QUANTA Lite C1q CIC ELISA Uniquement pour Diagnostics In-Vitro Complexité de CLIA: Haut
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- Élodie Leroux
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1 QUANTA Lite C1q CIC ELISA Uniquement pour Diagnostics In-Vitro Complexité de CLIA: Haut Application Ce coffret est destiné au dosage in-vitro des complexes immuns circulants (CIC) liant le C1q dans le sérum humain. Il permet de déterminer le taux de CIC dans le sérum de patients ayant différentes maladies autoimmunes ou maladies liées au CIC. Les résultats doivent être interprétés en fonction de la clinique. 41 échantillons en double ou 89 échantillons en simple avec une courbe de calibration, un contrôle positif et un contrôle négatif peuvent être testés avec ce coffret. Informations concernant le test Les interactions antigène-anticorps peuvent résulter dans la formation de complexes immuns. Ils font partie des fonctions immunologiques normales du corps. Les antigènes peuvent être fixés dans les tissus ou libres dans le plasma ou dans les autres liquides du corps formant des complexes immuns circulants. Normalement, les CIC sont éliminés par le système réticuloendothélial. Cependant, des dépôts importants de complexes immuns dans les structures vasculaires avec une activation des voies inflammatoires telle que la cascade du complément peuvent induire une maladie des complexes immuns avec des dommages tissulaires. L importance de ces complexes dépend de nombreux paramètres comme la nature de l antigène, la classe des anticorps, la taille des complexes, leur taux de production et l intégrité fonctionnelle du système phagocytaire. A cause du rôle pathogénique des CIC dans de nombreuses maladies, des méthodes spécifiques ont été développées pour les détecter. Ces méthodes portent sur les propriétés physicochimiques spécifiques des CIC et/ou leur capacité à se lier à des cellules comme les cellules de Raji et les plaquettes ou les molécules telles que le C1q 1, 2, 3. En effet, l organisation mondiale de la santé a recommandé d utiliser au moins deux méthodes distinctes pour mesurer les CIC 4. Le dosage des concentrations sériques des CIC liant le C1q en ELISA est un facteur de prognostic important 5. Il est particulièrement adapté au suivi des taux de CIC chez des patients atteints de lupus érythémateux disséminé pour lesquels les taux varient avec l activité de la maladie et chez les patients présentant des réponses abaissées en protéines du complément 6. Principe du test Les micropuits sont recouverts de C1q humain purifié. Les calibrateurs, les contrôles et les échantillons dilués sont déposés dans les puits et les complexes immuns se lient au C1q durant la première incubation. Après le lavage des puits pour éliminer toutes les protéines non fixées, un conjugué HRP de chèvre anti-igg humaines est ajouté. Le conjugué se lie à l anticorps fixé et l excès de conjugué non lié est éliminé lors d une autre étape de lavage. Le conjugué lié est visualisé avec du 3,3,5,5 tetramethylbenzidine (TMB) qui donne un produit de réaction bleu. L intensité est proportionnelle à la concentration en CIC de l échantillon. De l acide sulfurique est ajoutée à chaque puits pour arrêter la réaction. Le produit de la réaction est jaune et la lecture doit se faire à 450nm. La concentration en CIC dans l échantillon est lue à partir de la courbe de calibration et les résultats sont exprimés en équivalents d IgG humaines agrégées à la chaleur par ml (µg Eq/mL). Contenu du coffret 1. Plaque de microtitration ELISA revêtue d antigène humain C1q avec portoir de 12 barrettes de 8 micropuits en polystyrène sécables, dans un sachet d aluminium avec un dessiccant 2. Contrôle Négatif ELISA pré-dilué, 1 flacon de 1,2 ml de sérum humain sans anticorps humains C1q, dans du 3. Calibrateur A ELISA C1q CIC pré-dilué, 1 flacon de 1,2 ml de d IgG humaines agrégées à C1q, dans du 4. Calibrateur B ELISA C1q CIC pré-dilué, 1 flacon de 1,2 ml de d IgG humaines agrégées à C1q, dans du 5. Calibrateur A