THÈSE. En vue de l obtention du. DOCTORAT de L UNIVERSITE de TOULOUSE

Transcription

1 THÈSE En vue de l obtention du DOCTORAT de L UNIVERSITE de TOULOUSE Délivré par : l Université Toulouse III Paul Sabatier Spécialité : Interactions Plantes Microorganismes Présentée et soutenue par Marc CAZAUX Le 04 mai 2009 Etude de la résistance de la légumineuse modèle Medicago truncatula à Colletotrichum trifolii, agent de l anthracnose. JURY B. JULIER Chargée de recherche, INRA, Lusignan Rapportrice T. LANGIN Directeur de recherche, CNRS, Paris XI Rapporteur V. LEFEBVRE Directrice de recherche, INRA, Montfavet Examinatrice G. BECARD Professeur, Université Paul Sabatier, Toulouse Examinateur C. JACQUET Maître de Conférences, Université Paul Sabatier, Toulouse Directeur de thèse M.T ESQUERRE-TUGAYE Professeur, Université Paul Sabatier, Toulouse Co-directrice de thèse Ecole Doctorale Sciences Ecologiques, Vétérinaires, Agronomiques, et Bioingénéries UMR 5546 CNRS-UPS, 24 chemin de Borde Rouge BP Auzeville, Castanet-Tolosan, France

2 Remerciements Les travaux de recherche présentés dans ce mémoire de thèse sont le fruit d un peu plus de trois années passées à l UMR Au delà de l acquisition de techniques, de connaissances et du raisonnement scientifique, cette thèse m a permis de gagner en maturité. Tout ceci n aurait pu être réalisé sans un ensemble de personnes à qui j adresse mes plus sincères remerciements ainsi que le témoignage de mon plus profond respect. Je remercie tout d abord Christophe Jacquet, mon directeur de thèse pour ses conseils, son aide, et pour m avoir permis de laisser libre cours à mes idées, tout en me ramenant parfois les pieds sur terre. Mes remerciements vont aussi à ma co-directrice de thèse, Madamme Marie-Thérèse Esquerré- Tugayé qui m a accueilli dans son équipe, et m a fait partager sa sagesse et ses conseils. Je tiens également à remercier les membres du jury, Mesdames Bernadette Julier et Véronique Lefèbvre ainsi que Messieurs Thierry Langin et Guillaume Bécard pour avoir accepté d évaluer ce travail. Je remercie également l ensemble des membres de l équipe Interactions Plante-Microorganisme, sans oublier l ensemble du personnel du laboratoire, pour leur aide ainsi que pour leur accueil chaleureux qui m a permis de m y sentir comme chez moi pendant ces années. Mes remerciements à Fabien Chardon et Thierry Huguet pour m avoir permis de découvrir et d appréhender l univers de la génétique quantitative qui n était qu une vague notion à mon arrivée dans l équipe. Je remercie Richard O Connell pour m avoir si cordialement accueilli dans son équipe pendant 3 semaines, pour sa disponibilité et la pertinence de ses conseils. Je remercie aussi Yves Martinez pour m avoir expliqué l utilisation des microscopes et du vibratôme. Je garde un très bon souvenir de toutes les discussions sur le monde de la moto partagées avec ce «vrai» motard. Ma plus grande gratitude à mes parents pour leur soutien et pour m avoir permis de faire des études me conduisant à présenter ce doctorat. Merci à mes amis pour tous les moments passés. Et finalement, je remercie la personne qui m est la plus chère, Marie, sans qui je ne serais probablement pas arrivé là. 2

3 Résumé Dans le cadre de l étude des mécanismes de résistance aux champignons pathogènes chez les Légumineuses, un pathosystème utilisant la Légumineuse modèle Medicago truncatula et Colletotrichum trifolii, agent de l anthracnose de la luzerne, a été développé. La lignée A17 est résistante à 3 isolats de C. trifolii : la race 1, la race 2, et l isolat C86-2 que nous définissons dans ce travail comme une probable nouvelle race. A contrario, la lignée F est sensible à ces trois mêmes races. L analyse génétique d une population de lignées recombinantes (RILs) montre que la résistance de M. truncatula à l anthracnose est conférée par un QTL majeur de résistance commun aux trois souches. Ce QTL est situé au sommet du chromosome 4 dans une région riche en analogues de gènes de résistance. Son rôle a été confirmé par l utilisation de lignées quasi-isogéniques (NILs). Une cartographie fine de cette région a permis d identifier des loci de résistance différents pour chacune des souches de C. trifolii. En dépit de plusieurs tentatives d identification de la région physique du génome contenant les gènes de résistance aux races 2 et C86-2, le locus reste encore dans une partie du génome non séquencée. La seconde partie de cette thèse révèle la capacité de C. trifolii à infecter les racines de M. truncatula. Après pénétration, des hyphes fins convergent vers le cylindre central de la racine. Au niveau de l endoderme, il forme des agrégations de mycélium intracellulaires, structures non-encore décrites, à partir desquelles se différencient de nouveaux appressoria lui permettant probablement de rentrer dans le cylindre central. Une fois dans la stèle racinaire, le champignon remonte le long du système vasculaire jusqu aux parties aériennes où il entraine le développement de symptômes d anthracnose classiques. Le comportement différentiel observé sur les parties aériennes des lignées A17 et F est également observable sur les racines. Alors que C. trifolii est capable de pénétrer dans le cylindre central de F , il reste bloqué dans les premières assises de l épiderme chez A17. La présence d espèces activées de l oxygène, de renforcements pariétaux, et de composés aromatiques chez cette lignée révèle qu il s agit d une résistance active conférée par un unique QTL qui se juxtapose avec celui de la résistance foliaire. L existence de RILs résistantes sur feuilles et sensibles sur racines (ou inversement) et l analyse des NILs indique que les loci de résistance foliaire et racinaire sont différents. Finalement, une dernière étude cytologique révèle que C. lindemuthianum, non hôte sur feuille de M. truncatula, est capable d infecter les racines de cette plante. Ce dernier résultat indique une spécificité tissulaire de la résistance. 3

