Développement de vecteurs lentiviraux régulables pour le transfert de gène dans le Système Nerveux Central
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- Clémence Latour
- il y a 8 ans
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1 Développement de vecteurs lentiviraux régulables pour le transfert de gène dans le Système Nerveux Central Lahouari AMAR LGN - UMR 7091 sous la direction du Docteur Jacques MALLET
2 Le transfert de gène dans le SNC Les vecteurs lentiviraux - caractéristiques - avantages et méthode de production - applications Résultats Développement d un seul vecteur lentiviral pour: 1) l expression régulée d un facteur protéique 2) l expression régulée de sharn Conclusion générale et perspectives
3 Transfert de gène dans le SNC In vivo Ex vivo Gène thérapeutique: protéine ou séquence nucléotidique (siarn) Cellules transduites
4 Spécificités du système nerveux central relatives au transfert de gène Présence de la barrière hématoencéphalique Limite le passage de molécules thérapeutiques» Nécessité du transfert de gène La majorité des cellules du SN sont quiescentes Possibilité d utilisation de vecteurs intégratifs ou épisomaux Vecteurs non viraux peu efficaces à long terme» préférentiellement viral Diversité cellulaire Nécessité d expression restreinte ou élargie du facteur thérapeutique Possibilité de ciblage d une structure ou noyau particulier dans le SN Transport rétrograde ou antérograde dans les neurones» avec un vecteur dont le tropisme est modulable. Vecteurs lentiviraux particulièrement adaptés
5 Avantages des vecteurs lentiviraux Transduction des cellules quiescentes et en division Expression stable et à long terme du transgène dans le SNC Faible toxicité Facilité de production à haut titre dénuée de RCR Pseudotypage aisé
6 Vecteurs lentiviraux : méthode de production tat Plasmide transcomplémentant P hcmv Ψ gag Pro pol rev pa Plasmide d enveloppe P hcmv VSV-G pa PPT Plasmide vecteur 5 LTR RRE cppt Pro TransgèneWPRE 3 LTR Ψ U3 Particules virales pseudotypées avec la protéine G du virus de la stomatite vésiculaire (VSV-G) VSV-G
7 Applications des vecteurs lentiviraux Thérapie génique Production d animaux transgéniques (modèles de maladies ) Etude de fonction de gènes (surexpression ou inhibition par siarn)
8 Nécessité d un système régulable Etudes cliniques Moduler l expression du facteur thérapeutique Arrêt du traitement en cas de complication grave Etudes fondamentales Contrôle temporel du transgène Contrôle du niveau d expression
9 Le système de régulation inductible par la Tetracycline (Tet-on) PGK rtetr VP16 rtetr VP16 rtta + Tet Tet Tet Tet VP16 rtetr 7TetO CMVmin Transgène 7TetO CMVmin Transgène
10 1. Développement d un seul vecteur lentiviral pour l expression régulée d une protéine thérapeutique
11 Nécessité d un vecteur unique Réduction de la quantité de vecteur administrée: Réduction du risque de mutagenèse insertionnelle Réduction du risque d immunogénicité lié au vecteur Permettre l expression du transgène et du transactivateur dans la même cellule
12 Un vecteur lentiviral unique pour l expression régulée d un transgène PPT 5 LTR BGH polya rtta2-m2 P PGK Stuffer cppt Ins P cmv min Transgène WPRE 3 LTR Ψ U3 - Luciférase - Tyrosine hydroxylase
13 Expression régulée de la luciférase in vitro Transduction d une culture primaire d astrocytes + Dox -Dox
14 Effet de la doxycycline sur l activité luciférase Cinétique d induction in vitro Réversibilité in vitro Dose optimale in vitro
15 Injection du vecteur lentiviral exprimant de façon régulée la luciférase dans le striatum de rat + Dox -Dox
16 Un vecteur lentiviral exprimant de façon régulée la tyrosine hydroxylase Evaluation in vitro + Dox - Dox
17 Un vecteur lentiviral exprimant de façon régulée la tyrosine hydroxylase Evaluation in vivo + Dox - Dox Contrôle non injecté
18 Résumé Construction d un seul vecteur lentiviral portant un système de régulation Tet-on Validation in vitro et in vivo Niveau d induction fort Fuite non détectable en absence d inducteur Dose d inducteur élevée in vivo
19 Applications, limites et voies d amélioration Application de ce vecteur Tet-on Utilisation in vitro Utilisation chez l animal» Exemple : stratégie de neuroprotection» Limites dans une stratégie de remplacement? Utilisation en clinique exclue Nombre faible de cellules exprimant le transgène in vivo après induction Quantité de vecteur utilisée sous optimale Défaut de retrotranscription d un génome vecteur long Co-expression du transactivateur et du transgène Un vecteur versus deux vecteurs?
