Mémoire présenté par Sophie Denamur en vue de l obtention du diplôme de Licence en Sciences Biomédicales Orientation Toxicologie

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1 Université catholique de Louvain Faculté de Médecine École de Pharmacie Laboratoire de Pharmacologie Cellulaire et Moléculaire Mémoire présenté par Sophie Denamur en vue de l obtention du diplôme de Licence en Sciences Biomédicales Orientation Toxicologie Promoteur : Pr. M.P. Mingeot-Leclercq Année académique

2 Apoptose : un marqueur de toxicité des aminoglycosides? Étude comparative sur cellules en culture incubées avec de la gentamicine et de l amikacine.

3 Introduction Aminoglycosides Infections sévères à Gram négatif Molécules polaires et polycationiques. Fonctions aminées chargées positivement à ph acide Ototoxicité et néphrotoxicité HO H 3 C HN H 3 C HO H 2 N O OH O H 2 N OH O OH R HO H 2 N O gentamicine O NH 2 CH R 1 R 2 OH HO OH O HO O O NH 2 N H NH 2 amikacine Sophie Denamur 3

4 Introduction Toxicité sélective Accumulation spécifique des aminoglycosides : Interaction avec les phospholipides acides de la membrane plasmique Endocytose médiée par la mégaline Sophie Denamur 4

5 Introduction Manifestations cliniques de néphrotoxicité Phospholipidurie et présence d enzymes lysosomiaux dans l urine Protéinurie Polyurie Augmentation de l urée sanguine et de la créatinine Anurie (au stade terminal, très rare) Sophie Denamur 5

6 Introduction Comparaison de l induction de néphrotoxicité in vivo Mean nephrotoxicity score GEN AMK Control Multiples of human dose Score déterminé en fonction de la dégénérescence tubulaire, de l inflammation péritubulaire, de la nécrose tubulaire, de la dilatation tubulaire, de la basophilie tubulaire et de la fibrose interstitielle Hottendorf et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 1981; 19 (6) : Sophie Denamur 6

7 Introduction Mécanismes de néphrotoxicité Mingeot-Leclercq & Tulkens, 1999, Antimicrob. Agents Chemother., 43 : Accumulation dans les lysosomes (Tulkens et al. 1978) Phospholipidose (Kosek et al.,1974; Aubert-Tulkens et al., 1979; Laurent et al., 1982; Mingeot-Leclercq et al., 1988; Laurent et al., 1990; Piret et al., 1992) Apoptose (El Mouedden et al., 2000.a, b) Sophie Denamur 7

8 Introduction Apoptose Phénomène actif Perte des contacts intercellulaires Modifications de la membrane plasmique (translocation des PS) Altérations du cytosquelette Réduction du volume cellulaire Condensation de la chromatine Sophie Denamur 8

9 Introduction Apoptose (2) Fragmentation de l ADN Pas de changement apparent des organites subcellulaires Formation de corps apoptotiques Voie intrinsèque (mitochondriale) ou voie extrinsèque (death receptors) dialogica.com.ar/medline/archives/2004/07/ apoptosis_celul.html Sophie Denamur 9

10 Sophie Denamur 10

11 Introduction Rôle du réticulum endoplasmique Sandoval and Molitoris, Am. J. Physiol. Renal Physiol ; 286 : Sophie Denamur 11

12 Introduction Apoptose in vitro Induction d apoptose in vitro sur différents types cellulaires El Mouedden et al., Toxicological Sciences 2000; 56 : Sophie Denamur 12

13 Introduction Néphrotoxicité in vivo El Mouedden et al., Antimicrob. Agents Chemother. 2000; 44 : Sophie Denamur 13

14 Introduction Objectifs du mémoire L apoptose observée in vitro peut-elle constituer un marqueur prédictif de la toxicité d aminoglycosides? Meilleure compréhension du mécanisme d induction d apoptose par la gentamicine et l amikacine Sophie Denamur 14

15 Modèles cellulaires et antibiotiques utilisés Matériel et méthodes LLC-PK1 : lignée cellulaire provenant du tube contourné proximal de rein de porc J774 : lignée de macrophages dérivée d'un réticulosarcome de souris Gentamicine : Geomycin Pro injection 40 mg/ml, Schering-Plough, mélange de gentamicine C1, C1a et C2 Amikacine : Amukin, solution injectable IV-IM 50 mg/ml, Bristol-Myers Squibb Belgium Sophie Denamur 15

