Analyse génétique chez Caenorhabditis elegans

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1 Analyse génétique chez Caenorhabditis elegans Qu est ce que le nématode C. elegans? Génétique de C. elegans Analyse génétique chez C. elegans

2 Anatomie de C. elegans L hermaphrodite 1 mm

3 Anatomie de C. elegans Le mâle

4 Anatomie de C. elegans Coupe transversale Cuticule Hypoderme Intestin Gonades Muscles

5 Cycle de vie de C. elegans 46 hr at 20 C

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7 Le génome de C. elegans Taille du génome Megabases (Mb) Nombre estimé de gènes C. elegans 97 Mb Humain 3000 Mb Drosophila 160 Mb Levure (S. cerevisiae) 12 Mb % des gènes de C. elegans ont des homologues chez les autres espèces

8 Avantages de C. elegans en tant que modèle animal Petite taille Transparent Temps de génération court Auto-fertilisation (hermaphrodite) Clonal Congélation à long terme (-80 ) Carte génétique Séquence génomique Domaines de recherche utilisant C. elegans: Apoptose Développement Neurosciences Immunologie 0.1 mm image taken from

9 Notion de cribles génétiques But: connaitre les gènes codant les protéines impliquées dans le mécanisme étudié Mécanismes régulant la taille et/ou la forme de l animal? Mécanismes régulant la locomotion? Mécanismes régulant la ponte des œufs? Mécanismes régulant le vieillissement? Solution: cribles génétiques pour isoler des mutants ayant des mutations dans des gènes codant les protéines impliquées dans le mécanisme étudié

10 Notion de cribles génétiques Comment générer un grand nombre de mutants (mutagenèse)? EMS (Ethyl Methane Sulphonate): -Mutation sur une seule base (transitions), G devient A ou C devient T -Mutations subtiles: codon stop prématuré, changement d 1 A.a. Irradiations aux UV: -Délétions -Il manque de grands fragments du gène, perte de fonction Irradiations aux rayons gamma: -Réarrangements majeurs tels que des translocations ou duplications Transposons: -Insertions d un fragment d ADN dans le génome -Entraine généralement une perte de fonction

11 Notion de cribles génétiques Comment générer un grand nombre de mutants? EMS, UV, F1: Certaines mutations vont se produire dans la lignée germinale, donc transmission m Mutations majoritairement récessives: pas de phénotypes quand les individus sont hétérozygotes F2: m : : m m 2 : 1 : 1

12 Notion de cribles génétiques Mécanismes régulant la taille et/ou la forme de l animal? -recherche de phénotypes dpy (DumPY) ou lon (LONg) Mécanismes régulant la locomotion? - recherche de phénotypes unc (UNCoordinated) Mécanismes régulant la ponte des œufs? - recherche de phénotypes egl (EGg Laying defective) Mécanismes régulant le vieillissement? - recherche de phénotype age (AGEing alteration)

13 Notion de cribles génétiques Mécanismes régulant la taille et/ou la forme de l animal? Exemples des phénotypes dpy et lon WT (sauvage) Mutant dpy WT (sauvage) Mutant lon

14 Notion de cribles génétiques Mécanismes régulant le vieillissement? Exemples du phénotype age % d animaux vivants WT Mutant age Temps (jours)

15 Notion de cribles génétiques Où est la mutation? EMS (Ethyl Methane Sulphonate): Irradiations aux UV: Transposons (Tn): Clonage classique par croisements successifs ou par RFLP/SNP Identification du site d insertion du transposon par PCR inverse car séquence du Tn connue. Tn ATTCGGCTATAA Tn Séquence flanquant le site d insertion du Tn

16 Exemple de cartographie d un mutant age-1 Nous travaillons sur le vieillissement Mutagenèse à l EMS et crible pour des mutants vivant plus longtemps % d animaux vivants WT Mutant age Temps (jours)

17 Notions de cartographie génétique Où est la mutation? Mutation dominante ou récessive? age-1 age-1 [mutant] Stratégie?