ELISA C1q CIC pré-dilué, 1 flacon de 1,2 ml de d IgG humaines agrégées à C1q, dans du 6. Calibrateur A ELISA C1q CIC pré-dilué, 1 flacon de 1,2 ml de d IgG humaines agrégées à C1q, dans du 7. Calibrateur A ELISA C1q CIC pré-dilué, 1 flacon de 1,2 ml de d IgG humaines agrégées à C1q, dans du 8. Contrôle positif C1q CIC pré-dilué, 1 flacon de 1,2 ml de d IgG humaines agrégées à C1q, dans du 9. Diluant d échantillons type III, teinté en jaune, 2 flacons de 50 ml contenant du tampon, du Tween 20, des stabilisateurs de protéines et des conservateurs 10. Tampon de lavage HRP concentré 40X tampon Tris salin avec du Tween 20, teinté de rouge, 1 flacon de 25 ml. Consulter le paragraphe Méthode pour la dilution. 11. Conjugué HRP C1q CIC IgG, 1 flacon, teinté en bleu, dans du tampon avec des stabilisateurs de protéines et des conservateurs, de 10 ml 12. TMB Chromogène, avec stabilisateurs, 1 flacon de 10 ml 13. Solution d arrêt HRP, acide sulfurique 0,344M, non teinté, 1 flacon de 10 ml Avertissements 1. ATTENTION: le diluant d échantillons, contrôles et le conjugué contiennent 0,02% de chloramphénicol, considéré comme cancérigène dans l état de Californie. Le diluant d échantillons contient également Proclin 150. Eviter tout contact avec la peau ou les yeux et toute inhalation. 1
2 2. Tout le matériel d'origine humain utilisé pour la préparation des contrôles a été testé et trouvé négatif lors de la recherche d'anticorps anti-vih, anti-antigène de surface de l'hépatite B et anti-virus de l Hépatite C à l'aide de tests approuvés par la FDA. Cependant, aucune méthode ne peut donner une garantie complète quant à l'absence de VIH, de VHB, du VHC ou d'autres agents infectieux. En conséquence, tous les sérums humains de contrôle doivent être manipulés avec les mêmes précautions que celles utilisées pour un matériel potentiellement infectieux. (réf. 8) 3. L azide de sodium (NaN 3 ) est utilisé comme conservateur. NaN 3 est un poison et il est toxique en cas d ingestion et de contact avec les yeux et la peau. Eviter de l exposer aux bases, métaux ou autres composants, réagissant avec les acides. Après l évacuation des réactifs, laver à grande eau afin d éviter des dépôts dans les canalisations. 4. Le conjugué HRP C1q CIC IgG contient un composant chimique dilué qui est un poison corrosif, toxique en cas d'ingestion en grande quantité. Pour éviter des brûlures chimiques, il est recommandé d'éviter tout contact avec la peau ou les yeux. 5. Le chromogène TMB est irritant et peut être toxique en cas d'inhalation, d'ingestion et d absorption en grande quantité. Eviter tout contact avec la peau ou les yeux et toute inhalation. 6. La solution d'arrêt HRP est une solution diluée d'acide sulfurique. Eviter de l exposer aux bases, aux métaux, aux oxydants ou tout autre composé susceptible de réagir avec les acides. L acide sulfurique est toxique et corrosif en cas d absorption. Eviter le contact avec la peau et les yeux pour éviter toute brûlure chimique. 7. Lors de la manipulation de ces produits, utiliser les équipements de protection personnelle appropriés. 8. Les éclaboussures de réactifs doivent être nettoyées immédiatement. Respecter les règlements en vigueur concernant l élimination des déchets. Précautions 1. Ce test est pour un usage diagnostic in vitro. 2. Ces réactifs doivent être utilisés uniquement par un personnel qualifié. 3. Il est recommandé de suivre scrupuleusement le protocole. Toute déviation peut affecter les performances du test et les résultats obtenus. Faire attention aux «Notes» spécifiques et aux précautions d utilisation. 4. Les réactifs provenant de différents lots ne sont pas interchangeables. Si un grand nombre de tests est réalisé, s assurer que tous les réactifs soient du même lot. Toutes les barrettes utilisées doivent provenir du même emballage aluminium. L utilisation d autres composants peut induire des résultats incorrects. 5. Afin d éviter la contamination des réactifs, utiliser uniquement des récipients neufs ou correctement nettoyés en plastique ou en verre. Ne jamais remettre les réactifs non utilisés dans les flacons. 