Immunologie de base. Master 1 Biologie & Santé Année AUTEURS : ANDRIAMANANTENA Vohary MAAKNI Smail WANG Xinyue CARPIER Jean-Marie

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1 Immunologie de base Master 1 Biologie & Santé Année TD basé sur la publication A distinct lineage of CD4 T cells regulates tissue inflammation by producing interleukin 17 Heon Park, Zhaoxia Li, Xuexian O Yang, Seon Hee Chang, Roza Nurieva, Yi-Hong Wang, Ying Wang, Leroy Hood, Zhou Zhu, Qiang Tian & Chen Dong Nature Immunology 6, (2005) ENCADREMENT : Monsieur Jean KANELLOPOULOS Monsieur Pierre BOBE AUTEURS : ANDRIAMANANTENA Vohary MAAKNI Smail WANG Xinyue CARPIER Jean-Marie

2 Sommaire Remise en contexte. Réponse immunitaire et différ²enciation des lymphocytes T. Lymphocytes T CD4 positifs différenciés. Modèle de sclérose en plaque expérimentalement induite Caractérisation d une nouvelle sous population de lymphocytes auxiliaires, LTh17 (Park et al., Nature Immunology.) 2

3 Aspects fonctionnels RI et Entrée (rupture de la barrière &épithéliale) Réponse immunitaire et des lymphocytes T Tissu Reconnaissance par le SI Macrophage Pathogène porteur de motif(s) antigénique(s) Lymphocyte B Migration vers les organes lymphoïdes secondaires Expression d un peptide immunogène au CMH II Cellule dendritique Expression au CMH I d un peptide immunogène par cross-présentation (Ex. virus) Organe lymphoïde secondaire EV Présentation à des LT CD4+ naïf ayant un TCR spécifique Présentation à des LT CD8+ naïf ayant un TCR spécifique Circulation lymphatique 1 LICOS ICOS Activation des LT8 en LT8 cytotoxique et de LT4 en LTh0 Tissu TCD8+ activée Th0 CYTOTOXICITE Th1 Th2?? IL-17

4 Aspects fonctionnels RI et LT helpers Les lymphocytes T auxiliaires Souspopulation Fonction Sécrétion Activation (signal3) TH1 Activation de la fonction microbicide des macrophages Activation des LB présentateurs d Antigènes et commutation isotypique IFNγ IL-2 TH2 Activation des LB présentateur d Antigène et commutation isotypique (IgE +++) IL-4 IL-5 IL-13 IFNγ IL-12 IL-4 (Cellules dendritiques, macrophages, cellules NK) Récepteur JAK (RTK) STAT-1 T-bet (FT) GATA-3 (FT) STAT-6 IL-4 C-MAF IFNγ + r. IL-12 STAT-4 Expansion/ 3

5 Inflammation et médiateurs EAE Experimental autoimmune encephalomyelitis. Modèle de sclérose en plaque expérimentalement induite. Injection de MBP ou MOG (constituants de la myéline et des oligodendrocytes) d une espèce différente => immunisation => production de LT autoréactifs. Infiltration leucocytaire au sein du CNS. Destruction des gaines de myéline des fibres nerveuses et lésions multiples au niveau du SNC. = Modèle animal de sclérose en plaque. 4

6 Inflammation et médiateurs EAE SPACH K. M, Gene expression analysis suggests that 1,25 dihydroxyvitamin D3 reverses EAE by stimulating inflammatory cell apoptosis. Physiologycal Genomics, 18:

7 expérimentale Hypothèse initiale : L IL-17 est exprimée par une sous-population de lymphocytes Thelpers Mode de des lymphocytes TH-17? Régulation de la en LTH17? Implication dans la mise en place d un contexte inflammatoire Second modèle : IL-17 pulmonaire Existence d un pool de cellules productrices? Rôle de cytokines au cours du développement des LTH17 in vitro? Rôle de l IL-17? Ce pool est-il restreint au LT4? Rôle de cytokines au cours du développement des LTH17 in vivo? IL-17 et pathogénèse de l EAE? Particularité du signal 2, spécifique de cette voie de? Rôles des complexes transcriptionnels? Influence du traitement anti-il-17 sur les LT reconnaissant MOG Régulation de l expression de IL-17 par les LTCD4 + effecteur/mémoire? Raison du recrutement des LT autoréactifs et des macrophages dans le SNC 6

