of activated T-cells (NFAT) family, allowing their nuclear localization. These transcription factors can then bind to DNA binding site in the promoter of target genes. Most often NFAT is associated with other transcription factors for initiating the transcription of defined genes in T-cell subsets. NFAT regulates numerous genes responsible for synaptic plasticity, axonal growth and neuronal survival, and is also essential for T-cell development and T-cell effector functions. NFAT activation depends on an entry of Ca 2þ through voltage-operated calcium channels (Ca v 1 alias L-type calcium channels) in neurons and /$ e see front matter Ó 2011 Elsevier Masson SAS. All rights reserved. doi: /j.biochi

166 2088 V. Robert et al. / Biochimie 93 (2011) 2087e2094 Fig. 1. Some of the molecules regulating the intracellular Ca 2þ concentration. This figure does not take into account the cell type. AA: arachidonic acid; DAG: diacylglycerol; Cam: calmodulin; CamK: calmodulin kinases; Cn: calcineurin; CRAC: calcium release activated calcium (channels); ER/SR: endo (sarco)plasmic reticulum; NCX: Na þ /Ca 2þ exchanger; NFAT: nuclear factor of activated T-cells; NMDAR: NMDA receptors; PMCA: plasma cell Ca 2þ -ATPase; ROCC: receptor operated Ca 2þ channels; SERCA: sarco/endoplasmic reticulum Ca 2þ -ATPase; SMOCC: second messenger operated Ca 2þ channels; SOCC: receptor operated Ca 2þ channels; VOCC: voltage-operated Ca 2þ channels; SR: sarcoplasmic reticulum. through SOCC in T-lymphocytes. However SOCC are also present in excitable cells and an increasing line of evidence shows that Ca v 1 channels are also present in T-lymphocytes or at least in some T-cell subsets. Therefore we will focus on SOCC and Ca v 1 channels and their respective role in calcium signalling, especially in T-lymphocytes. 2. T-cell subsets The activation through the TCR induces the recruitment and activation of tyrosine kinases allowing the formation of a signalling platform and the activation of downstream signalling pathways, finally resulting in activation of a genetic program allowing cell proliferation, cytokine production (reviewed in [2,3,4]). Among these pathways, phospholipase C gamma is activated, cleaves the phosphatidylinositol bisphosphate in inositol trisphosphate (IP3) and diacylglycerol (Fig. 2). IP3 binds to IP3 receptors expressed at the membrane of the endoplasmic reticulum (ER/SR) leading to the release of ER/SR Ca 2þ stores, which induces a conformational change of STIM1, an ER/SR Ca 2þ sensor, and finally activates Orai1 channels defined as the main SOCC in T-lymphocytes. However this scheme accounts neither for the involvement of other calcium channels nor for differences in the [Ca] i regulation between T-cell subsets. T-cells are not a homogeneous cell population. After encountering the antigen presenting cell loaded with the appropriate peptide, naïve T helper (Th) cells may differentiate into Th1, Th2 and Th17 that produce defined sets of cytokines, exert different functions, and express both common and lineage specific transcription factors. Thus, Th1 cells produce interferon-g and contribute to the elimination of viruses while Th2-cells synthesize interleukin (IL)-4, IL-5 and IL-13 and contribute to parasite eradication. Th17 produce IL-17 and are implicated in the clearance of pathogens. The regulation of [Ca] i is different in resting conditions and following stimulation through the TCR in these populations. Thus, the concentration in [Ca] i in resting conditions is higher in Th2-cells than in Th1 cells and intermediate in Th17 cells [5]. Conversely, the rise of [Ca] i elicited by TCR engagement is lower in Th2-cells compared to Th1 or Th17 lymphocytes. These data suggest that the regulation of [Ca] i depends upon the T-cell type; this could result from differences in TCR-driven signalling pathways and in the equipment of channels, Ca 2þ pumps. In line with this, Fanger et al. [6] showed defective capacities of Th2-cells to extrude Ca 2þ from the cytosol and our group showed selective up-regulation of Ca v 1 channels in Th2 lymphocytes, which could contribute to the singularities of Ca 2þ signals in Th2 lymphocytes [7]. 3. Calcium channels in the intracellular compartments 3.1. IP3 receptors TCR activation induces the recruitment of kinases, a series of tyrosine phosphorylation events coupling the TCR to downstream signalling pathways. Among them, phospholipase C g is activated and hydrolyzes phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate to generate inositol 1,4,5-trisphosphate (IP3) and diacylglycerol. IP3 binds to the calcium channel-receptors IP3R mainly located in the membrane of the ER/SR. Three genes code IP3R (IP3R1-3) in mammalian cells. The channel functions as tetramers (homo or hetero-tetramers), which generates diversity. Splice variants also contribute to this diversity although the biological consequences of this diversity are ill understood. The sequence of the IP3R consists in an N-terminal part, containing a suppressor domain and the IP3 binding domain, a large region, which can interact with regulatory components and a C-terminal region containing the 6 transmembrane domains. The main regulators of IP3Rs are IP3 and Ca 2þ. Cytosolic Ca 2þ is an essential regulator of IP3R with a biphasic effect on IP3R activity: Ca 2þ rapidly stimulates and more slowly inhibits IP3Rs. It is assumed that IP3 binding does not itself gate the IP3R but tunes it to respond to Ca 2þ. As discussed by Taylor et al. [8],

167 V. Robert et al. / Biochimie 93 (2011) 2087e Fig. 2. Ca 2þ signalling in T-lymphocytes. The recognition of the antigenic peptide presented by major histocompatibility complex (MHC) molecules at the surface of the antigen presenting cell (APC) by the T-cell receptor (TCR) activates tyrosine kinases (TK) of the src and syk family that phosphorylates adapters and enzymes including MAP Kinase, phospholipase C (PLCg). The latter cleaves the PIP2 into IP3 and diacylglycerol (DAG). IP3 binds to IP3 receptors (IP3R) at the membrane of the ER/SR which releases ER/SR Ca 2þ stores. This depletion is sensed by STIM allowing its oligomerization and its translocation at the ER/SR plasma cell membrane junction. STIM can then interact with the plasma membrane ORAI channels which allows an entry of Ca 2þ from the external medium. Other channels including TRP channels, purinergic receptors, NMDA receptors (NMDAR) and Ca v 1 channels could contribute to the Ca 2þ influx. The resulting increase in the intracellular Ca 2þ concentration activates the calmodulin-calcineurin pathway. Dephosphorylation of the transcription factor NFAT induces its nuclear translocation and the activation of the target genes. IP3 would trigger a hierarchical recruitment of elementary Ca 2þ release events in many cell types, probably because of the impact of Ca 2þ diffusing on neighbouring IP3R and of the clustering of these receptors during activation. This could result in either localized Ca 2þ concentration changes (Ca 2þ puffs) or in spreading the Ca 2þ signal throughout the cell. Weak stimulation of cell-surface receptors would induce random opening of single IP3Rs generating the smallest Ca 2þ release event, lasting no more than 130 ms and increasing the [Ca 2þ ] i by no more than 40 nm. Increasing the stimulus intensity, and so the intracellular concentration of IP3, would increase the local Ca 2þ concentration and its duration, which would correspond to the synchronous opening of several close IP3Rs. A stronger stimulation would increase IP3 production leading to Ca 2þ -induced Ca 2þ release and propagation of the Ca 2þ signal [9]. IP3Rs are also regulated by many additional intracellular signals including the binding of nucleotides (ATP.) and phosphorylation by many kinases (PKA, PKC, PKG, Akt, Rho kinases, tyrosine kinases.), (reviewed in [10]). Interestingly, kinases susceptible to phosphorylate IP3R and to modulate their activity are activated by TCR stimulation. TCR-drivenactivation triggers the formation of macromolecular complex containing the scaffolding protein LAT (favouring PLCg activation), IP3R1 and the src kinase Fyn, capable to phosphorylate IP3R1. The clustering of the IP3R1 at the site of TCR activation is due to specific movement of the channel (and not of the ER/SR) towards the TCRassociated signalling platform (reviewed [10]). Fyn-mediated phosphorylation of IP3R1 leads to a 5-fold increase in affinity for IP3 and the opening of the channels, even at concentrations of Ca 2þ that are normally inhibitory. IP3R1s would continue to release Ca 2þ even when IP3 production declines supporting continuous SOCCdependent Ca 2þ entry (SOCE) and NFAT activation (reviewed in [10]). Interestingly, naïve mouse T-cells were shown to express together IP3R1, IP3R2, and IP3R3 but their relative expression varies according to their state of activation. Thus, activation through the TCR induces down-regulation of the transcription factor Ets-1, which is likely to be responsible for a loss of the expression of IP3R3 and an inability of TCR stimulation to induce subsequent Ca 2þ response in already activated T-cells. The use of 2- APB as an inhibitor of all the IP3R suggests that these receptors were crucial for the initiation of IL-2 and IFNg production but only early during activation [11]. Therefore, the loss of expression of IP3R3 would limit Ca 2þ signalling. The rise in IP3-evoked [Ca] i for a limited period of time early during T-cell activation would be sufficient to get optimal IL-2 and IFNg production. However, this interpretation has to be considered with caution since 2-APB blocks both IP3R and SOCC Ryanodine receptors Besides Ca 2þ release by IP3, the second messengers, cyclic adenosine diphosphate ribose (cadpr) and nicotinic acid adenine dinucleotide phosphate (NAADP) (the most potent Ca 2þ -releasing agent known) are produced after TCR engagement and seem to be critically involved in the process of Ca 2þ release in T-cells [12,13]. To know whether these messengers directly activate ryanodine receptors (RyR) is a matter of debate. RyR channels form tetramers, which are located in the membrane of the sarcoplasmic reticulum