6. Ne pas laisser les flacons de réactifs sans bouchon. Une évaporation ou une contamination peut induire des résultats incorrects. 7. Le substrat TMB ne doit pas être exposé à la lumière ou à l eau. 8. Les sérums contaminés par des bactéries, hémolysés ou lipidiques et les échantilllons contenant des particules de matière ne doivent pas être utilisés. 9. Une mauvaise dilution ne peut pas être vérifiée comme les contrôles du coffret sont prêts à l emploi. L utilisation de pipettes calibrées et de contrôles de qualité internes est recommandée. 10. L utilisation d automates, de diluteurs et d autres équipements automatisés peut induire des différences dans les résultats en comparaison avec la procédure manuelle. Il est de la responsabilité de tout laboratoire de valider complètement le système et de s assurer que les résultats soient dans les limites indiquées dans la fiche technique et dans le certificat de contrôle de qualité associé. 11. Tout équipement doit être calibré et entretenu suivant les instructions du fabricant. Conditions de conservation 1. Le coffret doit être stocké à 2-8 C et ne doit pas être congelé. 2. Le tampon de lavage dilué est stable pour une semaine à 2-8 C. 3. La date de péremption figure sur l étiquette du coffret. Echantillons 1. Les échantillons doivent être prélevés par ponction veineuse et le sérum doit être séparé après coagulation. 2. Les sérums peuvent être conservés à 2-8 C pendant 7 jours avant les tests (réf. 6) ou aliquotés et congelés à -20 C minimum pour une conservation plus longue. 3. Les congélations et décongélations répétées doivent être évitées. 4. Les sérums ne doivent pas être inactivés par la chaleur, ceci peut induire de faux positifs. Procédure Matériel fourni Une fiche technique : donnant tous les détails de la technique. Un certificat de contrôle qualité : indiquant les performances du lot. Contrôle Négatif ELISA : 1 flacon de 1,2mL de sérum humain prédilué. La valeur est indiquée sur le certificat de contrôle qualité. Il est fourni prêt à l emploi. Calibrateurs C1q CIC: 5 flacons contenant 1,2mL d IgG humaines agrégées avec les concentrations suivantes en complexes immuns : 100 ; 33,3 ; 11,1 ; 3,7 ; 1,23 µg Eq/mL. Ils sont prêts à l emploi. Contrôle positif C1q CIC: 1 flacon de 1,2mL d IgG humaines agrégées prédilué. La valeur est indiquée sur le certificat de contrôle qualité. Il est fourni prêt à l emploi. Diluant d échantillons Type III : 2 flacons de 50mL de tampon prêt à l emploi et coloré en jaune. Nécessaire à la dilution des échantillons. Tampon de lavage HRP concentré 40X: 1 flacon de 25mL de tampon concentré 40 fois pour le lavage des puits. Conjugué C1q CIC IgG-HRP : 1 flacon de 10mL d antisérum humaines IgG purifié et conjugué à la peroxydase. Il est prêt à l emploi et coloré en bleu. 2
3 TMB Chromogène : 1 flacon de 10mL de TMB prêt à l emploi. Solution d arrêt HRP : 1 flacon de 10mL acide sulfurique 0,344M, prêt à l emploi. Autre matériel nécessaire non fourni Laveur automatique de plaque : recommandé, cependant les lavages manuels sont également possibles. Lecteur de microplaques : capable de mesurer la densité optique à 450nm. Eau distillée ou eau désionisée : elle doit être de très bonne qualité. Micropipettes : pour la distribution de volumes de 1000, 100 et 10µL. Pipette multicanaux : pour la distribution de volumes de 100µL de conjugué, de substrat et de solution d arrêt. Tubes en plastique ou en verre : pour la dilution des échantillons. Méthode Préparation du test 1. Ramener le coffret à température ambiante Ces coffrets sont opérationnels à une température comprise entre 20 et 24 C. Avant utilisation, laisser le coffret à température ambiante pendant environ 60 minutes. Ne pas retirer les barrettes de leur sachet aluminium durant cette période. Attendre que les barrettes soient à température ambiante. Note : Les coffrets peuvent être gardés à température ambiante au plus une semaine. 