Testing moléculaire RER/MSI
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- Samuel Lepage
- il y a 8 ans
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1 Atelier Instabilité Microsatellitaire 26 avril 2014, Bordeaux Testing moléculaire RER/MSI Isabelle Soubeyran Unité de Pathologie Moléculaire Institut Bergonié Bordeaux PGMC d Aquitaine
2 Système RER = système de réparation de l ADN Erreurs de réplication INSTABILITE MICROSATELLITAIRE Complexes protéiques dimériques MLH1/PMS2, MLH1/PMS1 MSH2/MSH6, MSH2/MSH3 Reconnaissance des erreurs Protéine déficiente Poulogiannis, Histopathology 2010 Réparation ADN Défaut réparation ADN
3 Défaut réparation = conséquences sur l ADN INSTABILITE MICROSATELLITAIRE Electrophorèse capillaire : fragments d ADN additionnels
4 EN PRATIQUE Tumeur INSTABILITE MICROSATELLITAIRE Immunohistochimie Recherche perte expression des protéines RER dans tumeur Etude de l instabilité microsatellitaire Analyse en biologie moléculaire à partir des ADN extraits de la tumeur
5 INSTABILITE MICROSATELLITAIRE TEST RER/instabilité microsatellitaire Microsatellites = petites séquences répétées d ADN de 1 à 6 bases dispersées tout au long du génome sensibles aux erreurs de réplication mais peu polymorphes Panel de 5 régions ciblées par le test : Bat25, Bat26, NR21, NR24, NR27 (Bethesda modifié) : colon+++ Reflète l état de stabilité de l ADN 1- PCR pentaplex poly- A fluorescente NR27 BAT26 BAT25 NR21 NR24 2 migration et analyse de fragments
6 Principes de la PCR PCR = Amplification exponentielle et spécifique d un fragment d ADN dont la séquence est connue ADN tumoral extrait du bloc dntp amorces enzyme Chauffage 95 C, 1mn C, 1mn 72 C, 1-2mn 1 PCR pour chaque région d ADN ciblée Amorce : séquence nucléotidique complémentaire d une séquence connue du gène étudié Elongation : synthèse d ADN complémentaire par incorporation de nucléotides grâce à une enzyme l ADN polymérase
7 Migration sur séquenceur et analyse de fragments INSTABILITE MICROSATELLITAIRE Interprétation : Profil normal : profil pmmr, MSS ou RER négatif
8 INSTABILITE MICROSATELLITAIRE Pics additionnels (flèches rouges) 2 marqueurs instables : profil dmmr, MSI High ou phénotype RER positif
9 ADN tumeur 1 marqueur instable INSTABILITE MICROSATELLITAIRE ADN tissu sain Profils ADN tumeur et tissu sain superposable = polymorphisme de Bat25 = Profil MSS/pMMR/RER négatif ADN tissu sain Profils ADN tumeur et tissu sain différents = 1 marqueur instable = Profil MSI low/pmmr/rer négatif
10 Etiologie tumeurs RER +/MSI : 2 mécanismes différents INSTABILITE MICROSATELLITAIRE Mécanismes Conséquences Anomalies secondaires Mutation gène MMR Instabilité Méthylation promoteur MLH1
11 INSTABILITE MICROSATELLITAIRE Mutation gène MMR Instabilité Méthylation promoteur MLH1 2 mécanismes = mutation (syndrome de Lynch) méthylation promoteur MLH1 (sporadique) Perte MSH2/MSH6 Perte isolée MSH6 ou PMS2 LYNCH Consultation oncogénétique Confrontation IHC Perte MLH1/PMS2 Phénotype RER+ avec perte MLH1 Poursuite des analyses
12 Mutation gène MMR Méthylation promoteur MLH1 INSTABILITE MICROSATELLITAIRE Instabilité Autres tests moléculaires utiles : Phénotype RER+ avec perte MLH1 Poursuite des analyses Recherche méthylation promoteur MLH1 Et /ou recherche mutation BRAF (40 60%) Recherche sur ADN tumeur déjà extrait pour MSI Techniques de PCR Si BRAF et méthylation négatifs : Lynch. Cs d oncogénétique avant recherche de mutation à recommander Si BRAF et/ou méthylation positifs : cas sporadique probable (15% CCR)
13 Gestion du prélèvement 1- IHC 2- BM Sélection zone T Forage Lyse cellulaire élution ADN Quantification ADN - cerclage - évaluation % cellularité T
14 Limites 1- biopsies si quantité et % faible : privilégier l IHC
15 2- les prélèvements faiblement cellulaires Carcinome colloïde muqueux Résection rectale post-radiothérapie
16 Avantages et Inconvénients du INSTABILITE MICROSATELLITAIRE test moléculaire Avantages Très spécifique (pas de faux +) Si associé à perte MLH1, peut et doit être complété par la recherche de mutation de BRAF ou d hyperméthylation du promoteur de MLH1 pour éliminer une cause sporadique Permet de rattraper des faux de l IHC Limites Ne permet pas à lui seul d orienter vers étiologie (confrontation IHC et tests complémentaires) Moins performant que IHC si quantité et % cellules tumorales dans l échantillon <20% (risque faux ) Moins sensible que l IHC pour les K non coliques (faux )
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