Table ronde technologique

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1 Table ronde technologique «QUANTIFICATION DES MITOCHONDRIES» 1) Marqueurs biochimiques Jean-François Dumas (Tours) 2) ADN mitochondrial Christophe Rocher (Bordeaux) 3) Imagerie Frédéric Joubert (Paris)

2 Comment quantifier les mitochondries?

3 nombre de mitochondries?? densité mitochondriale?? volume mitochondrial?? masse mitochondriale??

4 Table ronde technologique «QUANTIFICATION DES MITOCHONDRIES» 1) Marqueurs biochimiques Jean-François Dumas (Tours) 2) ADN mitochondrial Christophe Rocher (Bordeaux) 3) Imagerie Frédéric Joubert (Paris)

5 Table ronde technologique «QUANTIFICATION DES MITOCHONDRIES» 1) Marqueurs biochimiques Jean-François Dumas (Tours)

6 Citrate synthase (CS) : description matrice mitochondriale Enzyme du cycle de Krebs qui forme du citrate à partir de l oxaloacétate et de l acétyl-coa Matrice mitochondriale ADN nucléaire Régulation allostérique : inhibition par NADH et succinyl-coa

7 Citrate synthase (CS) : dosage par spectrophotométrie Principe de la réaction Réaction catalysée par la citrate synthase (CS) CS Acetyl-coA + oxaloacétate citrate + coa-sh + H + + H 2 O Réaction colorimétrique 2 coa-sh + 2 DTNB 2 TNB + coa-s-s-tnb = réaction colorée jaune 412 nm

8 Citrate synthase (CS) : dosage par spectrophotométrie Absorbance TNB (412 nm) + oxaloacétate sans oxaloacétate 2 min 5 min temps (min) activité non spécifique ( 35% activité totale dans foie) activité totale activité CS spécifique = activité totale activité non spécifique

9 Citrate synthase (CS) : conditions et paramètres de mesure Dosage en cuve ou sur microplaque Température dosage : C Homogénats de cellules, de tissus ou d organes détermination masse mitochondriale d un échantillon donné Préparation enrichies en mitochondries normalisation activité intrinsèque phosphorylation oxydative par unité fonctionnelle Rupture des membranes (plasmique et mitochondriales) pour un meilleur accès à l activité

10 Citrate synthase (CS) : conditions et paramètres de mesure Possibilité de conservation des échantillons avant dosage (azote puis -80 C) Quantité matériel nécessaire: 0,5-10 µg protéines (suspension mitochondriale) µg protéines (homogénats) cellules 100 dosages en microplaque : 200 euros

11 Citrate synthase (CS) : conditions et paramètres de mesure Kits de dosage commercialisés Sigma : Citrate Synthase Assay Kit 786 euros : 100 dosages en cuve 480 dosages en microplaque Abcam : Citrate Synthase Activity Assay Kit (ab119692) 510 euros : 96 dosages en microplaque Étape d immunocapture (3 heures) CliniSciences : Citrate Synthase Activity Colorimetric Assay Kit 350 euros : 100 dosages en microplaque Interchim : MitoCheck TM Citrate Synthase Activity Assay Kit?? euros : 96 dosages en microplaque

12 Citrate synthase (CS) : de nombreux exemples d utilisation diverses lignées cellulaires : HepG2, HeLa, MCF-7, HEK293, fibroblastes. divers tissus/organes : foie, cœur, cerveau, muscles diverses origines : humain, souris, rat diverses situations physiologiques/pathologiques : personne en «bonne santé», entraînement physique, cancer, obésité, insulinorésistance, vieillissement

13 Citrate synthase (CS) : une méthode quantitative ou semi-quantitative Exemple d activité CS sur homogénat cœur souris CS = 600 µmol/min/mg prot souris mdx, temp: 37 C CS = 0,018 µmol/min/mg prot Souris transgéniques, temp: 25 C CS = 50 µmol/min/mg prot Souris transgéniques, temp: 25 C Difficulté de comparer entre différents laboratoires et différentes études

