Microscopie électronique en biologie

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Françoise Beauchamp
il y a 8 ans
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1 Microscopie électronique en biologie

2 Objectif de la microscopie en biologie Imager des structures, Co-localiser les protéines ou certaines molécules Acquisition In vivo A haute résolution

3 Microscopie électronique

4 R R= 0.61 l /nsinm R = Limite de résolution

5 Avantages et limites de la MO M Photonique Signal Résolution Fixé ou in vivo Epaisseur l échantillon Durée de préparation Temps d acquisition Immunomar quages Milieu Photons 0.2 µm Fixé ou in vivo 1 à 50 µm Coupe ou culture Quelques sec à qlq heures Quelques ms en 2D Marquage et colocalisation Air, liquide Cheveu en MO 0.2 mm Support Lame, boite de pétri 60 µm Microsphère en MO En fluorescence on ne voit que ce qui est marqué

2 µm Fixé ou in vivo 1 à 50 µm Coupe ou culture Quelques sec à qlq heures Quelques ms en 2D Marquage et

6 En Microscopie optique Muscle cardiaque en coupe longitudinale Gross. x300

7 En Microscopie électronique En Microscopie photonique X 1000 X 10000

8 Principe de la ME : Interaction électron-matière

9 LE Microscope Electronique à Transmission MET

10 Microscope Electronique en Transmission JEOL 100 Kv

11 La Microscopie Electronique en Transmission MO Immunofluorescence d une protéine de jonction sur culture cellulaire L image MET la même culture

12 Applications du MET Ultrastructure sur coupe de tissu vivant ou matériaux Immunomarquage des protéines par billes d or Diffraction électronique

13 Coupe MET dans une feuille d arabidopsis

14 Effet de peptides microbienne sur cellules cancéreuse

15 Phagocytose

16 Bacteries dans cellules

17 Coloration négative Virus, proteines, molecules Pas de coupes Phages Résultats rapides APT ou AcU à saturation dans l eau ou alcool 100 nm

18 Immunomarquage, Echantillons Système révélateur billes or (1 à 15 nm) Anticorps primaire Epitope Antigène Echantillon (tissus, cellules, ( bactéries virus, Stage d'immunomarquage en M E, Toulouse le 15 mai 2010

Antigène Echantillon (tissus, cellules, ( bactéries

19 Marquage post synaptique d une protéine sur coupe de cellules nerveuse

20 LE Microscope Electronique à Balayage MEB

21 Interaction électron-matière

22 Microscope électronique à Balayage 840A de JEOL

23 MO MET L image MEB correspondante

24 Application du MEB Image de surface cellulaire ou de matériau Immunomarquage des protéines de surface par billes d or Imagerie en mode électrons rétrodiffusés Spectrométrie X

25 La différence entre la peau humaine et la peau de souris La surface d un cheveu humain. Notez les plaques de kératine qui se chevauchent comme des écailles 20µm Epiderme Poil Couchedes cellules desquamentes Poil Chez la souris les plaques s emboitent entre elles. Derme 20µm

26 Images de vaisseaux sanguins en MEB et MET MEB MET Pl N Gr N Gr 2µm

27 Fibrocytes Culture cellulaire Osteoblastes Osteocyte Osteoclaste

28 200µm 500µm 200µm Œufs et larves(chenilles) du papillon blanc Charançon perçant le grain de blé 500µm

29 Legionella pneumophila traité aux peptides antimicrobienne

30 Les différents types de grain de pollen 20µm 20µm

31 Pomme de terre Crue Pomme de terre cuite 200µm

32 Un poil de barbe coupé par la lame d un rasoir mécanique Un autre poil qui a été déchiqueté par un rasoir électrique 50µm

33 Cardiomyocite sur lame de culture

34 Cellule sanguine de Wolbachia

35 Col de chemise propre Col de chemise sale 200µm 200µm

36 Contraintes liées à l échantillon Le plus proche du vivant (Fixé) MET et MEB Ultrafin Epaisseur de coupe comprise entre 60 et 70 nm MET Déshydraté Surface conductrice MET et MEB MEB

3 jours minimum Etapes de préparations des échantillons pour la MET MET Fixation des protéines MEB 1 jour au mini Fixation des protéines Culture cellulaire Tissu ou Suspensions (virus, bactéries, )

37 3 jours minimum Etapes de préparations des échantillons pour la MET MET Fixation des protéines MEB 1 jour au mini Fixation des protéines Culture cellulaire Tissu ou Suspensions (virus, bactéries, ) Fixation des Lipides Déshydratation Acétone ou Ethanol Inclusion dans la résine Polymérisation 60 à 70 C dans étuve (obtention de blocs) Coupes au microtome Semi-fines ~ 1 µm Ultrafines ~ 60 à 70 nm Contraste Observation Déshydratation Acétone ou Ethanol Appareil par contournement du pt critique du CO2 CO2 liq par purges à 10 C CO2 liq /gaz 31 C (pt critique) CO2 gaz 40 C Dessiccation totale Métallisation Observation

38 Prise de contact : Compétence et savoir faire : Préparation d échantillons biologiques pour l observation au MET et MEB Techniques classiques de fixation, déshydratation, inclusion et de coupes pour l analyse ultrastructurale, Techniques immunocytochimiques avec immunomarquage à l or colloïdal en pré ou post enrobage avec amplification à l argent si nécessaire. Coloration négative de macromolécules et de fractions cellulaires Réalisation de coupes fines suivi du contraste Métallisation et dessiccation par contournement du point critique. Observation aux microscopes MEB et MET. Collecte des résultats sous forme fichiers numériques Enseignements et formations

39 Nouvelles techniques microscopie Electronique AMW (Automatic Microwave Tissue Processor) Techniques à froid : cryofixation-cryocoupe- Cryo-MET cryo-transfert pour le MEB Tomographie électronique MEB 3 view Microscopie à balayage environnementale

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