4 Abstract To study resistance mechanisms to fungal pathogens in legumes, a pathosystem was developed between the model legume Medicago truncatula and Colletotrichum trifolii, agent of alfalfa anthracnose. The A17 M. truncatula line was resistant to three C. trifolii isolates including race 1, race 2, and the C86-2 isolate that we define in this work as a probable new race. In contrast, the line F was sensitive to the same three races. Genetic analysis of resistance with a population of recombinant inbred lines (RILs) showed that M. truncatula resistance to anthracnose was conferred by a major QTL for resistance to three C. trifolii races. This QTL is located at the top of chromosome 4, in a locus rich in resistance gene analogs. It was validated through the use of near isogenic lines (NILs). A fine mapping of this region identified different resistance loci for each of the three races. Despite several attempts to identify the physical region of the genome containing genes for resistance to races 2 and C86-2, the locus remains in a region of the genome that is not yet sequenced. The second part of this thesis showed the ability of C. trifolii to infect M. truncatula roots. Following penetration, thin hyphae rapidly moved toward the central cylinder of the root. They were stopped by the endoderm cells in which they formed aggregations structures that have not yet been described. Inside those structures acervuli and appressoria were observed. This later structure probably allowed the fungus to enter the central cylinder. Once in the root stele, C. trifolii moved inside the vascular system up to the aerial parts where classical symptoms of anthracnose can be observed. The differential responses observed on the aerial part of A17 and F were also observed following root inoculation. While C. trifolii was able to enter inside F central cylinder, it was arrested in the first cells layers of the epidermis in A17. The presence of reactive oxygen species, callose papillae synthesis, and accumulation of aromatic compounds in this line revealed an active resistance mechanism, which was conferred by a single QTL that is juxtaposed to that of the leaf resistance. The identification of RILs that are resistant following foliar inoculation and susceptible after root inoculation (or inversely) along with result on NILs indicating that the locus involved in root resistance was not the same as the one involved in foliar resistance. In a last cytological study, C. lindemuthianum, a non host pathogen on leaves, was shown to infect M. truncatula roots successfully, indicating that non host resistance is tissue specific. 4

5 Liste des abréviations Termes : PAMP - Pathogen Associated Molecular Pattern PRR - Pattern Recognizing Receptor RLK - Receptor-Like Kinase RLP - Receptor-Like Protein LAR - Local Acquired Resistance SAR - Systemic Acquired Resistance HR - Hypersensitive Response PTI - PAMP-Triggered Immunity ETI - Effector-Triggered Resistance ETS - Effector-Triggered Susceptibility Avr - avirulence Gène R - gène de résistance Protéine R - protéine de résistance TIR - Toll Interleukin-Receptor CC - Coiled-coil NB - Nucleotide-Binding domain NBS - Nucleotide Binding Site LRR - Leucine-Rich Repeat CNL - CC-NB-LRR TNL - TIR-NB-LRR RGA - Resistance Genes Analog ROS - Reactive Oxygen Species MAPK - Mitogen Activated Protein Kinase CDPK - Calcium-Dependent Protein Kinases SA - acide salicylique JA - acide jasmonique ET - éthylène NO - Nitric Oxid FT Facteur de Transcription PR protéine - Pathogenesis-Related proteins HRGP - Hydroxyproline Rich Glycoprotéin QRL - Quantitative Resistance Loci QTL - Quantitatives Trait Loci ADN - Acide Désoxyribonucléique ORF - Open Reading Frame RIL - Recombinant Inbred Line NIL - Near Isogenic Line SNP - Single Nucleotide Polymorphism SSR - Single Sequence Repeat EST - Expressed Sequence Tag ITS - Internal Transcribed Spacer BAC - Bacterial Artificial Chromosome UV - ultraviolet WGA - Wheat Germ Agglutinin FITC - Fluoresceine Iso Thio Cyanate GFP - Green Fluorescent Protéin Unités: cm - centimorgans kb - kilobase pb - paire de base g - gramme mg - milligramme cm - centimètres µm - micromètre h - heure jai - jour après inoculation L - litre M - mole/litre qsp - quantité suffisante pour % - pourcent λ - longueur d onde C - degrés Celcius 5

6 Introduction Générale Liste des figures Introduction Figure i.1 - Illustration des différents types d interactions plante/parasite. Figure i.2 - Représentation schématique de différentes protéines R et de leur localisation cellulaire. Figure i.3 - Hypothèse du modèle de garde. Figure i.4a - Répartition des clusters de gènes de RGAs sur les 5 chromosomes d Arabidopsis thaliana. Figure i.4b - Répartition des clusters de RGAs sur les 8 chromosomes de Medicago truncatula. Figure i.5 - Illustration schématique des réactions de défense induites lors d interactions plantes/agent pathogène ou éliciteurs/plante. Figure i.6 - Modèle en zigzag illustrant le niveau de défense quantitatif du système immunitaire des plantes. Figure i.7 - Base conceptuelle de la cartographie de QTL sur une population F2. Figure i.8 - Production de Légumineuses en Europe en Figure i.9 - Croisements établis avec les lignées de M. truncatula. Figure i.10 - Carte consensus représentant la synthénie entre les six principales légumineuses. Figure i.11 - Illustration des symptômes provoqués par les anthracnoses les plus dommageables sur légumineuses. Figure i.12 - Processus infectieux hémibiotrophe développé par C. lindemuthianum. Figure i.13 - Observations des symptômes présentés par les lignées A17 (Jemalong) et F après inoculation par la race 1 de C. trifolii. Chapitre I Figure I.1 - Phénotypes des trois isolats de C. trifolii. Figure I.2 - Schéma de la région ITS séquencée. Figure I.3 - Alignement entre les séquences ITS des trois souches de C. trifolii. Figure I.4 - Alignement entre les séquences ITS de différentes espèces de Colletotrichum. Figure I.5 - Arbre phylogénique de différentes espèces de Colletotrichum. Figure I.6 - Distribution de la population de RILs en fonction de leur moyenne phénotypique après inoculation des trois souches de C. trifolii sur feuilles détachées. Figure I.7 - Représentation par groupe de similarité de phénotype de la population de RILs de M. truncatula inoculées avec les trois races de C. trifolii. 6

7 Introduction Générale Figure I.8 Détection de QRLs chez M. truncatula associés à la résistance aux trois races de C. trifolii par PlabQTL. Figure I.9 - Stratégie adoptée pour la cartographie fine du locus de résistance à C. trifolii. Figure I.10 - Carte physique au niveau du locus de résistance à C. trifolii au moment de l analyse. Figure I.11 - Lignées recombinantes dans le locus de résistance. Figure I.12 - Phénotype de la descendance de trois RILs hétérozygotes dans le locus de résistance à C. trifolii. Figure I.13 - Obtention et phénotypes des lignées quasi-isogéniques issues des RILs hétérozygotes 195 et 210. Figure I.14 - Recherche de nouveaux recombinants entre les marqueurs Mc2 et Mc4 sur environ 400 descendants F9 de la RIL n 210-F8. Figure I.15 - Fixation et phénotype des NILs recombinants descendants de la lignée n 210. Figure I.16 - Cartographie fine des gènes de résistances aux 3 races de C. trifolii chez M. truncatula. Chapitre II Figure II.1 - Phénotype de la lignée F après inoculation racinaire par C. trifolii. Figure II.2 - Les différents modes de pénétration de C. trifolii dans les racines de Medicago truncatula. Figure II.3 - Développement de C. trifolii dans les racines de F Figure II.4 Infection racinaire par C. trifolii de la lignée résistante A17 en comparaison de la lignée sensible F Figure II.5 Echelle quantitative de l invasion racinaire utilisée pour l analyse génétique. Figure II.6 Répartition de la population de RILs en fonction de leur moyenne phénotypique sur racines et sur feuilles. Figure II.7 Détection de QTL de résistance à l infection racinaire de C. trifolii comparé à celui identifié sur feuilles et phénotype des NILs et Figure II.8 Développement de C. lindemuthianum dans les racines de M. truncatula. Figure II.9 Représentation schématique du développement de C. trifolii dans les racines de M. truncatula. 7

