Croissance bactérienne et expression des protéines

Transcription

1 Croissance bactérienne et expression des protéines Stéphane Delbecq Laboratoire de Biologie Cellulaire et Moléculaire EA 4558 «vaccination antiparasitaire» Faculté de Pharmacie

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4 Caractéristique d un vecteur d expression (E. coli)

5 Inhibiteur de T7RNA pol

6 Caractéristique d un vecteur d expression (E. coli) Clonage en phase avec la protéine de fusion (ex.: GST) ou le tag (ex.: His6) Choix des sites de restriction et des amorces (PCR)

7 Devenir des protéines synthétisées chez E. coli

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9 vitesse de traduction > vitesse de repliement Interactions entre segments hydrophobes de polypeptides en cours de synthèse (non repliés)

10 Croissance bactérienne sur milieu solide Manipulation des bactéries (transformation ) Adaptation au milieu Archivage à court terme (qqes semaines à +4 C) Ex de culture sur milieu solide à but d identification des bactéries (lecture automatisable)

11 Croissance bactérienne en milieu liquide Ex de culture en milieu liquide à but diagnostique (hémoculture) Petit volume (1-10 ml): - test de croissance - archivage long terme (cryostabilat) - test d expression de protéine Lecture automatisable

12 Croissance bactérienne en milieu liquide: production de biomasse ml 0.5 l - x m3

13 1: phase de latence 2: phase de croissance exponentielle 3: phase de ralentissement 4: phase stationnaire 5: phase de déclin

14 Loi de Monod «Approximation» de la croissance bactérienne

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16 Taux de croissance et conditions environnementales: Exemple de la température

17 Croissance en diauxie et milieux «autoinductibles»

18 Quelques autres systèmes d expression

19 Quelques autres systèmes d expression

20 Localisation cellulaire (membrane, compartiments..) tissulaire (type cellulaire) temporelle (profil d expression) Protéine Structure taille structure 3D modifications post-traductionnelles Fonction activité enzymatique interactions protéiques Ligands-récepteurs

21 Différentes stratégies d étude Séquence du gène est connue: Protéine recombinante Identification de domaines Analyse bioinformatique Analyse in vivo Étude structurale Étude fonctionelle Anticorps (monoclonaux)

22 Séquence du gène est inconnue, protéine pure Biologie moléculaire (criblage par Ac, clonage) Identification directe du profil de digestion Séquençage Nterminal Protéolyse (trypsine) HPLC Séquençage des peptides par spectrométrie de masse Séquençage Nterminal des peptides Obtention de la séquence du gène

23 Séquence du gène est inconnue, mélange complexe de protéines Caractérisation du mélange: MS, 2D Obtention d un moyen de détection spécifique de la protéine: anticorps, activité enzymatique, affinité pour un ligand Purification de la protéine d intérêt (critères??) protéine pure Études sur la protéine native étude in vivo

24 Séquence du gène est inconnue, criblage de banques Utilisation d anticorps spécifique Recherche d une fonction particulière: ex: affinité pour un ligand Criblage de banque d expression (cdna) Utilisation de banques d expression «fonctionnelle»: ex: double hybride, sélection type phage display Séquence ADN Séquence ADN

25 Critères de choix de la méthode : Méthodes informatiques : besoin de la séquence + homologies Méthodes biologiques: - transfection: cellule génétiquement manipulable - banques «fonctionnelles» : expression soluble, modifications post-trad., - expériences types complémentation: expression soluble, lien avec un phénotype Méthodes biochimiques: protéine naturelle ou recombinante - électrophorèses, immunodétection (Western blot, ELISA,IP, IFA) - chromatographies (gel filtration, échangeuse d ions, affinité ) Méthodes physiques: - spectrométrie de masse : protéine naturelle ou recombinante - structure : RX, RMN protéine recombinante soluble - spectroscopies (CD, fluorescence, IR ) protéine recombinante soluble

26 Analyse de séquence 1ère étape: identifier la phase de lecture ouverte et la séquence protéique déduite (intron etc) Analyses «physico-chimiques»: profil d hydrophobicité, recherche de séquences répétées, prédiction de structures secondaires et signaux d adressage, prédiction de linker Homologies: - sites de modification post-trad. (glycosylation, phosphorylation, acylation, GPI ) - motifs et signatures (sites actifs, interactions ) - recherche d homologies de séquences : BLAST, PSI-BLAST - recherche d homologies de structures Modélisation: - prédiction de la structure 3D à partir de celle d un homologue (modèle) - recherche de ligand spécifique (docking) Rem: annotation des génomes fonctionne essentiellement par homologies!

