Etude de la relation structure- fonction de bovserpina3-3: 3: Rôle(s) ) des Aspartates (D) Xavier Blanchet

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1 Etude de la relation structure- fonction de bovserpina3-3: 3: Rôle(s) ) des Aspartates (D) Xavier Blanchet

2 Les serpines Acronyme pour SERin Protease INhibitor Ces serpines sont des inhibiteurs non Michaeliens d environ 400 acides aminés. Elles possèdent un site (Reactive Center Loop) mimant le substrat de la protéase. Dans le muscle squelettique bovin, deux serpines ont été extraites et caractérisées biochimiquement : bovserpina3-1 et bovserpina3-3 Etude de la relation structure-fonction de la serpine bovserpina3-3 1

3 Les serpines bovines (1) Inhibition des protéases à sérine et des protéases à cystéine : Cross-Class Inhibition bovserpina3-7 : papaïne (Hwang et al., 2002) bovserpina3-3 : pas d'inhibition (Bremaud et al., 2006) Existe-t-il quand même des protéases à cystéine cibles de bovserpina3-3? Dans le muscle post-mortem pas de nécrose Donc APOPTOSE Caspases : cibles de bovserpina3-3? Caspases = protéases à cystéine qui clivent après un aspartate (D) du motif consensus DXXD 328 HGAALDVDEE GTEGAAATGI GIERTFLRII VRVNRPFLIA VVLKDTQSII 377 2

4 Production de différentes protéines bovserpina3-3 recombinantes bactériennes Changement du résidu aspartate en alanine A A Les serpines bovines (2) 328 HGAALDVDEE GTEGAAATGI GIERTFLRII VRVNRPFLIA VVLKDTQSII 377 A H 2 N His-Tag COOH bovserpina3-3 référente H 2 N COOH bovserpina3-3 D372A H 2 N COOH bovserpina3-3 D335A H 2 N COOH bovserpina3-3 D333A H 2 N COOH bovserpina3-3 3D/A Résidus aspartate modifiés Gel SDS-PAGE 12 % Piste 1 : marqueur de taille Piste 2 : bovserpina3-3 référente Piste 3 : bovserpina3-3 D333A Piste 4 : bovserpina3-3 D335A Piste 5 : bovserpina3-3 D372A Piste 6 : bovserpina3-3 3D/A Dépôt de 1 µg dans chaque cas. 3

5 Mesures de l'activité inhibitrice in vitro (1) Mesure de l'activité inhibitrice de bovserpina3-3 (constante d'association) = mesure de l'activité résiduelle de la protéase cible commerciale utilisée (fluorescence) 2 protéases commerciales utilisées : - la trypsine (sérine protéase) - la caspase-3 (cystéine protéase) Substrats spécifiques des protéases cibles : Protéase commerciale Trypsine Caspase-3 Substrat N-CBZ-Phe-Arg-NHMec N-acetyl-Asp-Glu-Val-Asp-NHMec 4

6 Mesures de l'activité inhibitrice in vitro (2) Avec la trypsine (Beatty et al., 1980) : bovserpina3-3 référente 0 - Enzyme à une concentration donnée - Ajout de l'inhibiteur à différents temps - Incubation à 37 C - Ajout du substrat - Lecture toutes les minutes pendant 10 minutes Vitesse d'hydrolyse du substrat pour des temps d'incubation croissants fluorescence 30 sec incubation 60 sec incubation 90 sec incubation 120 sec incubation temps Avec la caspase-3 (Zhou et al., 1997) : 0 - Incubation de l'enzyme + substrat - Lecture de la fluorescence pendant 5 minutes - Ajout de l'inhibiteur à différentes [ ] - Lecture pendant 30 à 40 minutes fluorescence bovserpina3-3 référente 2 nm inhibiteur 5 nm inhibiteur 7,5 nm inhibiteur 10 nm inhibiteur Vitesse d'hydrolyse du substrat pour des [inhibiteur] croissantes 5 min temps 5

7 Mesures de l'activité inhibitrice in vitro (3) k ass (M -1 s -1 ) Protéine recombinante / Protéase cible Trypsine (x 10 6 ) Caspase 3 (x10 5 ) SERPINA3-3 référente 1,87 9,04 SERPINA3-3 D333A 0,29 N.I. SERPINA3-3 D335A 30,5 N.I. SERPINA3-3 D372A SERPINA3-3 3D/A N.I. : pas d inhibition 0,79 constante non déterminée (protéine très instable) N.I. N.I. Problème : Quelle est la cible parmi les trois D? Modélisation 6

8 Modélisation de bovserpina3-3 D335 D333 D372 Institut de Biologie et de Chimie des Protéines UMR 5086 CNRS/Université Lyon Pr. Gilbert DELEAGE Dr. Christophe COMBET Résidus D333 et D335 situés sous la boucle Résidu D372 situé sur la face externe de la serpine 7

9 Mode d action d des serpines Protéase cible Serpine 1) Fixation de la protéase au niveau du site actif de la serpine 2) Clivage du par la protéase et formation d'une laison covalente et irreversible 3) Insertion du lié dans un feuillet β et basculement de la protéase Inactivation stable de la protéase 8

10 Rôle(s) des Aspartates 328 HGAALDVDEE GTEGAAATGI GIERTFLRII VRVNRPFLIA VVLKDTQSII 377 Par modélisation Résidus D333 et D335 situés sous la boucle 1) Accessibilité pour la Caspase 3 Cibles possibles de la Caspase 3 2) Acides aminés «non cibles» Implication dans la conformation du D333A Pas d inhibition D335A Pas d inhibition Analyse du peptide libéré par spectrométrie de masse Résidu D372 sur la face externe de la serpine Implication dans la dimérisation 9

11 Construction par mutagénèse dirigée de bovserpina3-3 D372E Purification sur résine de nickel Implication de D372 dans la dimérisation Gel SDS-PAGE 12 % Piste 1 : marqueur de taille Piste 2 : bovserpina3-3 référente Piste 3 : bovserpina3-3 D372E Piste 4 : bovserpina3-3 D372A Dépôt de 1 µg dans chaque piste Implication de la charge mais pas uniquement Longueur de la chaîne? % Dimérisation > Piste Construction d un mutant D372N 10