8 Introduction Générale Matériels et Méthodes Figure m&m.1 - Croisements établis avec les lignées de M. truncatula dans les laboratoires à Tunis, Toulouse, Montpellier, et Rennnes. Figure m&m.2 - Réaction chimique mise en jeu pour le dosage des espèce activées de l oxygène. Figure m&m.3 - Echelle de symptômes utilisée lors du phénotypage sur feuille détachées, 7 jours après inoculation. Figure m&m.4 - Echelle quantitative de l invasion racinaire utilisée pour l analyse génétique. Annexes Annexes 3 Carte génétique du croisement LR5 Carte génétique de Medicago truncatula enrichie en marqueurs sur le groupe de liaison 4 utilisée pour la détection de QTL de résistance à l infection racinaire. Annexes 5 Alignement entre les séquences ITS de l isolat français C86-2 et le japonais MAFF

9 Introduction Générale Liste des tableaux Introduction Tableau i.1 - Les classes majeures des gènes de résistance clonés Tableau i.2 - Principales maladies des légumineuses. Tableau i.3 - Principaux outils disponibles sur Medicago truncatula. Tableau i.4 - Résumé des études illustrant la variabilité naturelle de réponse de M. truncatula aux agents pathogènes de légumineuses. Tableau i.5 - Interactions race/cultivars spécifiques entre les deux lignées de référence de M. sativa et les races 1 et 2 de C. trifolii. Chapitre I Tableau I.1 - Analyse de la réponse de lignées de référence de M. sativa à l inoculation par les trois isolats de C. trifolii. Tableau I.2 - Analyse de la réponse de lignées de M. truncatula à l inoculation par les trois isolats de C. trifolii. Tableau I.3 - Paramètres biométriques des QRLs identifiés. Tableau I.4 - Paramètres biométriques des QTLs obtenus avec la carte LR5 enrichie en marqueurs dans le locus de résistance. Matériels et Méthodes Tableau M&M.1 - Programme PCR utilisé pour l amplification de fragments d ADN. Annexes Annexe I Milieux de culture Milieu M pour la culture des plantes in vitro Composition des milieux de culture de Colletotrichum trifolii Composition des milieux pour l électroporation d E. coli. Annexes 2 Solutions utilisées en biologie moléculaire Tampon CTAB pour l extraction d ADN génomique Tampon TAE (Tris Acétate EDTA) Solution stock de polyacrylamide Annexes 4 Caractéristiques des amorces utilisées. 9

10 Introduction Générale Sommaire Introduction Générale 15 1 ière Partie - La résistance des plantes aux maladies 16 De la reconnaissance à la défense, les différentes étapes 17 I. Les signaux de reconnaissance 17 I.1. La reconnaissance générale non-spécifique d hôte 17 I.2. La reconnaissance spécifique 18 I.2.1. Les gènes d avirulence 20 I.2.2. Les gènes de résistance 20 I.2.3. Les différents modèles de perception R/Avr 26 I.2.4. Répartition des gènes de résistance dans les génomes 26 I.2.5. Evolution des gènes de résistance 28 II. La signalisation conduisant à la défense 30 II.1. Les flux ioniques et la dépolarisation membranaire 30 II.2. Les espèces activées de l oxygène (ROS) 31 II.3. Gènes de résistance et réseaux de signalisation 31 II.4. La phosphorylation ou voie des MAP kinases 31 II.5. Les hormones et autres molécules signaux de la défense 32 II.5.1. Les hormones 32 II.5.2. Les interconnexions entres les différentes voies 33 II.5.3. L oxyde nitrique (NO) 33 II.6. Les facteurs de transcription 34 III. Les réponses de défense 34 III.1. La constitution des barrières physiques 34 III.1.1. Les dépôts de callose 34 III.1.2. Accumulation d HRGP et de polymères pariétaux 35 III.2. La synthèse de composés antimicrobiens 35 III.2.1. Les dépôts de callose 35 III.2.2. Les ROS 36 III.2.3. Les protéines PR 36 III.2.4. Les phytoalexines 37 Durabilité et efficacité de la résistance, notions de résistance quantitative 39 I. Naissance d une théorie 39 II. Origines d une résistance quantitative. 40 III. Principe de la cartographie de QTL 44 IV. Limites de la cartographie de QTL 45 IV.1. Densité des cartes génétiques 45 IV.2. Détection des QTLs proches et mineurs 45 IV.3. Impact de l environnement et qualité du phénotypage 46 V. Clonage de QRLs 46 2 ème Partie Les Légumineuses et l anthracnose 48 I. Les Légumineuses et leur importance 48 II. Medicago truncatula, légumineuse modèle 50 II.1. Vers une Légumineuse modèle 50 II.2. Les ressources génétiques pour l étude de la résistance aux maladies 52 II.3. Medicago truncatula et la synthénie 52 10