18 Notions de cartographie génétique Où est la mutation? Mutation dominante ou récessive? G1 [sauvage] X age-1 age-1 [mutant]?

19 Notions de cartographie génétique Où est la mutation? Mutation dominante ou récessive? G1 [sauvage] (x) age-1 age-1 [mutant] F1 Si la mutation est récessive Si la mutation est dominante 100 % 100 % 100 % 100 % age-1 age-1 AGE-1 AGE-1 [sauvage] [sauvage] [mutant] [mutant]

20 Notions de cartographie génétique Où est la mutation? Mutation age-1 récessive Chromosome sexuel ou autosome? C. elegans est diploïde: 5 pairs d autosomes et une paire de Chromosomes sexuels XO XX Stratégie?

21 Notions de cartographie génétique Où est la mutation? G1 Chromosome sexuel ou autosome? (x) [sauvage] [mutant]?

22 Notions de cartographie génétique Où est la mutation? G1 Chromosome sexuel ou autosome? (x) [sauvage] [mutant] Mutation sur chromosome sexuel Mutation sur autosome F1 100 % [mutant] 100 % [sauvage] 100 % 100 % [sauvage] [sauvage]

23 Notions de cartographie génétique Sur quel autosome? Principe de liaison entre 2 gènes Si 2 gènes ne sont pas liés sur le même chromosome G1 F1 m1 m1 Où est la mutation? m1 (x) m2 m2 m2 F2 On cherche la liaison m1-m2 en F2

24 Notions de cartographie génétique Où est la mutation? Sur quel chromosome? Principe de liaison entre 2 gènes Si 2 gènes ne sont pas liés sur le même chromosome m1 m1 m2 m2 m1 [m1 ] [m1 ] [ ] [ ] m1 m2 [m1 ] [m1 m2] [ m2] [ ] m2 [ ] [ m2] [ m2] [ ] [ ] [ ] [ ] [ ] 4 phénotypes différents en F2 [ ] [ m2] [m1 ] [m1 m2] 9 : 3 : 3 : 1

25 Notions de cartographie génétique G1 Où est la mutation? Sur quel chromosome? Principe de liaison entre 2 gènes Si 2 gènes sont liés sur le même chromosome m1 m1 (x) m2 m2 F1 m2 m1 F2 m2 m2 : : m1 m1 m2 m1 1 : 2 : 1 3 phénotypes différents en F2 :?

26 Notions de cartographie génétique Où est la mutation? Plusieurs marqueurs génétiques sont utilisables (phénotype fort) L -25 cm I dpy-1 dpy-2 25 cm II dpy-3 dpy-4 dpy-5 dpy-6 III VI dpy-7 dpy-8 R V dpy-9 dpy-10 X dpy-11 dpy-12

27 Notions de cartographie génétique Où est la mutation? Sur quel chromosome? Croisements entre notre mutant age-1 et des souches portant un ou des marqueurs génétiques dont la position est connue précisément. Le but est de faire un test de liaison entre age-1 et le marqueur. G1 dpy dpy ou (x) age-1 ou dpy dpy age-1 age-1 age-1 F1 age-1 dpy ou dpy age-1 F2?

28 Phénotypes en F2 Notions de cartographie génétique [ ] [ age-1] [dpy ] [dpy age-1] dpy-1, I:-20cM dpy-2, I:10cM dpy-3, II:-15cM dpy-4, II:20cM dpy-5, III:-15cM dpy-6, III:15cM dpy-7, IV:-10cM dpy-8, IV:20cM dpy-9, V:-20cM dpy-10, V:20cM

29 Notions de cartographie génétique Liaison forte entres la mutation age-1 et les marqueurs génétiques présents sur le chromosome IV. age-1 certainement sur le chromosome IV. Début de cartographie sur le chromosome IV. Comment?