2. Composants du coffret Mélanger chaque composant du coffret avant utilisation. 3. Dilution du tampon lavage (concentré 40 fois) Diluer la totalité de la solution de lavage (25ml) avec 975 ml d eau distillée (1/40). La solution de tampon diluée reste stable une semaine à 2-8 C. Si la totalité de la plaque de microtitration n est pas utilisée en une seule fois, un plus petit volume de tampon sera suffisant, par exemple pour traiter 16 puits, diluer 2ml de tampon concentré dans 78ml d eau distillée ou deionsée. 4. Dilution des échantillons Diluer 10µL de chaque échantillon avec 1000µL de diluant échantillon (dilution au 1:101) et mélanger bien. Note : L échantillon dilué doit être utilisé dans les 8 heures suivant la dilution. 5. Manipulation des barrettes et du support Placer le nombre de puits requis sur le support de la position A1 en remplissant les colonnes de gauche à droite. Manipuler la plaque par les bords longs du support de plaque afin d émpécher les puits de tomber. Note : Remettre immediatemment les puits non utilisés dans leur emballage aluminium avec les deux dessicateurs et refermer soigneusement afin de minimiser l exposition à l humidité. Faire attention à ne pas percer ou déchirer le sachet, cf.ci-dessous. ATTENTION : L exposition des puits à l humidité, à la poussière ou à des particules de matière peut induire une dégradation de l antigène conduisant à une mauvaise précision et à des résultats potentiellement faux. Exécution du test 1. Dépôt des échantillons Déposer 100µL de chaque calibrateur, contrôle et échantillon dilué (1:101) dans les puits appropriés de la plaque fournie. Note : Les échantillons doivent être déposés sur la plaque aussi rapidement que possible pour minimiser les différences et le décompte doit démarrer après l ajoût du dernier échantillon. Incuber à température ambiante pendant 30 minutes. 2. Lavage La procédure de lavage est très importante et requiert une attention spéciale. Une plaque mal lavée peut donner de mauvais résultats avec une mauvaise précision et du bruit de fond. Après l incubation, vider la plaque et laver 3 fois les puits avec 200 à 300µL de tampon de lavage par puits. Laver la plaque manuellement ou avec un lecteur de plaque automatique comme indiqué ci-dessous. Après le lavage final, renverser la plaque et taper les puits sur du papier absorbant. Les plaques peuvent être lavées manuellement comme indiqué ci-dessous : a. Vider le contenu de la plaque dans un réservoir, b. Taper les puits sur du papier absorbant. c. Remplisser chaque puits avec 200 à 300µL de tampon de lavage en utilisant une pipette multicanaux. d. Agiter doucement la plaque. e. Répéter 2 fois les étapes a à d. f. Répéter les étapes a et b. 3. Dépôt du conjugué Déposer 100µL de conjugué dans chaque puits. Enlever les éclaboussures autour des puits à l aide d un tissu. Note : Afin d éviter les contaminations, ne jamais remettre l excès de conjugué dans le flacon d origine. Incuber à température ambiante pendant 30 minutes. 4. Lavage Répéter l étape Dépôt du substrat (TMB) Déposer 100µL de substrat TMB dans chaque puits. Enlever les éclaboussures autour des puits à l aide d un tissu. Note : Afin d éviter les contaminations, ne jamais remettre l excès de TMB dans le flacon d origine. Incuber à température ambiante dans l obscurité pendant 30 minutes. 6. Solution d arrêt Déposer 100µL de solution d arrêt dans chaque puits. Ceci induit un changement de couleur du bleu au jaune. 7. Mesure de la densité optique Lire la densité optique (DO) de chaque puits à 450nm avec un lecteur de microplaques dans les 30 minutes suivant l arrêt de la réaction. 3