11 Introduction Générale III. L anthracnose, maladie majeure des Légumineuses 55 IV. L anthracnose de la luzerne 55 V. La résistance à l anthracnose 57 VI. Le Pathosystème C. trifollii / M. truncatula 57 Objectifs de la thèse 60 Chapitre I - Analyses génétiques de la résistance foliaire de Medicago truncatula à l anthracnose 61 Analyse génétique de la résistance aux races 1 et 2 de Colletotrichum trifolii. 63 Analyse génétique de la résistance à l isolat C I. Caractéristiques morphologiques 74 II. Analyse des séquences ITS 76 III. Comparaison des phénotypes de lignées de M. truncatula vis-à-vis des trois souches de C. trifolii 78 IV. Phénotypage d une population de lignées recombinantes 80 V. Détection de QTL de résistance 82 VI. Conclusions 82 Cartographie fine des gènes de résistance à l anthracnose de Medicago truncatula. _85 I. Ajout de nouveaux marqueurs 85 II. Validation du QRL - Création de lignées quasi-isogéniques (NILs) 87 III. Réduction du locus de résistance par la création de NILs recombinantes 89 IV. Contigage du locus et localisation des gènes 91 V. Conclusions 93 Chapitre II - Etude cytologique et génétique de l infection racinaire de Medicago truncatula par Colletotrichum spp. 96 Introduction 97 Résultats 101 I. Capacité de C. trifolii à pénétrer à l intérieur des racines de M. truncatula 101 II. Modes de pénétrations de C. trifolii dans les racines de M. truncatula 103 III. Développement de C. trifolii à l intérieur des racines 103 IV. Mécanismes de résistance dans la racine de Medicago truncatula 105 V. Phénotypage de la population de RILs 109 VI. Recherche de QRL racinaire 111 VII. Spécificité de l infection 113 Discussion 114 Conclusion 120 Conclusions et Perspectives

12 Introduction Générale Matériels et Méthodes 127 I. Matériel biologique 129 I.1. Medicago truncatula 129 I.1.1. Lignées utilisées 129 I Lignées parentales et population de lignées recombinantes 129 I Lignées quasi-isogéniques 129 I.1.2. Germination des graines 129 I.1.3. Conditions de culture 130 I.2. Colletotrichum trifolii 130 I.2.1. Souches utilisées 130 I.2.2. Conditions de culture 131 II. Méthodes 132 II.1. Méthodes d inoculation 132 II.1.1. Inoculations sur plantes entières 132 II.1.2. Inoculation de feuilles excisées 132 II.1.3. Inoculation de cotylédons in vitro 132 II.1.4. Inoculation de racines in vitro 133 II.1.5. Test sur vermiculite de plantes inoculées sur racines 133 II.2. Méthodes pour les analyses cytologiques, microscopiques, et chimiques _ 133 II.2.1. Fixation des échantillons 133 II.2.2. Coupe des échantillons 133 II.2.3. Coloration du champignon à la WGA-FITC 135 II.2.4. Détection des dépôts de callose 135 II.2.5. Détection des composés phénoliques 135 II.2.6. Quantification des espèces actives de l oxygène 135 II.2.7. Préparation des échantillons pour la microscopie à balayage 137 II.3. Méthodes de Biologie Moléculaire 137 II Extraction d ADN 137 II.3.2. Amplification de fragments par PCR 137 II.3.3. Analyse d ADN 138 II Analyses électrophorétiques d ADN 138 II Electrophorèse d ADN sur gel d agarose 138 II Electrophorèse d ADN sur gel d acrylamide 138 II Séquençage des fragments d ADN 138 II.3.4. Méthodes pour l analyse des séquences ITS 139 II Purification de fragments d ADN 139 II Introduction d ADN dans les bactéries compétentes 139 II Electrotransformation de bactéries compétentes 139 II Sélection des clones bactériens transformés 140 II Sélection blanc-bleu 140 II Criblage par PCR 140 II Extraction de plasmide 140 II Séquençage et analyse des fragments 140 II.4. Analyse génétique de la résistance à C. trifolii 141 II.4.1. Principe 141 II.4.2. Identification de marqueurs moléculaires 141 II Marqueurs microsatellites 141 II Identification

13 Introduction Générale II Révélation 143 II Marqueurs SNP 143 II Identification de marqueurs SNP 143 II Révélation des marqueurs SNP 145 II.4.3. Génotypage des lignées recombinantes 145 II.4.4. Elaboration de la carte génétique du croisement LR5 145 II.4.5. Phénotypage de la population de RILs 145 II Phénotypage sur feuilles détachées 145 II Phénotypage sur racines 147 II.4.6. Méthodes de détection des QTL 147 Références bibliographiques 149 Annexes 166 Liste des activités effectuées au cours de la thèse

14 Introduction Générale Préambule Les travaux exposés dans ce mémoire ont pour objectif l étude de la résistance de Medicago truncatula à Colletotrichum trifolii. Au cours de l introduction générale, seront successivement présentés sous forme de revue bibliographique les différents aspects de la résistance des plantes (première partie) puis des informations concernant plus spécifiquement la résistance des Légumineuses et l anthracnose (deuxième partie). L ensemble de ces données constitue la toile de fond des résultats et de leur discussion traitant respectivement de l analyse génétique de la résistance foliaire (premier chapitre) puis de la mise en évidence cytologique et génétique de la résistance racinaire (deuxième chapitre). 14

15 Introduction Générale Introduction Générale 15

16 Introduction Générale 1 ière Partie - La résistance des plantes aux maladies L interaction entre une plante et des microorganismes potentiellement pathogènes est une des constantes de la nature. Le développement d une maladie n est possible que si l agent pathogène parvient à outrepasser les différentes barrières de l hôte. Cependant, cette situation reste exceptionnelle car le microorganisme est le plus souvent incapable d infecter la plante en raison de l existence d un système de défenses préformées basées sur des polymères hydrophobes de surfaces (Tsuba et al., 2002) ainsi que la production constitutive de composés antimicrobiens (Papadopoulou et al., 1999). Ce premier niveau de résistance non hôte est associé à des défenses passives. Les autres niveaux de résistance sont caractérisés par la mise en jeu de mécanismes de défenses induites (ou activées). Ceux-ci résultent de la reconnaissance initiale entre la plante et l agent pathogène qui peut être générale ou spécifique. Il s ensuit une activation de cascades de signaux conduisant à l induction des gènes de défense et à la synthèse de plusieurs protéines et autres molécules qui créent un environnement défavorable à l invasion du parasite. Les signaux émis lors de la défense peuvent s étendre par la suite aux cellules adjacentes conduisant à une résistance locale acquise (LAR: Local Acquired Resistance) puis gagner l ensemble de la plante empêchant ainsi d éventuelles infections secondaires, on parle alors de résistance systémique acquise (SAR: Systemic Acquired Resistance) (Durrant and Dong, 2004). La partie bibliographique ci-après, aborde les différentes étapes impliquées dans la mise en place des mécanismes de résistance active qui peut être de type qualitatif ou quantitatif. La première a été largement documentée depuis l énoncé du concept «gène pour gène» par Flor en La seconde, basée sur les outils de génétique quantitative est en revanche moins bien connue ; aussi les concepts et techniques utilisés pour l appréhender seront-ils présentés, car ils constituent la base sur laquelle s appuient les travaux exposés dans ce mémoire. 16