8 Mode de expérimentale Hypothèse initiale : L IL-17 est exprimée par une sous-population de lymphocytes Thelpers Mode de des lymphocytes TH-17? Existence d un pool de cellules productrices? Ce pool est-il restreint au LT4? Particularité du signal 2, spécifique de cette voie de? 7

9 Mode de Souris B6 ( C57BL/6) Immunisation avec peptide MOG + adjuvant CFA Délai de 7 jours Extraction des OL IIr (rate et ganglions) Restimulation avec MOG Mesures de la présence de cytokines intra/extracellulaire Mode de des LTh-17 Question 1 : Y-a-t-il une un pool de cellules productrices d IL-17? a) Mesure par ELISA de cytokines extracellulaires Deux contrôles : - Nonimm, contrôle négatif assurant du taux basal d expression des cytokines - CFA, contrôle négatif assurant que la réponse n est pas lié à l adjuvant seul. Parmi les LT CD4 +, une souspopulation produirait de l IL- 17 et serait différente de celle produisant l IFNγ (Th1) b) Détection par cytométrie de flux de cytokines intracellulaires de LTCD4 + 8

10 Mode de Souris B6 ( C57BL/6) Mode de des LTh-17 Question 2 : Ce pool de cellules productrices d IL-17 est-il restreint au LT CD4 + ou bien concerne-il les LT CD8 +? Immunisation avec protéine KLH induisant réponse LT CD8 et CD4 Extraction des OL IIr (rate et ganglions) Expression de IFNγ Expression de IL-17 LT CD8 + CD LT CD8 - CD Détection de cytokines intracellulaires Ainsi, les LT CD8 + n expriment pas d IL-17 même une fois activés. L expression est donc restreinte à certains LT CD4 + Figure 1c Détection de cytokines intracellulaires par cytométrie de flux dans cellules CD4 ou CD8 9

11 Mode de Mode de des LTh-17 Question 3 : Quel mécanisme de co-stimulation est nécessaire pour une vers des LT CD4 + exprimant de l IL-17? Souche transgénique B6 WT Souche transgénique B6 ICOS -/- Sélection de LT4 in vitro LT4 naïf TCR OVA ICOS -/- LT4 naïf TCR OVA ICOS +/+ Culture en présence de l Antigène (ovalbumine) CPAg B7 +/+ CPAg B7 -/- 10

12 Lavage Stimulation non spécifique par anticorps anti-cd3 LT4 TCR OVA ICOS -/- LT4 TCR OVA ICOS +/+ ELISA (SURNAGEANT) 11

13 Mode de Souris B6 ICOS +/+ ou ICOS -/- Sélection de LT4 TCR- OVA (OTII cells) Culture en présence de l antigène (ovalbumine) Lavage Stimulation LT4 par anticorps anti-cd3 Mode de des LTh-17 Question 3 : Quel(s) mécanisme(s) de co-stimulation sont nécessaire(s) pour une vers des LT CD4 + exprimant de l IL-17 in vitro? Expression d IFNγ Expression de IL-4 Expression de IL-17 B7WT et ICOS +/+ (témoin positif) B7KO et ICOS +/ B7WT et ICOS -/ /- + B7KOet ICOS -/- (témoin négatif) Sous-population de LTh associé LTh1 LTh2 LTh17? Les partenaires de co-stimulation sont requis de manière différentielle dans la polarisation des différentes souspopulations de LTh. B7 et ICOS sont nécessaires pour l expression de IL-17 Détection de cytokines par ELISA Figure 1d Détection de cytokines extracellulaires par ELISA. 12

