PCR quantitative 18S fongique

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1 Version :2 Page : 1 / 6 Version Date Modificateur Descriptif 0 26/08/2009 N. Chemidlin Création du document 1 01/01/2010 M. Lelievre Ajout séquences des amorces 2 24/10/2012 M. Lelievre MAJ complete : mise en page, en tête, changement appareil et harmonisation du texte 2 16/01/2013 C. Bard Précision du lieu de manipulation (hotte ou paillasse tout au long du document) 3- Ajout précisions sur SybrGreen 6- Ajout précisions sur la non conservation de la gamme

2 Version :2 Page : 2 / 6 1- Mots clés PCR quantitative, champignons, ADNr 18S, FR1, FF Objectif / principe L objectif de ce mode opératoire est de dénombrer le nombre de copies d ADN ribosomal 18S de champignon au sein d un échantillon d ADN. Ce dénombrement est réalisé par PCR en temps réel en utilisant un couple d amorces spécifique des champignons : FR1 / FF390 (Vainio et al., 2000), préalablement validé pour sa spécificité. 3- Consignes de sécurité La PCR en temps réel utilise des molécules cancérigènes (SYBRGreen ) pour mesurer la quantité d ADN. Il est donc impératif de toujours travailler avec des gants et de manipuler le SYBRGreen sous la hotte. 4- Durée de l expérience : 3h30 : 1h de préparation de la plaque PCR et 2h30 de PCR en temps réel 5- Matériel et produits nécessaires Matériel : Appareil de PCR en temps réel (StepOne Plus) Logiciel Pipettes (spécifiques aux produits manipulés) Consommables stock plateforme_conservatoire GenoSol Plaque 96 puits/barettes/tubes 0.2ml de qualité optique (Applied Biosystems) Film optique/bouchons optiques (Applied biosystems) stock commun microtubes 2ml/1,5ml pointes à filtres pointes normales plaque ABgene 96 puits + bouchon (strip*8 puits) Produits de biologie moléculaire (stock plateforme_conservatoire) Master Mix SYBRGreen T4 Apligen Eau 5 PRIME Gamme qpcr 18S (aliquot tube mère à 0.5E9 copies/µl) Etalon interne Gx (aliquot) Amorces FR1/FF390 10µM purif RP-CARTRIDGE (stock aliquots gérés par T. Regnier)

3 Version :2 Page : 3 / 6 6- Méthode : Réserver l appareil et un créneau Préparer le plan d expérimentation à l aide de la trame de mix Diluer les échantillons à 1ng/µl avec une prise d essai minimum de 0.5-1µl selon la pipette utilisée dans de l eau UP (5 PRIME). Les échantillons peuvent être directement dilués en plaque 96 puits selon le même plan de plaque que le plan d expérimentation. La plaque 96 puits + bouchons doit être stérilisée aux UV pendant 15 minutes. Si la dilution est réalisée plus de 24h à l avance, conserver la plaque à -20 C jusqu à son utilisation. Stériliser la hotte PCR aux UV pendant 10 minutes en ayant pris soin de placer la plaque 96 puits en dessous sur son portoir spécifique, une paire de gants, l eau UP, le réservoir, le tube de mix. Mettre les aliquots d amorces à dégeler, le master Mix SybrGreen (Applied). Préparer la T4 dans un bloc froid ou au congélateur. Pendant ce temps, o Centrifuger la plaque d ADN : short jusqu à g o Préparer la gamme à partir du tube mère : 6 points de gamme de 10 8 copies/µl à 10 3 copies/µl, avec au moins 2µl de prise d essais (soit 2µl de sol mère + 18µl d eau UP). La gamme est utilisable une seule fois car elle ne se conserve pas. o Préparer l étalon interne (utiliser le même pour un projet) à 1ng/µl Une fois les UV éteints, préparer le mix PCR selon le tableau ci-après avec des cônes à filtre. Une trame d analyse de mix est disponible dans la documentation qualité. TOUT LE CONSOMMABLE SOUILLE AU SYBRGREEN DOIT ETRE EVACUE SPECIFIQUEMENT ET EN SECURIBAC!! Composition du Mix marque Concentration initiale quantité finale Pour 1 Tube (µl) Master mix SybrGreen (6mM Life MgCl2) Technologies 2x 1x 10 Primer 1 (FR1) (10µM) Eurogentec 10µM 1.25µM 2.5 Primer 2 (FF390) (10µM) Eurogentec 10µM 1.25µM 2.5 H 2 O 5PRIME T4 apligene MP Bio 500µg/ml 0.500µg 1

