Laurie Casalot. Bacteria Archaea

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1 Analyses des populations bactériennes à l aide des techniques moléculaires Bacteria Archaea Laurie Casalot Institut Méditerranéen d Océanologie (MIO) Laboratoire de Microbiologie Environnementale et Biotechnologie Institut de Recherche pour le Développement-IRD

2 Introduction Techniques permettant d identifier des microorganismes isolés ou des populations Applicables dans tous les domaines : Santé, agro-alimentaire et environnement Avantages et inconvénients de ces approches

3 Introduction Morphologie ne permet pas identification Etudes de microbiologie classiques Isolement et mise en culture Dans l environnement, jusqu à 99% des bactéries sont dites non-cultivables Méthodes d écologie moléculaire permettent d étudier la population bactérienne sans mise en culture - Nécessité de marqueurs

4 Marqueur moléculaire : Gène codant pour l ARNr 5S Gène présent chez tous les procaryotes Information ne permettant pas une identification au niveau de l espèce

5 Marqueur moléculaire : Gène codant pour l ARNr 16S Gène conservé au cours de l évolution et présent chez tous les procaryotes Taux de sélection des mutations variable en fonction des régions: Régions conservées : amorces universelles Régions variables : amorces spécifiques

6 Marqueur moléculaire : Gène codant pour l ARNr 16S

7 Pb de validité transfert horizontal? Marqueur moléculaire : Gène codant pour l ARNr 16S Gène présent chez tous les procaryotes Taux de mutation variable en fonction des régions: Régions conservées : amorces universelles Régions variables : amorces spécifiques Plus de séquences disponibles dans les banques de données (Genbank, EMBL) Pb au niveau du nombre de copies : paramètre non constant

8 Marqueur moléculaire : Gènes de fonction Possibilité d étudier des populations plus spécifiques Plusieurs gènes déjà étudiés par ces méthodes Sulfite réductase Nitrate réductase Hydrogénases

9 Méthodes d écologie moléculaire Sample Représentativité de l échantillon

10 Direct extraction Extraction Méthodes d écologie moléculaire Sample Cell enrichment Extracted NucleicAcids ADN ou ARN? A-t-on tout extrait?

11 Pulse Field Gel Electrophoresis (PFGE) ou Champ Pulsé ADN Génomique digéré par une enzyme de restriction Reconnaissance de sites de coupure rares Nécessité de travailler sur ADN intact Taille et nombre de fragments caractéristiques

12 Comparaison des pulsotypes de souches de L. monocytogenes Image obtenue après électrophorèse et coloration. Avantages de la PFGE : Fort pouvoir discriminant même entre souches génétiquement proches Technique très utilisée pour le typage des souches d origine clinique Inconvénients de la PFGE : Délai d analyse important (5 jours/12 souches) Nécessité de personnel très compétent Manque de souplesse et de rapidité d intervention

13 Ribotypage ADN génomique digéré par une enzyme de restriction Electrophorèse, transfert et hybridation Sonde : gènes codant pour l opéron ribosomique Nombre et taille des fragments caractéristiques CODE BARRE caractéristique d une souche donnée Base de données

14 Ribotypage Riboprinter : le ribotypage automatisé Automate à haute cadence 32 ribotypes / jour Reproductibilité parfaite Intégration immédiate dans la base de données de tout nouveau ribotype Fonctionnement possible en réseau avec d autres utilisateurs Applications et avantages du Riboprinter Etudes d environnement (archivages du répertoire génétique des souches peuplant un site donné) Evaluation du risque (comparaison de souches isolées à des souches présentant un danger pour la Santé Publique) Contrôle qualité (suivi de souches de référence) Enquête (comparaison de souches isolées d un environnement donné avec souches isolées de malade)

15 Amplification Direct extraction Extraction Méthodes de diagnostic moléculaire Sample Cell enrichment Extracted NucleicAcids A-t-on tout amplifié? Inhibition PCR DNA Amplificates PCR RT c DNA Pb amorces universelles

16 PCR en temps réel Techniques de PCR Quantification de l ADN ou de l ARN Fluorescence proportionnelle à la quantité d ADN présent

17 PCR classique vs PCR en temps réel

18 PCR en temps réel ou PCR quantitative C T : threshold cycle, nombre de cycle à partir duquel la fluorescence associée à un produit PCR devient détectable