168 2090 V. Robert et al. / Biochimie 93 (2011) 2087e2094 (SR) and can release SR Ca 2þ into the cytosol. Three isoforms of RyRs have been described (RyR1 to RyR3). RyR1 and RyR2 predominate in skeletal and cardiac muscles respectively. RyR3 is more ubiquitous and it was shown that smooth muscle cells express the three isoforms. cadpr, which can bind to RyR1 and RyR3 that are expressed in T-lymphocytes, may activate Ca 2þ release from ER/SR stores [14,15,16]. It was recently shown that NAADP, known as formed in acidic compartments, binds to twin pore calcium channels, releasing the Ca 2þ stores of these compartments [17]. This mechanism could also promote indirectly the release of ER/SR Ca 2þ stores by a calcium-induced calcium release mechanism. However, it was also shown that NAADP might bind to and activate RyR1 [18] in few seconds upon TCR stimulation. These authors propose that NAADP-evoked ER/SR Ca 2þ release by RyR1 initiates further Ca 2þ release events. Indeed, IP-3 and cadprmediated ER/SR Ca 2þ release occur later on (in the ranges of minutes for IP3 and more than 10 min for cadpr) after activation. Specific blockers of the NAADP-dependent Ca 2þ response induce partial activation of Ca 2þ signalling resulting in impaired IL-2 production emphasizing the importance of these channels in T-cell activation. 4. Calcium channels at the cell membrane 4.1. ORAI channels STIM and ORAI: the ER/SR cell membrane coupling In 2005, STIM1 (stromal interaction molecule 1) was identified as the ER/SR calcium-binding proteins acting as a sensor that couples the ER/SR Ca 2þ depletion to an influx of Ca 2þ through the cell membrane SOCC [19,20,21]. The identification of SOCC in T-lymphocytes remained unknown up to 2006, although electrophysiological studies have characterized the current through these channels (also defined as calcium release activated calcium channels or CRAC channels) [22,23]. They are highly Ca 2þ selective (Ca 2þ > Na þ by a factor > 1000) but had a low unitary conductance (estimated to be w30 fs, which corresponds to w10 4 Ca 2þ ions flowing through the channel per second at a membrane potential of 100 mv). In 2006, genome wide RNAi screening in Drosophilia and the study of patients suffering from severe primary immunodeficiency associated with defective SOCC-mediated Ca 2þ entry pointed out ORAI as the main SOCC operating in T-lymphocytes. The review by Hogan and colleagues [24] outlines the steps leading to the identification of STIM and ORAI in T-cells and provides insight into how they work. The putative Ca 2þ -sensing region of STIM1 contains a predicted EF-hand motif and SAM (sterile alpha motif) domain. EF-hands consist of two short a-helical segments linked through a loop region, the residues of which confer a Ca 2þ binding site [25]. STIM1 has a relatively low affinity for Ca 2þ. Stathopulos et al. reported that STIM1 EFeSAM binds Ca 2þ with an apparent dissociation constant, K d of 0.2e0.6 mm [25], which is compatible with the Ca 2þ concentrations in the ER/SR. Depletion of ER/SR Ca 2þ stores displaces the equilibrium between Ca 2þ -bound and Ca 2þ -free STIM1, which would result in oligomerization of STIM1, short migration by diffusion in the membrane of the ER/SR and the formation of spots or puncta (visible in immunofluorescence by using cells transfected with fluorescent protein-stim1 fusion proteins). Point mutations of STIM in the EF-hand 1 domain, preventing Ca 2þ -binding leads to constitutive puncta formation and CRAC currents, demonstrating that the ER/SR Ca 2þ concentration directly governs CRAC channel activity. The reasons why oligomerization of STIM1 promotes the movements of STIM1 and the formation of puncta are unclear. STIM1 aggregates come in apposition with ORAI channels at the cell membrane but the generation of CRAC currents does not seem to correlate with the size of the puncta. ORAI1 is recruited to ER/SReplasma membrane contacts through engagement of a C-terminal cytosol segment of ORAI1 by STIM1, and a further STIM1-ORAI1 interaction gates the channel. ORAI is dispensable for the recruitment of STIM1 in puncta but STIM is necessary to localize ORAI in the ER/SR-cell membrane junctions. We will not discuss here the stoichiometry of STIM and ORAI channels engaged to form the CRAC channel or the biochemical interactions between STIM and ORAI, which is extensively discussed by Hogan and colleagues (see the review [24]). The use of T-lymphocytes transfected with GFP-ORAI1 and YFP- STIM1 stimulated through the TCR with coated anti-cd3 antibody or with antigen presenting cells loaded with superantigens allowed to show the localization of STIM and ORAI close together in the vicinity of the immunological synapse (the zone of contact between the T-cell and the antigen presenting cell which is associated with an enrichment in signalling molecules) [26,27]. However STIM/ ORAI do not co-localize with proteins phosphorylated on tyrosine and therefore are in distinct zones from those associated with tyrosine kinase activity. The authors also found a proportion of STIM/ORAI at the opposite pole of the cell relative to the immunological synapse. They showed by FRET experiments that STIM and ORAI were less mobile in this zone; they presumed that STIM and ORAI might serve as a reservoir that could be rapidly mobilized when a second antigen presenting cell loaded with the appropriate peptide encounters this T-cell [26,27]. Recent data analyzing the limiting steps linking Ca 2þ influx through ORAI channels to Ca 2þ - dependent gene expression suggest that NFAT exclusion from the nucleus is a slow process which could allow to a relatively sustained Ca 2þ -dependent gene expression even after termination of Ca 2þ transport [28]. However, we have to keep in mind that NFAT remains localized in the nucleus for hours and even days for Th2- cells (personal observation) suggesting that Ca 2þ -dependent gene expression requires a coordinated entry through ORAI channels and possibly other Ca 2þ channels Roles of the different isoforms of STIM and ORAI Two genes encode STIM (STIM1 and STIM2) in mammalian cells. STIM2 is also expressed in T-lymphocytes although it represents around 5% of the STIM content. Its structure looks like STIM1; it is located quasi exclusively in the ER/SR but the roles of STIM1 and STIM2 are not redundant even if over-expression of STIM2 partially restores store-operated Ca 2þ entry in STIM1 / T-cells [29]. STIM translocation at the ER/SR plasma cell membrane interface would be initiated for ER/SR Ca 2þ concentration estimated to be lower for STIM2 than for STIM1 [1,30]. The ER/SR Ca 2þ level at which translocation starts to be triggered is approximately 400 mm for STIM2 and 200 mm for STIM1 [1,31]. Structural studies showed that STIM proteins exist as monomers in the absence of ER/SR Ca 2þ -depletion because the ER luminal portion of STIM suppresses homotypic STIM associations via a stable fold of EF-hand and SAM domains (EFeSAM) in the presence of Ca 2þ in ER/SR [32]. Ca 2þ depletion induces the destabilization of EFeSAM conformation, which results in the oligomerization of STIM proteins. STIM1 EFeSAM would form oligomers more rapidly than STIM2 EFeSAM comforting the notion that STIM1 and STIM2 are distinct regulators of SOCC channels (discussed in [Oh-hora, 2009 #7480]). These differential behaviours of STIM isoforms could account for the specific role of STIM2 in maintaining the basal intracellular Ca 2þ concentration. This could also explain why STIM2 deficiency has low impact on early Ca 2þ entry in activated T-lymphocytes while STIM2 / T-lymphocytes failed to maintain sustained nuclear localization of NFAT and to produce cytokines [29]. Surprisingly double deficient, STIM1 / STIM2 / mice developed an autoimmune inflammatory disease associated with

