Mesures microbiologiques objectivant la durée de vie des produits. Georges Daube

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1 Mesures microbiologiques objectivant la durée de vie des produits Parc Créalys Georges Daube Université de Liège Faculté de Médecine Vétérinaire Département des Sciences des Denrées Alimentaires Fundamental and Applied Research for Animal & Health Microbiologie Sart-Tilman, bât. B43bis 4000 Liège tél fax

2 Introduction Plan de l exposé Durée de vie microbiologique Micro-organismes impliqués Facteurs déterminant la durée de vie Etablissement pratique de la durée de vie microbiologique Analyses, mesures, littérature Microbiologie prédictive Tests de vieillissement Tests de croissance/survie Applications à Listeria monocytogenes Stratégie de vérification et mesures à prendre Conclusions 2

3 Introduction 3

4 Durée de vie microbiologique Période par rapport à la date d origine (date fixée par le fabricant) pendant laquelle l aliment reste dans les limites microbiologiques fixées. (norme française NF V ) Ces limites sont fixées afin de garantir que, pendant toute la période, l aliment est propre à la consommation quant aux caractéristiques liées aux micro-organismes, à savoir: La sécurité des aliments (micro-organismes pathogènes) La salubrité des aliments (micro-organismes d altération) 4

5 Micro-organismes impliqués Micro-organismes pathogènes Divers organismes peuvent être à l origine de maladies chez le consommateur lorsqu ils contaminent la chaîne alimentaire: Les parasites (vers et protozoaires) Les algues Les levures et les moisissures Les bactéries Les virus Les agents transmissibles non conventionnels 5

6 Micro-organismes impliqués Micro-organismes pathogènes Divers organismes peuvent être à l origine de maladies chez le consommateur lorsqu ils contaminent la chaîne alimentaire: Les parasites (vers et protozoaires) Certains peuvent se Les algues multiplier pendant la Les levures et les moisissures période de conservation Les bactéries Les virus Les agents transmissibles non conventionnels 6

7 Micro-organismes impliqués Micro-organismes pathogènes La multiplication des micro-organismes dans les aliments augmente le risque de maladie: en se rapprochant de la dose infectieuse variable en fonction du micro-organisme, de la sensibilité de l hôte de l aliment en augmentant la concentration de toxine ou de substance toxique dans l aliment D où besoin de garder le nombre de micro-organismes pathogènes sous un seuil prédéfini pendant toute la période de conservation Ce seuil doit être fixé par les Autorités en charge de la Santé publique 7

8 Micro-organismes impliqués Micro-organismes d altération Divers organismes peuvent être à l origine d altérations des aliments: Les moisissures Mucor, Rhizopus, Sporotrichum, Penicillium, Geotrichum Les levures Zygosaccharomyces, Pichia, Saccharomyces, Candida Les bactéries Les «Gram négatives»: Pseudomonas, Shewanella, entérobactériacées Les «Gram positives»: Acinetobacter, microcoques, «bactéries lactiques», Bacillus, Clostridium 8

9 Micro-organismes impliqués Micro-organismes d altération Divers types d altérations sont liés à des micro-organismes pour chaque type d aliment Les altérations d aspect visuel Les enduits bactériens (>10 8 /cm 2 ) Les moisissures visibles (>10 8 /cm 2 ) Les autres altérations organoleptiques (odeur, goût, texture) Le catabolisme de l aliment (>10 7 /cm 2 ) Dégradation des protéines Dégradation des glucides Dégradation des lipides Les synthèses microbiennes (>10 8 /cm 2 ) Polysaccharides, pigments diffusibles ou non 9

10 Micro-organismes impliqués Micro-organismes d altération Méthodes d appréciation des dégradations microbiennes Méthodes organoleptiques Chiffrées (poissons, crevettes décortiquées) Jurys sensoriels Méthodes physiques ph, UV, tendéromètre Méthodes chimiques ABVT, TMAO, dosages Méthodes microbiologiques, métagénomiques Adaptées aux flores suspectées Limites généralement fixées par le producteur 10

11 Facteurs déterminant la durée de vie Facteurs intrinsèques: La contamination initiale (quantitative et qualitative) La composition Le ph L activité de l eau Le potentiel d oxydoréduction Facteurs extrinsèques: La température et le temps de conservation ou de préparation Les radiations ionisantes et les UV Le conditionnement Les agents conservateurs Les flores de barrière protectrices 11