14 Mode de Souches WT ou déficientes pour B7 et/ou ICOS Immunisation avec KLH (+ CFA, adjuvant) Rappel Mode de des LTh-17 Question 3 : Quel(s) mécanisme(s) de co-stimulation sont nécessaire(s) pour une vers des LT CD4 + exprimant de l IL-17 in vivo? Expression d IFNγ Expression de IL-4 Expression de IL-17 B7KOet ICOS -/ B7KO et ICOS +/ B7WT et ICOS -/ B7WT et ICOS +/ Détection de cytokines splénique par ELISA Résultats très similaires à ceux trouvés in vitro : La d une sous-population lymphocytaire sécrétant de l IL-17 dépend à la fois des deux partenaires de co-stimulation CD28 et ICOS, à l inverse des LTh1 par exemple qui n auraient besoin que d ICOS. Figure 1f Détection de cytokines spléniques par ELISA en fonction de la concentration en antigène. 13

15 Mode de Mode de des LTh-17 BILAN LICOS ICOS LT sécrétant IL-17 LTh1 sécrétant INFγ 14

16 expérimentale Hypothèse initiale : L IL-17 est exprimée par une sous-population de lymphocytes Thelpers Mode de des lymphocytes TH-17? Existence d un pool de cellules productrices? Régulation de la en LTH17? Rôle de cytokines au cours du développement des LTH17 in vitro? Ce pool est-il restreint au LT4? Rôle de cytokines au cours du développement des LTH17 in vivo? Particularité du signal 2, spécifique de cette voie de? Rôles des complexes transcriptionnels? 15

17 Mode de Régulation de Régulation de la en LTh-17 Question 1 : Quel environnement en cytokines est nécessaire pour induire ou inhiber in vitro la en un pool lymphocytaire sécréteur d IL-17? OTII cells Activation (incubation en présence d ovalbumine) en condition variables Rappel et activation médiée par Ac anti-cd3 Détection de la production de cytokines par ELISA et cytométrie de flux Figure 2a. Détection de cytokines extracellulaires par ELISA en fonction des conditions. La neutralisation différentielle de cytokines conduit à la détection de cytokines différentes et donc de sous-populations lymphocytaires sécrétrices différentes: - Ac anti-ifnγ => LTh2 - Ac anti-il4 => LTh1 Phénomène d auto-entretien des pools sécréteurs respectifs. - Ac anti IL-4, anti-ifnγ, + IL-23 => LT sécréteur de IL-17 Exclusion mutuelle dans la régulation des différentes s: régulation négative de la des LTh17 en présence de LTh1/2. IL-23 semble avoir un rôle spécifique sur LTh

18 Mode de Régulation de Régulation de la en LTh-17 Question 2 : Quel environnement en cytokines est nécessaire pour induire ou inhiber in vivo la en un pool lymphocytaire sécréteur d IL-17? Souris IFNγ -/- Immunisation (MOG +CFA) + Restimulation ex vivo En l absence d IFNγ in vivo, augmentation de la sécrétion d IL- 17 et donc augmentation du pool de LTh-17. L IFNγ est bien à l origine d une régulation négative de la en LTh17 Détection de la production de cytokines extracellulaires par ELISA et intracellulaires par cytométrie de flux Figure 2b. Détection de cytokines extracellulaires et intracellulaire par respectivement ELISA et cytométrie de flux. 17

19 Mode de Régulation de Souris Balb/c Stat4 -/- ou Stat6 -/- Immunisation (KLH +CFA) + Restimulation ex vivo Régulation de la en LTh-17 Question 3 : Quel est le rôle des voies de transcription connues dans la en LTh17 : STAT6 et STAT4? Expression d IFNγ STAT4 -/- STAT6 -/- Sécrétion d IL-4 inchangé diminution Sécrétion d IFNγ diminution inchangé Sécrétion d IL-17 inchangé inchangé Détection de la production de cytokines extracellulaires par ELISA et intracellulaires par cytométrie de flux Les voies faisant intervenir STAT6/4 n interviennent pas dans la de LTh17 Figure 2c. Détection de cytokines spléniques par ELISA en fonction de la concentration en antigène. 18