14 Citrate synthase (CS) : conclusion Dosage simple (réalisation et matériel) Faible quantité de matériel (cellules, tissus, organes) nécessaire Bonne reproductibilité: faibles variations intra- et inter-dosages Pas très cher Pas toujours possible de comparer entre différentes études Toujours possibilité que activité intrinsèque soit modifiée

15 Cardiolipines (CL) : description dans cellules mammifères signature lipidique des mitochondries localisation majoritaire dans feuillet interne de membrane interne puis dans points de contact puis dans membrane externe 10 à 20% des phospholipides mitochondriaux totaux

16 Cardiolipines (CL) : un bon marqueur? marqueur non enzymatique mais constitutif mais liens très forts avec activités mitochondriales car implication dans : - activité et assemblage des complexes de la phosphorylation oxydative - dynamique mitochondriale - apoptose

17 Cardiolipines (CL) : un bon marqueur? oui quantité CL meilleur marqueur de la quantité de mitochondries (16 individus)

18 Cardiolipines (CL) : un bon marqueur? oui Diabetes, % +48% +56% corrélation entre densité mitochondriale et quantité CL (r = 0,67; p < 0,01) corrélation entre densité mitochondriale et activité CS (r = 0,61; p < 0,01) corrélation entre quantité CL et activité CS (r = 0,76; p < 0,001)

19 Cardiolipines (CL) : un bon marqueur? non Syndrome de Barth : maladie génétique (gène codant pour la Taffazine -TAZ-) Synthèse Remodelage Réticulum endoplasmique Membrane externe mitochondriale Acyl-CoA polyinsaturés ALCAT-1 CL mature Espace intermembranaire Membrane CDP-DAG + CLS interne CDP-DAGPGPS + G3P PGP PG mitochondriale PTPMT1 CL immature ipla2γ Matrice mitochondriale PC MLCL Acyl-CoA TAZ MLCLAT-1 Lyso-PC CL mature MLCL CL métabolisme des cardiolipines Pas de variation ou augmentation quantité mitochondries mais diminution quantité CL

20 Cardiolipines (CL) : un bon marqueur? non chimiorésistance MCF-7 MCF-7dox cellules cancéreuses mammaires IC 50 = 0,11 µm IC 50 = 7 µm doxorubicine x 60 résistance à la doxorubicine activité CS = densité mitochondriale (MET) = quantité CL Pas de variation quantité mitochondries mais diminution quantité CL

21 Cardiolipines (CL) : dosages 1) High Perfomance Thin Layer Chromatography (HPTLC)-densitométrie Rf=1 Front of the eluent CL PA PE Quantification avec standard Rf= PI PC+PS SM Deposit 2) High Performance Liquid Chromatography Quantification avec standard Détection seulement des principales CL Ritov et al, J Chromato B, 2006

22 Cardiolipines (CL) : dosages 3) Spectrométrie de masse Quantification avec standard Détection de toutes les espèces de CL (composition en AG des 4 ch. latérales) 4) Fluorescence sonde Nonyl Acridine Orange (NAO) (488/525 nm) Méthode semi-quantitative Problème de spécificité??

23 Cardiolipines (CL) : conclusion Bon marqueur??? Uniquement dans un nombre limité de situations Assez faible quantité de matériel nécessaire - cellules: millions - tissus, organes: qq mg Dosages complexes, pas réalisables dans tous les laboratoires Dosages chers (HPTLC-densitométrie = 3000 euros pour 100 dosages)

24 Autres techniques : les protéines mitochondriales «constitutives»? Intérêt = marqueur non enzymatique VDAC Rôle dans transport des métabolites et dans apoptose (libération protéines pro-apoptotiques et intéraction avec acteurs apoptose)

25 Autres techniques : les protéines mitochondriales? Utilisation de VDAC comme marqueur quantité mitochondries Journal of Physiology, 2015 Mais quantification par Western-Blotting

26 «quantification des mitochondries» : marqueurs biochimiques Que choisir? CS Autres techniques