169 V. Robert et al. / Biochimie 93 (2011) 2087e Fig. 3. Ca v 1 channels. Ca v 1 channels are formed by the a1 subunit, and auxiliary a2-d and intracytoplasmic b subunit. The g subunits are not always present and are not represented here. The a1 subunit forms the Ca 2þ pore and comprizes four domains with a dihydropyridine (DHP) binding site. defective development of natural regulatory T-cells, suggesting that both STIM1 and STIM2 are required for a correct development of this subset [29]. Naïve T-cells express ORAI1, ORAI2 and ORAI3. Naïve ORAI1 / T-cells develop normally and have a defect of SOCE, less pronounced than the one in differentiated T-lymphocytes [33]. Of note, the expression of ORAI2 and ORAI3 is down regulated in activated T-lymphocytes, which could explain why ORAI1 deficiency results in such an impaired SOCE and cytokine production by experienced T-lymphocytes (that have been previously activated and/or differentiated). Pentamers of ORAI1 and ORAI3 have been shown to form arachidonate-regulated Ca 2þ (ARC) channels that are independent of store Ca 2þ depletion but would be regulated by STIM1 molecules expressed at the cell membrane [34]. Whether these channels contribute to Ca 2þ signalling in T-lymphocytes remains to be determined Ca V Channels in T-cells Voltage-gated Ca 2þ (Ca V 1 alias L-type calcium) channels are considered as characteristic of excitable cells because they are activated by strong cell membrane depolarization. They are formed by the a1 subunit (containing the Ca 2þ pore) and auxiliary subunits (b, a2-d and eventually g) that may interfere with cell membrane expression and associate with regulatory molecules [35], (Fig. 3). Four genes code the a1 subunits of Ca v 1 channels and the corresponding proteins (Ca v 1.1 to Ca v 1.4) have an expression, which varies depending on the tissues. These channels were also defined as dihydropyridine (DHP) receptors with some DHP having agonistic properties and other ones antagonizing the channels. Ca v 1.1 predominates in skeletal muscles; Ca v 1.2 is found in the cardiomyocytes, in smooth muscle cells and in neurons; Ca v 1.3 is found in neurons, in neuroendocrine tissues, in pacemaker cells of the heart; Ca v 1.4 is found in the retina. Ca v 1.2 and Ca v 1.3 are frequently found in the same cells but their role does not seem to be redundant. Electrophysiological studies show some calcium or barium (which can be transported by the channel but does not induce fast Ca 2þ -mediated inactivation of the channel) currents from 20 mv, with a peak for a cell potential of þ20 mv. However these properties depend on the channel with Ca v 1.4 and Ca v 1.3 activating for more negative potentials than Ca v 1.2. Numerous studies have reported the expression of Ca v 1-related products in non-excitable T-lymphocytes (the cell membrane potential of which would be around 50 mv), (Table 1), and shown that dihydropyridine antagonists or other inhibitors of these channels reduced TCR-elicited Ca 2þ response (discussed in [36]). However, DHP antagonists or other drugs are not perfectly specific for Ca v 1 channels and could interact with K þ channels. Such an inhibitory effect on K þ channels would result in reducing the electrochemical driving force required to maintain Ca 2þ entry through ORAI channels [37]. All the studies conclude that Ca v 1 channels are not voltage-gated in T-lymphocytes. Some of the authors related the absence of voltage-sensitivity of Ca v 1 channels to their molecular structure with the presence of truncated forms of the channels [38,39]. Kotturi et al. showed the presence of Ca v 1.4 splicing variants lacking one voltage sensor in mouse lymphocytes [40]. However these authors did not establish that this variant could mediate Ca 2þ transport. Since 2006, Flavell s group used several approaches for demonstrating the implication of Ca v 1 channels in calcium signalling and T-cell functions (reviewed in [41]). They showed the expression of Ca v 1.1, 1.2, and 1.4 transcripts and proteins as well as auxiliary b subunits in mouse T-cells. Their expression increased after TCR stimulation with anti-cd3 and anti- CD28 in vitro [42]. They used b3 and b4 null mice (b subunits are required for a correct expression of Ca v 1 channels at the cell membrane) to study the impact on TCR-driven [Ca] i increase. They showed a normal T-cell development but a decreased calcium response and cytokine production. More recently, they showed that depletion of the b3 subunit leads to a loss of expression of Ca v 1.4 at the protein level in naïve CD8 þ T-lymphocytes associated with defective survival and decreased Ca 2þ response upon TCR stimulation [43]. Intriguingly, Ca v 1.4 is down regulated in effector CD8þ T-cells whereas Ca v 1.1 is up regulated. How Ca v 1 channel work in Table 1 Ca v 1-related channels in T-lymphocytes. T-cell Ca v 1 isoform Molecular characteristics Function and tools used for their study Human T [34] Ca v 1.2, Ca v 1.3 Truncated forms 80e100 kd vs 210 kd Inhibitors of Ca v 1 channels decrease TCR-driven Ca 2þ response a Human CD4 and CD8 [36,54] Ca v 1.4 Novel truncated form around 200 kd Inhibitors of Ca v 1 channels decrease TCR-driven Ca 2þ response a Jurkat and human T b Ca v 1.1, Ca v 1.3 Novel truncated forms Inhibitors of Ca v 1 channels decrease TCR Ca 2þ response a Murine T [37e40] Ca v 1.1 Ca v 1.2 Ca v 1.4; Varies from one cell type to another and depends on the state of activation? Decreased TCR-driven Ca 2þ responses in T-cells from b (2, 3, 4) or AHNAK / mice Murine Th2 [6,41,44] Ca v 1.2, Ca v 1.3 Down regulated in Th1 cells Classical neuronal isoforms Decreased TCR-driven Ca 2þ response in Th2-cells transfected with Ca v 1AS No effect on Th1 cells The references were included in the table. Ca v 1AS ¼ Ca v 1.2 plus Ca v 1.3 specific antisense oligonucleotides. a Pharmacological inhibitors of Ca v 1 channels were used to check the impact on the Ca 2þ response of T-cells (CD4þ or CD8þ) stimulated through the T-cell receptor (TCR). b Corresponds to a patent filed by JP Kinet in 2005.

170 2092 V. Robert et al. / Biochimie 93 (2011) 2087e2094 T-lymphocytes is unknown, however this change in the expression of Ca v 1 a1 subunits could deal with the constraints of TCR signalling that differ depending on the T-cell subset. The same authors showed that T-lymphocytes express AHNAK1, a very large scaffolding protein (around 700 kda) that binds several proteins including Ca v 1.1 channels. In addition, disrupting the gene encoding AHNAK leads to a decreased Ca 2þ response in CD4 þ T- lymphocytes and IL-2 production associated with an impaired expression of Ca v 1.1 at the cell membrane [44]. Important questions remain unsolved regarding how these channels work and why such a diversity of Ca v 1 a1 and auxiliary subunits might be used for generating varied calcium responses depending upon the T-cell subsets and their state of activation. Our group showed that Ca v 1.2 and Ca v 1.3 were selectively up regulated in differentiated Th2-cells (that secrete IL-4) and down regulated in IFN-g producing Th1 cells [7,45]. These channels were detected at the mrna and protein levels in effector Th2 lymphocytes. We transfected Th2-cells with Ca v 1.2 and/or Ca v 1.3 specific antisense oligodeoxynucleotides (Ca v 1AS), and showed that knocking down either Ca v 1.2 or Ca v 1.3 a1 subunits results in profound decrease in the TCR-elicited calcium response and cytokine production by Th2-cells without any effect on Th1 cells [7]. Ca v 1AS did not affect the increase in [Ca] i induced by thapsigargin (an inhibitor of the SERCA pump, which activates SOCE) showing that Ca v 1 channels are not SOCC. Moreover, Th2-cells transfected with Ca v 1AS lost their capacity to induce asthma in adoptive transfer experiments [7] while Th1 cells transfected or not with Ca v 1AS induced similar lung inflammation [7]. Finally, Ca v 1AS given by an intranasal route prevents experimental asthma indicating that these channels might represent a promising novel target in allergic diseases. The absence of voltage sensitivity of Ca v 1 channels in Th2-cells could be explained by a different regulation from classically described regulation in excitable cells. In this regard, it is remarkable that Santana s group demonstrated that a limited number of Ca v 1.2 channels e structurally identical to voltage-gated Ca v 1.2 channels e are constitutively activated at the resting cell membrane potential in smooth muscle cells [46,47]. Indeed these few channels are associated with protein kinase C, which increases their open probability to 0.2. This probability is much higher than the one described for Ca v 1 channels even at depolarized potentials (around 0.03). Therefore, few channels would contribute to maintain a significant Ca 2þ influx since the unitary conductance of Ca v 1 channels (around 2e20 ps) is more than 100 fold higher than the conductance of CRAC channels (30e200 fs). If such data are available in Th2-cells, it could explain the increased [Ca] i concentration in Th2-cells in basal conditions, compared to other T-cell subsets. Interestingly, we previously showed that protein kinase C was required for Ca v -dependent Ca 2þ entry [48]. Thus, it can be hypothesized that TCR activation induces localization of Ca v 1 channels together with the activating kinases in clusters near the immunological synapse. 5. Ca v 1 channels and ryanodine receptor interactions These interactions have not been demonstrated in T-lymphocytes. However Ca v 1 channels are known to interact with RyR channels. RyR1 and Ca v 1.1 may interact physically together (at distance inferior to 10 nm). Voltage-operated conformational change of Ca v 1.1 then leads to the activation of RyR1 channels and the release of SR Ca 2þ store, independently of an entry of Ca 2þ through Ca v 1.1 channels from the external medium (reviewed in [49]). The same mechanism has been proposed in some neurons were Ca v 1.2 channels might directly interact with RyR1 channels [50]. Alternatively, in the heart, Ca v 1.2 channels were shown to mediate an entry of Ca 2þ leading to RyR2 channel activation (distance between channels around 20 nm) through a mechanism called Ca 2þ -induced Ca 2þ release. Putative interactions between RyR and Ca v 1 channels remain to be investigated in T-lymphocytes. 6. ORAI and Ca v 1 channels interplay Many reports suggest that ORAI and Ca v 1 channels co-exist in both excitable and non-excitable cells. Recent papers highlighted some features of the coordinated regulation between Ca v 1 and ORAI channels by STIM1 ([51], discussed in [52]). Depletion of intracellular Ca 2þ stores would lead to STIM1 location underneath the cell membrane resulting in possible interactions with ORAI and Ca v 1.2 channels through the same domain CAD. The final consequence would be ORAI channel activation, a decrease in Ca 2þ influx through Ca v 1.2 channels and the internalization of Ca v 1.2 channels. This could have biological significance since Ca v 1.2 or CRACdependent Ca 2þ currents activate distinct transduction pathways. It will be important to understand the dynamics of Ca v 1 and ORAI channel openings in excitable and non-excitable cells, including T-lymphocytes and more precisely in the effector T-cell subsets. It would be also important to understand why some T-cell subsets express Ca v 1 channels and the putative impact of the genetic programme associated with their peculiar functions. At the moment, this discussion is highly speculative. It is possible that Ca v 1 channel-dependent Ca 2þ fluxes induced a peculiar Ca 2þ signature essential for Ca 2þ- dependent chromatin remodelling required for Th2 cytokine production. The expression of Ca v 1 channels might also be implicated in the relative resistance of Th2- cells to apoptosis compared to Th1 cells. In this line, Jha et al. showed that Ca v 1.4 expression by CD8þ cells would be important for their survival [43]. 7. Other ionic channels The ATP-gated purinergic receptor calcium channels P2X1, P2X4 and P2X7 are expressed in human T-lymphocytes and ATP is produced upon TCR activation raising the question of their involvement in Ca 2þ entry during T-cell activation. Indeed, it was recently shown that P2X1 and P2X4 localize at the immunological synapse after TCR engagement and that knocking down these channels inhibits Ca 2þ entry and NFAT-dependent gene expression [53]. NMDA receptors belong to the family of ligand-gated ionotropic glutamate receptors. They are non-selective cationic channels activated by the binding of glutamate and glycine. Calcium influx through NMDA receptors would be essential for synaptic plasticity required for learning and memory processes. Numerous NMDA receptors were recently described in thymocytes, including single positive CD4 þ and CD8 þ lymphocytes. Therefore, they are likely to be expressed by mature lymphocytes at the periphery. These calcium channels localized near the immunological synapse between T-lymphocytes and dendritic cells upon TCR engagement. The release of glutamine by the dendritic cell in close contact with the T-cell would induce full activation of NMDA receptors expressed by T-cells [54]. This would be implicated in Ca 2þ -mediated apoptosis and negative selection process in the thymus. The putative role of NMDA receptors in mature T-cell functions deserves further investigation. Before the identification of ORAI channels as the channels responsible for the SOCE, members of the transient receptor potential family (TRP), non-specific cationic channels were considered as potential SOCC. A recent work analyzed the equipment of human naïve and activated T-lymphocytes in TRP channels [55]. The authors showed that TRPC3 was highly up regulated in CD4 þ T-cells stimulated with anti-cd3/anti-cd28 coated beads. In