16 Quantification du nombre de cellules en apoptose : technique du DAPI Matériel et méthodes 4, 6 -diamidine-2 phenylindole dihydrochloride Agent intercalant Cellule apoptotique p p q Cellules non apoptotiques Marquage des noyaux Sophie Denamur 16

17 Matériel et méthodes Détermination de l'activité apoptogène d'un composé : dosage de l'activité de la caspase 3 OH O O O O N H O H N N H O H N N H OH O O AMC O O O H Clivage du substrat Ac-DEVD par la caspase 3 et libération de l AMC (7-amino-4-méthylcoumarine) Evaluation de l activité de la caspase 3 (caspase effectrice) Sophie Denamur 17

18 Détermination de la cytotoxicité cellulaire : dosage de lactate déshydrogénase (LDH) Mesure de la consommation de NADH au cours de la réduction du pyruvate en lactate par la lactate déshydrogénase Matériel et méthodes O O O - + NADH +H LDH O - + NAD + H 2 O O pyruvate OH lactate Évaluation du relargage de LDH dans le milieu Sophie Denamur 18

19 Matériel et méthodes Évaluation de la concentration cellulaire en aminoglycosides : dosage microbiologique Détermination de la concentration en aminoglycosides grâce au diamètre d inhibition de croissance de Bacillus subtilis induit par l échantillon sur une gélose. Droite d'étalonnage Diamètre d'inhibition (cm) y = 1,0961x + 1,3579 R 2 = 0,9926-0,500 0,000 0,500 1,000 1,500 2,000 Log concentration AMK (µg/ml) Sophie Denamur 19

20 Matériel et méthodes Electroporation Aminoglycosides directement amenés dans le cytosol Tampon d électroporation contenant l aminoglycoside 8 pulses d ondes carrées, 800V/cm, 1ms Milieu de culture et incubation de 24h à 37 C sous 5% CO 2 Pulse power supply Electrodes Electrical contacts Cells in suspension Sophie Denamur 20

21 Matériel et méthodes Autres techniques Perméabilisation lysosomiale (acridine orange) Délocalisation du cytochrome c (fractionnement, immunoprécipitation, western blot) Sophie Denamur 21

22 Résultats Induction d apoptose dans les LLC-PK1 Effet temps effet concentration gentamicine / amikacine DAPI % of apoptotic cells (DAPI [+]) h 48h 72h gentamicin extracellular concentration (mm) % of apoptotic cells (DAPI [+]) h 48h 72h amikacin extracellular concentration (mm) Sophie Denamur 22

23 Induction d apoptose dans les LLC-PK1 (2) Résultats Effet temps effet concentration gentamicine / amikacine Caspase-3 Caspase-3 activity (% of control) h 48h 72h gentamicin extracellular concentration (mm) Caspase-3 activity (% of control) h 48h 72h amikacin extracellular concentration (mm) Sophie Denamur 23

24 Induction d apoptose dans les LLC-PK1 (3) Comparaison gentamicine / amikacine à 24h Caspase-3 Résultats Caspase-3 activity (% of control) a GEN AMK a a a *** *** b b Activité de la caspase-3 après 24h d incubation avec de la gentamicine ou de l amikacine Extracellular concentration (mm) Sophie Denamur 24

25 Induction d apoptose dans les LLC-PK1(4) Résultats Caspase-3 / DAPI en fonction de la concentration et du temps - Gentamicine % apoptotic cells (DAPI [+]) h 48h 72h Time Caspase-3 activity (% of control) DAPI 2mM DAPI 3mM Caspase-3 2mM Caspase-3 3mM Sophie Denamur 25

26 Résultats Induction de nécrose dans les LLC-PK1 Effet temps effet concentration gentamicine / amikacine LDH incubation 24h incubation 72h Co GEN 1mM GEN 2mM GEN 3mM AMK 3.162mM AMK 6.325mM AMK 9.445mM *** *** % of LDH released Co GEN 1mM GEN 2mM GEN 3mM AMK 3.162mM AMK 6.325mM *** *** ** % of LDH released AMK 9.445mM Sophie Denamur 26

27 Résultats Mise en évidence in vitro d une différence significative entre l effet apoptogène de la gentamicine et celui de l amikacine, qui reflète leur toxicité in vivo. Sophie Denamur 27