30 Notions de cartographie génétique Pour calculer les distances entres 2 gènes liés, utilisation du phénomène de recombinaison homologue (crossing-over). age-1 dpy dpy age-1 dpy age-1

31 Notions de cartographie génétique Pour calculer les distances entres 2 gènes liés, utilisation du phénomène de recombinaison homologue (crossing-over). age-1 dpy-6 dpy-22 Plus la distance entre les 2 gènes est grande, plus il y aura d événements de recombinaisons homologues entre ces 2 gènes. 1cM entre 2 gènes = 1% de recombinaison 10cM entre 2 gènes=10% de recombinaison

32 Notions de cartographie génétique Si la distance entre les 2 gènes est de 10cM, 10% des gamètes vont posséder des chromatides avec recombinaisons entres les 2 gènes. Chromatides parentales dpy 10cM age-1 Méiose et recombinaisons age-1 45% Gamètes produits dpy dpy age-1 45% 5% 5% 10% (10cM)

33 Notions de cartographie génétique Animaux hermaphrodites!! En F2 (m1-m2 = 10cM) 81%: 0 chromosome recombiné. m1 (45%) m1 (45%) [m1 ] (20,25%) m1 m2 (5%) [m1 ] (2,25%) m2 (45%) [ ] (20,25%) (5%) [ ] (2,25%) 18% :1 chromosome recombiné. m1 m2 (5%) [m1 ] (2,25%) [m1 m2] (0,25%) [ m2] (2,25%) [ ] (0,25%) 1% : 2 chromosomes recombinés. m2 (45%) [ ] (20,25%) [ m2] (2,25%) [ m2] (20,25%) [ ] (2,25%) (5%) [ ] (2,25%) [ ] (0,25%) [ ] (2,25%) [ ] (0,25%)

34 Notions de cartographie génétique Animaux hermaphrodites!! En F2 (m1-m2 = 20cM) 64%: 0 chromosome recombiné. m1 (40%) m1 (40%) [m1 ] (16%) m1 m2 (10%) [m1 ] (4%) m2 (40%) [ ] (16%) (10%) [ ] (4%) 32% :1 chromosome recombiné. m1 m2 (10%) [m1 ] (4%) [m1 m2] (1%) [ m2] (4%) [ ] (1%) 4% : 2 chromosomes recombinés. m2 (40%) [ ] (16%) [ m2] (4%) [ m2] (16%) [ ] (4%) (10%) [ ] (4%) [ ] (1%) [ ] (4%) [ ] (1%)

35 Notions de cartographie génétique Calcul du pourcentage de recombinaison entre notre mutation et différents marqueurs génétiques. dpy-7 IV lon-3 unc-32 sma-6egl-5 cm dpy Problème: en F2, seul les individus ayant reçus 2 gamètes recombinés (très rare) sont détectables Solution: regarder en F3.

36 F2 Notions de cartographie génétique Calcul du pourcentage de recombinaison entre notre mutation et différents marqueurs génétiques. m1 (x) m2 G1 m1 m2 F1 m2 m1 m2 m2 : : m1 m1 m2 m1 1 : 2 : 1 [m1 ] [ ] [ m2] : : m2 m1 m2 : [ m2] m1 m1 m2 [m1 ] Choix d une population au phenotype fort ex: [ m2] : : m2 [ ] m1 [ ]

37 Notions de cartographie génétique F2s [ m2] clonés m2 : m2 m2 m1 m2 20,25% (2,25% 2,25%) 81,8% 18,2% F3 100% [ m2] : 75% [ m2] 25% [m1 m2] DONC, si m1 et m2 sont liés sur le même chromosome et distants de 10 cm, 18,2% des F2s clonés auront de la F3 [m1 m2]. De manière générale et pour des distances de moins de 25cM, on applique le raccourci: 2% de recombinants = 1 cm

38 Notions de cartographie génétique lon-3 (x) age-1-23cm F2: [ ] [lon-3 ] [ age-1] [lon-3 age-1] 50% 23% 25% 2% 60% 40% F3: [lon-3 ] [lon-3 age-1] 20 cm egl-5 (x) age-1 15cM F2: [ ] [egl-5 ] [ age-1] [egl-5 age-1] 50% 25% 25% 0% 82% 18% 9 cm F3: [egl-5 ] [egl-5 age-1]