12 Facteurs déterminant la durée de vie Principaux germes pathogènes Micro- organismes Paramètres minimums de croissance temp. p H Aw Aérobies ( C) /anaérobi es Temps de réduction décimale (minutes) D 70 D 90 D 121 Salmonella spp. 5,1 4 0,95 aéro-anaérobi e 0,001 à 0,01 Campylobacter jejun i 3 2 4,9 0,95 microaérophi l e 0,0001 Listeria monocytogenes 0 4,4 0,92 aéro-anaérobi e 0,03 Yersinia enterocoliti ca 0 4,6 0,95 aéro-anaérobi e 0,01 Vibrio parahaemolyticus 5 4,5 0,94 aéro-anaérobi e 0,001 (halophil e) Clostridium perfringen s ,95 anaérobi e ,15 Clostridium botulinum non 1 0 4,6 0,94 anaérobi e 0,15 (toxine) 0,2 psychrotophes Clostridium botulinum psychrotophes 3,3 5 0,97 (3,5% NaCl) anaérobi e 0,15 (toxine) 1,5 (cellul e) Staphylococcus aureus 7 (10 4 (5,2 0,86 (0,90 aéro-anaérobi e 0, 1 >1 (toxine) toxine) toxine) toxine) Bacillus cereus 4 4,9 0,912 aéro-anaérobi e 10 (spor es) Escherichia coli 2,5 4,4 0,95 aéro-anaérobi e 0,001 Vibrio cholerae ,97 aéro-anaérobi e 0,3 12

13 Facteurs déterminant la durée de vie Principaux germes d altération Micro-organismes Paramètres minimums de croissance temp. p H Aw Aérobies ( C) /anaérobi es Pseudomonas. < 0 5,5 0,97 aérobi e Enterobacter aerogenes 2 4,4 0,94 aéro-anaérobi e Bactéries lactiques 4 3,8 0,94 aéro-anaérobi e Micrococcus spp 4 5,6 0,9 aérobi e Levur es ,8 aéro-anaérobi e Moisissur es < 0 < 2 0,6 aérobi e 13

14 Méthodes d analyse microbiologique Méthodes qualitatives Expriment la présence ou la détection d au moins 1 micro-organisme dans une certaine quantité d aliment Ex: Présence de Salmonella dans 25 grammes d aliment Méthodes quantitatives Expriment le nombre de micro-organismes dans une certaine quantité d aliment Ex: 3000 Pseudomonas par gramme d aliment RBA - Cours

15 Etablissement pratique de la durée de vie microbiologique d un aliment

16 Etapes de validation par les opérateurs 1. Connaissance du produit fini et de son devenir Composition (analyses, tables, littérature) Flores altérante, pathogène ou technologique attendues (analyses microbiologiques ou métagénomiques, littérature, ICMSF 6) Paramètres physico-chimiques (analyses, mesures, littérature) Températures de conservation et type de conditionnement Tenir compte de l hétérogénéité des produits, de l utilisation attendue, de la maîtrise attendue de la chaîne du froid 2. Choisir et fixer les seuils acceptables pour les germes pathogènes et altérants (législation, AFSCA, guides sectoriels d auto-contrôle, ICMSF 6, littérature) 16

17 Etapes de validation par les opérateurs 3. Estimer in silico les évolutions microbiologiques potentielles en fonction des alternatives de conservation Germes altérants ou technologiques (Microbiologie prédictive) Germes pathogènes (ICMSF 5, Microbiologie prédictive) 4. S assurer que les conditions de conservation choisies donnent des garanties suffisantes (marges de sécurité) surtout en termes de risque pour la santé publique 17

18 Etapes de validation par les opérateurs 5. Valider expérimentalement les dates limites de consommation et les conditions de conservation pour les produits périssables Tests de vieillissement 6. Évaluer les risques potentiels et éventuellement adapter les critères microbiologiques en sortie de production (Listeria monocytogenes) pour les produits périssables Tests de croissance ou «Challenge-test» ou épreuve microbiologique 7. Vérifier la maîtrise en réalisant des analyses microbiologiques aux points-clé du processus et sur les produits finis 8. Utiliser les données collectées lors des validations pour simuler des accidents de conservation ou de fabrication et pour tester des alternatives technologiques 18

19 Littérature Bases de données bibliographiques ICMSF 19

20 Microbiologie prédictive USDA Pathogen Modeling Program (PMP) Croissance Survie Destruction pathogen.htm 20

21 Microbiologie prédictive Autres programmes disponibles: Growth Predictor (y compris germes d altération) ComBase Sym Previus (y compris germes d altération) (payant) 21

