Diagnostic moléculaire des maladies virales

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1 Diagnostic moléculaire des maladies virales Cours DES Virologie 8 Mars 2004 Dr Bettinger PH Virologie I. Introduction Modernisation spectaculaire du )g virologique en 30 ans < années 70 : seules techniques disponibles = culture cellulaire effet cytopathogène caractéristique :scopie électronique visualisat particules virales > années 70 : Apparit Ac Monoclonaux A évolution )g de la sensibilité des techniques existantes (immunofluorescence sur culture cellulaire, immuno-me) Recherche directe d Ag viraux sur cellules d origines diverses )g + rapide, + spécifique, + sensible. Dvpt de techniques immunoenzymatiques type Elisa pour détect Ag viraux circulants ou AC spécifiques antiviraux. 1

2 I. Introduction Depuis ans : développement des techniques de Biologie Moléculaire Découverte de virus dont la culture était impossible (HPV, VHC) Relais de certaines méthodes classiques peu sensibles et peu spécifiques Détection des acides nucléiques viraux, le + souvent marqueurs d une infection virale active Quantification des charges virales A taux de virus circulant (VIH, VHB, VHC) Séquençage du génome viral A recherche de mutations de résistance aux antiviraux, typage viral II. Hybridation moléculaire Base de nombreuses techniques de BM telles que : la PCR, réaction très sensible et très spécifique pour détection de génomes viraux les techniques de quantification des génomes viraux A notion de l intensité de la réplication virale le génotypage, le séquençage A. Principe Appariement des bases de séquences complémentaires d ac. nucléiques, entre : cible : séquence du génome viral choisie pour sa pertinence pour un résultat spécifique sonde nucléique marquée ADN ou ARN, ou amorce oligonucléotidique dans la PCR. A=T, C/G 2

3 II. Hybridation moléculaire A. Paramètres de l hybridation : 2 d hybridation = élt essentiel : f(2 de fusion de la sonde ou Tm), elle-même f(longueur, contenu en G-C, concentration en sels) température et concentration en sels (MgCl 2 ) : déterminent la stringence que l on peut faire varier selon le degré de spécificité voulu concentration en formamide (pour œ Tm) B. Réalisation : Sonde nucléique préalablement marquée / composé radioactif ou haptène non radioactif facilem t détectable Y détection des duplex formés : / mesure de RA, R immunoenzymatiques, colorimétriques, fluorescentes, chimioluminescentes. 1.A partir d AN extraits et dénaturés : cas le + fréquent * dot blot : AN immobilisés sur une mb = support pr R d hybridation et détection des hybrides. Peut être semi-quantitative mais peu sensible (seuil 10 pg/ml de sérum). Nbx ex publiés avec sondes RA Y signal intense. Sondes biotinylées Y signal satisfaisant si [cible] suffisante (ex : HPV, HBV) * Southern blot (Southern 75) : digestion de l ADN par enzymes de restriction, puis électrophorèse pour séparer fragments obtenus en gel d agarose, puis blotting = transfert sur mb, puis hybridation sur mb Y duplex visualisés sous forme de bandes dont le niveau de migration f de la taille des fragments. * Northern blot : même chose pour détection des transcrits d ARN extraits 3

4 2. Directement sur coupes de tissus ou sur cellules, sans extraction = hybridation in situ * Prétraitement pour perméabiliser les cellules * Observation des coupes Y appréciat semi-quantitative de la charge virale au niveau cellulaire (avec sondes radiomarquées en particulier : domaine de la recherche). * Seuil de sensibilité. 20 copies d HPV / cellule avec technique d HIS standard. * Intérêt: - localisation des cellules infectées au sein d une structure tissulaire. - possibilité d appréciation de l état du génome viral (ex HPV : intégré ou non) selon l aspect du marquage ( diffus, ponctué). Corrélation avec grade de la lésion cervico-vaginale. 3. Hybridation en milieu liquide : Techniques commerciales standardisées quantification. Hybridation avec amplification de signal : - Trousse Abbott : utilise sondes RA Y démodée infrastructures lourdes pour labo (ADN Hépatite B) - Trousse Digene : Hybrid Capture : lyse des particules virales, dénaturation, hybridation avec sondes ARN, capture des hybrides ARN-ADN par AC anti-hybrides fixés sur des cupules de microplaques, révélation par 2ème AC anti-hybride marqué à la PAL. Application : recherche semi-quant. d HPV ds frottis cervico-vaginaux, quantificat de CMV ds sang total, d HBV dans sérum. Le seuil de sensibilité a été abaissé par du nb de molécules de PAL ( + conc. en sonde). 4

