UE Génétique des Eucaryotes

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1 L3 BCP Université Paris 7 Denis Diderot UE Génétique des Eucaryotes TD Arabidopsis thaliana Exercice 2 : Analyse de mutants résistant à l'éthylène a) Une population M2 de graines ayant subit une mutagenèse par l EMS a été semée dans une chambre fermée contenant de l éthylène dans l air (5 L/litre). Parmi plantules, le mutant de réponse etr1-1 a été identifié pour son incapacité à réaliser la triple-réponse à l éthylène (Figure 1). Figure 1 : The effect of increasing ethylene concentrations on hypocotyl elongation of dark-grown wild type ( ) and etr1 ( ) Arabidospis seedlings. [Bleecker et al., 1988, Science] L analyse de la ségrégation du mutant etr1-1 au niveau de la génération M3 a montré que 38 plantes ont un phénotype mutant alors que 13 possèdent un phénotype sauvage en réponse à l éthylène [Bleecker et al., 1988, Science]. Q1 : Discuter des résultats de cette ségrégation. Comment identifieriez-vous les plantes homozygotes pour la mutation etr1-1? Ségrégation 3 :1 donc juste une mutation à l origine du phénotype. Mélange de phénotype en M3 alors que la plante mère avec phénotype mutant. Donc la plante mère est hétérogygote et le phénotype conféré par allèle mutant est dominant que le phénotype conféré par allèle sauvage. Les plantes homozygotes etr1-1//etr1-1 donneront 100% de plantes [tr] à la génération d après (il faut donc analyser le phénotype de la génération M4). b) Le clonage positionnel à l aide de marqueurs moléculaires a permis de localiser la mutation dans un fragment de 47kb [Chang et al., 1993, Science]. Le séquençage du génome d Arabidopsis a permis de montrer que ce fragment comporte 5 ORF. Q2 : Quelle(s) stratégie(s) pourriez-vous développer pour savoir où se trouve la mutation? PCR sur chaque ORF, séquençage de chaque fragment PCR et comparaison des séquences obtenues avec le génome de référence. 1

2 c) La protéine ETR1 possède 3 domaines transmembranaires ainsi qu un domaine histidine kinase et un domaine régulateur de réponse, similaires aux systèmes de signalisation cellulaire à deux composantes trouvés chez les bactéries. En parallèle à ces résultats, une expérience de liaison à l éthylène marqué radioactivement à été réalisée sur des plantes sauvages et mutantes etr1-1 : Ta ble 1 : In vivo binding of [ 14 C]ethylene in wild type and ethylene-insensitive mutant (etr1-1). [Bleecker et al., 1988, Science] Q3 : Interprétez les résultats du tableau 1. Que pouvez-vous en déduire quant au rôle de ETR1? L éthylène se lie moins aux plantes etr1-1 qu aux plantes sauvages. La protéine de liaison à l éthylène étant les récepteurs, cela veut dire que la mutation affecte la liaison de l éthylène à son récepteur et que ETR1 est un récepteur à l éthylène. d) Un crible de génétique inverse a permis d isoler un mutant nul etr1-6. Contrairement à etr1-1, ce mutant présente un phénotype sauvage, à savoir qu il répond à l éthylène de façon similaire aux plantules sauvages [Hua and Meyerowitz, 1998, Cell]. Q4 : Comment interprétez-vous le phénotype sauvage du mutant etr1-6? Le mutant etr1-6 est un mutant nul donc la protéine ETR1 est absente chez ce mutant. En absence de ETR1, le phénotype est sauvage, ce qui laisse supposer l existence d une redondance fonctionnelle entre e) Quatre autres protéines, ETR2, ERS1, ERS2 et EIN4, ayant la même fonction que ETR1 ont été isolées par des cribles génétiques similaires. Chacun des simples mutants nuls ADN-T montre un phénotype sauvage en réponse à l'éthylène. En revanche le quintuple mutant etr1-6 etr2 ers1 ers2 ein4 présente un phénotype 'triple réponse' même en absence d'éthylène [Hua and Meyerowitz, 1998, Cell]. Q5 : Interprétez puis proposez un modèle d'action de l'éthylène? Cela confirme la redondance de fonction entre les protéines. On peut en déduire le modèle suivant: 2

