Relations entre stress oxydant et résistance à l insuline

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1 Relations entre stress oxydant et résistance à l insuline

2 Notion de radical libre Un radical libre (RL) est une espèce chimique qui possède un électron non apparié (célibataire) sur sa couche périphérique H O H H O électrons de la liaison H 2 O électrons célibataire du radical hydroxyle Le radical est doté d une réactivité particulière Afin d apparier son électron célibataire, il peut se comporter avec d autres atomes ou molécules comme : un oxydant un réducteur

3 Notion de radical libre Les radicaux libres impliqués dans le stress oxydant présentent un électron célibataire sur un atome d oxygène Ces radicaux libres peuvent être produits in vivo ou in vitro soit : Par rupture homolytique d une liaison covalente en deux composés conservant un électron célibataire Par la perte ou le gain d un électron chez une espèce non radicalaire In vivo ils peuvent être générés en faible quantité lors du métabolisme normal de l oxygène (CRM)

4 Formation des radicaux libres La CRM permet la réduction de l'oxygène moléculaire en 2 H 2 O Cette réduction directe : implique la présence de quatre électrons est rendue possible grâce à un système complexe de protéines et d'enzymes localisées dans la membrane interne de la mitochondrie. Les conséquences de cette activité de la CRM sont doubles et paradoxales la mitochondrie fournie 36 ATP ~0,4 à 4% de l'oxygène ne sont pas correctement convertis en eau NADH NAD + 4H + succinate fumarate 2H + ½O 2 H2 O 4H + C1 C2 C3 C4 ~0,4 à 4% Matrice mitochondriale 4H + 2H + Cyt C 2H + EIM

5 Stress oxydant Le stress oxydant est observé lorsque la production des espèces réactives de l oxygène (ERO) dépasse les capacités de défense des tissus Il entraîne des altérations des composants cellulaires, dues aux réactions chimiques des ERO avec les lipides, les protéines et les nucléiques cellulaires. acides ERO Antioxydants ERO : Espèces Réactives de l Oxygène

6 Production des Espèces Réactives de l Oxygène Par réduction monoélectronique, l'oxygène peut donner naissance à des Espèces Réactives de l Oxygène (ERO) parmi lesquelles figurent l'anion superoxyde (O 2 - ) ou le radical hydroxyle (OH ) ERO un atome ou une molécule dont la structure chimique est caractérisée par la présence d'un électron libre rendant cette espèce chimique beaucoup plus réactive que l'atome ou la molécule dont il (elle) est issu(e) 1 O 2 Oxygène singulet hλ O 2 4 e - H2 O O - 2 e - Anion e - superoxyde H 2 O 2 peroxyde d'hydrogène e - OH Radical hydroxyle

7 Espèces Réactives de l Oxygène (ERO) une ERO est beaucoup plus réactive que l oxygène qui leur a donné naissance Anion superoxyde peroxyde d'hydrogène Radical hydroxyle O 2 - H 2 O 2 OH ERO Il existe d autres ERO RO 2 RO Radical peroxyle Radical alkoxyle

8 Origine des différentes ERO Oxygène singulet 1 O 2 hλ O 2 oxydases H 2 O 2 peroxyde d'hydrogène Arg NOS NO Monoxyde d azote NAD(P)H oxydase O 2 - Anion superoxyde SOD Fe 3+ myéloperox Cl - HOCl Ac hypochloreux Peroxynitrite ONOO OH Radical hydroxyle NO 2 Radicaux primaires, dérivent de O 2 ou de N par réduction de 1e - Espèces réactives de O 2 (ERO)

9 Toxicité des différentes ERO Oxygène singulet 1 O 2 hλ O 2 H 2 O 2 peroxyde d'hydrogène Arg NO Monoxyde d azote O 2 - Anion superoxyde Fe 3+ Peroxynitrite ONOO OH Radical hydroxyle Nitration des protéines Activation de kinases Oxydation des protéines Peroxydation des lipides Oxydation du DNA

