LES GENES DE L IMMUNOLOGIE ET LA QUESTION GENERALE DE LA DIVERSITE DES ANTI-CORPS

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1 Master immunologie 20/11/07 17h-19h RT :Frédérique DIZIN LES GENES DE L IMMUNOLOGIE ET LA QUESTION GENERALE DE LA DIVERSITE DES ANTI-CORPS I-Introduction et historique II-Organisation des gènes III-Mécanisme responsable de la formation du répertoire A-Réarrangement VDJ B-Mutation somatique C-Commutation isotypique (Switch) IV-conclusion I- Introduction et Historique Comment générer la diversité des Ig a été une question très importante pendant 50 ans. On a trouvé dans le sérum des facteurs qui reconnaissent spécifiquement des structures : -Reconnaissance spécifique de protéine très similaire (jusqu à un seul acide aminé de différence) -Reconnaissance des formes lévogyre/dextrogyre des acide aminé -Reconnaissance de structure chimique de synthèse : les haptènes (absents dans la nature) On est ensuite passé d une théorie adaptative, dans laquelle l Ac se modèle sur l Ag, à une théorie sélective, dans laquelle l Ag sélectionne l Ac parmi un ensemble de structures divers (théorie de la sélection clonale), l Ag sélectionne un lymphocyte B (LB) présentant un Ac a sa surface, on parle de récepteur spécifique. Puis se pose la question de combien y a-t-il de gènes dans le génome -théorie germinale : toutes les spécificités sont codées dans le génome -théorie somatique : très peu de gènes diversifié par des mécanismes somatiques : -mutation -recombinaison -Dreyer et Benett mettent en évidence que le développement du séquençage des protéines met en évidence une partie constante et une partie variable

2 II- Organisation des gènes : Composition du répertoire des gènes de l Ig : pseudo-gène, élément D, élément J et une partie constante et unique. Chez la souris : -chaine lourde (chr12) 195 gènes, 10 éléments D, 4 éléments J et une partie constante (unique). -chaine légère kappa (chr6) 140 gènes dont 100 fonctionnels, 4 éléments J et une partie constante. -chaine légère lambda (chr7) alternance de gènes, éléments D et éléments J. Les chaines légères kappa sont beaucoup plus majoritaires (95%) que les chaines légères lambda (5%). Chez l homme : -chaine lourde (chr14q32) 123 gènes dont 44 seulement fonctionnels, 25 éléments D, 6 éléments J et une partie constante. -chaine légère kappa (chr2p11) 76 gènes dont 51 fonctionnels, 5 éléments J et une partie constante. -chaine légère lambda (chr22q11) 74 gènes dont 31 fonctionnels, 4 éléments J et une partie constante. Comme pour la souris, chez l homme, les chaines légères kappa sont plus majoritaires (2/3) que les chaines légères lambda (1/3). Gènes variables : Organisation des gènes selon leur homologie de séquence : -en famille de taille variable : 7 familles chez l homme, 22 VH3, 11 VH1 et VH3, 3 VH2, 2 VH5, 1 VH6 et VH7. -en groupe : 3 groupes chez l homme Existence de nombreux pseudo-gènes : 19 pseudo-gènes sur 123VH chez l homme Taux de réarrangement variable III- Mécanisme responsable de la formation du répertoire A- recombinaison VDJ Deux choses fondamentales à retenir : -il y a un véritable réarrangement des gènes : on approche un gène d un autre -ce remaniement nécessite un système enzymatique adapté pour exciser la séquence comprise entre deux gènes et l expulser hors de la cellule qui modifie son génome. Ce système doit être capable de couper, liguer, rajouter des nucléotides, selon un processus de recombinaison que l on appel VDJ

3 Le système de recombinaison VDJ : V (gènes variables), D (gènes de diversité), J (gènes de jonction) Le processus de recombinaison VDJ consiste à rapprocher un gène V d un gène D et d un gène J. Ces gènes sont dispersés dans le locus des Ig. Dans un premier temps, un gène D est rapproché d un gène J, formant une unité DJ. Puis dans un deuxième temps, un gène D et rapproché de cette unité formant alors VDJ. Si la recombinaison VDJ donne une entité qui respecte le cadre de lecture et qui est viable au niveau de la configuration protéique, le remaniement est sélectionné, il y a synthèse d une chaine d Ig qui est finalement exportée à la surface de la cellule. Ce processus de recombinaison VDJ est spécifique des lymphocytes, seules cellules de l organisme à modifier leur génome. Il y a un processus d instabilité génétique physiologique. Deux protéines à connaître : -la recombinase RAG (recombinase activating gene) : protéine de recombinaison spécifique des lymphocytes. -la polymérase TdT (terminal deoxynucleotydil transférase) : a pour fonction de rajouter des nucléotides aux points de jonction des segments D, V et J, et ce de manière totalement aléatoire. Formation de séquence N. Le but est d avoir la plus grande diversité possible d Ig, il existe des millions d Ac différents. CDR3 : Le CDR 3 de la chaine lourde est un marqueur de clonalité des lymphocytes B chez l homme. -quasiment aucune redondance dans les cellules naïves -marqueur de l expansion des clones au cours de réponse immunitaire -marqueur des lymphomes (évaluation de l efficacité des traitements-rituximabchimiothérapie-et des cas de rechutes). C est le CDR 3 de la chaine lourde qui à un rôle spécifique et non celui de la chaine légère, car il représente 6 à 20 acides aminés sur la chaine lourde et seulement 7 à 11 acides aminés sur la chaine légère Mécanisme de réarrangement : Signaux de recombinaison : Séquences très conservées : heptamère et nanomère espacés par deux longueurs différentes : 12 ou 23 bases.