19 C T- value CT cycle treshold Le C T est le nombre de cycles nécessaires pour que la fluorescence atteigne un certain seuil Il existe une relation linéaire entre la valeur du Ct et le log du nombe de copies C T

20 Real-time PCR (SYBR Green 1 Dye) Non spécifique, intégration toutes les 25 pb environ dans le petit sillon de l ADN, nécessité d intégrer une courbe de fusion pour confirmer l absence de primers-dimers

21 Courbes de fusion (SYBR Green)

22 Real-time PCR (TaqMan ) Pas d extension possible de la sonde en 3 (dideoxynucléotides)

23 Real-time PCR (TaqMan ) Activité 5 nucléase de l ADN polymérase

24 Comparaison des efficacités de détection entre SYBR Green et TaqMan SYBR Green TaqMan Seuil détection Seuil détection

25 Sondes de type Molecular Beacon Zone complémentaire de l ADN à quantifier Structure en épingle à cheveux Fluorochrome/ Quencher

26 TaqMan vs Molecular Beacon

27 Fluorochromes utilisables en PCR quantitative Dans le cadre de l utilisation de plusieurs fluorochromes, il vaut mieux prendre des fluorochromes avec les l les plus éloignées pour éviter les recouvrements FAM est le fluorochrome qui émet le plus de lumière En duplex, il vaut mieux mettre le fluorochrome qui «crache» le plus sur la cible la moins représentée

28 Choix du Quencher

29 PCR en temps réel NASBA Techniques de PCR Quantification de l ADN ou de l ARN Fluorescence proportionnelle à la quantité d ADN présent Nucleic Acid Sequence Based Amplification

30 NASBA (nucleic acid sequence-based amplification) Amplification à partir de l ARN Pas de faux positifs à cause la contamination par de l ADN. Processus isotherme (généralement à 41 C) Utilisation pour la première fois pour la détection du HIV 1. Le premier primer s attache à l extrémité 3 de l ARN 2. La reverse transcriptase synthétise le brin d ADN complémentaire 3. La RNAseH détruit le brin ARN (RNAse H détruit l ARN dans les hybrides ARN-ADN, mais pas les ARN simple brin) 4. Le deuxième primer se fixe sur l extrémité 5 du brin ADN. 5. L AMV-RT (activité polymerase ADN dépendante) génère un ADN double brin avec un promoteur T7 fonctionnel. 6. Ce promoteur est reconnu par la T7 polymérase qui génère entre 10 et 1000 copies d ARN anti sens, simple brin correspondant à l ARN initial ciblé. 7. Ces ARN anti sens transcrits servent alors de matrice pour l amplification. Les amorces s hybridant dans l ordre inverse

31 PCR en temps réel NASBA PCR multiplex Techniques de PCR Quantification de l ADN ou de l ARN Fluorescence proportionnelle à la quantité d ADN présent Nucleic Acid Sequence Based Amplification Amplification différentielle en utilisant plusieurs paires d amorces

32 PCR multiplex ADN Amplicons Identification A B C D E F

33 PCR multiplex : détection d OGM Forte et al, 2005 Caractéristique du Maïs (Témoin positif) terminator promoter Séquences transgéniques présentent dans 95% des OGM commercialisées % OGM présent

34 PCR en temps réel NASBA PCR multiplex RAPD PCR Techniques de PCR Quantification de l ADN ou de l ARN Fluorescence proportionnelle à la quantité d ADN présent Nucleic Acid Sequence Based Amplification Amplification différentielle en utilisant diverses paires d amorces Random Amplification of Polymorphic DNA PCR

35 Principe de la RAPD PCR Amplification de fragments d ADN pris au hasard dans la séquence en utilisant des petites amorces (10pb) Amorces capables d amplifier simultanément entre 3 et 10 séquences génomiques différentes Séquences amplifiées (0,5-5 kb) séparées par électrophorèse Polymorphisme interprété par la présence ou l absence de bandes de taille particulière

36 Exemple de RAPD PCR ADN de diverses souches naturelles de l'escargot, Biomphalaria glabrata, qui sont soit résistantes, soit sensibles au ver parasite Schistosoma mansoni (ver trématode qui infecte aussi l'homme) Mise en évidence de la sensibilité Résistants Sensibles La flèche montre une différence liée à la sensibilité/ resistance. Spada et al 2002

37 Amplification Cloning Direct extraction Extraction Méthodes de diagnostic moléculaire Sample Cell enrichment Extracted NucleicAcids Shotgun Cloning: Métagénomique PCR DNA Amplificates PCR RT c DNA

