Le Diagnostic Génétique
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- Timothée Marceau
- il y a 8 ans
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1 Le Diagnstic Génétique Outils et Applicatins Pascale Richard UF Cardigénétique et Mygénétique
2 Le cntexte du diagnstic mléculaire Les utils L étape clinique Définir un phéntype Examiner attentivement histire du patient Interrger sur ses antécédents Les examens paracliniques L électrmygramme (EMG) L imagerie musculaire (IRM) Le bilan cardirespiratire Les examens bilgiques La bipsie musculaire Cnstantes bilgiques L analyse mléculaire
3 Anmalies de l ADN cellule smatique u germinale Mutatins génmiques: anmalies du nmbre des chrmsmes Mutatins chrmsmiques: réarrangement chrmsmique Sur un même Chrmsme Mutatins géniques: mutatin d une u plusieurs bases Entre Chrmsmes différents Génétique Mléculaire Carytype Cytgénétique
4 Maladies génétiques Maladie dminante Maladie récessive GENE MUTE Maladie 1 Maladie 2 Maladie 3 Maladie mngénique Maladie multigénique 1 gène muté u Gène A Gène C Gène E Gène B Gène D génétiquement hétérgènes Plusieurs gènes mutés et Gène K Gène L Gène M Gène J Gène P
5 Le gène et ses altératins L util diagnstique est chisi en fnctin du type de mutatin Mutatins de type substitutins EXONIQUES Faux sens Nn sens INTRONIQUES Sans effet : plymrphismes Effet sur l épissage Mutatins de type Insertins/délétins De petite taille Décalant le cadre de lecture Ne décalant pas le cadre de lecture De grande taille D un u plusieurs exns Du gène entier mutatins décrites
6 Différentes apprches Recherche de mutatin ciblée 1. Mutatins récurrentes (SMA, r repeat expansins; Mytnic dystrphy, OPMD ) Pur des maladies specifiques Séquençage cmplet du/des gène(s) 1. Exn par exn 2. A partir du cdna Lng et cher Analyses spécialisées 1. Deletins/duplicatins d exns 2. FISH pur grandes délétins 3. DNA cmbing & painting Eg. FSHD Pur des gènes spécifiques Identifier la mutatin(s) Analyse de liaisn: Puces SNPs Dépends de la structure de la famille et du diagnstic de apparentés Permet d exclure des gènes Permet de truver de nuveau gènes Limitatins Danger des mutatins de nv
7 Matériel Bilgique ADN Prélèvement sanguin, Cellules Buccales (écuvilln) Cellules amnitiques * Séquençage standard d un u plusieurs gènes * Suthern Blt ARNm: Bipsie musculaire, fie,.. peau (fibrblastes) * Séquençage du cdna d un u plusieurs gènes * Analyse des cnséquences d épissage Démarche diagnstique 1. Extractin des Acides Nucléiques (ADN / ARN) 2. Amplificatin des séquences géniques d intérêt Cibler les régins Augmenter la quantité d ADN de ces régins 3. Détectin d une anmalie 4. Identificatin de l anmalie
8 Analyse de l ADN Détectin d anmalies: HRMA Maladies dminantes: Anmalies Hétérzygtes Permet d analyser de nmbreux patients simultanément Analyse fragment / fragment Bien adapté a la détectin des mutatins privées dans les maladies dminantes Les variants nn pathgènes Interfèrent N identifie pas la mutatin Cut faible, rapide
9 Analyse de l ADN Identificatin d anmalies: séquençage Adapté aussi bien aux maladies dminantes qu aux maladies récessives Distinctin immédiate lrs de l analyse des mutatins vs plymrphismes Analyse fragment par fragment et gène par gène COL6A3 Séquence Nrmale c.6220g>t Patient Ne détecte pas les recmbinaisns Affectant un u plusieurs exns du gène Vire le gène entier p.gly2074cys
10 Ct values Recherche de grands remaniements Certaines pathlgies snt dues a des mutatins particulières qui ne snt pas détectées par le séquençage après amplificatin: Perte de la ttalité d un des deux allèles du gène (recmbinaisn) Perte de 1 u plusieurs exns sur un allèle Duplicatin partielle u ttale d un allèle La PCR quantitative repse sur l explitatin de la cinétique de la PCR qui cmprend Une phase expnentielle, mdélisable Une phase en plateau QMPSF et MLPA Amplificatin simultanée de plusieurs séquences cibles en cnditin quantitative Ct s Lg cpy number
11 Analyse de liaisn Puces SNPs Permet de géntyper de nmbreuses variatins plymrphes en même temps Différentes puces (CHIPS) avec un nmbre variable de SNPs Enrichissement en SNPs exniques Etudes d assciatin Cpy number variatins ~2.5 millin (fixed) up t 500K (custm)