5 - Technique Chiron (Bayer) = Versant ou ADN branché : lyse particules virales, capture des AN / sondes de capture spécifiques fixées sur support, puis Xrs hybridat avec systèmes de sondes = amplification du signal. (HIV, HCV, HBV) 4. Hybridation avec les sondes PNA nouvelle approche de l hybridat avec sondes peptidiques : sondes sans phosphore donc non chargées, formées d unités répétitives de N2(amino éthyl) glycine reliées par des ponts peptidiques. Affinité ++ avec spécificité ++ pour des séquences cibles peu accessibles (ADN double brin, ARN ribosomal) ou dans conditions stringentes peu favorables. " Hybridation de haute affinité avec spécificité au nucléotide près car très sensible aux mésappariements. " Intérêt pour recherche de séquences rares, détection de mutations ponctuelles, utilisation pour HIS... Non utilisé en routine 5

6 III. Amplification de la cible Hybridation simple Hybridat + ampli de signal PCR = dénaturation, hybridation, élongation PCR + hybridation spécifique Sensibilité Cette grande sensibilité peut être : soit d une grande utilité pour )g d infection récente ou latente, avec réplication virale peu intense, pour les suivis de ttt. soit un critère déroutant dans le cadre de maladies virales qui ne s expriment qu en présence de quantités importantes de virus (hépatite B, CMV, virus G) 1. La PCR : Technique princeps en milieu liquide. cycles successifs dénaturation des brins formés hybridation d amorces oligonucléotidiques sur cible élongation des amorces grâce à 1 polymérase amplificat du nb de cibles, d abord exponentielle puis en plateau. (Xrs millions de copies à partir d 1 brin d ADN, sensibilité évaluée à 1 copie d ADN au sein de 10 4 à 10 5 cellules) Cinétique PCR Q produits formés Plateau n exponentielle Temps 6

7 Précédée d une extraction du matériel génomique, étape clé de la détection génomique par PCR. Pour le )g viral, on part d une quantité définie de prélèvement (ex : 100 µl sérum ou LCR). Il faut avoir un témoin (témoin de non contam) et un témoin (témoin de bonne marche de la R ), et faire en // l ampli d un gène ubiquitaire (G6PD ou $ globine), témoin d amplification pour chaque prélèvement. Pour les virus à ARN, PCR précédée d une transcription inverse ou RT (étape de synthèse d 1 brin d ADN complémentaire de l ARN)! RT-PCR. Détect pdt amplifiés : * après én en gel d agarose : simple coloration au Br- d éthidium (sensibilité peu importante) hybridation des amplifiats par sondes spécifiques après transfert sur mb * en µplaques. Techniques maison encore très utilisées :! sensibilité et spécificité pour recherches rares : parvovirus B19 : atteinte foetale affirmée si génome viral retrouvé dans liq amniotique ou sang foetal pour recherches saisonnières : entérovirus pour recherches qualitatives : hep B, herpès virus, virus G Techniques commerciales! généralisat / souci de standardisation. - kits avec mélanges tout faits de tampons, dntps... - systèmes semi-automatisés (Cobas Amplicor, Roche). Sensibilité : 100 cp/ml pour VHC > permet un diagnostic avant la séroconversion (1 semaine après le contage) 2. Techniques dérivées : PCR quantitative : Mesure de la charge virale = élément indispensable pour le suivi d une maladie virale (VIH, Hépatite B et C, CMV, HPV). PCR quantitative repose sur le principe de dilution limite ou sur l utilisation d étalons internes. Travail en point final techniques commerciales de quantification par PCR : - technique Roche Amplicor (VIH, VHC, VHB) : ampli simultanée de la cible et d 1 std de quantification (séquence cible mais + courte), avec mêmes amorces. Dilut des amplifiats et détect / hybridat en µplaque. Détect séparée de la cible et du std de quantif, avec des sondes marquées. Calcul des concentrations / rapport des DO obtenues dans les puits. Automatisation : Cobas Amplicor. Prix d 1 CV VIH 100 7