39 IV lon-3 unc-32 egl-5 cm Notions de cartographie génétique age-1 est à droite de lon-3 et à 10cM à gauche ou à droite de egl Choix d un marqueur génétique vers le centre; unc-32 (5cM)

40 Notions de cartographie génétique age-1 est très proche d unc-32 unc-32 (x) age-1 5cM F2: [ ] [unc-32 ] [ age-1] [unc-32 age-1] 50% 25% 25% 0% 99.7% 0.3% 0.15 cm F3: [unc-32 ] [unc-32 age-1] 0.15 cm à gauche ou à droite de unc-32?

41 IV Notions de cartographie génétique age-1 est très proche d unc-32 On croise le mutant age-1 avec une souche possédant 2 marqueurs. En effet, il n y a en général qu 1 seul événement de recombinaison par chromosome. age-1 age-1 unc-32 egl-5 Donc : si age-1 est à gauche de unc-32, il sera possible d associer les 3 mutations après recombinaison, phénotype [age-1 unc-32 egl-5]. Si age-1 est à droite de unc-32, il y aura majoritairement association des mutations age-1 et unc-32 sans egl-5 après recombinaison, phénotype [age-1 unc-32 ].

42 Notions de cartographie génétique age-1 est très proche d unc-32 Après le croisement unc-32, egl-5 (x) age-1, la majorité des recombinants sont [age-1 unc-32 ]. Donc age-1 est à droite de unc-32. IV unc-32 5 age-1 egl-5 Une cinquantaine de gènes dans cette partie du génome Stratégie de sauvetage par injection de long fragments d ADN «sauvage» dans le mutant. En tout, entre 2 mois et plusieurs années de travail

43 age-1 code pour une PI3-K qui permet la rétention de DAF-16 dans le cytoplasme Resistance au stress oxydatif, aux UV,

44 SNPs / RFLPs RFLP = Restriction Fragment Length Polymorphism SNP = Single Nucleotide Polymorphism Un gène ou une séquence génomique peuvent avoir plusieurs formes au sein d une population. On parle alors de polymorphisme d un gène ou d une séquence. Ces différences peuvent êtres si subtiles qu elles ne concerneront qu un seul nucléotide. Individu.atcgttccgtaacgttgctaacgtgatcgtgac A Individu.atcgttccgtaacgttgataacgtgatcgtgac B

45 SNPs / RFLPs Ces différences peuvent êtres détectés par séquençage ou par digestion enzymatique (enzyme de restriction) puis électrophorèse. Exemple: L enzyme de restriction EcoRI reconnait exclusivement la séquence GAATTC Site de restriction EcoRI Individu A Individu B AATTCGTACGAATTCGCGTATT AATTCGTACGAAATCGCGTATT Pas de site de restriction EcoRI

46 SNPs / RFLPs Individu A Individu B ADN ADN PCR avec des oligonucleotides (oligos, primers) encadrant le polymorphisme Electrophorèse - A B Digestion avec EcoRI puis électrophorèse - A B Mise en évidence du polymorphisme (RFLP/SNP) entre A et B

47 SNPs / RFLPs Pour la cartographie génétique Ces différences d une paire de base qui n affectent pas forcement le phénotype de l animal se transmettent à la descendance lors des croisements. Ces SNP faisant partie du matériel génétique, ils sont sujet aux recombinaisons homologues. Il est possible de les suivre par digestion de la portion d ADN appropriée. Ils sont comme autant de marqueurs génétiques disposés le long du génome mais détectable seulement par digestion ou séquençage.

48 SNPs / RFLPs Pour la cartographie génétique Idée: croiser des nématodes portant une mutation que l on cherche à cloner avec une souche d animaux portant de nombreux polymorphismes. Ceci permettra en très peu de croisement de suivre la liaison entre notre mutation et les polymorphismes disposés le long du génome.