28 Généralisation des résultats à une autre lignée cellulaire (macrophages J774) Effet concentration gentamicine / amikacine Incubation 24h DAPI - LDH Résultats % of apoptotic cells (DAPI [+]) GEN AMK *** *** extracellular concentration (mm) % of LDH released GEN AMK extracellular concentration (mm) Sophie Denamur 28

29 Généralisation des résultats à une autre lignée cellulaire (macrophages J774) Effet concentration gentamicine / amikacine Incubation 24h DAPI - LDH Résultats % of apoptotic cells (DAPI [+]) GEN AMK *** *** extracellular concentration (mm) % of LDH released *** *** *** amikacin extracellular concentration (mm) Sophie Denamur 29

30 Résultats Reproductibilité des résultats dans un autre type cellulaire Sophie Denamur 30

31 Mécanisme d induction d apoptose Résultats Importance de la quantité d'aminoglycosides accumulée au sein des cellules Rôle des aminoglycosides dans le cytosol (électroporation) Sophie Denamur 31

32 Accumulation des aminoglycosides au sein des cellules Résultats Cc/Ce Toxicité (apoptose) GEN AMK Sophie Denamur 32

33 Résultats Induction d apoptose par les aminoglycosides dans le cytosol des cellules LLC-PK1 Effet concentration gentamicine / amikacine DAPI après électroporation % of apoptotic cells (DAPI [+]) *** *** *** *** *** Gentamicin extracellular concentration (mm) 1 % of apoptotic cells (DAPI [+]) Amikacin extracellular concentration (mm) Sophie Denamur 33 3

34 Résultats Induction d apoptose par les aminoglycosides dans le cytosol (2) Effet concentration gentamicine / amikacine Dosage activité caspase-3 après électroporation Caspase-3 activity (% of control) * ** * Gentamicin extracellular concentration (mm) Caspase-3 activity (% of control) Amikacin extracellular concentration (mm) Sophie Denamur 34

35 Résultats Induction d apoptose par les aminoglycosides dans le cytosol (3) % of apoptotic cells (DAPI [+]) Gentamicin extracellular concentration (mm) Caspase-3 (% of control) Caspase-3 DAPI Sophie Denamur 35

36 Résultats Accumulation après électroporation Cellular concentration (µg/ml) GEN AMK Extracellular concentration (mm) Sophie Denamur 36

37 Résultats Accumulation après électroporation (2) Cc/Ce Toxicité (apoptose) GEN AMK Sophie Denamur 37

38 Résultats Comme dans les cellules incubées, la gentamicine induit nettement plus d apoptose que l amikacine L effet apoptotique est détectable à des concentrations beaucoup plus faibles lorsque les cellules sont électroporées Le rapport Cc/Ce dans les cellules électroporées n est pas directement lié à la quantité d apoptose induite, alors que ces facteurs semblent être en relation directe dans les cellules incubées Sophie Denamur 38

39 Discussion et perspectives Apoptose in vitro vs toxicité in vivo Mise en évidence d une différence significative entre l effet apoptogène de la gentamicine et celui de l amikacine, qui reflète leur toxicité in vivo. l apoptose pourrait être un bon marqueur prédictif de la toxicité induite in vivo par des aminoglycosides. Sophie Denamur 39

40 Discussion et perspectives Apoptose, bon marqueur prédictif? Élargissement de l étude à d autres aminoglycosides : molécules déjà commercialisées (ex : isépamicine) et des molécules en développement (ex : sous composés de la gentamicine) Sophie Denamur 40

41 Discussion et perspectives Modèles cellulaires Résultats observés sur les LLC-PK1 généralisables à un autre type cellulaire (macrophages J774) Accumulation semblable dans les deux types cellulaires capture indépendante de la mégaline dans les LLC-PK1 Perspective : utilisation de cellules LLC-PK1 exprimant la mégaline Sophie Denamur 41

42 Discussion et perspectives Compréhension du mécanisme (1) INCUBATION ELECTROPORATION AG Lysosome Apoptose directement liée à la concentration cellulaire en AB AG Pouvoir apoptotique intrinsèque Sophie Denamur 42

43 Discussion et perspectives Compréhension du mécanisme (2) INCUBATION ELECTROPORATION AG Lysosome Apoptose directement liée à la concentration cellulaire en AB Vérification de la localisation subcellulaire des aminoglycosides après incubation et électroporation AG Pouvoir apoptotique intrinsèque Sophie Denamur 43