4 Facteurs spécifiques aux cellules lymphocytaires : Ce sont des facteurs enzymatiques RAG1 / RAG2 : Ce sont des gènes de sélection, il faut les deux gènes pour pouvoir faire le réarrangement. Ils très proches et très petit, dépourvu d introns. Ils sont suffisants à eux seuls pour induire le réarrangement sur un substrat «accessible». Si l un ou l autre est absent, alors il n y aura pas de cellules lymphocytaires (T et B), ils sont nécessaires individuellement. La TdT (cf plus haut) Facteurs ubiquitaires : Réparation des cassures doubles brin -NHEJ : réparation par jonction de séquences non homologues -DNA-PKcs : mutation SCID chez la souris -Ku70/Ku80 (ou KU86) -Artemis (endo/exonucléase) -DNA ligase IV, XRCC4, Cernunnos/XLF On passe maintenant au mécanisme de réarrangement à proprement parler, j ai remis les diapos de la prof, ils sont pas mal et parlent d eux même.

5 Durant la phase NHEJ il y a des éléments de risques pour la cellule du à l inactivation génique ou à des translocations

6 Inactivation des différents composants : Chez la souris : -RAG-1, RAG-2 : phénotype SCID «severe combined immuno-deficiency» -DNA-PKcs, Artemis: SCID + Radiosensibilité modéré -Ku70, Ku80 : SCID + apoptose des cellules neuronales + radiosensibilité -Ligase IV XRCC4 : létalité embryonnaire (apoptose neuronale massive) + Radiosensibilité Chez l homme : -RAG-1, RAG-2 : Mutations inactivantes : SCID Mutations hypomorphes : SCID + auto-immunité -Artémis : SCID + radiosensibilité modérée -Cernunnos, DNA ligase IV (mutations hypomorphes) : SCID, microcéphalie, Retard mental (phénotype très violent) -pas de mutations décrites pour la DNA-PKcs-Ku70-Ku80 Répertoire pré-immun : Le répertoire théorique excède le nombre de lymphocytes B présents dans l organisme à un moment donné. Certains réarrangements sont retrouvés avec une forte fréquence (modulation également au cours de l ontogénèse). D autres, plus rare, auront l occasion d émerger au cours de la vie animale, lors de la formation continuelle de nouvelles cellules B dans la moelle osseuse. De nombreuses espèces utilisent des mécanismes de diversification additionnels pour former leur répertoire pré-immu. B- Mécanisme d hypermutation La diversification des gènes des immunoglobulines au cours de la réponse immunitaire représente un phénomène «adaptatif» unique au monde vivant par lequel l agent déclenchant cette réponse va induire une mutagénèse ciblée du récepteur responsable de sa reconnaissance et de son élimination.

7 On a une mutation sélectionné par la réponse immunitaire (une mutation de 1 ou 2 acide aminé et non un gène qui change), il a alors un signal de prolifération intense des cellules B naïves, puis mutation sur les gènes des immunoglobulines et enfin sélection par compétition des cellules qui reconnaissent le mieux l Ag. C est un processus qui dure 1 à 2 semaines. On fait distingues ensuite deux cellules B : -les cellules B mémoire (très longue durée de vie, base de la vaccination) -plasmocytes qui secrètent des Ig qui ont une meilleur reconnaissance de l Ag Etude de la maturation de l affinité au cours de la réponse à des antigènes de type haptène : Haptène : très petite structure chimique (équivalent à une base), couplés à des protéines «carrier», incapable de déclencher une réponse immunitaire par eux-mêmes. Exemple : dinitrophenol (DNP), arsenate (Ars) Un certain nombre d entre eux génèrent des réponses récurrentes, basées sur l existence d un répertoire germinal mobilisant une combinaison VH-VL réarrangée d occurrence fréquente et présentant une bonne affinité pour l haptène. On a de plus en plus de mutations récurrentes avec une affinité de plus en plus forte. Exemple : évolution de la réponse à la phényl-oxalone -mobilisation d un réarrangement VH/VL «canonique» -augmentation de l affinité par mutations ponctuelles et sélection des mutants de meilleure affinité (quelques mutations «clés») -émergence au cours des immunisations successives d autres réarrangements, de plus faible affinité initiale mais susceptible de plus forte amélioration. Mutation somatique : -se produit à des stades de différentiation spécifiques des cellules B -très fort taux de mutation (10 3/bp /division) (1 million de fois supérieur au taux de mutation spontané de l ADN) -domaine muté situé à 2kb en aval du promoteur Ig -dépend des enhancers spécifiques des immunoglobulines -la cible elle-même n a pas de séquence spécifique (le gène V peut être remplacé par n importe quel autre gène) -les quatre bases sont mutées (transitions/transversions : 2/1) mutations ponctuelles essentiellement (délétions et duplications) -hotspots de mutation : RGYW

