Protocole pour les petits échantillons (1 er juin 2004)

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1 Protocole pour les petits échantillons (1 er juin 2004) Important : pipettez toujours un volume égal ou supérieur à 2 µl. Étape 1 : préparation des ARN poly-a contrôles Quantité d ARN total au départ Dilutions en série Première Deuxième Troisième Quatrième 10 ng 2:40 2:100 2:100 2:20 2 µl 50 ng 2:40 2:100 2:100 2:4 2 µl 100 ng 2:40 2:100 2:100 2 µl Utilisez toujours un tampon pour contrôles poly-a pour les dilutions. La première dilution des ARN poly-a contrôles (1:20) peut être conservée jusqu à 6 semaines à -20 C dans un congélateur non équipé d un dispositif sans givre, et décongelée-recongelée jusqu à 8 reprises. à ajouter à l amorce T7- Oligo(dT) Étape 2 : synthèse du premier brin d ADNc, premier cycle Préparation de la solution amorce T7-Oligo(dT)/contrôles poly-a Amorce T7-Oligo(dT), 50 µm 2 µl ARN poly-a contrôles dilués 2 µl Pour 10 échantillons Eau sans ARNase 16 µl total 20 µl Ajoutez l échantillon d ARN total à la solution amorce T7-Oligo(dT)/contrôles poly-a. des composantes Échantillon d ARN total ( ng) Variable Solution amorce T7-Oligo(dT)/contrôles poly-a 2 µl Pour 1 échantillon Eau sans ARNase Variable total 5 µl

2 1. Préparez la solution dans un tube à PCR de 0,2 ml. 2. Inversez délicatement le tube à quelques reprises pour mélanger la solution, puis centrifugez brièvement pour faire descendre la solution au fond du tube. 3. Incubez pendant 6 minutes à 70 C (lancez le programme S-Affy du PCT100). 4. Le programme refroidit l échantillon à 4 C pendant au moins 2 minutes. Centrifugez brièvement pour faire descendre l échantillon au fond du tube. Dans un autre tube, préparez la solution de synthèse du premier brin d ADNc, premier cycle. Solution de réaction 5X pour le 1 er brin 2,0 µl DTT, 0,1 M 1,0 µl Inhibiteur d ARNase 0,5 µl Pour 1 échantillon dntp, 10 mm 0,5 µl SuperScript II 1,0 µl total 5,0 µl 1. Ajoutez 5 µl de solution de synthèse du premier brin d ADNc, premier cycle, à chaque solution échantillon d ARN total/amorce T7-Oligo(dT)/contrôles poly-a. Le volume final est de 10 µl. 2. Mélangez bien la solution en inversant délicatement le tube à quelques reprises. Centrifugez brièvement pour faire descendre la solution au fond du tube, puis mettez immédiatement le tube dans le PCR et lancez le programme d incubation pour 1 heure à 42 C. 3. Le programme chauffe l échantillon à 70 C pendant 10 minutes pour inactiver la transcriptase inverse, puis refroidit l échantillon à 4 C pendant au moins 2 minutes. L échantillon doit être refroidi à 4 C avant de passer à l étape suivante. L ajout de la solution de synthèse du deuxième brin d ADNc, premier cycle dans une solution à 70 C compromet l activité enzymatique. 4. Centrifugez brièvement pour faire descendre la solution au fond du tube, puis passez immédiatement à l étape suivante.

3 Étape 3 : synthèse du deuxième brin d ADNc, premier cycle Préparez suffisamment de solution de synthèse du deuxième brin d ADNc, premier cycle, pour tous les échantillons. Eau sans ARNase 4,8 µl MgCl 2 frais, 17,5 mm* 4,0 µl Pour 1 échantillon dntp, 10 mm 0,4 µl ADN polymérase I E. coli 0,6 µl ARNase H 0,2 µl total 10,0 µl * Préparez une nouvelle solution de MgCl 2 à chaque manipulation. Mélangez 2 µl de MgCl 2 1M avec 112 µl d eau sans ARNase. 1. Ajoutez 10 µl de solution de synthèse du deuxième brin d ADNc, premier cycle à chaque échantillon, pour un volume total de 20 µl. 2. Mélangez bien la solution en inversant délicatement le tube à quelques reprises. Centrifugez brièvement pour faire descendre la solution au fond du tube, puis mettez immédiatement le tube dans le PCR et lancez le programme d incubation pour 2 heures à 16 C. (Laissez le couvercle du PCR ouvert pendant cette incubation.) 3. Le programme chauffe l échantillon à 75 C pendant 10 minutes, puis refroidit l échantillon à 4 C pendant au moins 2 minutes. 4. Centrifugez brièvement pour faire descendre la solution au fond du tube, puis passez immédiatement à l étape suivante. des composantes