8 Pour VIH, sensibilité du test std = 200 copies/ml. Ce seuil à 50 voire 20 cp/ml avec version ultrasensible : [] préalable des virions / ultracentri (1 h à g), prise d essai >. Rem : Le seuil de détection est le même en bdna (Versant) PCR multiplex : Objectif = recherche de virus de structure génomique proche en amplifiant une séquence commune aux virus recherchés, à l aide d amorces consensus. En cas de positivité, révélation avec des sondes spécifiques de chacun des virus recherchés. Exemple : Trousse Argène Herpès Consensus : Ampli dans une zone conservée codant l ADN polymérase des Herpèsvirus = screening. Si s, résultat négatif. Si, hybridat avec 6 sondes spécifiques des virus HSV-1, HSV-2, CMV, VZV, HHV-6, EBV. Recherche dans le LCR ou autres liquides clairs (vitrée, liq amniotique ). Pas dans le sérum. Application : )g d 1 encéphalite herpétique, difficile à diagnostiquer cliniquement, ou d 1 encéphalite à CMV chez un patient atteint de SIDA... Autres techniques d amplification de la cible Il en existe de nombreuses : à température fixe : NASBA, SDA, TMA à 2 températures : LCR TMA (Transcription Mediated Amplification) : actuellement utilisée dans les CTS pour le )g génomique viral (DGV) : recherche du génome de VIH et VHC sur tous les produits destinés au don, avec une très bonne sensibilité (. PCR) Ampli isotherme (41.5 C) à base de transcription de l ARN cible par une transcriptase inverse et amorce avec promoteur T7 > RNAse H > cdna = matrice + T7 ARN polymérase > transcrits d ARN > nouvelle ampli à base de transcription inverse. Autocatalytique. Technique d extraction utilisée = Target Capture Assay = avec particules magnétiques comprenant des oligonucléotides spécifiques, ciblant déjà les séquences spécifiques ; purification par lavages. Travail en prélèvements poolés -> rendement +++ Mais encombrement de l appareillage. Fait pour grosses séries. 8

9 Précautions, bonnes pratiques 1. W avec pipettes justes et calibrées (vérifiées régulièrement) 2. W avec embouts filtres 3. Nettoyage des paillasses à l alcool ou solution RNAse free 4. Pièces dédiées : pré-ampli, ampli : respecter sens de circulation 5. Système Ampérase (trousses Roche, Abbott ) : Ampérase : UNG = Uracyl N Glycosylase : E de protection contaminat / pdts amplifiés. ADN cibles amplifiés avec incorporation de dutp au lieu de dttp format d ADN uracilé. Ampérase dans les mix : reconnaît ADN uracilé et le lyse au niveau double liaison U=A des doubles brins d ADN ne détruit pas l ADN natif car ne contient pas de U ne détruit pas ARN natif car l U qu il contient n est pas déoxy action sur ADN provenant d ampli antérieures. Active à2< 55 action avant la PCR, inactivée lors des cycles ultérieurs. Attention : après ampli, si 2 (<55 ) destruction nouveaux amplifiats dénaturer les amplifiats immédiatement après ampli (UNG inactive sur ADN sb) PCR Temps réel Q produits formés Cinétique PCR n exponentielle Plateau PCR : relation théorique entre [séquence cible] et [produit amplifié], mais pb de répétabilité : réactifs en excès mais compétition entre renaturation des amplifiats et hybridat des amorces. Au plateau, du taux d ampli (0) Temps PCR temps réel : n la + reproductible. La 1ère significative du taux d amplicons (proportionnel au signal fluorescent émis) est proportionnelle à la Q initiale de matrice 9