10 Les Espèces Réactives de l Oxygène Anion superoxyde (O 2 - ) Produit par capture d un électron l oxygène moléculaire est réduit en anion superoxyde : O 2 + 1e - O 2 - Il est produit majoritairement par la CRM, mais également par des oxydases Produit par une oxydase membranaire NAD(P)H oxydase : Modulation de la signalisation cellulaire Intervention dans les régulations métaboliques Parmi les RL du stress oxydant, l anion superoxyde est celui qui a la réactivité vis-à-vis des substrats la plus faible Il ne réagit pas avec les Ac nucléiques et les protéines

11 Les Espèces Réactives de l Oxygène Le radical hydroxyle (OH ) La coexistence de l anion superoxyde et du peroxyde d hydrogène peut engendrer cette espèce oxygénée très réactive Cette réaction est catalysée par des métaux de transition (Fe 2+ et Cu 2+ ) Réaction de Fenton H 2 O 2 + Fe 2+ Fe 3+ + OH - + OH Fe 2+ est reconstitué par divers réducteurs dont l anion superoxyde Fe 3+ + O 2 - Fe 2+ + O 2

12 Les Espèces Réactives de l Oxygène Le monoxyde d azote (NO ) RLO produit in-vivo par les NO Synthases (NOS) Arg + 2 NADPH + O 2 Citrulline + NO + 2 NADP + NO est caractérisé par : Une grande difusibilité Une réactivité limitée Une ½ vie qui n excède pas quelques secondes NO est susceptible de réagir avec : La plupart des ERO Les fonctions thiols Les métaux (fer héminique)

13 Les Espèces Réactives de l Oxygène Le monoxyde d azote (NO ) NO peut être : Oxydé en ion nitrosonium (NO + ) Réduit en anion nitroxyle NO - La production concomitante de NO et d anions superoxyde (O 2 - ) en un même site entraîne la formation du peroxynitrite (ONOO - ) hautement cytotoxique NO + O 2 - ONOO - peroxynitrite NO se rapproche de O 2 - par sa faible réactivité sur les molécules biologiques

14 Les Espèces Réactives de l Oxygène Peroxyde d hydrogène (H 2 O 2 ) Peut être obtenu : Par réduction divalente de l oxygène moléculaire (action des oxydases) O 2 + 2e - + 2H + H 2 O 2 Par dismutation de l anion superoxyde 2O H + H 2 O 2 + O 2 H 2 O 2 électriquement neutre, réactivité limitée diffuse à travers les membranes biologiques plus facilement que l anion superoxyde Il donne naissance à des radicaux plus réactifs.

15 Les Espèces Réactives de l Oxygène Oxygène singulet Atome d oxygène seul Il est très réactif - Durée de vie très courte Il est produit par transfert d énergie lumineuse par des protéines telles que la riboflavine, la bilirubine et le rétinal O 2 hλ 1 O 2 Oxygène singulet

16 Les radicaux libres de l oxygène O2 - Faible action oxydative Anion superoxyde Formé par la mitochondrie Peut générer des radicaux secondaires Radical hydroxyle OH Très réactif avec les macromolécules biologiques Oxyde nitrique NO Réagit avec OH- peroxynitrite Les espèces réactives de l oxygène Peroxynitrite ONOO - Très réactif nitration de Tyr Ac Aminé polaire Oxygène singulet ERO rencontrées dans l organisme 1 O 2 Atome d oxygène seul ; Très réactif ; Durée de vie très limitée Peroxyde d hydrogène H 2 O 2 En présence Fe radical hydroxyle

17 endogènes Origine des EOR Sources exogènes peroxysome mitochondrie auto oxydation phagocytes infections exercice détoxification enzymes oxydantes EOR pollution (NOx, O3) radiation, ultrasons pesticides cigarettes drogues

18 ERO ET SANTÉ PUBLIQUE Existence d une association entre altération des systèmes de défense antioxydants et développement de nombreuses pathologies : Athérosclérose Maladies inflammatoires Diabète cancer SIDA vieillissement ERO Arthrite rhumatoïde Cataracte, dégénérescence rétinienne Asthme Parkinson, démence