38 Métagénomique Bactéries de biotopes divers Bactérie hôte E.coli Bactéries résistantes Stress (conditions létales) 1 Extraction d ADN Digestion enzymatique 5 Fragments de taille variable 3 Transformation Banque métagénomique 4 4 Séquençage de l insert : recherche de gènes d identification 5 2 Clonage Hybridation (recherche de gènes spécifiques) Vecteur à large spectre d hôte Bactéries positives

39 Clone selection Sequencing Amplification Cloning Direct extraction Extraction Méthodes de diagnostic moléculaire Sample Cell enrichment Extracted NucleicAcids Shotgun Cloning: Métagénomique PCR DNA Amplificates PCR RT c DNA DNA clones Clone analyses Sequencing

40 Méthodes de diagnostic moléculaire Techniques d analyse des clones ARDRA Amplified Ribosomic DNA Restriction Analysis Comparaison des profils de restriction des clones en utilisant diverses enzymes de restriction

41 Exemple d ARDRA (Luo Guan et al, AEM 2003) HaeIII MseI

42 Méthodes de diagnostic moléculaire Techniques d analyse des clones ARDRA T-RFLP Amplified Ribosomic DNA Restriction Analysis Comparaison des profils de restriction des clones en utilisant diverses enzymes de restriction Terminal Restriction Length Polymorphism Comparaison de la taille du fragment terminal après analyse de restriction et marquage de l extrémité

43 Méthodes de diagnostic moléculaire Techniques d analyse des clones ARDRA T-RFLP DGGE Amplified Ribosomic DNA Restriction Analysis Comparaison des profils de restriction des clones en utilisant diverses enzymes de restriction Terminal Restriction Length Polymorphism Comparaison de la taille du fragment terminal après analyse de restriction et marquage de l extrémité Denaturing Gradient Gel Electrophoresis Séparation de fragment de même taille en fonction de leur comportement de dénaturation

44 Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE)

45 Exemple de DGGE (Luo Guan et al, AEM 2003) Avantages de la DGGE : Détection de mutation ponctuelle Permets de comparer des profils complexes Identification des bandes relativement aisée Séquençage possible des fragments Inconvénients de la DGGE : Fragments trop petits Si trop complexe, difficilement interprétable

46 Méthodes de diagnostic moléculaire Techniques d analyse des clones ARDRA T-RFLP DGGE Amplified Ribosomic DNA Restriction Analysis Comparaison des profils de restriction des clones en utilisant diverses enzymes de restriction Terminal Restriction Length Polymorphism Comparaison de la taille du fragment terminal après analyse de restriction et marquage de l extrémité Denaturing Gradient Gel Electrophoresis Séparation de fragment de même taille en fonction de leur comportement de dénaturation SSCP Single Strand Conformation Polymorphism Séparation de fragments simple brin en fonction de leur conformation bidimensionnelle

47 Single Strand Conformation Polymorphism (SSCP)

48 Exemple de SSCP Gasser et al Nature Protocols (2007) ITS-1 de Malassezia spp. (Basidiomycète). Avantages de la SSCP : Détection de mutation ponctuelle Permets de comparer des profils complexes Identification des bandes relativement aisée Séquençage possible des fragments Inconvénients de la SSCP : Fragments encore plus petits Si trop complexe, difficilement interprétable

49 Exemple de SSCP Godon (2006) Analyse des Phytophthoras (champignons destructeurs de plante; exple: Mildiou ) Prélèvement de sol Avantages de la SSCP : Détection de mutation ponctuelle Inconvénients de la SSCP : Difficile de comparer des profils si plus de 5-10 clones Identification difficile des bandes Pas de séquençage direct

50 Clone selection Sequencing Amplification Cloning Direct extraction Extraction Méthodes de diagnostic moléculaire Sample Cell enrichment Extracted NucleicAcids Shotgun Cloning: Métagénomique PCR DNA Amplificates PCR RT c DNA DNA clones Clone analyses Sequencing

51 Sequencing Comparative analysis Amplification Cloning Direct extraction Extraction Méthodes de diagnostic moléculaire Sample Cell enrichment Extracted NucleicAcids Shotgun Cloning: Métagénomique PCR DNA Amplificates PCR RT c DNA DNA clones Clone analyses Sequencing rdna sequences Comparative analysis rdna database Phylogenetic tree