10 PCR en temps réel : Technique permettant de suivre, en temps réel, cycle par cycle, la formation des produits amplifiés grâce à des sondes fluorescentes, hybridées et activées simultanément à l amplification ampli et détect en même tps pas de traitement post-pcr. Durée d ampli : < 1 h. Analyse à signal constant le nb de cycles détermine la [ ]. Courbe standard : pente liée à l efficacité de la PCR Travail ds la zone exponentielle de la courbe et non en point final. 2 chimies : Cybr green; TaqMan Chimie Sybr Green Marquage non spécifique de l ADN double brin. Quand l ADN est dénaturé, les molécules de Sybr Green sont libérées et la fluorescence est réduite Au cours de la polymérisat, le Sybr green s insère dans les doubles brins formés de la fluorescence - Fluorescence non spécifique. Excitation 497 nm ; émission 520 nm - spécificité liée seulement aux amorces - utilisé plutôt pour la recherche et les mises au point (le non spécifique génère un signal) PCR multiplex impossible : Ct interne dans un autre tube utilisation pour les courbes de fusion 10

11 Principe de FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfert) transfert d énergie / résonance = transmission d énergie d un fluorophore à l autre si physiquement proches. 1. Hydrolyse de sondes : Technologie TaqMan : le fluorophore émetteur transfert son énergie au fluorophore suppresseur voisin par principe du FRET 2. Hybridation de 2 sondes : Technologie HybProbes : utilisation de 2 sondes linéaires complémentaires à 1 séquence cible (peu distantes l 1 de l autre) pour maximiser la spécificité du signal. 1 sonde bloquée en 3 porte un fluorophore donneur en 3 (FITC), 1 autre sonde avec fluorophore accepteur (LC Red). Hybridation tête à queue transfert énergétique de la fluorescéine verte au fluorophore rouge Fluo rouge proportionnelle à la quantité d ADN synthétisé 3. Balises moléculaires : molecular beacons (sondes en épingle à cheveu) Balise en solution énergie quenchée ; hybridat éloignement émission de fluo 5 3 Essai 5 Nucléase avec sonde TaqMan 2 amorces classiques 1 Sonde TaqMan : oligo nucléotide (15-25 nt) avec un Reporter fluorescent en 5 et un Quencher en 3 (sondes d hydrolyse) Excitation lumineuse/ lampe halogène Basé sur l activité exonucléasique de la Taq polymérase hydrolyse de la sonde hybridée pdt étape hybridat /extens Sonde intacte émission quenchée Sonde hydrolysée / déplacement du brin et clivage lors de l extension dans chaque cycle séparation du reporter de son quencher émission de fluorescence caractéristique du Reporter (fluorophores : Fam, Vic, Tamra, Rox : 8 d émission caractéristiques) émission proportionnelle à la quantité de cible. Possibilité de faire PCR multiplex (CT interne /ex) 11

12 Notion de cycle seuil : + le nombre de matrices à amplifier au départ est élevé, moins élevé est le nb de cycles requis pour atteindre un niveau d émission significativement > au bruit de fond. Ce point = cycle seuil (Ct) : tjs pendant la n exponentielle d ampli Fluorescence Ct: cycle seuil Ligne de base Nb de cycles Appareillages de PCR temps réel : Système Perkin-Elmer = Abi Prism : en µplaques Système Roche = LightCycler : en µcapillaires Autres firmes : Beckmann... Applications de la PCR Temps réel en Virologie PCR : Détection qualitative et quantitative de virus Sensibilité meilleure que les techniques classiques qualitatives Evolution vers la technique unique avec courbe de calibration (VHB, VHC, VIH??) (ou seulement quali avec contrôles std) Actuellement au labo : quantification en temps réel pour CMV en routine (essentielle chez patients greffés, immunodéprimés, pour suivis de ttt ) quantification de l EBV pour suspicion de lymphome /ex : à l étude dans sang total quantification du VHB : ancienne technique quanti insuffisamment sensible ( cp/ml), technique quali maison : seuil= cp/ml Traitement doit être mis en place [ cp/ml. PCR temps réel seuil 300 cp/ml. Pb : standardisation, unités quantification du VHC : en cours Technique peu onéreuse applicable dans les pays en développement pour mesure de charge virale VIH/ex 12