19 Sources cellulaires des ERO Dans les cellules production essentiellement enzymatique : CRM NAD(P)H oxydase membranaire A degrés moindres Xanthine oxydase Enzymes du REL (cyt P450) NADH NAD + 4H + succinate fumarate 2H + ½O 2 H2 O 4H + Matrice mitochondriale ~0,4 à 4% C1 C2 C3 C4 4H + 2H + Cyt C 2H + EIM

20 Sources cellulaires des ERO Au niveau mitochondrial Tetraréduction 95% Monoréduction 4e - O 2 1e - H 2 O Cytochrome C oxydase 3-5% O 2 - MnSOD H 2 O 2 OH Radical hydroxyle

21 Sources cellulaires des ERO NAD(P)H oxydase membranaire O 2 O 2 - H + O 2 H + NAD(P)H NAD(P) + NAD(P)H O 2 - NAD(P) + Polynucléaire neutrophile Cellule musculaire lisse Complexe multimérique localisé au niveau de la membrane plasmique. Complexe transmembranaire permettant d interagir avec le substrat NAD(P)H cytoplasmique et de libérer l anion superoxyde produit à l extérieur de la cellule (PN) ou à l intérieur (cellules musculaires lisses)

22 Sources cellulaires des ERO Au niveau du peroxysome Les peroxysomes utilisent une part importante de l O 2 Production majoritaire de H 2 O 2 Glycolate oxydase - acyl-coa oxydase - D-amino acide oxydase La catalase utilise H 2 O 2 formée par ces enzymes pour oxyder différents substrats (AG) et pour la détoxification (éthanol) Au niveau du REL / CytP 450 Réaction de mono-oxyg oxygénation L-H H + O 2 + NADPH + H + L-OH + H 2 O + NADP + Le REL est riche en cytp 450 impliqués s dans les processus de détoxificationd

23 Sources cellulaires des ERO Autres systèmes de production Auto-oxydation Cyclo-oxygénase et lipo-oxygénase Système de transport des électrons dans la membrane nucléaire Xanthine/xanthine oxydase Activation des polynucleaires Hémoglobine et Myoglobine

24 Sources cellulaires des ERO Les mitochondries : principale source de production de radicaux libres Mitochondries microsome peroxysome cytosol 45% 20% 30% 5% Exception pour le foie, oùo les microsomes sont les principaux producteurs Mitochondries microsome peroxysome cytosol 15% 45% 35% 5%

25 Systèmes de Défense

26 Systèmes de Défense Systèmes enzymatiques Superoxyde dismutases Catalase GSH peroxydases

27 Première ligne de défense O 2. - SOD H 2 O+ O 2 Catalase H 2 O 2 Fe 2+ Fe 3+ OH. GSH GPx GSSG H 2 O

28 Superoxyde dismutase.- Enzyme qui permet l élimination du radical O 2 en le métabolisant en H 2 O 2 par une réaction de dismutation. O 2. - H 2 O 2 SOD Différentes formes SOD Localisation Cu/Zn-SOD SOD1 cytosolique O 2.- Mn-SOD SOD2 Mitochondriale (MIM) Cu-SOD SOD3 Matrice extracellulaire Enz-Cu 2+ + O 2.- Enz-Cu + + O H + Enz-Cu + + O 2 Enz-Cu 2+ + H 2 O 2 O H + H 2 O 2 + O 2

29 Catalase Enzyme tétramérique héminique un hème Chaque unité porte un NADPH H 2 O 2 H 2 O+ O 2 Catalase Présentes dans les peroxysomes d un grand nombre de tissus Particulièrement abondantes dans le foie et les GR Sont localisées dans les peroxysomes La réaction se fait en deux étapes : Substrat : H 2 O 2 H 2 O 2 Catalase-Fe 3+ + H 2 O 2 Composé1 + H 2 O Composé1 + 2 H 2 O 2 Catalase-Fe 3+ + H 2 O+O 2 2 H 2 O 2 2H 2 O+O 2