12 Une révlutin technlgique Next generatin Sequencing (NGS) Séquençage a haut débit de grandes quantités de séquences Aujurd hui Les gènes snt séquencés individuellement et seln une apprche séquentielle qui dépends de la clinique Le séquençage d un gène se fait par amplificatin de chaque exn (500 bp) individuellement Lng et fastidieux Nn exhaustif Cher en persnnels Bientôt Tut le génme d un individu purra être séquencé en 1 fis L exme (tutes les séquences cdantes) de plusieurs patients peuvent être séquencés ensemble (60Mb) Plusieurs genes ciblés pur de nmbreux patients peuvent être séquencés en 1 fis (20Gb)
13 Séquençage haut débit NGS: Next generatin sequencing Séquençage simultané de grandes quantités de séquences : Gène Exme Génme 1Kb à 100Kb 1 à 100 exns (max 360 exns) 30 megabases (Mb) exns 1% du génme 3500 Mb (3,5 milliards de paires de nuclétides) - haplide à gènes Sélectinner les séquences d intêret Les amplifier Les séquencer
14 Exn 1a >c.210 Exn2 Exn 4 Exn 6 Exn 8 Exn 10 Exn 1b>215 Exn 3 Exn 5 missing Exn 7 Exn 9 Exn 11 Exn 12 Exn 1a >c.210 Exn2 Exn 4 Exn 6 Exn 8 Exn 10 NGS Amplificatin multiplex de gènes d intérêt LMNA Sample Frward reads Reverse reads Ttal
15 NGS Capture des séquences de gènes d intêret Chse prbes accrding t the genes that yu want t capture Fragment yur patient(s) DNA(s) and Tag it(them) Mix the prbes with the patients dans and purify the targetted sequences Amplify all the captured sequences tgether Sequence all the Amplified DNA
16 Biinfrmatique Nuvel util et nuveau métier pur les généticiens mléculaires Validatin et tri des variants Appliquer les critères de qualité MQ: Scre de qualité de l alignement (MQ>20) QUAL: Scre de qualité de détectin du variant (QUAL>20) DPused: Rbustesse de détectin du variant (DP>30) GQ: scre de qualité de l attributin du géntype (GQ>20) Eliminer les régins nn ciblées (untargeted) Intergéniques, Dwnstream and upstream, 5 UTR et 3 UTR Génes nn capturés (mirna,.) Intrns?? Trier les variants restants en fnctin de leur fréquence allèlique Enlever SNVs de fréquence 0.01 >> 0.99 Eliminer sus réserve Variants hmzygtes : Attentin Chrmsme X Variants Synnymes : Attentin aux sites cryptiques d épissage Interpréter en fnctin des scres «in silic»
17 Exemples de représentatin des résultats Mutatin pnctuelle Mutatin Hétérzygte de type CNVs Mutatin de type Indel p.ala1834thr
18 Variants faux sens Cmment interpréter le rôle pathgène Le prblème n est pas de truver des mutatins mais de leur attribuer un rôle pathgène en relatin avec la maladie Critères de pathgénicité d un variant 1. Mdificatin de l acide aminé (analyses in silic) 2. Régin prtéique impliquée 3. Régin cnservée dans l évlutin des espèces 4. Cségrégatin familiale si pssible 5. Absence dans les bases de dnnées de ppulatins cntrôles Une mutatin qui ne change pas l acide aminé n est pas tujurs un plymrphisme Un cdn stp n est pas tujurs pathgène des variatins faux sens snt suvent des plymrphismes Cette interprétatin n est pas tujurs pssible 1. Faux psitif: faux diagnstic, faux cnseil génétique, faux traitement 2. Empêche d avancer dans la réflexin de recherche du diagnstic
19 Outils PGM: 10 MB t 1 GB Life Science Illumina MySeq: 120 MB 7.5 GB HiSeq: 600 GB HiSeq 2000 Rche 454 pyrsequencing platfrms GS Junir: 35MB GS FLX: 720 MB
20 Avantages et limites Obtentin de la séquence de nmbreux gènes simultanément Analyse exhaustive des gènes impliqués dans un phéntype Diagnstic plus cmplet et plus rapide Cut mindre que l analyse gène à gène Analyse Biinfrmatique Interprétatin des variants identifiés / faux psitifs Manipulatin délicate sans autmatisatin Cut élevé (1000/1500 eurs par patient) mais relatif Nn adapté à l analyse de mutatins ciblées (apparentés, ) Nn adapté à un diagnstic d urgence (DPN ) Essential de crréler les variants identifiées avec la clinique, les examens paracliniques
21 Cnclusin Le premier util essentiel est la crrecte définitin du phéntype Cllabratin étrite entre praticiens de disciplines cmplémentaires L analyse génétique est en pleine évlutin technlgique Le diagnstic mléculaire apprte un diagnstic de certitude et est indispensable au cnseil génétique, la prise en charge et la thérapeutique éventuelle
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