52 Blast Analyses des séquences obtenues Banque de séquences (NCBI) (National Center for Biology Information) Comparaison des séquences d intérêt avec toutes les autres séquences connues Recherche du plus proche voisin

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57 Blast Analyses des séquences obtenues Banque de séquences (NCBI) (National Center for Biology Information) Comparaison des séquences d intérêt avec toutes les autres séquences connues Recherche du plus proche voisin + de 3% de différence Nouvelle séquence

58 Blast Analyses des séquences obtenues Banque de séquences (NCBI) (National Center for Biology Information) Comparaison des séquences d intérêt avec toutes les autres séquences connues Recherche du plus proche voisin + de 3% de différence Nouvelle séquence Bellerophon Détection des séquences chimériques

59 Bellerophon : Recherche des séquences chimériques

60 Blast Analyses des séquences obtenues Banque de séquences (NCBI) (National Center for Biology Information) Comparaison des séquences d intérêt avec toutes les autres séquences connues Recherche du plus proche voisin + de 3% de différence Nouvelle séquence Bellerophon Détection des séquences chimériques RDP Ribosomal Database Project Recherche des Séquences homologues

61 RDP 10

62 RDP 10 : sequence match

63 RDP 9 (Sequence match)

64 RDP 9 (Sequence match)

65 Blast Analyses des séquences obtenues Banque de séquences (NCBI) (National Center for Biology Information) Comparaison des séquences d intérêt avec toutes les autres séquences connues Recherche du plus proche voisin + de 3% de différence Nouvelle séquence Bellerophon Détection des séquences chimériques RDP Muscle Ribosomal Database Project Recherche des Séquences homologues Multiple Alignment Sequence Alignement des séquences homologues

66 MUSCLE : Multiple Alignment Sequence

67 MUSCLE : Multiple Alignment Sequence

68 Blast Analyses des séquences obtenues Banque de séquences (NCBI) (National Center for Biology Information) Comparaison des séquences d intérêt avec toutes les autres séquences connues Recherche du plus proche voisin + de 3% de différence Nouvelle séquence Bellerophon Détection des séquences chimériques RDP Muscle BioEdit Ribosomal Database Project Recherche des Séquences homologues Multiple Alignment Sequence Alignement des séquences homologues Sequence editor Comparaison de toutes les séquences Vérification manuelle des séquences et des alignements Délétion des ambiguïtés

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71 Construction d arbres phylogénétiques Méthodes basées sur les mesures de distances entre séquences prises 2 à 2, identifiant le nombre de substitutions de nucléotides ou d acides aminés entre ces 2 séquences Méthodes rapides donnant de bons résultats pour des séquences ayant de fortes similarités Neighbor-Joining

72 Construction d arbres phylogénétiques Méthodes basées sur les caractères qui s intéressent au nombre de mutations (substitutions/délétions/insertions) qui affectent chacune des positions de la séquence Méthodes lentes mais précises Méthodes tenant compte de l importance de la position et donc de l effet réel du changement au niveau évolutif. Parcimonie Maximum de vraisemblance (ML)

73 Comparaison des différentes méthodes Méthodes Séquences Avantages Inconvénients Sites traités de manière équivalente Distances Très proches Rapides Faciles à mettre en oeuvre Perte d information Non applicable à des séquences éloignées Lente Parcimonie Relativement éloignées Evaluation de différents arbres Inutilisable pour un grand nombre de séquences Pas d information sur la longueur des branches ML Eloignées Robuste Estimation de la longueur des branches Différences entre transition et transversion Lente Inutilisable pour un grand nombre de séquences

74 Arbres phylogénétiques Deux formats différents d arbres phylogénétiques sont utilisés pour mettre en évidence les relations inter-espèces

75 Finitions pour la construction d un arbre phylogénétique Analyse de la topologie finale de l arbre en déterminant un indice de confiance (bootstrap)

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77 Finitions pour la construction d un arbre phylogénétique Analyse de la topologie finale de l arbre en déterminant un indice de confiance (bootstrap) L arbre consensus majoritaire quantifie de manière statistique les regroupements : - un nœud retrouvé dans 100% des arbres sera dit robuste - un nœud retouvé dans seulement 50% des arbres sera moins robuste Il n existe pas de seuil ni de consensus universel (95%, 90%, 75% ), on se contente de donner les nombres et d interpréter!