171 V. Robert et al. / Biochimie 93 (2011) 2087e addition, knocking down TRPC3 alleviated Ca 2þ -dependent cell proliferation suggesting that this channel might contribute to Ca 2þ signalling, independent of intracellular Ca 2þ store depletion. However, how these channels operate needs to be determined. TRPM4 is one of the Ca 2þ -activated TRP channel expressed by activated T-cells [56]; it would mediate an influx of Na þ leading to cell membrane depolarization, which could prevent Ca 2þ overload. Voltage-dependent potassium channels and Ca 2þ -activated potassium channels are also important for maintaining the electrochemical force driving Ca 2þ entry. The development of inhibitors of these channels has clinical implication, especially in the treatment of autoimmune diseases or inflammation [57]. 8. Perspectives and pending questions T-lymphocytes appear to be equipped with several types of Ca 2þ channels at the membrane of the ER/SR and at the cell membrane. Deciphering the crosstalk between these channels will be an important issue. The diversity of the channels is enriched by the expression of several isoforms and splice variants, and varies depending upon the type of T-lymphocytes and their state of activation. Similarly, a great variety of Ca v 1 a1 and auxiliary subunits have been described in resting or activated human and mouse T-cell subsets (Fig. 3). In the future, we will have to understand the reasons of such diversity, an eventual impact on the calcium signature elicited by TCR engagement and the final consequences regarding gene expression in a peculiar T-cell subset. This is of clinical interest. Indeed, it is conceivable to selectively target a step controlling Ca 2þ signalling in a given T-cell subset responsible for a certain type of disease, which would allow the improvement of immunological disorders without overall immunosuppression. Acknowledgements This work was supported by the association 111 des Arts, and by the French Society of Allergology (SFA). VR was supported by a national grant (MENRT) and ET by a program "Translational Clinical Research (INSERM-Hospital). The authors have no financial conflict of interest. References [1] O. Brandman, J. Liou, W.S. Park, T. Meyer, STIM2 is a feedback regulator that stabilizes basal cytosolic and endoplasmic reticulum Ca 2þ levels, Cell 131 (2007) 1327e1339. [2] J.E. Smith-Garvin, G.A. Koretzky, M.S. Jordan, T cell activation, Annu. Rev. Immunol. 27 (2009) 591e619. [3] C.S. Guy, D.A. Vignali, Organization of proximal signal initiation at the TCR: CD3 complex, Immunol. Rev. 232 (2009) 7e21. [4] T. Yokosuka, T. Saito, The immunological synapse, TCR microclusters, and T cell activation, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 340 (2010) 81e107. [5] K.S. Weber, M.J. Miller, P.M. 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173 Eur. J. Immunol : DOI /eji Immunomodulation 3489 Endogenous estrogens, through estrogen receptor a, constrain autoimmune inflammation in female mice by limiting CD4 1 T-cell homing into the CNS Karine Lélu 1,2, Laurent Delpy 3, Virginie Robert 1, Eliane Foulon 1, Sophie Laffont 1, Lucette Pelletier 1,2, Britta Engelhardt 4 and Jean-Charles Guéry 1,2,5 1 INSERM, U563, Centre de Physiopathologie de Toulouse Purpan, Toulouse, France 2 Université Paul Sabatier, Toulouse, France 3 CNRS, UMR6101, Faculté de Médecine, Limoges, France 4 Theodor Kocher Institute, University of Bern, Bern, Switzerland 5 Centre Hospitalier Universitaire, Toulouse, France Sex hormones influence immune responses and the development of autoimmune diseases including MS and its animal model, EAE. Although it has been previously reported that ovariectomy could worsen EAE, the mechanisms implicated in the protective action of endogenous ovarian hormones have not been addressed. In this report, we now show that endogenous estrogens limit EAE development and CNS inflammation in adult female mice through estrogen receptor a expression in the host non-hematopoietic tissues. We provide evidence that the enhancing effect of gonadectomy on EAE development was due to quantitative rather than qualitative changes in effector Th1 or Th17 cell recruitment into the CNS. Consistent with this observation, adoptive transfer of myelin oligodendrocyte glycoprotein-specific encephalitogenic CD4 1 T lymphocytes induced more severe EAE in ovariectomized mice as compared to normal female mice. Finally, we show that gonadectomy accelerated the early recruitment of inflammatory cells into the CNS upon adoptive transfer of encephalitogenic CD4 1 T cells. Altogether, these data show that endogenous estrogens, through estrogen receptor a, exert a protective effect on EAE by limiting the recruitment of blood-derived inflammatory cells into the CNS. Key words: EAE/MS. Estrogen. Estrogen receptor. Inflammation. Th1/Th17 cells Supporting Information available online Introduction MS and its prototypic animal model, EAE, are autoimmune demyelinating diseases of the CNS. In MS and EAE, the Correspondence: Dr. Jean-Charles Guéry [email protected] inflammatory process is mediated by T lymphocytes reactive to CNS and brain autoantigens. It is well documented that sex hormones could influence immune responses and the development of autoimmune diseases including MS and EAE [1]. Indeed, protective effects of exogenous estrogens have been extensively reported in animal models of EAE [2 4]. The actions of estrogens are mediated primarily through nuclear estrogen receptor (ER) a and ERb [5]. Analysis of the effect of exogenous 17b-estradiol & 2010 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim

174 3490 Karine Lélu et al. Eur. J. Immunol : (E2) on EAE induction in ER-mutant mice clearly showed that this protective effect of E2 was mediated through ERa but not ERb [6 8]. Altogether, these studies support a protective role of estrogens on EAE that could explain the protective effect of pregnancy on MS [9]. Indeed, a clinical trial in women with MS has documented a beneficial effect of exogenous estriol administration [10]. Thus, although it has been shown that exogenous estrogens down modulate EAE through ERa, it is still unclear whether physiological levels of endogenous estrogens can significantly influence CNS autoimmunity [11, 12]. In female mice, sex steroid hormones, such as estrogens, are mainly produced by the ovaries, and previous studies have reported that ovariectomy could worsen EAE [2, 13, 14]. However, the mechanisms implicated in the protective action of endogenous ovarian hormones have not been previously examined. For instance, it is still unknown whether these effects were due to ovarian-derived estrogens or other gonadal hormones, and whether classical ERs were implicated or not. In the present study, we have investigated the impact of endogenous estrogens on EAE development in C57BL/6 (B6) female mice by comparing disease development between ovariectomized (Ovx) and sham-operated mice. Two EAE models were used: (i) active EAE induced by immunization with the MOG peptide and (ii) passive EAE induced by adoptive transfer of highly encephalitogenic myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG)- specific CD4 1 T cells. Using both models, we firmly established that endogenous estrogens exert a protective effect on EAE development and CNS inflammation through ERa. The role of estrogen-mediated signaling in hematopoietic versus non-hematopoietic tissues was examined using ERa-mutant mice. Altogether, our data support the conclusion that endogenous estrogens protect from EAE through ERa signaling in non-hematopoietic tissues by limiting the homing of inflammatory T cells into the CNS rather than through a direct anti-inflammatory effect on MOG-specific T-cell responses. Results Gonadectomy enhances EAE severity in adult ERa 1=1 but not ERa / female mice To analyze the mechanism responsible for the protective effect of endogenous ovarian hormones on EAE, we performed prepubertal gonadectomy and monitored the disease development in 10- to 12- wk-old female C57BL/6 mice. As shown in Fig. 1A and B and Supporting Information Fig. 1, clinical signs of EAE were exacerbated in Ovx mice compared to sham-operated control animals. Female mice with intact ovaries had delayed onset of EAE, reduced peak clinical score and cumulative disease index (Fig. 1B and Supporting Information Table 1 and Supporting Information Fig. 1). Estrogens are likely to be the ovarian hormones responsible for this protective effect on EAE. Indeed, we previously showed that low dose E2 administration in Ovx mice can protect from EAE development through ERa signaling [8]. To evaluate the implication of endogenous estrogens on EAE development, we Figure 1. Lack of ovarian hormones exacerbates EAE development in ERa 1/1 but not ERa / female mice. Four-wk-old female WT ERa 1/1 (A, B) or ERa / (C, D) B6 mice (n mice per group) were ovariectomized (Ovx, open circles) or sham-operated (sham, filled circles) and immunized at 12 wk of age with MOG emulsified in CFA. (A, C) Clinical signs of disease were assessed daily and expressed as mean (1SEM). (B and D) Cumulative disease index (CDI), defined as the mean (7SEM) of the sum of the clinical scores for each animal over the course of the experiment. po0.05; po0.01, Mann Whitney test. For data presented in panel (A), difference between curves was found highly significant (po0.005) with a significant interaction between effect of castration and disease kinetics (po0.001) by repeatedmeasures two-way ANOVA. analyzed the effect of ovariectomy on EAE in mice in which exon 2 of Esr1 gene has been deleted (ERa / ) leading to the unambiguous inactivation of ERa [15]. Castrated or sham-operated ERa-deficient B6 females were immunized with MOG peptide in adjuvant as in Fig. 1A and monitored daily for clinical signs of EAE. As shown in Fig. 1C and D, the disease course in ERa / mice was identical between castrated and control mice and was as severe as castrated ERa-sufficient mice (Fig. 1). These results show that ERa is the major ligand-inducible transcription factor responsible for the protective effect of endogenous estrogens on EAE in adult female mice. Endogenous estrogens protect from EAE through ERa signaling in non-hematopoietic cells We next determined whether this protective effect of endogenous estrogens requires ERa signaling in hematopoietic cells or not. We generated radiation bone marrow chimeras by reconstituting lethally irradiated WT mice with bone marrow cells from either ERa / or ERa 1/1 mice. Female mice were castrated at 4 wk of age, & 2010 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim

175 Eur. J. Immunol : Immunomodulation 3491 before irradiation and reconstitution 2 wk later. Eight wk after reconstitution, mice were immunized to induce EAE. Data in Supporting Information Fig. 2A and B show that ovariectomy exacerbates EAE development to similar extent in both ERa / - WT and ERa 1/1 -WT chimeras. Thus, the protective effect of endogenous estrogens on clinical EAE is not dependent on ERa signaling in bone-marrow derived cells. Endogenous estrogens down regulate EAE without inhibiting MOG-specific CD4 1 T-cell priming Next, we investigated whether endogenous estrogens protect from EAE development by modifying the phenotype of inflammatory T cells into the CNS. To address this point, mononuclear infiltrating cells from the brain and spinal cords of control and Ovx mice were isolated at disease peak (Fig. 2A). Then, we measured the frequency of effector T cells producing inflammatory cytokines among CNS-infiltrating CD4 1 T cells by intracellular staining upon in vitro stimulation with PMA and ionomycin as shown in Supporting Information Fig. 3. In the brain of sick mice, IFN-g- or IL-17-producing CD4 1 T cells were found at similar frequency in both sham-operated and Ovx mice (Fig. 2B and C), whereas IL-4-producing CD4 1 T cells were undetectable in both groups (frequencyo0.01%). Consistent with this observation, the production of effector cytokines IFN-g or IL-17 by lymph node T cells in response to MOG peptide was comparable between sham-operated and Ovx mice (Fig. 2E). Similar results were obtained by analyzing splenic CD4 1 T-cell responses at later time points (Supporting Information Fig. 4). The proliferative response of MOG-specific lymph node T cells was however higher in controls as compared to Ovx mice (Fig. 2D), suggesting an enhancing effect of endogenous E2 on T-cell priming in agreement with our previous works [16, 17]. To understand whether difference in EAE development was characterized by reduced early inflammation in sham-operated controls, we quantified various cytokines and chemokines transcripts in the CNS at disease onset. As shown in Fig. 3A, TCR-b and Th1- cytokine (IFN-g, Lymphotoxin-a) transcript levels were increased in CNS from Ovx mice that developed significantly worse EAE than sham-operated controls. Likewise, we found that mrna of various chemokines (TCA-3, MCP-1, C10, RANTES, MIG, MDC) known to be early upregulated in the CNS from mice developing EAE [18] and expression of the stress-associated gene P8, which is linked with active demyelination [19], were higher in Ovx mice relative to shamoperated control (Supporting Information Fig. 5A and B). Data in Fig. 3A show that expression of TCR-b transcripts in the spinal cords were also significantly reduced in intact females suggesting that ovarian hormones inhibit active EAE by limiting recruitment of inflammatory cells into the CNS. To address this Figure 2. The protective effect of endogenous estrogens is not due to a bias in effector T-cell homing into the CNS. EAE was induced in Ovx or sham-operated female mice (6 mice per group) with MOG in CFA. (A) Clinical signs of disease were assessed daily and expressed as mean (1SEM). At the peak of EAE (14 days after induction), mice were killed, and CNS-infiltrating mononuclear cells from 2 to 3 mice per group were purified by Percoll gradient centrifugation. Cells were stimulated in vitro with PMA ionomycin and stained with CD45- and CD4-specific mab before intracellular staining for IFN-g (B) and IL-17 (C). Analysis was performed on CD45 1 CD4 1 T lymphocytes as shown in Supporting Information Fig. 3. Data are expressed as percent of cytokine-producing CD4 1 T cells and were pooled from three independent experiments. (D, E) Ovx or shamoperated B6 mice were immunized as in (A). Seven days later, draining lymph node cells were recovered and stimulated in vitro in presence of MOG peptide. Recall proliferation (D), IFN-g and IL-17 (E) secretion were assessed in vitro at 72 h. Data are expressed as mean7sem of individual mice (6 mice per group) and are representative of two experiments performed. po0.05 ; po0.01, Mann Whitney U test. For data presented in panel (A), difference between curves was found very significant (po0.01) with a significant interaction between effect of castration and disease kinetics (po0.001) by repeated-measures two-way ANOVA. & 2010 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim

176 3492 Karine Lélu et al. Eur. J. Immunol : Figure 3. Limited EAE development in mice with intact ovaries is associated with reduced recruitment of inflammatory leukocytes into the CNS. Ovx or sham-operated female B6 mice (6 10 mice per group) were immunized with MOG peptide in CFA to induce EAE as in Fig. 2. (A) RNA were isolated from the spinal cords of mice at day 12 post-immunization and mrna levels for TCR-b, IFN-g and LT-a were determined by real-time PCR analysis on spinal cord samples from individual mice. Transcript levels were normalized to HPRT transcript abundance. (B, C) CNS-infiltrating mononuclear cells from brain and spinal cord were enriched using Percoll gradient centrifugation and stained with anti-cd45, anti-cd4 and anti- CD11b mab. Full gating strategy is shown in Supporting Information Fig. 6. Frequencies and absolute numbers of CD4 1 T cells (B) and macrophages (C) were determined in individual mice on CD45 high cells gated as shown in Supporting Information Fig. 6. Data are expressed as mean7sem. po0.05; po0.01, Mann Whitney U test. Shown are representative data of three independent experiments. In a separate experiment (D), Ovx or sham-operated controls (6 mice/group) were immunized with MOG as above. Mice were euthanized at day 12 and their spinal cords were fixed in PFA and prepared for immunohistology. Immune cell infiltration was determined by staining with anti-cd45 mab (brown color), magnification 50 (D) and 200 (E). (Scale bar, 200 mm.) point, we next analyzed the amounts of CNS-infiltrating mononuclear cells at disease onset (Supporting Information Fig. 6). A marked increase in both the frequency and the absolute number of CD45 hi CD4 1 T lymphocytes (Fig. 3B) and CD45 hi CD11b 1 macrophages (Fig. 3C) was observed in Ovx mice as compared to controls. Consistent with these data, stronger inflammatory infiltrates (CD45 1 mononuclear cells) were observed in the spinal cord sections of Ovx mice as compared to sham-operated controls (Fig. 3D) and were shown to contain CD3 1 T lymphocytes (Supporting Information Fig. 7). Stereological analysis demonstrated that the relative surface area of CD45 1 infiltrates occupied in spinal cord sections was 6.6%73.7% in the Ovx mice as compared to 1.9%71.4% in the sham-operated controls (po0.01). Thus, the protective effect of ovarian-derived factors on EAE development and CNS inflammation cannot be attributed to a defective priming of autoantigen-specific CD4 1 T cells in the periphery or to a bias in effector T cells recruitment into the CNS. Endogenous estrogens limit the recruitment of inflammatory leukocytes into the CNS Since endogenous estrogens might limit active EAE in the absence of inhibitory effect on encephalitogenic T-cell priming, the protective effect of endogenous estrogen should also be observed in adoptive EAE. To address this point, we used an adoptive transfer EAE model in which MOG-specific CD4 1 T cells were generated from ERa 1/1 or ERa / mice in order to exclude any effect of endogenous estrogens on encephalitogenic T lymphocytes. The cytokine secretion profiles of ERa 1/1 or ERa / MOG-specific CD4 1 T cells were similar and were characterized by a high frequency of IFN-g producing cells (62 82%) that also produce TNF-a (31 50%) and a low frequency (3 5%) of IFN-g neg IL-17-producing cells (Supporting Information Fig. 8). Injection of ERa 1/1 MOG-specific CD4 1 T lymphocytes into normal female mice induced EAE with earlier onset and enhanced severity in castrated female mice as compared to sham-operated controls (Fig. 4A and B). Likewise, stereological & 2010 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim

177 Eur. J. Immunol : Immunomodulation 3493 Figure 4. ERa expression in encephalitogenic CD4 + T cells is dispensable for EAE protection by endogenous estrogens. Encephalitogenic CD4 + T cells were prepared from normal B6 (A-C) or ERa / (D and E) mice immunized with MOG /CFA as described in Materials and methods section. MOG specific CD4 + T cells were injected i.p. ( cells/mouse) into 10 to 12 wk-old sham-operated or Ovx WT B6 mice. EAE clinical scores were assessed daily and expressed as described in Fig. 1. Panel (A and B) shows one representative experiment out of four performed with 4-5 mice per group. In panels B and D, data were pooled from two independent experiments (n=8-10). Repeated-measures two-way ANOVA analysis rendered a value of po0.01 when disease development was compared for both groups in (A) and (D) with p interaction o Group differences in clinical score were tested at each time point using a Bonferroni post hoc test (*po0.05; **po0.01; ***po0.001). (B and E) Mean (7SEM) of cumulative disease scores are shown. (C) Mice from experiment in panel (A) were euthanized at day 17, perfused and spinal cords were removed, and sections were stained with anti-cd45 mab as in Fig. 3. Relative surface area of CD45 + infiltrates occupied in spinal cord sections was calculated using established stereological methods and expressed as mean % 7SEM. *po0.05; **po0.01 (difference between groups (B, C, E)), Mann-Whitney U test). analysis of CD45 1 infiltrating leukocytes in the spinal cords demonstrated reduced CD45 1 infiltrates in spinal cord sections of sham-operated controls as compared to Ovx mice (Fig. 4C). In agreement with bone-marrow chimera experiments in Supporting Information Fig. 2, similar results were obtained using MOG-specific CD4 1 T cells from ERa / mice (Fig. 4D and E). To analyze further the role of ERa signaling in this effect, adoptive EAE experiments were simultaneously conducted in age-matched castrated or sham-operated ERa 1/1 or ERa / female mice. As shown in Fig. 5, ERa 1/1 female mice with intact ovaries exhibited a reduced disease severity as compared to castrated ERa 1/1 controls or ERa-deficient female mice whether they were castrated or not. Altogether, these data support the conclusion that the protective effect of ovarian-derived estrogens on EAE development is not due to a defective priming of autoantigen-specific CD4 1 T cells in the periphery and is mediated through endogenous estrogen-dependent activation of ERa in the host non-hematopoietic tissues. Endogenous estrogens limit encephalitogenic T-cell homing into the CNS The results obtained in the adoptive transfer model of EAE suggested that the protective effect of ovarian-derived estrogens could modulate the early phase of CNS inflammation leading to EAE development. We therefore analyzed the recruitment kinetics of inflammatory T cells and macrophages to the CNS of castrated or control female mice adoptively transferred with in vitro restimulated MOG-specific CD4 1 T cells. Although few blood-derived inflammatory leukocytes were found in the CNS at day 3 post-injection of encephalitogenic T cells (not shown), both CD45 hi CD4 1 T cells and CD45 hi Ly6C hi macrophages were readily detected in the CNS of both normal or castrated mice by day 5 (Fig. 6A and B). Although the profile of CNS-infiltrating mononuclear cells was similar between both groups, strong quantitative differences were found. As shown in Fig. 6C, there was a three- to fourfold increase in the absolute numbers of CD4 1 T cells or macrophages in Ovx mice as compared to shamoperated controls. Thus, the fact that ovariectomy leads to accelerated and more severe EAE can be explained by the enhanced capacity of encephalitogenic CD4 1 T cells to home to the CNS in these mice. Discussion The present study was designed to investigate the mechanism responsible for the protective effect of ovarian-derived hormones & 2010 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim

178 3494 Karine Lélu et al. Eur. J. Immunol : Figure 5. Endogenous estrogens protect from adoptive EAE through ERa signaling in the host tissues. Encephalitogenic T cells were prepared as in Fig. 4 and injected i.p. ( cells/mouse) into 10- to 12-wk-old Sham-operated or Ovx ERa 1/1 (A) or ERa / (B) mice (4 5 mice per group). EAE clinical scores were assessed during the acute phase of EAE. Repeated-measures two-way ANOVA analysis rendered a value of po0.05 when disease development was compared for both groups in (A) with p interaction o Group differences in clinical score were tested at each time point using a Bonferroni post hoc test ( po0.01). (C) Cumulative disease scores (mean1sem). Statistical significance of difference between groups was analyzed by using the Mann Whitney U test. Figure 6. Encephalitogenic T-cell homing to the CNS is reduced in the presence of endogenous estrogens. Encephalitogenic MOG-specific CD4 + T cells were prepared as in Fig. 4 and injected i.p. into 10 wk-old sham-operated or castrated (Ovx) B6 female mice (n=5). Five days after adoptive transfer, mice were sacrificed and their spinal cord and brain removed after intracardiac perfusion of PBS. CNS-infiltrating mononuclear cells were prepared as in Fig. 2 and stained with anti-cd45, anti-cd4 to label T cells (A), or anti-cd45, anti-cd11b and anti-ly6c mab to label myeloid cells (B). In (B), analysis of Ly6C expression was performed on CD45 + CD11b + cells, gated as shown in Supporting Information Fig. 6, to distinguish CNS resident microglia (CD11b+Ly6Clow) from infiltrating macrophages (CD11b+Ly6Chi). In panel (C), the absolute numbers of the different populations of CNS-infiltrating mononuclear cells from individual mice are shown. **po0.01, Mann-Whitney U test. Data shown are representative of two experiments. on EAE development in B6 female mice. Our data show that endogenous estrogens can protect from EAE development by limiting inflammatory cells recruitment into the CNS. Gonadectomized females showed increased clinical signs of EAE not only during the acute disease period but also during the chronic phase of the disease. We demonstrated that ERa-mediated signaling & 2010 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim

179 Eur. J. Immunol : Immunomodulation 3495 plays a pivotal role in the protective effect of endogenous estrogens on EAE development and CNS inflammation in female mice and that this effect of endogenous E2 did not require ERa expression in blood-derived inflammatory cells. Along this line, we show that female hormones protect from EAE and CNS inflammation without altering the priming and differentiation of MOG specific CD4 1 T cells into Th1 or Th17 effectors. Indeed, disease exacerbation was also found in Ovx mice as compared to sham-operated controls transferred with encephalitogenic MOG-specific CD4 1 T cells. This protective effect of endogenous estrogens on passive EAE also required a functional ERa in the host and was associated with a reduced recruitment of blood-born inflammatory T cells and macrophages in the CNS at disease onset. Taken together, our data show that the protective effect of endogenous estrogens is due to a reduction of inflammatory cells recruitment into the CNS, rather than an inhibition of T-cell expansion or skewing of effector T-cell development in the periphery. MS is more frequently observed in women than in men [1]. This gender difference in susceptibility to MS become apparent after sexual maturity suggesting a role for endogenous sex hormones [20]. On the other hand, progression of MS to a more severe form of the disease is slower in female patients [21, 22]. These observations suggest that sexual hormones, such as estrogens, could differentially regulate distinct developmental processes of CNS autoimmunity. For instance in female patients with established MS, endogenous estrogens might limit inflammation through indirect effects on non-lymphoid tissues, such as ERaexpressing cellular targets in the CNS or endothelial cells, thereby limiting the progression to more severe forms of the disease. Attempts to understand how sexual hormones regulate EAE have been done in several mouse models of EAE [2, 14, 23, 24]. Although some studies have previously reported that ovariectomy could worsen EAE [2, 13, 14], controversial results have been reported by others [11, 12]. We believe that differences in genetic background, EAE induction protocol and timing of ovariectomy might explain the controversial results obtained regarding whether endogenous physiological estrogens ameliorate EAE. In support of our work, an enhancing effect of gonadectomy on EAE development has been previously reported in B10.RIII [2] and B10.PL [13] female mice. However, a definitive role for endogenous estrogen-mediated signaling through classical ER had yet to be established. Using mutant mice in which ERa has been unambiguously inactivated [15], we now show that ERa expression is required for EAE protection in non-castrated females. The lack of effect of gonadectomy in ERa / mice cannot be attributed to a lack of production of endogenous ERligand, since ERa-mutant mice have high circulating levels of estradiol [5]. In addition, despite the fact that ERb is widely expressed in the CNS [5] and that ERb ligand has been shown to exert a neuroprotective effect in EAE [25], our data argue against a putative role for ERb in the protective effect of endogenous estrogens. Altogether, our results strongly support the conclusion that endogenous estrogens through ERa exert a protective effect on EAE development. Disease protection in females with intact ovaries was characterized by reduced inflammation in the CNS. Consistent with this observation, castrated animals had increased infiltration of inflammatory CD4 1 T cells and macrophages into the CNS at disease onset. At later time points, we could not detect any significant bias in the frequency of effector Th1 or Th17 encephalitogenic cells in the CNS of sick mice. This is consistent with our observation that gonadectomy does not significantly affect the priming and polarization of MOG-specific CD4 1 T-cell response in draining lymph nodes and spleen. Altogether, these observations suggest that endogenous estrogens might modulate leukocyte trafficking to the CNS rather than MOG-specific T-cell development. There is some evidence that endogenous estrogens can regulate chemokine receptor expression and function in T lymphocytes [26]. Recently, CCR6 expression by Th17 cells has been shown to be important for the initiation of CNS inflammation in EAE [27]. However, the regulation of CCR expression on T cells by E2 is unlikely, since we showed that ERa expression in T cells was dispensable to mediate the protective effect of endogenous estrogens. Alternatively, ERa is expressed in endothelial cells and beneficial effects of E2 through ERa expressed in endothelium have been recently documented in experimental models of reendothelialization [28] and atherosclerosis [29]. Along this line, E2 has been shown to inhibit IL-1-dependent induction of membrane E-selectin, ICAM-1 and VCAM-1 on cultured endothelial cells [30 32]. Interestingly, using intravital microscopy, it has been recently shown that ovariectomy in rats resulted in enhanced monocyte adhesion to arterial endothelium that was associated with increased adhesion molecule expression [33]. Supplementation with low dose of E2 inhibited the ovariectomy-induced upregulation of adhesion molecule expression on endothelium and adhesiveness of leukocytes, suggesting that endogenous estrogens may act to downregulate low grade microvascular inflammation in vivo [33]. The effect of estrogens on immune response and on the physiopathology of autoimmune diseases is complex and paradoxical [1]. Estrogens are not always immunosuppressive and can exacerbate autoantibody-mediated autoimmune diseases such as lupus-like syndrome [34, 35] and experimental autoimmune myasthenia gravis [17]. We and others have documented an enhancing effect of E2 on antigen-specific responses of conventional CD4 1 T cells [16] as well as NKT cells [36], characterized by enhanced production of type-1 cytokines. These pro-inflammatory effects were observed in Ovx mice supplemented with low doses of exogenous E2 and were mediated through ERa signaling in hematopoietic cells [16]. This could explain the slight but significant increase of Ag-specific T-cell proliferation we observed in the draining lymph nodes of mice with intact ovaries. Although the mechanisms implicated in this action of endogenous estrogens on T-cell response are unknown, this observation sustains the notion that the protective effect of physiological steady state levels of estrogens on EAE is not mediated through inhibition of T-cell immunity. In conclusion, our data support the notion that endogenous estrogens exert some beneficial effect on EAE through their capacity to limit encephalitogenic T-cell homing into the CNS. Although the & 2010 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim

180 3496 Karine Lélu et al. Eur. J. Immunol : precise mechanisms remain to be elucidated, we demonstrated that ERa expression in radiation resistant host tissues was required to mediate this protective effect. In women with MS, an effect of Esr1 gene polymorphism has been reported in both Japanese [37, 38] and Finnish populations [39]. However, this association was not found in all population examined [40]. Despite the controversy regarding the association of Esr1 polymorphism and MS, our data are the first to directly establish a link between endogenously produced physiological levels of estrogens and ERa signaling on the susceptibility of female to develop CNS autoimmunity. Additional studies of this intriguing observation should provide further understanding of the complex impact of female gender on the physiopathology of MS. Materials and methods Mice C57BL/6 (B6) mice were purchased from the Centre d Elevage R. Janvier (Le Genest St. Isle, France) and maintained in our animal facilities under pathogen-free conditions. Mice with a disrupted ERa gene (kindly provided by Professor P. Chambon and Dr. A. Krust, IGBMC, Strasbourg, France) have been previously described [15] and back-crossed on B6 background for at least ten generations. When indicated, animals were castrated or sham-operated at 4 wk. Unless otherwise stated, 12-wk-old mice were used in all experiments. All the protocols used have been approved by our institutional review board for animal experimentation. EAE induction and clinical evaluation For active EAE induction, mice were immunized subcutaneously in the flanks with 50 mg of MOG peptide (Neosystem, Strasbourg, France) emulsified in CFA (IFA supplemented with 1 mg/ml Mycobacterium tuberculosis H37RA; SIGMA-ALDRICH, Missouri, USA). Mice were injected i.p. with 200 ng of pertussis toxin (Calbiochem, Darmstadt, Germany) at days 0 and 2 and examined daily for clinical signs of disease. For EAE induction in the adoptive transfer model, mice were injected i.p. with purified encephalitogenic CD4 1 T cells prepared as described below. The mice were scored as follows: 0, no detectable signs of EAE; 1, complete limp tail; 2, limp tail and hindlimb weakness; 3, severe hindlimb weakness; 4, complete bilateral hindlimb paralysis; 5, complete hindlimb paralysis and forelimb weakness; 5.5, total paralysis of both forelimbs and hindlimbs; 6, death. (30 ng/ml) and anti-ifn-g mab XMG1.2 at 10 mg/ml as described elsewhere [41]. Three days after initiation of the culture, living cells were collected after Ficoll centrifugation and CD4 1 T cells were purified by negative selection using magnetic beads (Dynal Biotech, Oslo, Norway) as previously described [42]. CD4 1 T lymphocytes ( per mouse) were injected i.p. into mice in PBS or kept in culture for further analysis of their cytokine secretion profile by flow cytometry. Flow cytometric analysis of CNS-infiltrating cells and intracellular cytokine staining Spinal cord and brain were homogenized and then digested for 30 min with collagenase D (Roche, Indianapolis, IN, USA) and DNase I (Roche) under continuous agitation at 371C. Cell suspension was then strained through a 70-mm nylon filter (Falcon) and washed with HBSS containing 20 mm HEPES. Cells were separated by centrifugation (2000 rpm for 30 min) on a discontinuous isotonic Percoll gradient containing 40, 60 and 90% layers. Mononuclear cells at the 40%/60% interface were collected, resuspended in HBSS-HEPES and washed extensively in FACS buffer containing 1% FBS, 5 mm EDTA and 0.1% NaN 3 in PBS. For flow cytometry, cells were stained with PE anti- CD45.2, FITC-labeled anti-cd11b and APC-anti-CD4 mab, all purchased from BD Biosciences. For intracellular cytokine staining, CD4 1 T cells were stimulated for 4 h with 50 ng/ml of PMA and 500 ng/ml of ionomycin in the presence of 5 mg/ml of brefeldin A (Sigma-Aldrich). Cells were cell surface stained with anti-cd4-apc, fixed and permeabilized. Cells were stained intracellularly with FITC-anti-IFN-g mab and PE-conjugated anti-mouse IL-17, TNF-a or IL-4 mab (BD Biosciences). Data were collected on a FACSCalibur cytometer and analyzed using Flowjo software (Tree Star, Ashland, OR, USA). Statistical analysis Statistical analysis were performed with GraphPad Prism 4 (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA). For comparison of EAE clinical scores and effect of castration between groups, repeated-measures two-way ANOVA was performed, followed by a Bonferroni post hoc test. Otherwise, pairwise comparisons between control and Ovx groups were conducted using the Mann Whitney U test. All graphs show mean7sem. Preparation of T cells for passive EAE induction Briefly, splenocytes from MOG-immunized mice were cultured in the presence of MOG (30 mg/ml) with recombinant IL-12 Acknowledgements: This work was supported by grants from Agence Nationale de la Recherche (ANR-PHYSIO , ANR- 09-GENOPAT-008), and Association pour la Recherche sur la Sclérose en Plaques (ARSEP) for J. C. G. K. L. was supported by a fellowship from Ligue Franc- aise contre la Sclérose en Plaques & 2010 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim

181 Eur. J. Immunol : Immunomodulation 3497 (LFSEP). The authors thank the personnel of the animal facility at the Institut Fédératif de Recherche 150 (IFR150) and F. Capilla (Histopathology facility, IFR150) for their skillful technical assistance. ERa / mice were kindly provided by Professor P. Chambon and Dr. A. Krust (IGBMC, Strasbourg, France). Conflict of interest: The authors declare no financial or commercial conflict of interest. References 1 Whitacre, C. C., Sex differences in autoimmune disease. Nat. Immunol : Jansson, L., Olsson, T. and Holmdahl, R., Estrogen induces a potent suppression of experimental autoimmune encephalomyelitis and collagen-induced arthritis in mice. J. Neuroimmunol : Bebo, B. F., Jr., Fyfe-Johnson, A., Adlard, K., Beam, A. G., Vandenbark, A. A. and Offner, H., Low-dose estrogen therapy ameliorates experimental autoimmune encephalomyelitis in two different inbred mouse strains. J. Immunol : Ito, A., Bebo, B. 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182 3498 Karine Lélu et al. Eur. J. Immunol : Billon-Gales, A., Fontaine, C., Douin-Echinard, V., Delpy, L., Berges, H., Calippe, B., Lenfant, F. et al., Endothelial estrogen receptor-alpha plays a crucial role in the atheroprotective action of 17beta-estradiol in lowdensity lipoprotein receptor-deficient mice. Circulation : Nakai, K., Itoh, C., Hotta, K., Itoh, T., Yoshizumi, M. and Hiramori, K., Estradiol-17 beta regulates the induction of VCAM-1 mrna expression by interleukin-1 beta in human umbilical vein endothelial cells. Life Sci : PL Caulin-Glaser, T., Watson, C. A., Pardi, R. and Bender, J. R., Effects of 17beta-estradiol on cytokine-induced endothelial cell adhesion molecule expression. J. Clin. Invest : Simoncini, T., Maffei, S., Basta, G., Barsacchi, G., Genazzani, A. R., Liao, J. K. and De Caterina, R., Estrogens and glucocorticoids inhibit endothelial vascular cell adhesion molecule-1 expression by different transcriptional mechanisms. Circ. Res : Abu-Taha, M., Rius, C., Hermenegildo, C., Noguera, I., Cerda-Nicolas, J. M., Issekutz, A. C., Jose, P. J. et al., Menopause and ovariectomy cause a low grade of systemic inflammation that may be prevented by chronic treatment with low doses of estrogen or losartan. J. Immunol : Roubinian, J., Talal, N., Siiteri, P. K. and Sadakian, J. A., Sex hormone modulation of autoimmunity in NZB/NZW mice. Arthritis Rheum : Roubinian, J. R., Talal, N., Greenspan, J. S., Goodman, J. R. and Siiteri, P. K., Effect of castration and sex hormone treatment on survival, antinucleic acid antibodies, and glomerulonephritis in NZB/NZW F1 mice. J. Exp. Med : Gourdy, P., Araujo, L. M., Zhu, R., Garmy-Susini, B., Diem, S., Laurell, H., Leite-de-Moraes, M. et al., Relevance of sexual dimorphism to regulatory T cells: estradiol promotes IFN-gamma production by invariant natural killer T cells. Blood : Kikuchi, S., Fukazawa, T., Niino, M., Yabe, I., Miyagishi, R., Hamada, T. and Tashiro, K., Estrogen receptor gene polymorphism and multiple sclerosis in Japanese patients: interaction with HLA-DRB and disease modulation. J. Neuroimmunol : Niino, M., Kikuchi, S., Fukazawa, T., Yabe, I. and Tashiro, K., Estrogen receptor gene polymorphism in Japanese patients with multiple sclerosis. J. Neurol. Sci : Mattila, K. M., Luomala, M., Lehtimaki, T., Laippala, P., Koivula, T. and Elovaara, I., Interaction between ESR1 and HLA-DR2 may contribute to the development of MS in women. Neurology : Savettieri, G., Cittadella, R., Valentino, P., Manna, I., Andreoli, V., La Russa, A., La Porta, G. et al., Lack of association between estrogen receptor 1 gene polymorphisms and multiple sclerosis in southern Italy in humans. Neurosci. Lett : Thakker, P., Leach, M. W., Kuang, W., Benoit, S. E., Leonard, J. P. and Marusic, S., IL-23 is critical in the induction but not in the effector phase of experimental autoimmune encephalomyelitis. J. Immunol : Laffont, S., Coudert, J. D., Garidou, L., Delpy, L., Wiedemann, A., Demur, C., Coureau, C. and Guery, J. C., CD81T-cell-mediated killing of donor dendritic cells prevents alloreactive T helper type-2 responses in vivo. Blood : Abbreviations: CDI: cumulative disease index ER: estrogen receptor ERa / : mice in which exon 2 of Esr1 gene has been deleted E2: 17bestradiol MOG: myelin oligodendrocyte glycoprotein Ovx: ovariectomized Full correspondence: Dr. Jean-Charles Guéry, INSERM, U563, Centre Hospitalier Universitaire Purpan, Place du Dr Baylac, Toulouse Cedex 3, France Fax: [email protected] Received: 18/5/2010 Revised: 12/8/2010 Accepted: 13/9/2010 Accepted article online: 30/9/2010 & 2010 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim

183 Implication of Ca V 1 channels in calcium signaling of murine and human Th2 cells : potential therapeutic applications in asthma Abstract LT activation induce Ca 2+ entry by CRAC channels. This increase in intracellular calcium concentration ([Ca 2+ ]i) is necessary for the expression of genes such as those encoding cytokines. There are differences in the [Ca 2+ ]i between subsets of LT suggesting that calcium signaling components differ between populations. Recent studies have shown that other channels could be involved in the biology of LT, including Ca V 1 calcium channels. My thesis was to investigate the role of Ca V 1 channels in the biology of LT. We have shown that Ca V 1.2 and Ca V 1.3 isoforms were expressed by Th2. The inhibition of the expression of these channels by antisense oligonucleotides (Ca V 1AS) showed that they allowed the increase in [Ca 2+ ]i and production of cytokines. Th2 having a central role in the pathophysiology of asthma, we also tested the effect of inhibition of these channels in a Th2 in a model of experimental asthma. Th2 transfected with Ca V 1AS no longer allowed the development of asthma. In addition, the administration of Ca V 1AS by intranasal route prevents the development of inflammation and bronchial hyperreactivity. On the other hand, we have shown that human Th2 also expressed Ca V 1.2 and Ca V 1.3 channels in contrast to Th1. Their pharmacological inhibition by AS revealed the importance of these channels in calcium signaling induced by TCR engagement and cytokine production. We also demonstrated that the β subunit of Ca V 1 channels is important for the expression of the channel and its location at the plasma membrane. In addition, it appears that the function of Ca V 1 is under the control of PKC, since pharmacological inhibitor strongly reduced Ca 2+ entry after activation and cytokine production associated. Our work shows that there is a differential expression of Ca V 1 channels between subsets of LT since they are present and functional in Th2. In addition, these channels appear to be essential to the functioning of Th2.

184 Virginie Robert Implication des canaux Ca V 1 dans la signalisation calcique des lymphocytes Th2 murins et humains : possibles applications thérapeutiques dans l'asthme Directeurs de thèse : Lucette Pelletier Marc Moreau Thèse soutenue le 18 décembre 2012 à l hôpital Purpan, Toulouse Résumé L activation des LT induit une entrée de Ca 2+ par les canaux CRAC/ORAI. Cette augmentation de la concentration calcique intracellulaire ([Ca 2+ ]i) est nécessaire à l expression de gènes tels que ceux codant pour les cytokines. Des récentes études ont montré que d autres canaux pouvaient être impliqués dans la biologie des LT, notamment les canaux calciques Ca V 1. Ma thèse a consisté à étudier le rôle des canaux Ca V 1 dans le fonctionnement des LT. Nous avons montré que les isoformes Ca V 1.2 et Ca V 1.3 étaient exprimés par les Th2, une population produisant de l IL-4 et impliquée dans l asthme allergique. L inhibition de l expression de ces canaux par des oligonucléotides anti-sens (Ca V 1AS) a montré qu ils permettaient l augmentation de la [Ca 2+ ]i et la production de cytokines. Les Th2 ayant un rôle central dans la physiopathologie de l asthme, nous avons également testé l effet de l inhibition de ces canaux dans les Th2 dans un modèle d asthme expérimental. Les Th2 transfectés avec Ca V 1AS ne permettaient plus le développement de l asthme. De plus, l administration des Ca V 1AS par voie aérienne prévenait le développement de l inflammation et de l hyperréactivité bronchique. D autre part, nous avons montré que les Th2 humains exprimaient également les canaux Ca V 1.2 et Ca V 1.3 contrairement aux Th1, une population produisant de l IFN-γ, responsables de l élimination des pathogènes intracellulaires. Leur inhibition pharmacologique et par les AS ont révélé l importance de ces canaux dans la signalisation calcique induite par l engagement du TCR et la production de cytokines. Nous avons également démontré que la sous-unité β des canaux Ca V 1 était importante pour l expression du canal et sa localisation à la membrane. De plus, il semblerait que le fonctionnement de Ca V 1 soit sous le contrôle de la PKC, puisqu un inhibiteur pharmacologique réduit fortement l entrée de Ca 2+ après activation, et la production de cytokines associée. Nos travaux montrent qu il existe une expression différentielle des canaux Ca V 1 entre les sous-populations de LT puisqu ils sont présents et fonctionnels dans les Th2 et sont absents des Th1. De plus ces canaux s avèrent être indispensables au fonctionnement des Th2. Mots clés : lymphocytes Th2, canaux calciques Ca V 1, calcium, signalisation calcique, asthme. Discipline : Immunologie Inserm U1043, Centre de Physiopahologie Toulouse Purpan, BP3028, 31024, Toulouse Cedex 3