22 Validation de la durée de vie microbiologique des aliments périssables Études de validation de la Date Limite de Consommation et des conditions de conservation Tests de vieillissement (NF-V ) Évaluation des risques potentiels Tests de croissance ou «Challenge-test» ou épreuve microbiologique (NF-V ) 22

23 Tests de vieillissement (NF-V ) «Etude de l évolution dans un aliment de populations de microorganismes qui y sont habituellement présents, de façon détectable ou non, dans les conditions préconisées de conservation de cet aliment» (NF-V ) - Prototypes de denrées périssables réfrigérées et conditionnées - Etablissement d une DLC théorique (cfr étapes préalables) - Sélection des flores à rechercher et à dénombrer - Consignes de T de conservation (T ou t 2 >t 1 ) - Vérification de la DLC théorique sur présérie industrielle (DLC provisoire) - Vérification de la DLC provisoire sur échantillons issu d un lot de la production 23

24 Tests de vieillissement Exemple 24

25 Tests de vieillissement Exemple 25

26 26

27 Tests de vieillissement * Difficultés de ce type d études : - Standardisation du protocole - Choix des conditions de conservation - Respect des conditions de conservation choisies - Choix des flores pertinentes pour prédire les altérations et/ou les risques pour la santé - Nécessité de méthodes d analyse adaptées et quantitatives - A coupler avec des tests organoleptiques pertinents - Nombre de répétitions et de lots à tester - Expertise pour l établissement du protocole et pour l interprétation des résultats 27

28 Tests de croissance ou «Challenge Tests» (NF-V ) «Evaluation de la cinétique de croissance ou de survie d un germe précis dans ou sur un aliment donné après inoculation artificielle à un niveau prédéterminé et durant la conservation dans des conditions contrôlées pendant une durée prédéfinie.» Utilisés plus particulièrement lorsque l on étudie des micro-organismes pathogènes qui ne sont pas détectable de façon habituelle dans l aliment 28

29 Tests de croissance ou «Challenge-Tests» Exemples 29

30 Tests de croissance ou «Challenge-Tests» * Difficultés de ce type d études : - Biosécurité - Manipulation et inoculation de cultures de germes pathogènes - Standardisation du protocole - Choix des souches - Préparation de l inoculum (concentration, état physiologique) - Contrôle des conditions d inoculation, de conditionnement et de conservation - Nécessité de méthodes d analyse, si possible, quantitatives les plus sensibles - Nombre de répétitions et de lots à tester - Expertise pour l établissement du protocole et pour l interprétation des résultats D où recours à un laboratoire accrédité expérimenté 30

31 Simulations par microbiologie prévisionnelle Viande hachée : Listeria monocytogenes Simulation Validation Challenge Ajustement de par test d un croissance challenge à 8 C modèle à test primaire 5 C 10 C à 10 C 5 C =>µ opt Concentration de Listeria monocytogenes dans la viande hachée de porc (log UFC/g) 6,5 5,5 4,5 3,5 2,5 Simulation (T= 5 C) Simulation (T= 8 C) Simulation (T= 10 C) Challenge test à 5 C Challenge test à 8 C Challenge test à 10 C 1, Temps (jours) 31

32 APPLICATION A LISTERIA MONOCYTOGENES

33 Problématique de la contamination par Listeria monocytogenes Bactérie pathogène responsable de listériose Entérite, avortements, mortinatalité, septicémicie, méningo-encéphalite, etc Dose infectieuse supérieure à 100 ufc par gramme d aliment pour la population générale Incubation liée à la dose mais pouvant atteindre plusieurs semaines Bactérie Ubiquiste (environnement, matières fécales, aliments crus) Aéro-anaérobie (adaptée à beaucoup de types de conditionnement) Psychrotrophe (multiplication possible jusqu à 0 C) Relativement résistante dans les aliments (ph, teneur en sel, etc) D où risque important lié à la gravité de la maladie et maîtrise difficile 33

34 Critères «Listeria monocytogenes» dans les aliments «prêts à consommer» - Pas de tolérance - Risque faible - Risque important 1. Aliments destinés à des populations à risques ou ayant été soumis à un traitement listéricide dans le conditionnement final 2. Aliments dont la composition ne permet pas la multiplication de Listeria monocytogenes 3. Aliments permettant la multiplication de Listeria monocytogenes et autres que le cas 1 D où première chose à faire, classer les produits dans une catégorie (listes du règlement, ph, aw, DLC, tests de croissance) 34