4 Contrôle de qualité 1. Contrôle de qualité Afin de valider le test, tous les critères suivants doivent être respectés : Les calibrateurs, les contrôles positifs et négatifs doivent être inclus dans chaque série de test. Les valeurs obtenues pour chaque contrôle doivent être dans les gammes indiquées dans le certificat de contrôle de qualité. La forme de la courbe doit être similaire à la courbe de calibration fournie dans le certificat de contrôle de qualité. Si les critères ci-dessus ne sont pas respectés, le test est invalide et doit être répété. 2. Calcul des densités optiques moyennes (pour des tests en diplicats uniquement) Pour chaque calibrateur, contrôle et échantillon, calculer le DO moyenne des duplicats. Le coefficient de variation (CV en %) pour chaque duplicat doit être inférieur à 15%. 3. Courbe de calibration La courbe de calibration peut être tracée automatiquement ou manuellement en indiquant en abscisses la concentration en CIC en µg Eq/mL sur une échelle logarithmique et en ordonnées la DO pour chaque calibrateur sur une échelle linéaire. En automatique, utiliser le logiciel approprié avec une courbe la plus proche possible des données. En manuel, utiliser un papier linéaire/logarithmique et tracer une courbe passant par tous les points (pas une droite ni du point à point). 4. Traitement des points anormaux Si un point n est pas sur la courbe, il peut être éliminé. Si en l absence de ce point, la forme de la courbe est différente de celle présentée dans le certificat de contrôle de qualité ou si plus d un point n est pas sur la courbe, le test doit être répété. 5. Calcul des taux de CIC des contrôles et des échantillons Lire le taux de CIC dans les contrôles et dans les échantillons dilués directement à partir de la courbe de calibration. Les valeurs des contrôles doivent être dans les gammes données dans le certificat de contrôle de qualité. Note : Les valeurs des calibrateurs ont été ajustées d un facteur 100 pour tenir compte de la dilution de l échantillon au 1:101. Par conséquent, aucune correction n est requise. 6. Calibration du test Le test est calibré en µg Eq/mL en utilisant des calibrateurs internes calibrés contre la préparation de référence WHO des IgG humaines agrégées. Limites du test Ces coffrets apportent une aide au diagnostic uniquement. Un résultat positif peut suggérer certaines maladies qu doivent être confirmées par la clinique et par d autres tests sérologiques. Les résultats obtenus avec ce coffret ne sont pas une preuve diagnostique de la présence ou de l absence de maladie. Veuillez noter que les sérums peuvent contenir des substances interférentes telles que des agents chélateurs, de l ADN, des autoanticorps anti-c1q, du facteur rhumatoïde ou des immunoglobulines monomériques. Performances La gamme normale a été déterminée sur 200 sérums de donneurs de sang adultes et sains et les valeurs suivantes sont exprimées en µg Equivalents par ml (µg Eq/mL). Les gammes ci-dessous sont fournies à titre indicatif uniquement. Les tests ELISA sont très sensibles et capables de détecter de faibles différences entre les échantillons. Il est recommandé à chaque laboratoire de déterminer ses propres normes en fonction des techniques et du matériel utilisés. Valeurs Attendues < 4,4μg Eq/mL Résultat négatif 4,4 -<10,8µg Eq/mL Résultat douteux 10,8μg Eq/mL Résultat positif Valeur normale Les taux de CIC-C1q ont été mesurés dans le sérum de 200 donneurs de sang sains, les résultats sont présentés sur le graphe ci-dessous. Les CIC-C1q sont rencontrés sporadiquement dans la population normale comme un résultat d infections et peuvent être également élevés après le repas. Pour obtenir un seuil logique pour les «vrais normaux», les échantillons élevés ont été éliminés lors de 3 cycles itératifs, ce qui donne un seuil à 4,4µg Eq/mL. Une gamme de douteux a été établie entre 4,4 et 10,8µg Eq/mL avec des échantillons positifs 10,8µg Eq/mL. Sur cette base, 9 échantillons sur 200 étaient positifs avec des valeurs entre 11,6 et 13,5µg Eq/mL. Distribution normale Nb d'échantillons >10 CIC C1q ug Eq/mL Cette gamme normale est fournie à titre indicatif uniquement. Il est recommandé à chaque laboratoire de déterminer ses propres normes. 4