78 Finitions pour la construction d un arbre phylogénétique Analyse de la topologie finale de l arbre en déterminant un indice de confiance (bootstrap) Mise en place de la racine de l arbre

79 Arbres enracinés vs arbres sans racine Représentation des relations possibles entre 3 espèces A,B et C (A) Arbre sans racine représenté sous les deux formes possibles (B) 3 arbres possibles avec racine

80 Exemple d arbre phylogénétique 2% T B Desulfovibrio pangongensis strain PWC (T)(AM418397) 100 Desulfovibrio acrylicus (U32578) 100 Desulfovibrio vietnamensis G3100 (T) (X93994) 100 Desulfovibrio alaskensis strain JAc (DQ517282) 65 Desulfovibrio gabonensis (U31080) 58 Desulfovibrio profundus DSM (AF418172) Desulfovibrio capillatus strain Met 2 (AY176773) Desulfovibrio longus DSM 6739 (AY359867) 100 Desulfovibrio intestinalis strain KMS2 (Y12254) 98 Desulfovibrio desulfuricans ATCC (AF192154) 100 Desulfovibrio vulgaris DSM 644 (AB294142) 100 Desulfovibrio longreachii (Z24450) Desulfovibrio oryzae (AF273083) Desulfonatronum lacustre DSM 10312T (AF418171)

81 Probe design and synthesis Sequencing Comparative analysis Amplification Cloning Direct extraction Extraction Méthodes de diagnostic moléculaire Sample Cell enrichment Extracted NucleicAcids Shotgun Cloning: Métagénomique PCR DNA Amplificates PCR RT c DNA Nucleic Acid Probe DNA clones Clone analyses Sequencing rdna sequences Comparative analysis rdna database Phylogenetic tree

82 Probe design and synthesis Hybridization Sequencing Comparative analysis Amplification Cloning Direct extraction Extraction Méthodes de diagnostic moléculaire Sample Dot Blot / southern Microarrays Nucleic Acid Probe Dot Blot / colony Cell enrichment Extracted NucleicAcids Shotgun Cloning: Métagénomique PCR DNA Amplificates PCR DNA clones Clone analyses Sequencing rdna sequences Comparative analysis RT c DNA Amman et al., 1995 rdna database Phylogenetic tree

83 Principe des Microarrays

84 Utilisation des microarrays en écologie moléculaire Analyse quantitative de la population par la mesure de l intensité de la réponse Analyse de la plasticité du génome d un organisme donné (hybridation ADN/ADN) Analyse de la population et de son évolution au travers de sondes caractéristiques des différents genres

85 Sequencing Comparative analysis Amplification Cloning Direct extraction Extraction Méthodes de diagnostic moléculaire In Situ Hybridization (FISH) Sample Probe design and synthesis Hybridization Whole Cell Hybridization Quantitative Dot Blot Dot Blot / southern Microarrays Nucleic Acid Probe Dot Blot / colony Cell enrichment Extracted NucleicAcids Shotgun cloning PCR DNA Amplificates PCR DNA clones Clone analyses Sequencing rdna sequences Comparative analysis RT c DNA Amman et al., 1995 rdna database Phylogenetic tree

86 In situ hybridization (FISH) Utilisations : Ecophysiologie de microorganismes d intérêt pour lesquels une sonde est disponible Recherche et quantification de microorganismes ayant une activité intéressante à l aide de substrats radioactifs

87 Détection différentielle de bactéries lactiques dans le lait à l aide de sondes rrna fluorescentes Lactococcus lactis Leuconostoc citreus Contamination d une culture de Leuconostoc par Lactococcus Streptococcus thermophilus (rhodamine labelled) Lactobacillus delbrueckii (fluoresceine labelled) Lactobacillus helveticus (fluoresceine labelled) Lactobacillus delbrueckii (rhodamine labelled) Limitations : Pas plus de 7 microorganismes différents détectables dans une expérience Tous les environnements ne sont pas adaptés à ce type d étude

88 CARD-FISH Catalyzed reporter deposition fluorescent in situ hybridization Bactéries recherchées possédant des ribosomes. Séquence connue : possibilité de dessiner une sonde spécifique Sonde couplée à la HRP (Horseradish peroxydase); Hybridation spécifique avec les ribosomes d intérêt En présence de péroxyde d hydrogène, la péroxydase catalyse le dépôt de plusieurs molécules de tyramide couplées au fluorochrome FITC Amplification du signal : détection de bactéries présentes en faible quantité

89 Merci pour votre attention