20 Mode de Régulation de Régulation de la en LTh-17 Question 3 : Quel est le rôle des voies de transcription connues dans la en LTh17 : T-bet? Souris B6 T-bet -/- Immunisation (MOG+CFA) + Restimulation ex vivo Détection de la production de cytokines extracellulaires par ELISA et intracellulaires par cytométrie de flux En absence du FT : - concentration en IFNγ extracellulaire et intracellulaire plus faible donc la d un pool LTh1 est moindre (résulat attendu). - concentration en IL-17 plus élevée soit lié à - Régulation négative de la part de ce FT - La diminution en LTh1 qui n inhibe pas la en LTh17 Figure 2b. Détection de cytokines extracellulaires et intracellulaire par respectivement ELISA et cytométrie de flux. 19

21 Mode de Régulation de Régulation de la en LTh-17 Question 3 : Quel est le rôle des voies de transcription connues dans la en LTh17 : c-maf? Souris B6 ICOS +/+ ou ICOS -/- Purification de LT CD4 + Transfection gène codant pour FT c-maf ou non Les cellules portant le transgène de c-maf et exprimant ainsi le FT sécrète davantage d IL-4 et bien moins de IL-17. c-maf réguleraient négativement la des LTh17 et de manière directe (pas de manière indirecte dans le cas où provoquerait la de LTh2 qui inhiberaient par sécrétion d IL-4 la en LTh17, puisqu ici on utilise un transgène) Activation médiée par Ac anti-cd3 et APC wt ELISA Figure 1e. Détection de cytokines de LT CD4 + par ELISA en fonction de la concentration en antigène. 20

22 Mode de Régulation de la en LTh-17 BILAN Régulation de LTh1 c-maf LTh2 IFNγ IL-4 LTh17 c-maf Les évènements ayant un rôle régulateur de la des LTh17 sont différents de ceux des LTh1/2 (FT mis en jeu) 21

23 expérimentale Hypothèse initiale : L IL-17 est exprimée par une sous-population de lymphocytes Thelpers Mode de des lymphocytes TH-17? Existence d un pool de cellules productrices? Régulation de la en LTH17? Rôle de cytokines au cours du développement des LTH17 in vitro? Ce pool est-il restreint au LT4? Rôle de cytokines au cours du développement des LTH17 in vivo? Particularité du signal 2, spécifique de cette voie de? Rôles des complexes transcriptionnels? Régulation de l expression de IL-17 par les LTCD4 + effecteur/mémoire? 22

24 Mode de Régulation de Régulation des LTh17 Régulation de l expression de IL-17 par des LTh17 effecteurs / mémoires Figure 3. Détection d IL- 17 par ELISA. Trie des LT4 effecteurs/mémoire (CD4 + / CD62L low ) par FACS STIMULI DIVERS Détection d IL-17 par ELISA 23

25 Mode de Régulation de Régulation des LTh17 Régulation de l expression de IL-17 par des LTh17 effecteurs / mémoires IL-23 TCR/CD28 BILAN IL-4 IFNγ Expression IL-17 LTh 17 Pas d expression d IL-17 24

26 expérimentale Hypothèse initiale : L IL-17 est exprimée par une sous-population de lymphocytes Thelpers Mode de des lymphocytes TH-17? Régulation de la en LTH17? Implication dans la mise en place d un contexte inflammatoire Existence d un pool de cellules productrices? Rôle de cytokines au cours du développement des LTH17 in vitro? Rôle de l IL-17? Ce pool est-il restreint au LT4? Rôle de cytokines au cours du développement des LTH17 in vivo? IL-17 et pathogénèse de l EAE? Particularité du signal 2, spécifique de cette voie de? Rôles des complexes transcriptionnels? Influence du traitement anti-il-17 sur les LT reconnaissant MOG Régulation de l expression de IL-17 par les LTCD4 + effecteur/mémoire? Raison du recrutement des LT autoréactifs et des macrophages dans le SNC 25

27 Implication dans l inflammation Mode de Régulation de Inflammation LTh1 LTh2 IFNγ IL-4 IL-5 IL-13 Activation de l effet microbicide Réponse humorale médiées par les IgG Réponse humorale médiée par les IgE LTh17 IL-17? Pro-inflammatoire Sur divers type cellulaire in vitro Régulation de gène pro-inflammatoire en synergie avec TNF 26

