TECHNOLOGIE DE L ADN RECOMBINANT

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1 TECHNOLOGIE DE L ADN RECOMBINANT Les principaux outils : enzymes de restriction, ligases Genie_Gen-1-Chap-2.pdf 1. Etapes dans la construction d un ADN recombinant Etape 1 : obtenir le gène à transférer. Etapes 2 et 3 : attacher le gène au vecteur. Etapes 4 et 5 : introduire l ADN recombinant, rattaché au vecteur, dans une cellule hôte. Puis criblage. TRANSFORMATION = transfert d ADN dans une cellule bactérienne. TRANSFECTION = transfert d ADN dans une cellule eucaryote Amélioration grâce au développement Des vecteurs, des stratégies de clonage, des cellules hôtes (mise en évidence de souches bactériennes ne présentant pas le phénomène de restriction, et cellules eucaryotes). 1.2.Deux parties dans l ADN recombinant In vitro : tube contenant l ADN qui est manipulé. L ADN est traité par des enzymes. Etape contrôlée. In vivo : cellules hôtes. Manipulation pour réplication et/ou éventuellement expression par transcription et traduction. Etape moyennement contrôlée. Le tube contenant l ADN qui est manipulé est transféré dans les cellules hôtes pour répliquer cet ADN, et éventuellement l exprimer. Puis, ce qui a été obtenu in vivo, est traité par des enzymes in vitro. Tout ce qui est effectué in vitro est bien contrôlé, par contre, ce qui est effectué in vivo est moins bien contrôlé. 2. Manipulations in vitro les outils Copier, couper, et assembler des morceaux. Les enzymes modifiant l ADN : enzymes de restriction, ligases, ADN polymérases, ARN polymérases, phosphatase alcaline, polynucléotide kinase, nucléases. 2.1.Les enzymes de restriction Ce sont les enzymes qui effectuent la coupure sur des sites bien définis Extrémités débordantes (sticky ends) Exemple : ECO RI : G A A T T C C T T A A G G A A T T C C T T A A G extrémités débordante (sortante) de 4 nucléotides. 1/8 G OH P A A T T C C T T A A P OH G

2 Hha I : G C G C C G C G plus rare que ECO RI, présente chez Hemophilus haemotylicus. Extrémités débordantes (sortantes) de 2 nucléotides. Not I : G C G G C C G C C G C C G G C G est encore plus rare ; c est une coupure moins fréquente, mais toutefois présente chez Nocardia otitidiscaviarum. Extrémités débordantes (sortantes) de 4 nucléotides. Attention, certaines enzymes de restriction coupent des séquences non palindromiques : Bst XI : C C A N N N N N N T G G G G T N N N N N N A C C N est un nucléotide quelconque (il y en a 6). Le site de reconnaissance (CCA TGG) est différent du site de coupure. Extrémités débordantes (sortantes) de 4 nucléotides. Bsm I : G A A T G C N C T T A C G N ou G A A T G C N / et N G / C A T T C ou G A A T G C (1 / -1) Bsg I : GTGCAG(16) et (14)CTGCAC GTGAGN 16 CACGTCN 14 (ce sont différentes manières d écrire la même chose) Extrémités franches Eco RV : G A T A T C C T A T A G Les isoschizomères Enzymes différentes, reconnaissant le même site, et le coupant de manière identique. Exemple : isoschizomères de Bsm I : Bsa MI, Bsc CI, Pct I Facteurs modifiant l activité des enzymes de restriction Température : 37 C, mais aussi C ou 25 C. Composition du milieu : digestion avec plusieurs enzymes (action simultanée de 2 enzymes, action successive des 2 enzymes : augmentation de la force ionique, changement de milieu). Coupure aberrante de certaines enzymes dans certains milieux ("Star activity" de certaines enzymes, ex : Eco RV, ou Bam HI, ou encore Eco RI). 2/8

3 Méthylation de l ADN : dam méthylase (G m ATC) et dcm méthylase C m C(A/T)GG. Dam méthyle sur le A, et dcm méthyle sur le C. Genie_Gen-1-Chap-2.pdf Variation dans la digestion en fonction du substrat Influence des séquences bordant le site de restriction, et site localisé près d une extrémité font que parfois l enzyme de restriction peut ne pas agir. 2.2.Les ADN ligases OH P C G T C G C A G A A T G P T T A C A T G T A C OH Extrémités : phosphate, et extrémités : hydroxyle. OH P C G T C T T A C A T G G C A G A A T G T A C ATP + ADN polymérase P OH C G T C T T A C A T G G C A G A A T G T A C Ligases permettant d assembler Des fragments issus de la digestion par une même enzyme (exemple : Eco RI / Eco RI) Des fragments issus de la digestion par des enzymes différentes : - Coupures franches : association d extrémités franches : moins efficace, et destruction des sites de restriction! Exemple : Hind III / Eco RV. 1 g 1 d Hind III GTC GAC CAG CTG Eco RV 2 g GAT ATC CTA TAG 2 d 3/8 1 g + 2 d GTC ATC CAG TAG

4 - Extrémités cohésives : association de fragments compatibles issus de digestions différentes : meilleure efficacité, mais destruction du site de restriction! Exemple : Bam HI / Bgl II. Bam HI 1 g 1 d G GATCC CCTAG G Bgl II 2 g A GATCT TCTAG A 2 d 1 g + 2 d G GATCT CCTAG A => Utilisation de la ligase T4 pour : - Ligation d extrémités cohésives. - Ligation d extrémités franches, nécessite plus d enzyme. 2.3.Les ADN polymérases Les enzymes ADN polymérase I d E. coli. Le fragment de Klenow (ADN polymérase I sans la partie exonucléasique). ADN polymérase du phage T4 ou du phage T7. Transférase terminale. ADN polymérases thermophiles (beaucoup utilisées dans les réactions de PCR). Transcriptase inverse (transcrit l ARN en ADN) Activités du fragment de Klenow ADN polymérase I (Holoenzyme) protéolyse Fragment de Klenow Domaine polymérasique Domaine exonucléasique Domaine exonucléasique 4/8