17 Introduction Générale De la reconnaissance à la défense, les différentes étapes I. Les signaux de reconnaissance I.1. La reconnaissance générale non-spécifique d hôte La résistance non-spécifique d hôte est basée sur la reconnaissance d éliciteurs généraux communs à de nombreux agents pathogènes. Initialement, le terme éliciteur a été utilisé pour décrire les molécules capables d induire la production des phytoalexines (Keen, 1975), puis il a été étendu à l ensemble des molécules qui induisent les réactions de défense chez les plantes (Montesano et al., 2003). Ainsi, d après cette définition, les éliciteurs peuvent avoir une origine microbienne (éliciteurs exogènes : constituant des surfaces, ou molécules sécrétées), ou bien provenir de la dégradation de la paroi cellulaire végétale sous l action des enzymes hydrolytiques du parasite (éliciteurs endogènes) (Montesano et al., 2003; Garcia-Brugger et al., 2006). Ces éliciteurs appartiennent à plusieurs familles chimiques : protéines, glycoprotéines, glycanes, lipides. La notion d éliciteur a ensuite évolué vers celle de PAMP (Pathogen Associated Molecular Pattern) en raison notamment de convergences de résultats entre les travaux réalisés sur l immunité innée des mammifères et des plantes (Medzhitov and Janeway, 1997; Nürnberger and Brunner, 2002). Le terme PAMPs a été introduit pour décrire des motifs présents dans des molécules d origine microbienne, capables de déclencher les réactions de défense. De telles molécules sont souvent indispensables à la pathogénicité et à la survie de l agent pathogène (McGuinness et al., 2003). Les PAMP actuellement connus sont retrouvés dans des molécules polysaccharidiques ou protéiques. Les PAMPs de nature polysaccharidique sont représentés respectivement par les oligomères de β-glucanes communs aux parois végétales et fongiques, les oligomères de chitine ou de chitosan présents dans les parois des champignons et des insectes, et enfin, les oligogalacturonates des parois végétales (Shibuya and Minami, 2001). Plusieurs PAMPs présents dans des composés protéiques ont également été identifiés. Le plus connu d entre eux est un peptide de 22 acides aminés (flg22) contenu dans la flagelline, protéine majeure constituant le flagelle des bactéries (Zipfel et al., 2004). Cette protéine est reconnue chez les plantes par un récepteur like-kinase (RLK) appelé FLS2 pour flagellin-sensing locus2 (Gomez-Gomez and Boller, 2002). FLS2 est une protéine transmembranaire avec un domaine protéine kinase intracytoplasmique et un domaine LRR extracytoplasmique (Gomez-Gomez and Boller, 2000). La flagelline induit plusieurs réponses cellulaires dont l alcanilisation du milieu extracellulaire, la production d éthylène chez la tomate et le riz (Felix et al., 1999; Che et al., 2000), l activation d une cascade de MAPK 17

18 Introduction Générale (Mitogen Activated Protein Kinase) (Asai et al., 2002), et finalement l induction rapide de la transcription de 1100 gènes chez A. thaliana (Zipfel et al., 2004). FLS2 fait partie de la famille des PRR (Pattern Recognizing Receptor) de plantes qui comprend actuellement quatres autres récepteurs connus. EFR, un autre récepeur LRR-RLK (Leucine Rich Repeat Receptor Like Kinase) reconnaît le PAMP bactérien EF-Tu (Zipfel et al., 2006). Deux autres récepteurs sont des RLPs (Receptor Like Protein), il s agit de LeEix qui reconnaît un domaine de la xylanase fongique ElX (Ron and Avni, 2004), et de CEBiP, récepteur protéique à domaine LysM extracytoplasmique impliqué dans la perception de la chitine chez le riz, (Kaku et al., 2006). Un cinquième RLK de type LysM-RLK a récemment été identifié chez Arabidopsis, il a été nommé CERK1 (ou LysM RLK1) et est impliqué dans la perception spécifique et la transduction du signal relative à la reconnaissance d oligomères de chitine (Miya et al., 2007; Wan et al., 2008). Ces PRRs sont localisés au niveau de la membrane plasmique et sont susceptibles d activer des cascades de signalisation impliquant des flux de Ca 2+ et des MAPK qui induisent à leur tour des réactions de défense. Ainsi la reconnaissance des PAMPs comme «non soi» par la plante constitue donc le premier niveau d activation des défenses végétales. Ce mécanisme, caractérisé sous le terme PTI (PAMP Triggered Immunity) correspond aussi à ce que l on appelle le système d immunité basal (Jones and Dangl, 2006). Compte tenu de la conservation des motifs reconnus, il confère donc une protection à large spectre non spécifique d hôtes et d agents pathogènes. I.2. La reconnaissance spécifique Il s agit du deuxième niveau de reconnaissance des plantes, lorsque les parasites sont capables de franchir la barrière de la reconnaissance non-spécifique. Elle est liée à la détection spécifique de certaines races, appartenant à une espèce de microorganisme pathogène, par certaines variétés, appartenant à une espèce de plante hôte. On doit à Flor la démonstration que la résistance spécifique de race et de cultivar ne dépend en général que d un seul gène dans chaque partenaire (Flor, 1955). D où le concept gène-pour-gène selon lequel la présence simultanée et spécifique du produit d un gène de résistance (R) dans le génome d une plante et du produit d un gène d avirulence (Avr) correspondant dans celui d un parasite conduit à une résistance spécifique souvent caractérisée par la mort cellulaire programmée des cellules attaquées, aussi appelé réaction hypersensible (HR). L interaction est alors considérée comme incompatible. Ce phénomène de résistance, basé sur la reconnaissanse spécifique d effecteurs de l agent pathogène est qualifiée d ETI (Effector-Triggered Immunity). Dans le cas où le 18

19 Figure i.1 - Illustration des différents types d interactions plante parasite reliés aux déterminants de la reconnaissance du parasite et à la nature des défenses mises en jeu pour chacune d entre elles (Hammond-Kosack et Kanyuka, 2007).