27 Méthodes informatiques: traduction M A S S L R Q I L D S Q K M E W R S ATG GCT TCT TCT CTG CGT CAA ATT CTG GAT TCT CAA AAA ATG GAA TGG CGT TCT N A G G S M S D K I I H L T D D S F AAC GCT GGT GGT TCT ATG AGC GAT AAA ATT ATT CAC CTG ACT GAC GAC AGT TTT D T D V L K A D G A I L V D F W A E GAC ACG GAT GTA CTC AAA GCG GAC GGG GCG ATC CTC GTC GAT TTC TGG GCA GAG W C G P C K M I A P I L D E I A D E TGG TGC GGT CCG TGC AAA ATG ATC GCC CCG ATT CTG GAT GAA ATC GCT GAC GAA Y Q G K L T V A K L N I D Q N P G T TAT CAG GGC AAA CTG ACC GTT GCA AAA CTG AAC ATC GAT CAA AAC CCT GGC ACT A P K Y G I R G I P T L L L F K N G GCG CCG AAA TAT GGC ATC CGT GGT ATC CCG ACT CTG CTG CTG TTC AAA AAC GGT E V A A T K V G A L S K G Q L K E F GAA GTG GCG GCA ACC AAA GTG GGT GCA CTG TCT AAA GGT CAG TTG AAA GAG TTC L D A N L A * CTC GAC GCT AAC CTG GCC TAG 132 Exemple: séquence protéique déduite de la séquence du gène de la thioredoxine A (E. coli) Séquence protéique déduite dépend du code génétique appliqué lors de la traduction informatique (Archea, mitochondrie )

28 Index d hydrophobicité Méthodes informatiques: prédictions-homologies N résidus Profil d hydrophobicité : segments transmembranaires, peptides signaux

29 Prediction de région non-structurée

30 Méthodes informatiques: prédictions-homologies Homologies de séquence: - site actif - fonction (type de protéine) - modélisation

31 électrophorèse Migration de molécules chargées en solution et soumises à un champ électrique Résidus acides Résidus basiques

32 électrophorèse Ratio SDS-protéine constant : charge proportionnelle à la masse

33 électrophorèse

34 électrophorèse kda

35 Électrophorèse 2D IEF: IsoElectroFocalisation Protéines (bandes) au niveau du pi

36 Électrophorèse 2D

37 DiGE: difference gel electrophoresis

38 Western blot overlay blot Papier Gel Membrane Papier Immunodétection avec un produit coloré précipitant (ou chimioluminescence) Transfert

39 Western blot Coloration au Bleu de Coomassie 60 kda 50 kda 40 kda 30 kda 25 kda 20 kda 15 kda 37 kda Western blot

40 Immunoprécipitation Marquage métabolique en culture in vitro : un précurseur radioactif est ajouté au milieu, ce précurseur est ensuite incorporé dans le métabolisme Selon le précurseur : méthionine, glucosamine, éthanolamine, palmitate, phosphate, sulfate attention au métabolisme des informations peuvent être obtenues: - ancrage lipidique - ancrage GPI - glycosylation - phosphorylation Selon le temps : expérience de pulse-chase: suivi de la maturation d une protéine Selon les inhibiteurs : ajout d inhibiteurs (de glycosylation, de sécrétion, de protéolyse )

41 Gel filtration Vi : volume interne Vg : volume du gel V0 : volume mort Vs : volume de la phase stationnaire

42 Gel filtration Polymère Volume d élution dépend de la taille, forme, oligomérisation

43 Dichroïsme circulaire

44 Dichroïsme circulaire

45 Séquençage dégradation d Edman PITC : phenyl iso thio cyanate dérivé spécifique pour chaque aa

46 Séquençage spectrométrie de masse

47 Protéolyse ménagée

48 Protéolyse ménagée Détermination des domaines détermination des sites de liaison (protéolyse +/- ligand)

49 SAXS small angle X-ray scattering Forme globale de la molécule en solution pas de marquage nécessaire

50 Analyse des domaines : - séquence - protéolyse ménagée Masse de la protéine : - SDS-PAGE - spectrométrie de masse Forme, repliement et oligomérisation : - gel filtration - dichroïsme circulaire - SAXS (small angle X-ray scattering) Schéma des ponts disulfures : - SDS-PAGE +/- réducteur - spectrométrie de masse - protéolyse ménagée Maturation de la protéine : - SDS-PAGE - spectrométrie de masse - immunoprécipitation Recherche d interactions : - co-immunoprécipitation - double hybride - phage display - systèmes in vitro

51 Recherche des partenaires d interaction banque expression Protéine - information génétique Protéine - information génétique Protéine - information génétique Protéine - information génétique Protéine - information génétique Sélection de la protéine (ligand, activité ) Protéine - information génétique Amplification séquençage Séquence ADN

52 Différentes méthodes d identification

53 Double hybride et dérivés Triple hybride ex: interaction avec un ARN Interaction avec ligand: liaison covalente entre L1 et L2 Environnement cytoplasmique: pas de glycosylation du partenaire connu, milieu réducteur diversité limitée par l étape in vivo

54 Phage display et dérivés Séquence protéique fusionnée à piii Sélection par liaison : anticorps ligand (héparane ) protéine cellule

55 Phage display et dérivés Phage sauvage Phage non infectieux Phage sélectivement infectieux Protéine connue fusionnée à la protéine du phage Production en système procaryote: interférence avec la voie de sécrétion (phage M13) production cytoplasmique (phage T7) pas de modifications type eucaryote efficacité d encapsidation et de transformation (diversité)

56 Systèmes in vitro Ribosome display (eucaryote ou procaryote) mrna display Expression in vitro: pas de modifications post-traductionnelle (pas de microsomes) grande diversité (pas de transformation)

57 Avantages et inconvénients des différents systèmes Techniques d exposition de protéines: recherche de partenaires d interaction identification de site d interaction Résultats à confirmer par d autres techniques

58 Phage display + proteolyse : identification de domaine

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60 Séquence codante Mélange complexe Définition de domaine fractionnement Expression (optimisation ) Purification (> 10 mg) Caractérisation identification Outils spécifiques (Ac )