30 Enzyme à sélénocystéine Enzymes capables de détoxifier d origine lipidique. Glutathion peroxydases toxifier H 2 O 2 et d autres d peroxydes Réaction couplée e avec l oxydation l d un d substrat réducteur r (GSH) Quatre types différents (1 à 3 tétramérique) GPx1 : localisation cytosolique cytosolique,, ubiquitaire, fortement exprimée GSH GSSG GR reins foie H 2 O 2 GPx H 2 O GPx2 : localisation cytosolique cellules du tractus gastro-intestinal GPx3 : localisation plasmatique GPx4 : monomérique - localisation interface MIN cytoplasme Au niveau des membranes, elle peut réduire r les hydroperoxydes des Phospholipides et du Cholestérol (GSH 2 ème substrat)

31 Glutathion peroxydases Substrats: H 2 O 2 et hydroperoxydes organiques de type ROOH Action de la Glutathion peroxydase ROOH + 2 GSH ROH + GSSG + H 2 O Glutathion réductase GSSG + 2 NADPH, H + 2 GSH + 2 NADP + GPx ne sont pas spécifiques de H 2 O 2 peuvent agir sur tous les hydroperoxydes des esters de Cholestérol ou des PL des Mb cellulaires GPx sont spécifiques de GSH toutes sont inhibées par le cyanure

32 Systèmes de Défense Systèmes non enzymatiques : piégeurs de radicaux libres Antioxydants liposolubles: - α-tocophérol - carotène Antioxydants hydrosolubles: - ascorbate

33 LA DOUBLE VIE DES RADICAUX LIBRES

34 Faible concentration INTRODUCTION ERO sont des médiateurs cellulaires ayant des fonctions diversifiées : ERO impliquées dans inflammation; phagocytose et réaction immunitaire ERO participent aux voies de transduction du signal de plusieurs Ho et FC (PDGF, insuline ) ½ vie courte, diffusion rapide, réactivité avec protéines et lipides parfaits médiateurs Forte concentration Équilibre redox perturbé ERO s accumulent exercent une toxicité dépendante de la dose, de la nature et de la cellule Cibles des ERO ADN ; ARN ; protéines ; lipides et/ou glucides Problème essentiel de la notion de seuil : Où commence la toxicité où finit la physiologie?

35 Stress oxydant et résistance à l insuline

36 INTRODUCTION L hyperglycémie chronique est impliquée dans la survenue des complications macro et surtout microangiopathiques par l intermédiaire de l exacerbation de 4 voies métaboliques : la voie des polyols l activation accrue d isoformes de PKC l activation des hexosamines la glycation non enzymatique des protéines Ces voies sont toutes intriquées et aboutissent à un stress oxydant A ces facteurs métaboliques liées à l hyperglycémie sont associés des facteurs environnementaux et génétiques

37 Exacerbation de 4 voies métaboliques Glucose Gluc-6-P NADPH NADP + NAD+ NADH Sorbitol Fructose Polyol pathway Fruct-6-P GFAT Gln Glu Glucosamine P Hexosamine pathway UDP - GIcNac NADH Gly-3-P NAD + GAPDH NADH 1,3 Di-P-glycerate O 2.- OH. NAD + DHAP α -Glycerol-P DAG PKC Protein kinase C pathway Methylglyoxal AGEs AGE pathway adapted from M. Brownlee, (Nature 2001)

38 Voie des polyols Lorsque la concentration en glucose devient élevée Activation de la voie des polyols dans les tissus insulino-indépendant AR Glucose Sorbitol SDH Fructose NADPH NADP + NAD + NADH Conséquences : Baisse des coenzymes (NADPH, NAD + ) Baisse du GSH Baisse de l activité des enzymes antioxydantes Accumulation de sorbitol et de fructose peu diffusibles (osmolarité) Rôle dans la neuropathie diabétique (pseudo ischémie de l hyperglycémie) AR : Aldolase Reductase SDH : sorbitol Deshydrogenase

39 En période hyperglycémique Activation des hexosamines L excès d héxosamines favorise la transcription des gènes des facteurs de croissance par N-acétyl-glucosaminylation Principalement le VEGF, facteur proangiogénique et de perméabilité capillaire Glucose Glucosamine (GlcN) G 6-P F 6-P GlcN 6-P glycolyse UDP-GlcN O-glycosylation des protéines Rôle central dans la rétinopathie proliférante (prolifération de néovaisseaux)