20 Introduction Générale parasite est capable de contourner tous les systèmes de reconnaissance de son hôte, il parvient à se développer et à accomplir son cycle en provoquant la maladie. Cette sensiblilité de la plante due aux effecteurs du parasite est qualifiée d ETS (Effector-Triggered Susceptibility) (Jones and Dangl, 2006) (Fig i.1). I.2.1. Les gènes d avirulence (Avr) Les gènes d avirulence codent des protéines qui possèdent une activité élicitrice spécifique aux cultivars de plantes qui possèdent les récepteurs race-spécifique correspondants (Montesano et al., 2003). Les protéines d avirulence peuvent être considérées comme des effecteurs de par leur rôle dans le pouvoir pathogène du microorganisme (Ellis et al., 2007; Gohre and Robatzek, 2008). De nombreux gènes d avirulence ont été isolés chez les champignons, les bactéries et les virus et les oomycètes (Catanzariti et al., 2007; Ellis et al., 2007; Gohre and Robatzek, 2008). Dans le cas des bactéries, elles sont injectées directement dans le cytoplasme des cellules végétales grace au système de sécrétion de type III (Espinosa and Alfano, 2004). Dans le cas des champignons, elles sont majoritairement secrétées de façon extracellulaire. A titre d exemples, on peut également citer avrrpm1 et avrpto de Pseudomonas syringae, inducteurs de la résistance RPM1- et Pto-dépendante chez Arabidopsis et la tomate, respectivement (Nimchuk et al., 2001) ; ou Avr9 de Cladosporium fulvum sécrété dans l apoplaste et inducteur de la résistance cf9-dépendante dans la tomate (Piedras et al., 2000). Chez les oomycètes, les protéines d avirulence contiennent un motif d acide aminé RXLR, elles sont secrétées dans la matrice extra-haustoriale puis internalisées dans la cellule hôte (Birch et al., 2008). I.2.2. Les gènes de résistance Plus de 60 gènes R ont été clonés à partir des plantes mono et dicotylédones (Martin et al., 2003; Hammond-Kosack and Kanyuka, 2007) (Fig i.2) (Tableau i.1). La comparaison de la structure des protéines R qu ils codent révèle la présence de domaines protéiques conservés, impliqués dans la reconnaissance et la transduction de signaux (DeYoung and Innes, 2006). Les gènes R sont subdivisés en fonction de ces domaines en 5 classes majeures (van Ooijen et al., 2007). Les deux premières classes représentent la majorité des protéines R. Elles sont cytoplasmiques et portent un domaine central NB (Nucleotide-Binding domain) très conservé faisant partie d une entité plus grande appelée domaine NB-ARC, qui est présent dans APAF- 1 (Apoptotic protease-activating factor1) chez l Homme et la protéine CED4 chez 20

21 Tableau i.1 Exemples de gènes R clonés Nom Plante Confère la résistance à Domaines Références RAC1 A. thaliana Albugo candida TIR-NB-LRR (Borhan et al., 2004) RPP5 A. thaliana Hyaloperenospora parasitica TIR-NB-LRR (Parker et al., 1997) L6 lin Melamspora lini TIR-NB-LRR (Lawrence et al., 1995) Y-1 pomme de terre Potato Virus Y TIR-NB-LRR (Vidal et al., 2002) Bs4 tomate Xanthomonas campestris TIR-NB-LRR (Schornack et al., 2004) N tabac virus de la mosaïque du tabac TIR-NB-LRR (Whitham et al., 1994) Gro1-4 pomme de terre Globodera rostochiensis TIR-NB-LRR (Paal et al., 2004) RRS-1 A. thaliana Ralstonia solanacearum TIR-NB-LRR- NLS-WRKY (Deslandes et al., 2002) RPM1 A. thaliana Pseudomonas syringae pv. maculicola CC-NB-LRR (Grant et al., 1995) MLA orge Blumeria graminis f.sp. hordei CC-NB-LRR (Jorgensen, 1994) RPS2 A. thaliana Pseudomonas syringae pv. maculicola CC-NB-LRR (Bent et al., 1994) RPG1-b soja Pseudomonas syringae pv. glycinea CC-NB-LRR (Ashfield et al., 2003) Rps1-k soja Phytophtora sojae CC-NB-LRR (Gao et al., 2005) Xa-21 riz Xanthomonass oryzae pv. oryzae RLK (Song et al., 1995) RPG1 orge Puccinia graminis f.sp. tritici RLK (Brueggeman et al., 2002) Cf-2,4,5, 9 tomate Cladosporium fulvum RLP (Jones et al., 1994) (Rivas and Thomas, 2005) Pi-ta riz Magnaporte grisea NB-LRD (Bryan et al., 2000) Ve1 tomate Verticillium albo-atrum CC-LRR-TM- ECS (Kawchuk et al., 2001) Ve2 tomate Verticillium albo-atrum LRR-TM-PEST- ECS (Kawchuk et al., 2001) RPW8 A. thaliana Erysiphe cichoracearum CC-TM (Xiao et al., 2001) RFO1 A. thaliana Fusarium oxysporum WAK-TM-K (Diener and Ausubel, 2005) Asc1 tomate Alternaria alternata f.sp lycopersici TM (Brandwagt et al., 2000) Hm1 maïs Cochliobolus carbonum toxine réductase (Johal and Briggs, 1992) Pto tomate Pseudomonas syringae pv. tomato K (Martin et al., 1993) PBS1 A. thaliana Pseudomonas syringae pv. phaseolicola K (Swiderski and Innes, 2001) Xa27 riz Xanthomonas oryzae 2 hélices alpha (Gu et al., 2005) Pi-d2 riz Magnaporte grisea BLR-TM-K (Chen et al., 2006) TIR: Toll and Interleukin 1 receptor-like motif ; NB: nucleotide binding site ; LRR: leucine-rich repeat ; NLS: nuclear localization signal ; WRKY: motif d acides aminés caractéristique de certains facteurs de transcription des plantes ; CC: coiled-coil ; RLP: receptor-like protein ; RLK: receptor-like kinase ; LRD: leucine-rich domain ; TM: transmembran domain ; ECS: endocytosis signal ; PEST: séquence Pro-Glu-Ser-Ther-like ; WAK: wall-associated kinase domain ; K: kinase ; BLR: beta-lectin receptor