4 Version :2 Page : 4 / 6 x 35 cycles Séquences des primers : FR1 : 5 -AICCATTCAATCGGTAIT-3 FF390 : 5 -CGATAACGAACGAGACCT-3 I : Inosine. Elle ne s hybride à aucune des bases azotées Le I peut être remplacé par un N. Le N représente un mélange équimolaire de chaque base alors que le I se lie aspécifiquement à chaque nucléotide. Il n y a aucun impact sur le programme thermique ou le résultat. (sous la hotte) :Distribuer le mix (18µl par puits) dans la plaque 96 puits à l aide de la pipette distributrice ou d une pipette multicanaux + réservoir. Ajouter 2µl d ADN dilué (à 1ng/µl) ou de gamme dans la plaque 96 puits. (jamais d ADN sous la hotte!) Si vous plongez la pipette directement dans le mix, la pointe est souillée au SybrGreen, et donc à évacuer en conséquence. Attention à ouvrir les tubes délicatement pour éviter toute contamination entre les tubes d ADN dilués. Recouvrir la plaque contenant le mix qpcr et l ADN avec un film optique Applied et bien maroufler le film plastique, particulièrement entre les puits, afin qu il n y ait pas d évaporation au cours de la réaction ni de contamination entre les puits. Centrifuger la plaque : short jusqu à g. Homogénéiser la plaque sur l agitateur de plaque pendant 30 secondes La taq étant une hot start, il est possible de préparer l expérimentation à l avance et de stocker la plaque quelques heures à 4 C! Placer la plaque dans le bon sens dans l appareil PCR en temps réel et lancer la méthode. - Dénaturation initiale : 95 C_10minutes - Dénaturation : 95 C_15 secondes - Hybridation des amorces : 50 C_30 secondes - Elongation : 72 C_1 minute (+ collecte données) - Courbes de dissociation : 95 C_ 15 sec ; 60 C_15 sec ; (0.5 C/seconde) ; 95 C_15 sec Valider la plaque à l aide de l instruction de validation des analyses qpcr. Les critères ont été fixés par la plateforme :

5 Version :2 Page : 5 / 6 - Vérification qualitative d une amplification PCR : amplification de l étalon interne - Valider la gamme de standards : linéarité de la gamme et homogénéité entre réplicats - La linéarité de la droite de régression doit être très bonne. Le coefficient de corrélation (r²) doit être supérieur à 0, Les échantillons doivent être compris entre les bornes supérieure et inférieur de la gamme. Il faut éviter d avoir à faire des extrapolations. - L efficacité de PCR doit être comprise entre 85% et 110%, ce qui correspond à une pente comprise entre -3,1 et -3,74. - Les échantillons doivent se situés à au moins 1 log du témoin négatif (NTC, c.f. Amplification plot) et sortir à des cycles compris dans l intervalle défini par la gamme de standards. - Vérifier la "Melt Curve" : 1 pic - Vérifier les erreurs signalées par le logiciel : les flags SI LA PLAQUE EST VALIDE, exporter les données qui seront alors analysables. Les données exportées seront analysées selon la méthode de la super gamme (utiliser le Ct moyen de tous les étalons interne pour corriger les valeurs de Ct des points de gamme et des échantillons et calculer le nombre de copies de gènes pour chaque échantillon avec une nouvelle valeur de pente et d ordonnée à l origine) 7- Réactifs chimiques, éléments de sécurité Produits Numéro CAS Formule chimique Toxicité Nouveaux pictogrammes Protection SybrGreen Blouse, gants 8- Evacuation des déchets Les déchets liquides sont récupérés dans des flacons prévus à cet effet puis évacuer en soute sous forme de bidon ou dans un sécuribac. Les consommables sont éliminés dans des poubelles jaunes de laboratoire prévues à cet effet. Ces poubelles sont évacuées une à deux fois par semaine par une société privée. Les papiers et gants non contaminés sont évacués dans les poubelles conventionnelles. Les déchets contaminés au SYBRGreen sont évacués dans un sac placé sous la hotte PCR qui sera ensuite placé en sécuribac.

6 Version :2 Page : 6 / 6 9- Référence(s) bibliographique(s) Vainio, E. J. and J. Hantula (2000). "Direct analysis of wood-inhabiting fungi using denaturing gradient gel electrophoresis of amplified ribosomal DNA." Mycological Research 104(8): N Chemidlin Prevost Bouré, C Mougel, S Dequiedt, M Lelievre, R Christen, L Ranjard* Optimization and validation of real time PCR of fungal communities in soils. Plos One 6, e2466.