40 En période hyperglycémique Activation des PKC Activation liée principalement à l augmentation de la formation de DAG (DiAcylGlycérol), activateur de PKC, à partir des phosphatidyl inositol membranaire Voies d activation associées aux PKCs stress oxydant - AGE - VEGF Conséquences : augmentation de la perméabilité vasculaire augmentation de l endothéline diminution du NO responsables d une diminution du flux sanguin rétinien (ischémie), augmentation de l angiogenèse et de la croissance cellulaire Inhibition de la réponse métabolique induite par l insuline Impliquées dans la rétinopathie, la néphropathie et la neuropathie

41 AGEs ( Produits de Glycation avancée ) Impliqués dans les complications microvasculaires du diabétique Ils sont la conséquence de l HERGLYCEMIE Ils sont formés par des réactions non-enzymatiques entre les groupements aminés des protéines et le glucose ou un de ses dérivés Inducteurs hors de la cellule : GLUCOSE ; FRUCTOSE Inducteurs intracellulaire : dérivés carbonyles du glucose 3-DEOXY GLUCOSONE (décomposition des produits d Amadori) GLYOXAL (auto-oxydation du glucose) METHYL GLYOXAL (Fragmentation du Glycéraldéhyde 3-P et DHAP)

42 Glycation non enzymatique des protéines Réaction de Maillard in vivo qui conduit à la formation des produits avancés de la glycation (AGEs) Produits précoces de la glycation Glucose [Base de Schiff] Produits d Amadori (fructosamine) Transformation Produits intermédiaires de la glycation (1,3 ou 4)-Deoxyglucosone Produits avancés (terminaux) de la glycation CML Pyrraline Phase de propagation de la glycation

43 Glycation: produits intermédiaires Produits intermédiaires de la glycation : aldéhydes réactifs Glucose Peroxidation Lipidique Glycolyse (Degradation) Pr NH 2 Base de Schiff Voie des Polyols Glycation Trioses Phosphate Produits d Amadori Glyoxal Methylglyoxal 3-Deoxyglucosone α-cétoaldehydes

44 Glycation: produits intermédiaires Produits intermédiaires de la glycation : aldéhydes réactifs Lipid Peroxidation Voie des Polyols Degradation du glucose Produits d Amadori Trioses Phosphate α-cétoaldehydes Glyoxal Methylglyoxal 3-Deoxyglucosone O HC α O CH H 3 C O C α O CH H C α O HO HO HO O CH 2 OH

45 Glycation: Produits avancés de glycation Produits avancés de la glycation Glucose Base de Schiff Produits d Amadori (fructosamine) Pr NH 2 Pr NH 2 Pr NH 2 AGEs Intermédiaires glycolytiques : Trioses Phosphate Peroxydation Lipidique

46 stress oxydant / Diabète Voie métabolique obligatoire impliquée très précocement dans l évolution du diabète et responsable de l ensemble des complications par interaction avec les autres voies. hypothèse unifiante de Brownlee (Nature 2001)

47 ERO et action l insuline IR Voie PIP3 SS SS SS PTP1B PH PTB IRS-1 SH2 SH2 PTEN PI-3K PIP3 PH PDK1/2 Synthèse glycogène kinase GSK3 PIP3 PH PKB PP2A PIP3 PH PKC λ,ζ Transport glucose

48 ERO et action l insuline Protéine- Protéine-YOH active PTP-SH O 2 - HCXXAGXXRSG Inactive PTP-SOH mais réversible O 2 - Inactive PTP-SO 2 H et irréversible Forme acide sulfenique Forme acide sulfinique

49 ERO et action l insuline IR O 2 - SOD H 2 O 2 Glucose SS SS SS NAD(P)H oxydase?? DPi O 2 - H 2 O 2 Inhibition des PTPases ou autre(s) intervenant(s) thiol de de IR et IRS (48% et 43%) AUGMENTATION DE LA REPONSE BIOLOGIQUE

50 ERO et action l insuline IR Voie MAPK SS SS SS Raf GTP Ras GDP PH PTB MEK MKP-1 SOS Grb2 MAPK Différenciation Croissance cellulaire