5 Synthèse d ADN double brin à partir d ADN simple brin : important quand on veut ajouter des nucléotides marqués (dntp). Primer (amorce) d oligonucléotides G A G T T C A G G C T A Fragment de Klenow + dntp Non réalisé par la T4 ADN polymérase A G G C T A C AT G A G T T C A G Remplissage d extrémités débordantes, par exemple, après coupure débordante, on peut compléter le fragment pour le terminer de manière franche. A G G C A G T C C G T C C T A G Fragment de Klenow Nucléotides A G G C A G G A T C T C C G T C C T A G Elimination d extrémités débordantes, en utilisant l enzyme sans dntp ; l activité polymérasique coupe le fragment débordant. G A C G A G C T C T G C Fragment de Klenow seul G A C G C T G C Marquage de fragments d ADN, préparation de sondes. Permet de rassembler des ADN ayant des extrémités incompatibles (exemple : coupures par Hind III et Eco RI) T4 ADN polymérase Identique au fragment de Klenow, mais son activité environ 200 fois supérieure à celle du fragment de Klenow. Ne déplace pas les oligonucléotides hybridés en aval. 5/8

6 2.3.4.Transférase terminale Grande particularité et différence : elle a besoin d une amorce, mais pas d une matrice. Utilisations : Marquage d extrémités ("homopolymeric tailing"), puisqu elle ajoute aux extrémités. G A T C A C T G C A A C G T C T A G T G Transférase terminale + dttp G A T C A C T G C A T T T T T T T T T T T T T T T T A C G T C T A G T G Applications : plasmide linéarisé avec dgtp, et dans un tube, cdna + dctp, on les met ensemble, ils s assemblent. Plasmide linéarisé Transférase terminale + dgtp Transférase terminale + dctp cadn GGGGG GGGGG CCCCC CCCCC GGGGG CCCCC CCCCC GGGGG 6/8

7 2.3.5.ADN polymérase thermophiles Températures optimales : C. Activité Polymérase exonucléase Source et propriétés Taq Non de Thermus aquaticus, demie-vie à 95 C e = 10-4 à 2x10-5 de 1,6 heures. Pfu Oui de Pyrococcus furiosus, semble avoir la e = 1,5x10-6 marge d erreur la plus faible des ADN polymérases thermophiles. Vent Oui de Thermococcus litoralis, demie vie à Pfu < e < Taq 95 C de 7 heures. (e = taux d erreur) Représente un marché de plusieurs centaines de millions de $/an Transcriptase inverse ADN polymérase, ARN dépendante (ARN = matrice). ARN A C G G C U A U A C C G C U A G C C U A A G C A A A A A A A T T T T T T T (Primer) T T T T T T T A C G G C U A U A C C G C U A G C C U A A G C A A A A A A A Transcriptase inverse dntp ADN ARN T G C C G A T A T G G C G A T C G G A T T C GT T T T T T T A C G G C U A U A C C G C U A G C C U A A G C A A A A A A A RNase H (Les ribonucléases sont une classe de nucléases qui catalysent l'hydrolyse des liaisons phosphodiester de l'arn). ADN polymérase, ADN dépendante (pour la synthèse du deuxième brin d un ADN simple brin, donc ADN = matrice). Enzymes recombinantes commerciales : 7/8

8 - Virus de la leucémie murine de Moloney (activité RNase H faible). - Virus de la myeloblastose aviaire. Utilisations : - Copie d ARN en ADN (formation de cadn), avec utilisation d une amorce spécifique. - RT et PCR ; clonage de gènes à partir d ARNm ; étude du transcriptome Les ARN polymérases Plusieurs ARN polymérases phagiques sont utilisées en GG. Nom de la polymérase hôte du phage codant séquence promotrice T7 ARN polymérase E. coli TAATACGACTACTATAGGG T3 ARN polymérase E. coli AATTAACCCTCACTAAAGGG SP6 ARN polymérase Salmonella typhimurium AATTT Nucléases : DNase et RNase DNase I : coupe l ADN simple ou double brin. - Clivage préférentiel de sites adjacents à des pyrimidines. - Produits majeurs : di, tri, tétra nucléotides phosphate. - Utilisations : Elimination d ADN de préparations d ARN. Analyse des interactions protéine/adn par "foot printing". Introduction de coupures dans un ADN avant radiomarquage. - Purifiées à partir de pancréas. RNase A : coupure de l ARN simple brin. - Clivage préférentiel en de pyrimidines. - Produits majeurs : mono et oligo phosphates. - Utilisations : Elimination ou diminution des contaminations d ARN dans les purifications des plasmides Phosphatase alcaline Enlève les groupements phosphates à l extrémité de l ADN ou de l ARN. Utilisations : Enlève le groupement phosphate en de vecteurs coupés par une enzyme de restriction (prévient la religation). Enlève le groupement phosphate en de l ADN avant radiomarquage Polynucléotide kinase Ajoute un groupement phosphate en de l ADN ou de l ARN. Utilisations : Phosphorylation linkers ou d adaptateurs en prélude à la ligation Radiomarquage à l extrémité d oligonucléotides. 8/8