LES PUCES A ADN. Rémi Bernard

Transcription

1 LES PUCES A ADN Rémi Bernard

2 Chromosome Graphics courtesy of the National Human Genome Research Institute Cellule transcription traduction À l échelle cellulaire Gène (ADN) Transcrit (ARNm), Simple brin Protéine GENOME (ensemble des gènes d une cellule) TRANSCRIPTOME (ensemble des transcrits d une cellule à un instant donné) PROTEOME (ensemble des protéines présentes dans une cellule à un instant donné

3 ETUDE DU GENOME GENOMIQUE ETUDE DU TRANSCRIPTOME ETUDE DU PROTEOME POST-GENOMIQUE

4 ans une cellule seulement une fraction des ènes est exprimée... Tissu nerveux Tissu musculaire

5 utre exemple: au cours d une croissance bactérienne es conditions de milieu changent et les gènes exprimés aussi! O 600 nm Début de phase stat. Phase stationnaire Phase Expo. Gènes de croissance (metabolisme ) Gènes de mobilité (flagelle) Gènes de carence Temps (min) Gènes de survie (sporulation..) Gènes de défense (production d antibiotique )

6 Un des outils pour l étude du transcriptome: les biopuces ou puces à ADN Le but: détecter et quantifier chacune des différentes espèces d ARNm présents dans la préparation. Analyser le transcriptome c est identifier, à un temps t, et/ou dans une condition donnée, les séquences codantes du génome effectivement exprimées (transcrits, ou ARNm).

7 L ADNc ou ADN complémentaire n vivo Brin codant exon intron ADN génomique, double brin GAAATAAGCTGTTCTCTGCTTCAT CTTTATTCGACAAGAGACGAAGTA transcription GAAAUUCUGCUUCAU ARN messager, simple brin (instable) In vitro rétro-transcription CTTTAAGACGAAGTA ADNc, simple brin (stable) ADNc ne contient que les régions codantes d un gène (élimination des introns)

8 abrication des puces à ADN LE BUT: représenter sur la puce l ensemble des transcrits d un génome et pouvoir les identifier 2 types de sondes fixées sur le support solide DN génomique du gène 1 intron exon ADNc Gene 1 PCR amplification d un fragment codant spécifique) Fragment spécifique complémentaire simple brin (obtenu par : -oligosynthèse - synthèse in situ (photolitographie) Chaque position sur la puce est connue Chaque dépôt contient des fragments spécifiques d un seul gène. L ensemble des gènes du génome étudié doivent être représentés si possible sur la puce. Ces fragments fixés sur la puce sont les sondes et ne sont pas marqués.

9 ES CIBLES Préparation Population cellulaire (echantillon biologique) Extraction des ARNm totaux Reverse transcription et marquage Obtention d ADNc totaux marqués Hybridation de ces ADNc sur la puce

10 Deux marquages possibles ADNc marqués [P 33 ] dctp Marquage radioactif ARNm totaux Populations cellulaires ARNm totaux Marquage avec fluorochromes Cy3 CyX dctp Cy5 ADNc marqués

11 nteraction entre la sonde et la cible: HYBRIDATION MOLECULAIRE Hybridation: interaction des deux chaînes de séquences complémentaires (liaisons hydrogènes) Lame de verre comportant les sondes fixées Cible: ADNc du gène X TCCCAGCTGAAT dépôt contenant les sondes spécifiques du gène X AGGGTCGACTTA TCCCAGCTGAAT AGGGTCGACTTA AGGGTCGACTTA AGGGTCGACTTA

12 uantification des transcrits présents: e signal de détection est proportionnel à la concentration de la cible Condition: excès de sondes (sur la puce) par rapport aux cibles (venant s hybrider sur cette puce)

13 Plusieurs types de puces

14 nalyse des résultats sur une lame de microarray opulation cellulaire 1 (cellules références) Population cellulaire 2 (ex: cellules cultivées sans oxygène) ARNm totaux ARNm totaux ADNc marqués fluorochrome1 (CY5-dCTP) ADNc marqués fluorochrome2 (CY3-dCTP) Hybridation sur la puce Excitation 1

15 Analyse des résultats: Quantification de chacune des fluorescences pour chacun des dépôts (gènes) de la lame Classification des gènes sur un graphe de type suivant

16 Exemples d Applications- Diagnostics médicaux Cellules de foie sain Cellules tumorales du foie Comparaison des profils d expression par microarray Identification des gènes anormalement exprimés dans les cellules tumorales Applications similaires pour le diagnostic: -de maladies génétiques -de maladies cardio-vasculaires - recherche de marqueurs du vieillissement (qui n est pas un diagnostic bien sûr) Ces gènes constituent des marqueurs de cellules «malades» et leurs identifications facilitent les diagnostics médicaux

17 Exemples d Applications- Microbiologie Antibiotique Cellules bactériennes Comparaison des profils d expression par microarray Identification de gènes codant pour des systèmes de résistances à cet antibiotique (ex: un transporteur membranaire pouvant expulser l antibiotique, un enzyme pouvant dégrader l antibiotique.)

18 Exemples d Applications- Toxicogénomique tude de l influence de diverses substances toxiques sur l expression des gènes: cas particulier: les génotoxiques (agents d origine physique ou chimique provoquant l apparition e lésions dans l ADN, pouvant conduire à des mutations) x: benzène, amiante, rayonnements radioactifs, rayonnements solaires, produits cancérigènes Utilités des puces ADN: analyse de la réponse cellulaire à la présence de génotoxiques (au niveau du transcriptome) Etude sur un grand nombre d individus RESISTANCE? ntification de gènes participant a détoxication de la cellule ulti Drug Transporter, zymes de dégradation ) variation des réponses à un même génotoxique suivant les individus. (du au polymorphisme génétique entre les individus, notion de susceptibilité génétique) perspectives adaptation des traitements pharmaceutiques à chaque individu selon son polymorphisme (pharmacogénomique)

19 Exemples d Applications- Environnement 1) Détection de bactéries pathogènes dans un échantillon biologique Puce ADN contenant des sondes dirigées contre les ARN16S de plusieurs bactéries pathogènes (Salmonelles, Legionelles, Staphylocoques ) Révélation Hybridation Eau, produits alimentaires, tissus infectés prélèvements aractérisation rapide du ou des pathogènes résents dans le prélèvement (résultats obtenus en 24h) Amplification des gènes d ARN 16S présents + marquage

20 Exemples d Applications- Environnement 2) Détection de substances polluantes dans l eau (les biocapteurs) Principe Substance polluante (ex: arsenic..) Utilisation de ce biocapteur pour tester la présence de l agent polluant dans l eau Analyse microarray Identification de gènes spécifiquement induits et fortement induits par l agent polluant (ex: gène a) Construction d un biocapteur Couplage de la protéine codée par le gène a à une protéine fluorescente (induction de la fluorescence si l agent polluant est présent)

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22 Quelques références Animation sur le principe des puces ADN Un topo sur les puces ADN et leurs utilités Pour les plus courageux quelques publications Cui L. et al, Antimicrob Agents Chemother. 2005, Aug; vol 49 (8): pages DNA microarray-based identification of genes associated with glycopeptide resistance in Staphylococcus aureus Bartosiewicz M. et al, Archives of Biochemistry and Biophysics 2000, April; vol 376: pages Development of a toxicological gene array and quantitative assessment of this technology Rogge L. et al, Nature Genetics 2000, May; vol 25: pages Transcript imaging of the development of human T helper cells using oligonucleotide arrays Schena M. et al, TIBTECH. 1998, July; vol 16: pages Microarrays: biotechnology s discovery platform for functional genomics