22 Introduction Générale Caenorbabditus elegans (Van Der Biezen and Jones, 1998). Du côté C-terminal, le domaine NB-ARC est lié à un deuxième domaine LRR «Leucine-Rich Repeat» très variable composé de motifs répétés riches en leucines. Les domaines LRR sont retrouvés dans des protéines de natures très diverses et sont impliqués dans les interactions protéine-protéine ou protéinepolysaccharide, ainsi que dans d autres liaisons peptide-ligand (Kobe and Kajava, 2001). Ils porteraient la spécificité de reconnaissance de la protéine d avirulence (DeYoung and Innes, 2006). Le complexe des deux est appelé NB-LRR. Sur la base de leurs domaines N-terminal, les protéines NB-LRR sont subdivisées en deux classes en fonction du motif présent sur leur partie N-terminale. La première catégorie est constituée par les TIR-NB-LRR ou (ou TNL), en raison des homologies trouvées avec le domaine protéique TIR (Toll Interleukine-Receptor) similaire au récepteur des interleukines retrouvé sur les lymphocytes intervenant dans l immunité innée des animaux (Whitham et al., 1994). Chez les plantes, il peut interagir avec les molécules effectrices de l agent pathogène (Burch-Smith and Dinesh-Kumar, 2007). Ce domaine interviendrait aussi dans la signalisation conduisant à la mort cellulaire programmée (Swiderski et al., 2009). Chez A. thaliana la majorité des gènes à domaine NB-LRR appartient à la classe des TNLs (Meyers et al., 1999), qui est absente chez les monocotylédones (Pan et al., 2000). Chez les solanacées plusieurs gènes appartenant à cette classe ont été clonés : Bs4 chez la tomate (Schornack et al., 2004), Gro1-4 chez la pomme de terre (Paal et al., 2004) et N chez le tabac (Whitham et al., 1994) conférant la résistance respectivement à Xanthomonas campestris, Globodera rostochiensis et au virus de la mosaïque du tabac. La deuxième catégorie est représentée par les CC-NB-LRR (ou CNL) et possède un domaine avec une structure Coiled-coil (CC) impliqué dans les interactions avec des molécules signaux (DeYoung and Innes, 2006). Un des représentants de cette classe est le gène RPS2 identifié chez Arabidopsis qui code pour une protéine reconnaissant spécifiquement la protéine avrrpt2 de Pseudomonas syringae pv. maculicola (Leister et al., 1996). Chez cette même plante un autre gène appartenant à la classe des CNL, RPM1 confère la résistance à des souches de P. syringae ayant les gènes avrb ou avrrpm1 (Bent et al., 1994; Grant et al., 1995). Chez les Légumineuses, deux gènes de cette classe ont été clonés chez le soja : Rpg1-b et Rps1-k qui confèrent la résistance respectivement à Pseudomonas syringae pv. glycinea et Phytophtora sojae (Ashfield et al., 2003; Gao et al., 2005). Parmi les autres gènes R, certains possèdent un domaine LRR extracytoplasmique connecté, du côté C-terminal, à un domaine transmembranaire suivi d une région 22

23 Figure i.2 - Représentation schématique de différentes protéines R et de leur localisation cellulaire (Hammond-Kosack et Kanyuka, 2007). Les domaines prédits des protéines R conférant la résistance race-spécifique ou race non-spécifique sont représentés schématiquement : TIR: Toll and Interleukin 1 receptor-like motif ; CC: coiled-coil ; NB: nucleotide binding site ; LRD: leucine-rich domain ; LRR: leucine-rich repeat ; NLS: nuclear localization signal; ECS: endocytosis signal ; PEST: séquence Pro-Glu-Ser-Ther-like ; WRKY: motif d acides aminés caractéristique de certains facteurs de transcription des plantes ; 1, 2, 3, 4: domaines sans homologie significative avec des domaines protéiques connus ; 5: domaine présentant une homologie avec la beta-lectine ; 6: structure ayant une légère similarité avec un domaine PAN ; 7: structure ayant une homologie avec le domaine EGF du facteur de croissance épidermique. Les deux protéines Ve diffèrent dans leurs structures : Ve1 contient un domaine putatif CC mais pas de séquence PEST en C-terminal, Ve2 n a pas de domaine CC en N- terminal mais possède une séquence PEST en C-terminal.

24 Introduction Générale cytoplasmique variable. Si ce domaine cytoplasmique contient un domaine kinase, la protéine R est classée parmi les RLK (Receptor-Like Kinase). Le gène Xa21 est un représentant de cette classe confèrant au riz la résistance à la bactérie pathogène Xanthomonass oryzae pv. oryzae (Song et al., 1995). La protéine correspondante possède un domaine LRR extra cytoplasmique en N-terminal, un motif transmembranaire ainsi qu un domaine Sérine/Thréonine kinase cytoplasmique en C-terminal. La famille de gène Xa chez le riz, et Bs chez la tomate, comporte de nombreux membres de structures différentes conférant la résistance au genre Xanthomonas (Schornack et al., 2006) Si le domaine kinase n existe pas, la protéine fait partie alors de la classe RLP «Receptor- Like Protein». Cette classe est essentiellement représentée par la famille de gènes Cf conférant la résistance race-spécifique à Cladosporium fulvum chez la tomate (Rivas and Thomas, 2005). Les protéines correspondantes sont caractérisées par l existence d un domaine riche en répétitions en leucine (domaine LRR) en position N-terminale et des domaines transmembranaires putatifs en C-terminal. Malgré cette classification, il existe des protéines R qui ne font partie d aucune de ces classes auparavant définies. Ainsi, le gène Asc1 (Alternaria stem cancer) confère la résistance à Alternaria alternata f.sp lycopersici chez la tomate (Brandwagt et al., 2000). Ce gène, identifié en réponse aux toxines produites par le champignon code une protéine à six domaines transmembranaires, ne présentant aucune homologie avec les gènes de résistance connus jusqu alors. Des homologues à Asc1 ont également été trouvés chez A. thaliana (Brandwagt et al., 2000). Le gène Hm1 représente la classe des gènes codant des toxines réductases ; il confère la résistance chez le maïs à la race 1 du champignon Cochliobolus carbonum (Johal and Briggs, 1992) et code une HC-toxine réductase capable d inactiver la toxine produite par cette race, conférant ainsi une résistance race-spécifique au maïs. Cette famille de gènes semble particulièrement conservées chez les céréales puisque des homologues ont été retrouvés chez l orge ou encore le blé (Han et al., 1997). La famille de gènes RPW confère la résistance à Erysiphe cichoracearum chez A. thaliana (Xiao et al., 2001). Les protéines cytoplasmiques RPW8.1 et RPW8.2 sont caractérisées par la présence d un signal d ancrage putatif en N-terminal, suivi d un domaine CC. Un domaine transmembranaire, situé en C-terminal, intervient dans la reconnaissance directe d un facteur d avirulence et facilite la reconnaissance d autres molécules (Fluhr, 2001). Les gènes Pto et PBS1 conférent respectivement la résistance à Pseudomonas syringae pv. tomato chez la tomate (Martin et al., 1993) et à P. syringae pv. phaseolicola chez A. thaliana (Swiderski and 24

25 Figure i.3 - Hypothèse du modèle de garde (Bonas et Lahaye 2002). Les protéines R sont en vert. Les protéines Avr (A) sont en rouge. (a) Le modèle classique de ligand-récepteur prévoit une interaction directe entre la protéine R et Avr pour initier les réactions de défense. (b) Selon le modèle de co-récepteur, l interaction de la protéine Avr se fait d abord avec un co-récepteur de haute affinité (en bleu), qui agit à son tour (double flèche) avec la protéine R pour obtenir la réponse. (c) Dans le cadre conceptuel du modèle de garde, la protéine de résistance est gardée par une protéine cible correspondante (P en jaune) qui interagit avec la protéine Avr. (d) Etant donné que plusieurs gènes d avirulence bactériens, fongiques et viraux codent des protéases, ce modèle d activation de défense dépendant de la voie protéolytique, a été proposé pour expliquer l interaction. X : protéine ciblée par la protéase; AP : apoplaste ; PM : membrane plasmique ; CY : cytoplasme.