28 Mode de Régulation de Inflammation Implication dans l inflammation Question 1 : L IL-17 a-t-elle un impact sur le transcriptome de «cellules-cibles»? IL-17 Hygromycine IgG1-tag Transfection Lignée cellulaire de drosophile ELISA Mouse embryonic fibroblast (MEF) Production IL-17 Dans un contexte IL-17, les fibroblastes synthétisent et sécrètent de l IL-6 S1. Détection de la sécrétion d IL-6 par les MEFs en culture 27

29 Mode de Régulation de Inflammation Implication dans l inflammation Question 1 : L IL-17 a-t-il un impact sur le transcriptome de «cellules-cibles»? IL-17 Hygromycine IgG1-tag Transfection Détection par RT-PCR de l expression de gènes (approche par «gène candidat» Détection par micropuces à ADN de l expression de gènes (approche «systématique») RNA total Mouse embryonic fibroblast (MEF) Lignée cellulaire de drosophile Production IL-17 Fig4. Détection de la variation différentielle de l intensité de transcription en présence d IL-17 et de cytokines pro-inflammatoires 28

30 1-Préparation de le micropuce Distribution de la collection d ADN c sur un substrat solide (membrane de nylon ou une lame de verre ) à des localisations précises 2- Marquage de l ADN c par incorporation cytosine marquée par des fluorochromes (Cy3 Ou Cy5) lors de l amplification d ARNm Synthèse du brin complémentaire d ARN m à partir d un nucléotide conjugué au Cy3. Utilisation d ARN m de la seconde population cellulaire pour la synthèse d ADN c conjugué avec un nucléotide conjugué au Cy5. hybridation de cible avec sa sonde complémentaire : une fluorescence verte(cy3) ou rouge (Cy5) est détectée. Si les deux s hybrident à l ADN c,la fluorescence jaune est détectée. Noire absence de signal l expression du signal est proportionnelle à l intensité d hybridation donc à l expression des gènes 29

31 Mode de Régulation de Inflammation Implication dans l inflammation Question 1 : L IL-17 a-t-il un impact sur le transcriptome de «cellules-cibles»? IL-17 Hygromycine IgG1-tag Transfection Détection par RT-PCR de l expression de gènes (approche par «gène candidat» Détection par micropuces à ADN de l expression de gènes (approche «systématique») RNA total Mouse embryonic fibroblast (MEF) Lignée cellulaire de drosophile Production IL-17 IL-17 est une cytokines proinflammatoire au sens où elle stimule l expression de gènes proinflammatoires. 30

32 Mode de Régulation de Implication dans l inflammation Question 2 : L IL-17 a-t-elle un rôle dans certaines maladies inflammatoires? Exemple de l EAE. Inflammation Souche B6 Immunisations (MOG) Infiltration de LT dans le SNC à partir du 7 e jour Traitement au 9 e jour Fig5a. Variations des signes cliniques de l EAE en fonction du traitement. Pas de traitement Ac anti-il-17 (1 injections tout les jours jusqu au 12 e jour) IgG contrôle (1 injections tout les jours jusqu au 12 e jour) Symptômes au 12 e jour avec infiltration de mononucléaires dans le SNC Symptômes au 18 e jour Symptômes au 12 e jour avec infiltration de mononucléaires dans le SNC 31

33 Traitement Mode de Ac anti-il-17 IgG contrôle S2a. Variations des signes cliniques de l EAE en fonction du traitement Régulation de Inflammation Evaluation des signes cliniques Evaluation de l infiltration tissulaire par cytométrie de flux basée sur la présence des marqueurs CD4 (LT4) et CD11 (Macrophage) Délai dans la survenue des signes cliniques accordées par un traitement anti-il17 Régression des signes cliniques et notamment de l infiltration des LT4 et des macrophages dans le cadre d un traitement anti-il17 S2b. Analyse de l infiltration tissulaire 32