35 Critères «Listeria monocytogenes» dans les aliments «prêts à consommer» CRITERE - Absence dans 25g ou pas de tests nécessaire - < 100 ufc/g ou pas de tests nécessaire 1. Aliments destinés à des populations à risques ou ayant été soumis à un traitement listéricide dans le conditionnement final 2. Aliments dont la composition ne permet pas la multiplication de Listeria monocytogenes - Absence dans 25 g ou critère moins sévère (sortie producteur) - < 100 ufc/g (DLC) 3. Aliments permettant la multiplication de Listeria monocytogenes et autres que le cas 1 D où seconde chose à faire, choisir le critère approprié pour rester sous 100 ufc/g à la DLC, éventuellement via des tests de croissance. 35

36 Règlement européen CE N 2073/

37 Règlement européen CE N 2073/2005 Eventuellement via Challenge-tests 37

38 Règlement européen CE N 2073/2005 Critères «à la carte» après démonstration expérimentale pour les produits permettant la multiplication de Listeria monocytogenes Demande une nouvelle expertise des entreprises et des autorités de contrôles 38

39 STRATEGIE DE VERIFICATION ET MESURES A PRENDRE DANS LES ENTREPRISES CONCERNANT LISTERIA MONOCYTOGENES

40 Stratégies de vérification des plans HACCP quant au risque «Listeria monocytogenes» Contrôles de l environnement (SANCO/4198/2001 Rev. 20) Prélèvements sur les lieux de transformation et les équipements utilisés pour la production (alerte précoce = ligne directrice) si le danger Listeria monocytogenes est considéré dans le plan HACCP (cherche de Listeria spp car toutes les espèces ont la même écologie) Contrôle analytique des produits Classification des produits Composition, propriétés physico-chimiques Cinétique de croissance (Challenge-tests) si Croissance «théoriquement possible» Aliment non destiné aux populations à risque spécifique Aliment n a pas subi un traitement listéricide dans le conditionnement final Fixation du plan d échantillonnage et des critères microbiologiques adaptés Réalisation des échantillonnages et des analyses Si critères dépassés, notification à l autorité, retrait et rappel des produits (éventuellement par communiqué de presse), modifier le plan HACCP 40

41 Mesures à prendre dans les entreprises Conséquences très importantes pour les entreprises Stratégie de prévention adaptée au produit et à l entreprise pour minimiser les risques: Exemple d un produit cuit remanipulé Option 1: Fixer le critère à «absence dans 25 grammes» Option 2: Tout faire pour éviter TOUTE recontamination (salle blanche) ou RETRAITER le produit dans le conditionnement final (p.ex. flash pasteurisation). Réaliser un test de vieillissement accéléré (p ex. 37 C) d échantillons de produits de chaque lot et rechercher L. monocytogenes par ensemencement direct avant de libérer le lot. Adapter la recette (composition, conservateurs, ferments) et/ou le conditionnement Réaliser un challenge-test pour évaluer la cinétique de croissance Adapter le critère en conséquence à, par exemple, «absence dans 1 gramme» Minimiser toutes les sources de recontamination (BPH) Réaliser des contrôles analytiques fréquents de l environnement de production et au niveau du critère «produit» fixé à une fréquence suffisante 41

42 Conclusions Les dates limites de consommation des aliments périssables doivent être validées notamment en fonction de la durée de vie microbiologique sur les paramètres «sécurité» et «qualité»: Pour les paramètres d altération, des tests de vieillissement doivent être menées sur les flores pertinentes avec un protocole standardisé Pour les risques pour la santé, des tests de croissance doivent être mis en oeuvre Besoin d utiliser les méthodes les plus adaptées, les plus performantes et, si possible, quantitatives De plus en plus, intégration dans les cahiers des charges privés (BRC, IFS) et dans les législations (Listeria monocytogenes) Besoin de formation des producteurs comme des autorités de contrôle. 42

43 Bibliographie Codex alimentarius Proposed draft guidelines for the validation of food hygiene control measures. Règlement CE N 2073/2005 de la Commission concernant les critères microbiologiques applicables aux denrées alimentaires. Avis du comité scientifique de l AFSCA ( EFSA, Draft opinion on microbiological testing, criteria and other objectives (EFSA-Q ). SANCO/1628/2008 ver. 9.3 ( ) GUIDANCE DOCUMENT on Listeria monocytogenes shelf-life studies for ready-to-eat foods TECHNICAL GUIDANCE DOCUMENT on shelf-life studies for Listeria monocytogenes in ready-to-eat foods (EU community reference laboratory) 43

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