44 Discussion et perspectives Compréhension du mécanisme (3) INCUBATION ELECTROPORATION Meilleure compréhension des mécanismes de perméabilisation lysosomiale AG Lysosome Apoptose directement liée à la concentration cellulaire en AB AG Pouvoir apoptotique intrinsèque Sophie Denamur 44

45 Discussion et perspectives Compréhension du mécanisme (4) INCUBATION ELECTROPORATION Mise en évidence de la sortie des aminoglycosides à partir des lysosomes vers le cytosol AG Lysosome AG Pouvoir apoptotique intrinsèque Apoptose directement liée à la concentration cellulaire en AB Sophie Denamur 45

46 Discussion et perspectives Compréhension du mécanisme (5) Suivi de la cathepsine D INCUBATION ELECTROPORATION AG Lysosome Apoptose directement liée à la concentration cellulaire en AB AG Pouvoir apoptotique intrinsèque Sophie Denamur 46

47 Discussion et perspectives Compréhension du mécanisme (6) INCUBATION ELECTROPORATION AG Lysosome Apoptose directement liée à la concentration cellulaire en AB AG Pouvoir apoptotique intrinsèque Implication de la mitochondrie dans l apoptose induite par les AG Sophie Denamur 47

48 A ma promotrice, Madame le Professeur M.P. Mingeot-Leclercq, aux Professeurs F. Van Bambeke et P. Tulkens, à tous les membres de l équipe FACM, Merci Sophie Denamur 48

49 Sophie Denamur 49

50 CMIs moyennes (mg/l) des aminoglycosides pour des bactéries pathogènes courantes GENTA AMIKA Staph. aureus Coagulase-negative staphylococci Str. pyogenes 4 32 Str. pneumoniae 4 64 E. faecalis N. meningiditis N. gonorrhoeae 4 16 H. influenzae E. coli K. pneumoniae B. fragilis R R M. tuberculosis R 1 Sophie Denamur 50

51 Sophie Denamur 51 Chan S-L et al,clin & Exp Pharmacol and Physiol 2004, 31:

52 Sophie Denamur 52

53 Perméabilisation des lysosomes Control 4h Gentamicin 2mM 4h MSDH 25µM 3h H. Servais et al.,toxicology and Applied Pharmacology 2005 : 206; Sophie Denamur 53

54 Effet de la gentamicine directement dans le cytosol Servais et al., Antimicrob. Agents and Chemother ; 50 (4) : Sophie Denamur 54

55 Détermination de la perméabilisation lysosomiale : acridine orange AO 5 µg/ml 37 C 15 min AO AOH+ λ ex : 485 nm; λ em : 530 nm and 620 nm AOH+ Control cells Gm1-2-3 mm Amk mm Millot et al., 1997 Neuzil et al., 2002 AO AOH+ AO+ H+ AO Monomer Emission 530 nm AO Multimer Emission 620 nm Sophie Denamur 55

56 Introduction 16h 9 mars 2007 Sophie Denamur - FACM 56

57 Matériel et méthodes Mise en évidence de la délocalisation du cytochrome c Fractionnement cellulaire Immunoprécipitation Western blot Sophie Denamur 57

58 Matériel et méthodes Fractionnement cellulaire Homogénat Basse vitesse (3 x) 2000 rpm (783g) 1800 rpm (634g) 1600 rpm (501g) Haute vitesse rpm ( g) Surnageant (cytoplasme) Fraction nucléaire (noyaux) Fraction MLP (mitochondries, lysosomes, peroxysomes) Sophie Denamur 58

59 Matériel et méthodes Immunoprécipitation Sophie Denamur 59

60 Matériel et méthodes Western blot Migration dans un gel de polyacrylamide Transfert sur membrane de nitrocellulose Marquage avec anticorps (primaires et secondaires) Révélation Sophie Denamur 60

61 Résistance acquise (GEN) APH (3 )-I AAC (2 ) ANT (4 )-I HO H 3 C HN H 3 C O OH O HO H 2 N O O CH R 1 R 2 H 2 N NH 2 APH (2 ) + AAC (6 ) ANT (2 )-I AAC (3) AAC (6 )-II et IV Sophie Denamur 61

62 Résistance acquise (AMK) HO H 2 N OH O OH APH (3 )-II, III, IV, VI, VII ANT (4 )-II OH HO OH O HO O O NH 2 NH 2 APH(2 ) + AAC(6 ) R N H AAC (6 )-I I et III Sophie Denamur 62