13 Applications de la PCR Temps réel en Virologie possibilité de recherche de mutations ponctuelles Utilisation des courbes de fusion (Sybr Green ou TaqMan) séquence cible sauvage séquence mutée sur un AA amorces choisies s hybrident dans les 2 cas dénaturation en conditions stringentes : 2 pour les 2 hybrides. Travail en point final : présence ou non de la mutation Ex : recherche de mutation de résistance à l Epivir pour VHB : YMDD génotypage Exemple : typage HSV. Un seul changement de nucléotide peut déterminer un type ou sous-type. Détermination du mismatch. Utilisation des Sondes TaqMan spécifiques de chaque mutation 13

14 IV. GENOTYPAGE VIRAL Techniques de génotypage : aussi basées sur principe de l hybridation. Les applications usuelles en virologie concernent surtout le VHC car le type viral est un des critères de choix du traitement. -Technique Inno-Lipa : Après une PCR dans la région 5'NC, les produits PCR sont hybridés avec des sondes marquées spécifiques de types, immobilisées sur une bandelette, puis révélation colorimétrique. - Technique Sorin : RT Nested-PCR et hybridation en microplaque avec sondes spécifiques de type ; révélation immunoenzymatique. - Techniques de recherche : RFLP (restriction fragment lengh polymorphism) : restriction enzymatique, migration électrophorétique et analyse des fragments obtenus. SSCP (single strand conformation polymorphism) : produits de PCR mis en conditions très dénaturantes, migration en gel de polyacrylamide > profils si modifications génomiques => comparaison de souches - Séquençage : technique de référence permettant de donner la séquence exacte du gène recherché (pour VHC, types au niveau de qq nucléotides seult ; comparaison des séquences obtenues à celles de souches de référence) IV. Recherche des mutations de résistance aux antiviraux Principale application actuelle : recherche des mutations de résistance aux ARV du VIH. - Techniques utilisables : PCR sélective : amorces oligo générant une synthèse différentielle de l ADN des souches sauvages et des mutants (û en recherche) Technique LIPA : analyse des mutations avec sondes spécifiques fixées sur bandelettes (pb : de + en + de mutations décrites) Technique des Chips : Puces à ADN > hybridation de l ARN viral fluorescent sur des microsurfaces de silice (1.25 cm 2 ) où sont fixées Xrs centaines de sondes oligonucléotidiques. En cours de développement. Séquençage : technique de référence Extraction, amplification d une séquence du VIH comprenant le gène de la Transcriptase Inverse et le gène de la Protéase (cibles des thérapeutiques actuelles anti VIH). 14

15 TECHNIQUE DE SEQUENÇAGE Gènes cibles du séquençage Gènes de la transcriptase inverse et de la protéase du VIH-1 gag pol vif, p23 env Protéase Reverse Transcriptase RNase H Intégrase [amplifiats : séquençage = Technique de Sanger : déterminat de l enchaînement des nucléotides constituant l ADN. Synthèse d 1 brin d ADN marqué complémentaire du brin cible. Utilisation de didésoxynucléosides trip (ddxtp) marqués par un fluorochrome ( pour A, C, G ou T) et des dxtp non marqués, en excès. Incorporation aléatoire d 1 ddxtp Y arrêt de l élongation. Détermine des longueurs de fragments variables selon le nb de dxtp précédemment incorporés (tout l enchaînement nt est ainsi déterminé) Electrophorèse en gel de polyacrylamide. Les fragments migrent à la queue leu-leu en f de leur PM. Détection par un faisceau laser au fur et à mesure de la migration.toutes les longueurs de fragments sont représentées pour chaque nucléotide. Etude automatique de l enchaînement des bases et comparaison à la séquence d un gène de référence (souche sauvage de VIH). 15