3 (A) et (B) Cas du sauvage (C) Cas du mutant etr1-1 (D) Cas du quintuple mutant Exercice 4 : Analyse de la fonction des protéines HAT dans les mécanismes de défense Le virus de la mosaïque du concombre (CMV), initialement découvert chez le concombre, est un agent pathogène transmis par les pucerons et capable d infecter plus de 1200 espèces végétales différentes. Lors de l infection, ce virus injecte son ARN dans la cellule végétale qui va être transcrit puis traduit en protéines pour reformer de nouveaux virus (Figure 1). Pour contrer ces attaques pathogènes, les plantes ont développé un certain nombre de mécanismes moléculaires. HAT1, HAT2 et HAT3 sont des facteurs de transcription de type HD- Zip importants dans le développement de la plante Arabidopsis thaliana. Afin de caractériser leur rôle éventuel en réponse aux stress biotiques (stress engendrés par un pathogène), les scientifiques ont analysé les phénotypes d une plante sur-exprimant HAT1 (HAT1 OX), d un simple mutant hat1, d un double mutant hat1 hat3 et enfin d un triple mutant hat1 hat2 hat3 (Figure 2). 3

4 1. Analysez et interprétez les résultats présentés en figure 2. Entre autres, dans votre réponse, vous : - interpréterez les différences phénotypiques observées entre le simple mutant hat1, le double mutant hat1 hat3 et le triple mutant hat1 hat2 hat3 - préciserez en le justifiant les rôles des protéines HAT1, HAT2 et HAT3 dans les mécanismes de défense mis en place par A. thaliana lors de l infection du CMV. L expression des différents gènes HAT est vérifié dans la figure 2B : HAT1 est bien surexprimé dans le génotype HAT1 OX alors que les différents mutants utilisés dans cette étude sont bien nuls pour les protéines HAT. Tous les génotypes présentent le même phénotype dans les conditions contrôles de culture donc les mutations ou la sur-expression n ont aucun effet dans ces conditions (phénotype conditionnel). En présence de CMV, tous les génotypes se développent moins bien car l infection par le CMV affecte la croissance des plantes (la machinerie cellulaire végétale est utilisée pour la réplication du virus et non pour les fonctions basiques nécessaires à la survie des cellules végétales!). Chez le sur-expresseur, la croissance est diminuée en présence du CMV par rapport au sauvage (Fig 2A) alors que la quantité de protéines de capside est plus importante dans ces plantes par rapport au sauvage. Donc quand la protéine HAT1 est plus abondante que chez le sauvage, la multiplication du virus est amplifiée. Par conséquent HAT1 favorise la multiplication du virus dans la plante. Chez le triple mutant le phénomène inverse est observé ce qui confirme que les protéines HATs activent la réplication du virus dans la plante (le virus utilise donc la machinerie cellulaire à son profit). Chez le simple mutant hat1 et le double mutant hat1 hat3, le phénotype est de type sauvage probablement lié à de la redondance fonctionnelle (confirmée avec l analyse du triple mutant). L acide salicylique (SA) et l acide jasmonique (JA) sont deux hormones végétales qui activent les mécanismes de défense de la plante contre les pathogènes. Leurs contenus dans le sauvage, le sur-expresseur HAT1 OX et le triple mutant hat1 hat2 hat3 ont été analysés en conditions contrôle ( Mock ) et en présence de CMV (Figure 3). 2. En justifiant votre réponse, quelle conclusion pouvez-vous tirer des résultats présentés en figure 3? Chez les trois génotypes, les productions de SA et JA augmentent en réponse au CMV : les plantes induisent la biosynthèse de ces hormones après infection par le virus pour ralentir la réplication de ce dernier. Chez le triple mutant, les productions de SA et JA sont plus importantes que chez le sauvage. Donc les protéines HAT inhibent les biosynthèses des SA et JA, ce qui va favoriser la réplication du virus. Cela est confirmer avec l analyse du dur-expresseur (tout du moins pour SA!). 3. A partir de l ensemble des résultats, schématiser la voie moléculaire impliquée dans les mécanismes de défense de A. thaliana au CMV. 4

5 Figure 1 : Cycle de réplication du virus de la mosaïque du concombre dans une cellule végétale. 5

6 Figure 2 : Effet des protéines HAT sur l accumulation du CMV chez A. thaliana. Différents génotypes ont été étudiés lors de cette étude : le sauvage (Col-0), un sur-expresseur de HAT1 (HAT1 OX) et des mutants ADN-T homozygotes pour chacun des loci étudiés (simple mutant hat1, double mutant hat1 hat3, triple mutant hat1 hat2 hat3). Les plantes ont été cultivées pendant un mois en chambre de culture en conditions contrôles ( Mock ) ou en présence du virus CMV (A). Les teneurs en ARNm HAT1, HAT2 et HAT3 ont été analysés par RT- PCR (B) ainsi que les contenus en protéines CP du virus CMV par western blot (C). Figure 3 : Analyse des contenus en SA et JA chez des plantes sauvages, HAT1 OX et hat1 hat2 hat3 cultivées en conditions contrôles ( Mock ) ou en présence de CMV. 6