8 Lorsque le lymphocyte B rencontre son Ag, il subit un test d affinité pour ce dernier. Si l affinité est insuffisante, le lymphocyte va subir le processus d hypermutation somatique. L Ig est re-synthétisée et subit un nouveau test a l issu duquel : -soit l affinité est augmentée et le clone est sélectionné -soit l affinité est diminuée et donc la cellule meurt par apoptose (On a aussi une mise en mémoire de la cellule) Facteur spécifique (que dans les lymphocytes B) : AID (activation-induced cytine deaminas) : Responsable de trois mécanismes de diversification des gènes des immunoglobulines : -mutations somatiques -la commutation isotypique -la conversion génique La même région variable va être combinée à des structures constantes différentes. L AID desamine des cytidine de l ADN (on enlève NH2), on a donc de l uracile qui est une base étrangère pour l ADN mais c est un évènement bénin lors de désamination spontanée ou lors de la réplication, on a une activité de réparation. ADN polymérase «translésionnelles» : Franchissement des lésions de l ADN «non-informatives» bloquant la progression de la fourche de réplication (sites basiques, dimères de thymidine induits par les rayons UV, bases oxydées ) ADN polymérase souvent antimutagènes an face de lésions, mais très peu fidèles en présence d ADN normal. Syndrome XP-V (enfants de la lune) : risque accru de cancres cutanés UV-induits / inactivation de l ADN polymérase eta.

9 -reconnaissance de l uracile comme mismatch (phase G1) par le complexe MSH2/MSH6 et «réparation» mutagène par l ADN polymérase eta (mécanisme spécifique aux cellules B). -reconnaissance de l uracile par l uracile glycosylase en début de phase S, formation d un site abasique franchi par une ou plusieurs polymérases translésionelles (rôle normale de ces polymérases). En voulant réparer, on fait plus d erreur qu au début surtout par les ADN polymérases translésionelles qui sont des ADN polymérase à fort taux d erreur. Ces ADN polymérase sont plus tolérants et moins précises, elles ne s occupent que des lésions. Dans l hypermutation, on a l AID et on recrute des facteurs pour amplifier la mutagénèse initiale sur les gènes V C- commutation isotypique

10 Il y a association de différents exons codants pour les régions CONSTANTES de chaque type d Ig. Ainsi la commutation isotypique c est la recombinaison de la région constante de la chaine lourde qui aboutit à un mécanisme de transcription-épissage-traduction-sécrétion d Ig. Les régions Switch : -sont située sur le gène codant pour la chaine lourde -Elles sont situées en 5 dans les exons codant pour la région constante de ces mêmes chaines. -On les trouve aussi dans les régions introniques, ce qui permet de ne pas rompre la carde de lecture -Elles sont riches en séquences répétées, en GC et s apparient donc entre elles. -mécanisme : En 5 des exons les régions S peuvent s associer entre et créer un BOUCLE ; la partie génomique située dans cette boucle sera excisée, ce qui permettra le rapprochement des régions spécifiques -Il y a différentes recombinaisons possibles -C est la protéine AID qui est indispensable au Switch Déficit immunitaire lié à un défaut de la commutation isotypique : syndrome d hyper- IgM :-causes cellulaires (interaction lymphocytes B et T) -causes moléculaires (AID )

11 IV- conclusion Conséquence des processus de remaniement des gènes des immunoglobulines : les translocations d oncogènes dans les tumeurs : c-myc lymphome de burkitt translocations t (8 ;14)(q24 ;q32) t (8 ;22)(q24 ;q11) bcl-2 lymphomes folliculaires t (11 ;18)(q32 ;q21) bcl-6 lymphomes B larges et diffus t (3 ;14)(q27 ;q32) Origines :-cassures de l ADN lors de réarrangement -cassures de l Adn liées au Switch -cassures anormales lors de l hypermutation -évènement de mutagénèse non ciblées? Quatre types de remaniements affectent les gènes des immunoglobulines : -une recombinaison site-spécifique (réarrangement) -une mutagénèse aléatoire (hypermutation) -une recombinaison non-homologue (commutation isotypique) -une recombinaison homologue non-réciproque (conversion génique) (Génère le répertoire immunitaire chez certaines espèces) Tous ces mécanismes participent à la formation du répertoire des cellules B et/ou à la maturation de la réponse immunitaire. La conséquence négative de cette extrême plasticité génomique est représentée pas des évènements de translocation (et de mutation?) à l origine de nombreuses tumeurs lymphoïdes. Voila!! C est fini, je sais ce n est pas très évident, mais la prof n a pas toujours été très claire dans ses explications J espère que ca ira