16 Illustration schématique du CLIP Acteurs - 4 Nucléotides A-C-G-T - 2 amorces marquées (5 & 3 ) - DNA polymérase :enzyme pour commencer la réplication P - Quantité optimale de ddntp A C G T A C G T A C G T A C G T P P P P ADN A C G T Profil de résistance M184V Consensus AA bases RTB 5 et 3 Souche HIV-1 LAV bases AA

17 Techniques commercialisées : Visible Genetics (Bayer) et Perkin Elmer. Logiciels d interprétation permettant l analyse automatique des séquences au niveau des codons d intérêt pour les mutations de résistance aux ARV. Nécessité de remise à jour régulière (tous les 6 mois) car évolution constante des données issues de la recherche algorithmes d interprétation élaborés au niveau de groupes d experts (en France : AC11-ANRS). Application : chez patients VIH traités par ARV: Quand échappement thérapeutique : Charge virale : développement de mutations de résistance (sélection par ARV) concentration sanguine d ARV insuffisante (pb pharmacologique) mauvaise observance Dans tous les cas, la réplication virale du VIH en présence d ARV provoque la sélection de mutations de R échec thérapeutique En préthérapeutique : recherche de résistance éventuelle (transmission de souches résistantes 5-10%) Pour changements de ttt en cas d intolérance (ssi CV détectable) Autre application du séquençage : VHB Mutation YMDD résistance à la lamivudine Lamivudine TP Spacer Reverse Transcriptase RNAse H Domains F A B C D E 832 SNLSWLSLDVSAAFYHI VLGFRKIPMGVGLSPFLLAQFTSAICS AFSYMDDVVLG SLGIHLNPNKTT LNFMGYVIGSW rt L180M 204 rt M204V rt M204I Incidence of detectable serum variant HBV after: 1 yr = 24% 2 yr = 42% 3 yr = 53% Lai NEJM 1998; Liaw Gastroenterology 2000; Leung Hepatology

18 Mutation concernant l Adéfovir : nouvel antihbv Adefovir Dipivoxil TP Spacer Reverse Transcriptase RNAse H Domains F A B C D E 832 SNLSWLSLDVSAAFYHI VLGFRKIPMGVGLSPFLLAQFTSAICS AFSYMDDVVLG SLGIHLNPNKTT LNFMGYVIGSW rt N236T Incidence of detectable serum variant HBV after: 48 weeks = 0% 96 weeks= <2% Marcellin NEJM 2003; Hadzyannis NEJM 2003; Angus Gastroenterology 2003 Séquençage ciblé détect des mutations de R et typage du VHB Intérêt?? : certains types seraient + réfractaires au ttt et provoqueraient une hépatite B + sévère. TRUGENE TM HBV assay 520pb pres1 pres HBsAg SA Mutations* 145R TP SPACER RT F A B C D E RNase H RT Mutations** 173L 180M/V 204I/V (YMDD) 207I 236T*** * Carman et al The Lancet, 336, ** Pillay et al International Antiviral News, 6:9 *** Angus et al Gastroenterology, 125,

19 Alignement des séquences et comparaison automatique à des séquences de souches de référence Gene Librarian Software: Genotyping Report A report is automatically prepared Conclusion g des maladies virales par techniques de Biologie Moléculaire : en perpétuelle évolution en f de l avancement des technologies. maintenant une concurrence entre firmes pour dvpt d outils de diagnostic très sophistiqués basés sur les nouvelles techniques. Mais prix restent très élevés on cherche à mettre au point des techniques maison. Gros problème : standardisation des unités de quantification unités si techniques La PCR temps Réel représente un énorme progrès car : * bp + reproductible que la PCR classique quantification + fiable * sensibilité excellente (quantification de qq copies d ADN) * prix très accessible * éventail très large d applications * la standardisation peut être un objectif possible (à voir ) 19