5 Performances Spécifiques Précision Les précisions inter- et intra-essai ont été mesurées en utilisant trois échantillons à l intérieur de la courbe de calibration. La concentration moyenne et le CV en % pour chaque échantillon sont donnés ci-dessous : PRECISION INTER-ESSAI n=3 Concentration (µg Eq/mL) C.V. en % Echantillon 1 5,4 13,0 Echantillon 2 28,7 7,1 Ecantillon 3 50,7 3,9 PRECISION INTRA-ESSAI n=16 Concentration (µg Eq/mL) C.V. en % Echantillon 4 5,3 7,2 Echantillon 5 24,0 5,5 Echantillon 6 67,4 7,5 Sensibilité Analytique La sensibilité a été déterminée comme la concentration moyenne + 2 DS donnée par 20 déterminations du diluant échantillon. Elle est égale à 0,1µg Eq/mL. Relative Spécificité, Sensibilité, Corrélation La spécificité, la sensibilité et la corrélation relatives ont été déterminées par rapport à un autre coffret ELISA CIC- C1q sur 48 échantillons, incluant 29 échantillons de donneurs de sang sains et 12 patients atteints d un lupus confirmé. ELISA Coffret BINDAZYME CIC-C1q Autre ELISA + Douteux Douteux Sensibilité relative 95,0% Spécificité relative 75,0% Corrélation relative 83,3% Pour le calcul de la spécificité, de la sensibilité et de la corrélation relatives, les valeurs douteuses ont été considérées positives. Une corrélation des valeurs des deux coffrets a donné un coefficient R 2 de 0,80. Substances d'intefering Des échantillons positifs et négatifs en CIC liant le C1q ont été testés pour vérifier l effet possible de substances interférantes. La méthode utilisée pour vérifier ces substances est basée sur le test Interference Check A plus - Kokusai Shiyaku, Japon. Substances Bilirubine libre Bilirubine conjuguée Hémoglobine hémolysée Chyle Facteur rhumatoïde Concentration 18,3mg/dL 19,0mg/dL 490mg/dL 1930 unités 500 UI/mL Aucune interférence n a été observée avec les concentrations ci-dessus en bilirubine, hémoglobine ou en chyle cependant le facteur rhumatoïde (FR) interfère. Les échantillons susceptibles de contenir du facteur rhumatoïde doivent être dosés en RF avant la détermination ces CIC liant le C1q. Gamme de Mesure La gamme de mesure est de 1,23-100µg Eq/mL. 5
6 Plan de plaque A B C D E F G H Résumé de la procédure 1. Déposer 100µL de chaque calibrateur, contrôle et échantillon dilué au 1:101 dans les puits appropriés. Incuber 30 minutes. Laver. 2. Ajouter 100µL de conjugué par puits. Incuber 30 minutes. Laver. 3. Ajouter 100µL de substrat par puits. Incuber 30 minutes. 4. Ajouter 100µL de solution d arrêt par puits. Mesurer l absorbance à 450nm. QUANTA Lite est une marque déposée de INOVA Diagnostics, Inc Copyright 2013 Tous droits reserves 6
7 Références 1. Hay FC et al.: Routine assay for the detection of immune complexes of known immunoglobulin class using solid phase C1q. Clin. Exp. Immunol., 1976; 24: Stanilova SA, Slavov ES: Comparative study of circulating immune complexes quantity detection by three assays - CIF-ELISA, C1q-ELISA and anti-c3 ELISA. J. Immunol. Meth, 2001; 253: Van Hoeyveld E, Bossuyt X: Evaluation of seven commercial ELISA kits compared with the C1q solidphase binding RIA for detection of circulating immune complexes. Clin. Chem, 2000; 46: Lambert PH: WHO collaborative study for the evaluation of immune complexes in serum. Clin Lab Immunol., 1978; 1: Espinoza LR and Osterland CK.: Circulating immune complexes. Their clinical significance. Future publishing Co., Abrass CK et al.: Correlation and Predictive Accuracy of Circulating Immune Complexes with Disease Activity in Patients with Systemic Lupus Erythematosus. Arthritis Rheum., 1980; 23: Protein Reference Unit Handbook of Autoimmunity (3rd Edition) 2004 Ed A Milford Ward. J. Sheldon, GD Wild. Publ. PRU Publications, Sheffield Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Center for Disease Control/National Institute of Health, 2007, Fifth Edition. Fabricant: INOVA Diagnostics, Inc Old Grove Road San Diego, CA United States of America Technical Service (U.S. & Canada Only) : Technical Service (Outside the U.S.) : support@inovadx.com Représentant Autorisé: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D St. Ingbert, Germany Tel.: Fax.: FRA September 2013 Revision 4 7
ELISA PeliClass human IgG subclass kit REF M1551
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