51 ERO et resistance à l insuline (1/2) ERO médiateurs cellulaires ERO sont des médiateurs cellulaires qui activent de nombreuses voies sensibles au stress oxydant dommages cellulaires Certaines de ces voies sont impliquées dans de la RI Voie de NFκB impliquée dans la réponse immunitaire, l inflammation et l apoptose NFκB régule un grand nombre de gènes dont plusieurs associés aux complications du diabète (VEGF; RAGE) Activation de NFκB induit des phosphorylation sur ser protéasome Activation de NFκB activation de PKC, augmentation des AGEs

52 ERO et resistance à l insuline (2/2) ERO médiateurs cellulaires Voie de Jnk super famille des MAPKinases; Jnk / P38 kinases du stress Jnk activées par stress endogène / exogène ; choc osmotique, cytokines proinflammatoires Jnk activées apoptose Voie de P38 super famille des MAPKinases; Jnk / P38 kinases du stress P38 activées hyperglycémie; diabètes

53 ERO action de NFκB (monocyte) Stress oxydant NFκB Protéines d adhésion Cytokines enos MCP-1 VCAM-1 REMODELAGE VASCULAIRE

54 ERO et résistance à l insuline Glucose Acides gras ERO mitochondries Dommages macromoléculaires Stress oxydant NFκB Jnk P38 Hexosamines Sorbitol AGEs DAG cytokines RAGE PKC Résistance à l insuline Dysfonction des cellules β

55 ERO et résistance à l insuline IR Glucose Acides gras cytokines IR SS SS SS SS SS SS PTB PH SP PTB PH IRS-1 SH2 SH2 PI-3K ERO / ERN SP IRS-1 SP SP Réponse normale à l insuline IKKB Jnk ERK autres kinases Peu ou pas de réponse à l insuline SH2 SH2 PI-3K

56 CASCADE D EVENEMENTS METABOLIQUES HERGLYCEMIE AGEs O2 - VOIE DES POLYOLS NADH/NAD + DAG Na/K ATPase NO PKC VEGF LESIONS CELLULAIRES

57 CONCLUSIONS La connaissance des mécanismes moléculaires liées à l hyperglycémie chronique et impliqués dans les complications dégénératives ouvre de nouvelles perspectives thérapeutiques Les voies d altération glycémique alimentent la production radicalaire mitochondriale, responsable du stress oxydant La recherche s oriente vers des thérapeutiques ayant une action synergique sur toutes les voies ou luttant contre le stress oxydant

58 Biologie moléculaire et régulation de la communication cellulaire Aspects fondamentaux et cliniques Méthodes et outils d étude du métabolisme Introduction à la communication et à la signalisation cellulaire J. Giudicelli 3 h 13 mars Les voies de signalisation et de transduction des signaux Grandes voies de signalisation médiées par l'insuline / résistance à l insuline J. Giudicelli 3 h 20 mars Homéostasie du glucose/ métabolisme lipidique/ Pathologies associées Glucotoxicité (glycation / stress oxydant) J. Giudicelli 3 h 27 mars Acides gras nutritionnels et signalisation P. Grimaldi 2 h 03 avril Métabolisme des lipoprotéines / Dislipidémies P Bayer 2 h 03 avril Signalisation et pathologies Modes d'action moléculaires, fonctions biologiques, pathologies associées et nouvelles stratégies thérapeutiques V Goffin 2 h 10 avril Signalisation dans le tissu osseux : Applications actuelles et futures. H Schmid-Antomarchi 2 h 10 avril Chimiokines et cancer A Schmid-Alliana 2 h 17 avril Approches méthodologiques modernes Thérapie génique du diabète F Suavet 2 h 24 avril Spectrométrie de masse ; applications médicales M Samson 2 h 24 avril

59 Biologie moléculaire et régulation de la communication cellulaire Aspects fondamentaux et cliniques Voies de signalisation autres Le contrôle génétique du "milieu intérieur chez la drosophile P Léopold 2 h 15 mai Voies de signalisation et mitochondries B Sibille 2 h 15 mai Signalisation et nutrition Voies de signalisation mtor, insulino-résistance et déficience en synthèse protéique I Satney 2 h 22 mai Sarcopénie (à définir) St Schneider 2 h 22 mai