Projet I. Objectifs. Vérifier la carte de restriction d une insertion d ADN. Cartographie des plasmides inconnus

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Adrien Alarie
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1 Projet I Vérifier la carte de restriction d une insertion d ADN Objectifs Déterminer quel gène vous avez (Bioinfo) Générer une carte théorique (Bioinfo) Vérifier expérimentalement la carte Déterminer l orientation Cartographie des plasmides inconnus Vecteur puc19 1

carte théorique (Bioinfo) Vérifier expérimentalement la carte

2 Clonage dans puc19 SCM Digéré avec X Clonage dans puc19 + Insertion Déterminer le site d insertion Couper avec X + Insertion 2

3 X Delimites la droite & la gauche Ex. Si Pst est le site d insertion: Bam est à la gauche Si Xba est le site d insertion, alors Bam est à la droite Déterminer l orientation relative Orientation 1 A X A X Orientation 2 A X A X Projet II Mutagenèse dirigée de LacZ 3

site d insertion, alors Bam est à la droite Déterminer l

Objectifs Utiliser le PCR pour faire l amplification et la mutagenèse du gène LacZ dans puc19 Utiliser le PCR pour ajouter des sites de restrictions appropriés aux extrémités du gène LacZ pour

4 Objectifs Utiliser le PCR pour faire l amplification et la mutagenèse du gène LacZ dans puc19 Utiliser le PCR pour ajouter des sites de restrictions appropriés aux extrémités du gène LacZ pour permettre le clonage Réplication & Amplification d ADN La Réaction de la Polymérase en Chaîne Polymérases Amorce Extrémité OH GTACT Polymérase -OH TACGACGTAAACGCCCGTAATGAG CATGAATGCTGCATTTGCGGGCATTACTC Matrice d ADN ou ARN 4

clonage Réplication & Amplification d ADN La Réaction de la Polymérase en Chaîne Polymérases Amorce

5 2 Types de Polymérases ADN: ADN dépendante : Requiert une matrice ADN Fait la synthèse d ADN Ex. Polymérase Taq ARN dépendante Requiert une matrice ARN Fait la synthèse d ADN (ADNc) Ex. Transcriptase inverse La Réaction de la Polymérase en Chaîne-PCR Réplication répétitive d une région donnée d ADN Permet l amplification exponentielle d une région donnée d ADN Augmente la représentation relative d une région d intérêt Permet l isolation d une région donnée d ADN 14 PCR-1 ier Cycle Dénaturation (95 o C) Appariement des amorces (Tm) <GGAACGGTACCGT CATACCGTGGGGTGCA..ACGCGTTGCGATGGCA GTATGGCACCCCACGA..TGCGCAACGCTACCGT CCGTGGGGT> 5

Transcriptase inverse La Réaction de la Polymérase en Chaîne-PCR Réplication répétitive d une région donnée d ADN Permet l amplification exponentielle d une

6 Extension (72 o C) <GGAACGGTACCGT CATACCGTGGGGTGCA..ACGCGTTGCGATGGCA GTATGGCACCCCACGA..TGCGCAACGCTACCGT CCGTGGGGT> 16 PCR-2 e Cycle Dénaturation Appariement /Extension PCR- Cycles Subséquents Seulement cette matrice est amplifiée de façon exponentielle : 2 n fois 32 fois totale 6

Appariement /Extension -------------- --------------- ---------------- ---------- PCR- Cycles Subséquents

7 Survol des Cycles du PCR Amorces: Courte séquence nucléotidiques simple brins complémentaires aux cibles nucléotides Utilisée en excès comparativement à la cible afin de favoriser l appariement des amorces plutôt que l appariement des matrices Survol des Cycles du PCR Appariement: Température à laquelle les amorces s apparient aux séquences complémentaires Dois être sous le Tm des amorces Dois être une température qui permet aux deux amorces de s apparier Habituellement entre o C Survol des Cycles du PCR Extension: Fait à la température optimale pour la polymérase ADN Habituellement o C pour la polymérase Taq 7

amorces s apparient aux séquences complémentaires Dois être sous le Tm des amorces Dois être une température qui permet aux deux amorces de s apparier

8 Polymérase Taq Isolé d une bactérie thermophile Thermus aquaticus Stable à des températures élevées 95 o C - utilisée pour dénaturer l ADN Aucune activité exonucléase Pas d autocorrection Possède une activité deoxynucléotidyl transférase Activité polymérase indépendante d une matrice Ajoute da aux extrémité OH libres Amorces Caractéristiques: Courts oligonucléotides complémentaires aux séquences qui bordent la région d intérêt Établis le point d initiation de la réplication Établis le point de terminaison de la réplication 23 Conception d Amorces Autocomplémentarité: GGGGCCCC G G G G C C C C Complémentarité de la paire GGGGAAAA CCCC TTTT 24 8

libres Amorces Caractéristiques: Courts oligonucléotides complémentaires aux séquences qui bordent la région d intérêt Établis le point d initiation de la

9 Conception d Amorces Complémentarité Matrice.ATGGGTATTGGCC..- CCATAACCGG-OH Complémentarité Matrice.ATGGGTATTGGCC..- TACCCATAACC 25 Conception d Amorces Région d intérêt Région d intérêt Bonne orientation Mauvaise orientation 26 Problème -AAAAAAAAAAAA GGGGGGGGGGGGG- Vous désirez amplifier la séquence représentée par la boite. Quelle paire d amorces est dans la bonne orientation pour accomplir ceci? 1- AAAAAA 2- TTTTTT 3- GGGGGG 4- CCCCCC 27 9

.- TACCCATAACC 25 Conception d Amorces Région d intérêt Région d intérêt Bonne orientation Mauvaise orientation

10 Utilité du PCR Amplification et isolation d une région donnée en changeant sa représentation relative Entre 100pb et 10Kpb Criblage pour déterminer la présence d une séquence d intérêt Présence ou absence d un produit d amplification Mutagenèse dirigée Utilisé pour ajouter ou enlever des nucléotides sur la matrice originale 28 10

d une séquence d intérêt Présence ou absence d un produit d amplification

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