20 2. Développement d un seul vecteur lentiviral permettant l expression régulée de sharn
21 L ARN interférence
22 Expression des siarn
23 Un promoteur d ARN Polymérase III Le promoteur U6 L expression des sharn nécessite l utilisation d un promoteur d ARN polymérase III - Débute la transcription à un nucléotide défini (G) - Arrêt de la transcription par 5 thymidines Pol III Site de démarrage de la transcription STAF1 Oct SNAPc -29 TBP ESD ESP TATA sharn TTTTT G core
24 Stratégie négative : encombrement stérique inductible d un promoteur polymérase III Sans inducteur : inhibition de la synthèse des siarn ESD ESP TATA sharn Protéine SNAPc TBP Pol III Avec inducteur : synthèse des siarn Pol III SNAPc TBP ESD ESP TATA sharn inducteur
25 Encombrement stérique inductible du promoteur U6 par le système tétracycline Sans Doxycycline : inhibition de la synthèse des siarn ESD ESP Tet0 TATA sharn répresseur Tet SNAPc TBP Pol III Avec Doxycycline : synthèse des siarn SNAPc Pol III TBP doxycycline ESD ESP TetO TATA sharn
26 Un promoteur U6 régulable : Stratégie négative ESD ESP TATA ESD ESP TATA TetO ESD ESP TetO TATA ESD ESP TetO TATA TetO ESD TetO ESP TetO TATA TetO ESD TetO TetO ESP TetO TATA TetO ESD TetO TetO TetO ESP TetO TATA TetO
27 Inhibition de l expression de la GFP dans des cellules HEK 293T-GFP inhibition de la GFP par un vecteur lentiviral exprimant un sigfp régulable % de cellules GFP positives % de cellules GFP positives 120,00 100,00 80,00 60,00 40,00 20,00 0,00 293T-GFP LVsiGFP - Dox LVsiGFP+Dox
28 Stratégie positive : adaptation du système Tet-on à un promoteur d ARN polymérase III Utilisation d un transactivateur de l ARN polymerase III Utilisation d un promoteur polymérase III minimal inductible par la tétracycline
29 Développement d un transactivateur de promoteur polymérase III inductible par la doxycycline Un nouveau transactivateur rtta-oct2 rtta Q18III(Q A) VP16 Q18III(Q A) Q18III(Q A) Q18III(Q A) Domaine de liaison à l ADN du rtta2-m2 Domaine Domaine transactivateur transactivateur VP16 du virus HSV
30 Développement d un promoteur U6 minimal inductible par la doxycycline Un nouveau promoteur DSE ESP Boîte TATA 7 TetO
31 Un promoteur d ARN Polymérase III inductible par la doxycycline Oct-2 Dox rtta Pol III SNAPc TBP +1 ESP Boîte TATA sens boucle antisens TTTTT 7 TetO 19 pb 9 pb 19 pb sharn 5 UU sens antisens
32 Un vecteur lentiviral pour l expression régulée de sharn dirigé contre la GFP PPT 5 LTR cppt P U6 min shgfp P PGK rtta-oct2 WPRE 3 LTR Ψ U3 - dox Pas d expression de shgfp Synthèse de la GFP + dox Expression de shgfp Inhibition de la GFP
33 Une expression de shgfp régulée + Dox -Dox Northern Blot Transduction de cellules HEK293T-GFP avec différentes quantités de vecteur lentiviral exprimant de façon régulée un shgfp
34 Expression de shgfp en fonction de la concentration de doxycycline -Dox + Dox
35 Cinétique d expression du sharn -Dox + Dox + Dox -Dox
36 Application du système pour la régulation d un gène endogène : p53 HEK293T MCF-7 A549
37 Résumé Construction d un système de régulation qui permet une expression contrôlée par la doxycycline de sharn Validation du contrôle d un gène endogène Forte inductibilité Système réversible Forte concentration de doxycycline
38 Limites et perspectives Dose de doxycycline Validation in vivo Expression de sharn par promoteur pol III versus promoteur pol II
39 Conclusion générale Construction d un seul vecteur lentiviral pour l expression régulée par le système Tet-on d une protéine thérapeutique. Développement d un système de régulation de l expression de sharn inductible par la tétracycline et sa vectorisation. Problème de l immunogénicité du transactivateur pour utilisation clinique
40 Perspectives pour une utilisation clinique Se tourner vers un système de régulation d origine humaine ou «humanisé» pour la clinique Rapamycine ZFP synthétique Régulation Physiologique La régulation en cas de complication Alternatives :excision du vecteur ou suicide des cellules transduites
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