26 Introduction Générale Innes, 2001). Pto est une sérine/thréonine protéine kinase qui reconnait deux effecteurs de Pseudomonas syringae, AvrPto et AvrPtoB (Abramovitch and Martin, 2005). L activité de Pto requiert la présence de Prf, une protéine à domaine NB-LRR, l association des deux déclenchant les mécanismes de défense (Mucyn et al., 2006). I.2.3. Les différents modèles de perception R/Avr Le modèle gène-pour-gène initial présumait l existence d une interaction physique entre éliciteur Avr et protéine R. Des preuves du contact direct entre les deux types de protéines ont été fournies pour quelques modèles, tels que Pita/AvrPita (Jia et al., 2000), PopP2/RRS-1 (Deslandes et al., 2003), et L/AvrL567 (Dodds et al., 2006). Cependant, les cas d interaction directe R-Avr restent rares, laissant supposer une relation plus complexe (Ellis et al., 2000). Un nouveau modèle a donc été proposé, impliquant l intervention d une troisième composante dans cette interaction (Bergelson et al., 2001; Luderer et al., 2001; Van der Hoorn et al., 2002). Dans ce dernier modèle, appelé «hypothèse de garde», la protéine Avr et la protéine R feraient partie d un complexe incluant une protéine de garde médiant l interaction (Fig. i.3). Différents modes d action ont été proposés pour appuyer cette hypothèse (Dangl and Jones, 2001; Bonas and Lahaye, 2002) : i. la liaison du produit du gène d avirulence à la protéine R se ferait par l intermédiaire de la protéine de garde; ii. l accrochage d Avr induirait la dissociation du complexe protéine de garde-protéine R entraînant des défenses; iii. la protéine R s associerait au complexe protéique une fois l éliciteur fixé ; et enfin iv. la liaison de l éliciteur au complexe protéique entraînerait l activation de la protéine R. Ce dernier modèle ne s applique cependant pas à tous les pathosystèmes mais il pourrait expliquer le fait, par exemple, que la protéine kinase Pto chez la tomate requiert la présence de la protéine Prf pour activer les mécanismes de défense consécutivement à la reconnaissance d AvrPto (Mucyn et al., 2006). I.2.4. Répartition des gènes de résistance dans les génomes Les gènes de type NBS-LRR, qui constituent la classe majeure des gènes de résistance dans le règne végétal, sont regroupés à l intérieur de loci contenant soit des gènes isolés (singletons), soit des gènes regroupés en réseaux de gènes très liés appelés clusters (Holub, 2001). Pour la plupart des NBS-LRR, la fonction de ces gènes n est pas connue, mais leur similarité avec les gènes de résistance clonés fait qu on les classe comme des analogues de gènes de résistance (ou RGAs, Resistance Genes Analogs). 26

27 Figure i.4a - Répartition des clusters de gènes de RGAs sur les 5 chromosomes d Arabidopsis thaliana (Meyers et al., 2003). Figure i.4b - Répartition des clusters de RGAs sur les 8 chromosomes de Medicago truncatula (Ameline-Torregrosa et al., 2008). Les gènes de la classe TNL sont en rouge, ceux de la classe des CNL sont en vert.

28 Introduction Générale Les programmes de séquençage des génomes de différentes plantes, couplés aux analyses bioinformatiques, ont permis de révéler que les gènes R les plus représentés se regroupaient au sein de certaines régions des génomes analysés. Dans le cas le plus simple, le locus de résistance contient plusieurs allèles d un même gène R ; ainsi chez le lin le locus L contient 13 allèles. Trois loci supplémentaires de résistance à Melampsora lini ont également été caractérisés chez cette plante. Parmi eux, le locus M est un locus de résistance plus complexe qui contient au moins 7 RGAs différents dont un seul est responsable de la résistance (Anderson et al., 1997). Ces types de loci présentant des combinaisons plus ou moins complexes d allèles et de gènes différents dirigés contre un ou plusieurs agents pathogènes sont les plus courants. A titre d exemple, le locus RPP5, situé sur le chromosome 1 d A. thaliana, contient le gène de résistance RPP4, 7 allèles de RPP5 et le gène RPP7 (Dangl and Jones, 2001). Le séquençage complet de la plante modèle A. thaliana a permis de repérer 200 NBS-LRR distribués en 40 singletons et 43 clusters (Meyers et al., 2003) (Fig. i.4a). La répartition des clusters n est pas non plus homogène sur tous les chromosomes puisque des «super clusters» existent sur les chromosomes 1 et 5 tandis que les chromosomes 2 et 3 sont relativement pauvres en gènes NBS-LRR (Leister, 2004). Ces clusters renferment le plus souvent un mélange de TNL et CNL (Meyers et al., 1999). Le séquençage de Medicago truncatula a révélé l existence d environ 400 RGAs ayant une homologie avec les NBS-LRRs (Zhu et al., 2002; Ameline-Torregrosa et al., 2008). La cartographie génétique et physique de ces gènes a montré que les TNL et les CNL sont groupés en clusters, dont peu contiennent ces deux types de gènes NB-LRR simultanément (Zhu et al., 2002; Ameline-Torregrosa et al., 2008) (Fig. i.4b). Cette homogénéité des clusters de RGAs a été aussi notée chez le soja (Kanazin et al., 1996; Yu et al., 1996). I.2.5. Evolution des gènes de résistance La reconnaissance spécifique par le gène R d effecteurs de l agent pathogène est défavorable à l agent pathogène. Elle exerce sur lui une pression de sélection conduisant à la sélection de mutations dans les gènes d avirulence conduisant à l apparition de nouveaux effecteurs qui ne sont alors plus reconnus par la plante. Cela permet à l agent pathogène de contourner le système de reconnaissance spécifique de la plante. Il peut alors se propager et induire la maladie. Ce phénomène est connu sous le terme d ETS (Effector-Triggered Susceptibility). Cette évolution du parasite exerce à son tour une pression de sélection sur la plante conduisant à l apparition de nouveaux gènes de résistance qui reconnaissent les nouveaux effecteurs (Jones and Dangl, 2006; Friedman and Baker, 2007). 28