34 Mode de Régulation de Implication dans l inflammation Question 3 : Un traitement anti-il-17 atténue-t-il l activation des LT? Inflammation Souche B6 EAE Souche B6 EAE + Ac anti-il17 Splénocytes + MOG Splénocytes + MOG Après restimulation in vitro, détection par ELISA des cytokines pro-inflammatoires sécrétées Mesure de la prolifération des LT 33

35 Impossible d afficher l image. Impossible d afficher l image. Mode de Fig5b. Détection des cytokines pro-inflammatoires S2b. Détection des cytokines pro-inflammatoires en fonction de la concentration en MOG Régulation de Inflammation Pas d inhibition majeure de la sécrétion et de la prolifération des LT S2c. Analyse de la prolifération de LT en fonction de la concentration en MOG. 34

36 Mode de Régulation de Implication dans l inflammation Question 4 : Quelle est la cause de la diminution de l infiltration tissulaire? Inflammation Tissu cérébral d une souche B6 EAE Tissu cérébral d une souche B6 EAE + Ac anti-il17 EXTRACTION ARN total Fig5c. Résultat de real-time RT-PCR Real-time RT-PCR afin de quantifier les transcrits de certaines chimiokines Un traitement anti-il17 neutralise l IL-17 qui n induit plus la sécrétion de chimiokines par le tissu local d où une diminution de l infiltration tissulaire 35

37 Implication dans l inflammation Mode de Régulation de Inflammation IL-17 INDUCTION LTh17 effecteur Sécrétion de chimiokines Infiltration tissulaire de macrophages INFLAMMATION Circulation 36

38 expérimentale Hypothèse initiale : L IL-17 est exprimée par une sous-population de lymphocytes Thelpers Mode de des lymphocytes TH-17? Régulation de la en LTH17? Implication dans la mise en place d un contexte inflammatoire Second modèle : IL-17 pulmonaire Existence d un pool de cellules productrices? Rôle de cytokines au cours du développement des LTH17 in vitro? Rôle de l IL-17? Ce pool est-il restreint au LT4? Rôle de cytokines au cours du développement des LTH17 in vivo? IL-17 et pathogénèse de l EAE? Particularité du signal 2, spécifique de cette voie de? Rôles des complexes transcriptionnels? Influence du traitement anti-il-17 sur les LT reconnaissant MOG Régulation de l expression de IL-17 par les LTCD4 + effecteur/mémoire? Raison du recrutement des LT autoréactifs et des macrophages dans le SNC 37

39 But: détermination les conséquences chronique de surexpression de IL17 Expérience in vivo: Production et analyse des-il17-souris transgéniques CC10.CC10 IL-17 - Fig a Construction de CC10-IL-17 - Fig b ELISA de l'il-17 contenu dans le liquide de lavage broncho-alvéolaire recueillis auprès des souris transgéniques (Tg +) et des souris non transgéniques(tg -). Construction de Cc 10 IL17 Présence de IL17 dans le liquide broncho alvéolaire. Surexpression des chemokines 38

40 Comparaison histologique du tissu pulmonaire 10 mois 5 mois Fig f: présence de fine cristal dans le bronchiole Production de mucus Fig e:- production de mucus quantité importante de dans les cellules épithéliales collagène -infiltration et sur le accumulation des cellules mononucléaires sub épithélium de bronchiole 39

41 Expérience: RT PCR :traitement de MLE12 cellule avec IL17 Ig,TNFγ et ILβ pendant 6 H I L17 Ig, IFNγ et IL1 β profil d expression des similaire des chemokines et des métallo protéinases CSF2 facteur de stimulation des granulocytes 40

42 IL 17 induit directement la production de cytokines par les cellules épithéliales et augmente l adhésion de l expression de ICAM donc l adhésion des cellules,proinflammatoires 41

43 Test ELISA Annexes 42

44 Real-time PCR Annexes 43

45 Annexes Figure 1 44

46 Annexes Figure 2 45

47 Figure 3 Annexes 46

48 Annexes Figure 4 47

49 Annexes Figure 5 48

50 Figure 6 Annexes 49

51 Sup. Data S1 Annexes 50

52 Sup. Data S2 Annexes 51