4 Étape 4 : amplification in vitro de l ARNc, premier cycle Dans un autre tube, préparez la solution de transcription in vitro, premier cycle. Tampon de réaction 10X 5 µl Solution d ATP 5 µl Pour 1 échantillon Solution de CTP 5 µl Solution d UTP 5 µl Solution de GTP 5 µl Solution enzymatique 5 µl total 30,0 µl 1. À la température de la pièce, ajoutez 30 µl de solution de transcription in vitro à chaque échantillon, pour un volume final de 50 µl. 2. Mélangez bien la solution en inversant délicatement le tube à quelques reprises. Centrifugez brièvement pour faire descendre la solution au fond du tube, puis mettez immédiatement le tube dans le PCR et lancez le programme d incubation pour 16 heures à 37 C. À la fin du cycle, le programme refroidit les échantillons à 4 C et se met en attente. des composantes Étape 5 : lavage de l ARNc, premier cycle Eau sans ARNase 50 µl Tampon d hybridation d ARNc 350 µl Pour 1 échantillon total 400 µl 1. Mettez 400 µl d eau sans ARNase/tampon d hybridation d ARNc dans des tubes de microcentrifugeuse neufs. Le tampon d hybridation d ARNc peut précipiter pendant l entreposage. Si nécessaire, dissolvez-le de nouveau en le chauffant dans un bain d eau à 30 C, puis laissez-le à la température de la pièce. Toutes les étapes de la procédure doivent être menées à la température de la pièce. Au cours de cette procédure, travaillez sans interruption. 2. Mettez l échantillon dans le tube correspondant. 3. Ajoutez 250 µl d éthanol ( %) et agitez bien. Ne centrifugez pas.

5 4. Versez l échantillon (700 µl) dans une colonne de centrifugation pour le lavage de l ARNc. 5. Centrifugez 15 secondes à g ( tr/min). Mettez l éluat dans la colonne et centrifugez de nouveau 15 secondes à tr/min, à la température de la pièce. 6. Jetez l éluat et le tube collecteur. Transférez la colonne dans un nouveau tube collecteur de 2 ml, puis pipettez 500 µl de tampon de lavage d ARNc dans la colonne. Centrifugez 15 secondes à g ( tr/min). pour laver. Jetez l éluat. Le tampon de lavage de l ARNc est fourni en solution concentrée. Avant de l utiliser pour la première fois, ajoutez-y 20 ml d éthanol ( %), suivant les indications sur la bouteille, pour obtenir une solution complète. Cochez la case figurant sur le côté gauche de l étiquette pour éviter toute confusion. 7. Pipettez 500 µl d éthanol 80 % (v/v) dans la colonne, puis centrifugez 15 secondes à g ( tr/min). Jetez l éluat. 8. Ouvrez le capuchon de la colonne et centrifugez 5 minutes à vitesse maximum ([ g). Jetez l éluat et le tube collecteur. Disposez les colonnes à tous les deux godets de la centrifugeuse. Orientez les capuchons vers le godet vide adjacent de manière à ce qu ils pointent dans la direction opposée à la rotation. Cela évite d endommager les capuchons. Inscrivez le nom des échantillons sur les tubes collecteurs, et non sur les capuchons (au cours de la centrifugation, certains capuchons de colonnes peuvent se briser et vous risquez de perdre l information sur les échantillons). 9. Transférez la colonne dans un nouveau tube collecteur de 1,5 ml (fourni), puis pipettez 13 µl d eau sans ARNase sur la membrane de la colonne. Prenez soin de pipetter l eau directement sur la membrane. Centrifugez 1 minute à vitesse maximum pour éluer. Le volume moyen d éluat est de 11 µl pour 13 µl d eau sans ARNase. 10. Pour déterminer la quantité d ARNc produite, retirez un échantillon de 1 µl pour la bioanalyse d ARN pico LabChip. Si la production est inférieure à 600 ng, utilisez l éluat au complet pour l étape suivante. L échantillon peut être conservé à -20 C pour un usage ultérieur. Étape 6 : synthèse du premier brin d ADNc, deuxième cycle

6 1. Préparez une solution fraîche d amorces aléatoires (random primers) (concentration finale de 0,2 µg/µl). Mélangez 2 µl d amorces aléatoires (3µg/µl) avec 28 µl d eau sans ARNase. 2. Ajoutez 2 µl de cette solution d amorces diluées à l ARNc purifié. Si nécessaire, ajoutez de l eau sans ARNase pour obtenir un volume final de 11 µl. 3. Incubez 10 minutes à 70 C. 4. Refroidissez l échantillon à 4 C pendant au moins 2 minutes, puis centrifugez brièvement pour faire descendre l échantillon au fond du tube. 5. Dans un autre tube, préparez la solution de synthèse du premier brin d ADNc, deuxième cycle. Solution de réaction 5X pour le 1 er brin 4 µl DTT, 0,1 M 2 µl Inhibiteur d ARNase 1 µl Pour 1 échantillon dntp, 10 mm 1 µl SuperScript II 1 µl total 9 µl 6. Mélangez bien la solution en inversant délicatement le tube à quelques reprises. Centrifugez brièvement pour faire descendre la solution au fond du tube. 7. Transférez 9 µl de solution de synthèse du premier brin d ADNc, deuxième cycle dans chaque échantillon d ARNc/amorce aléatoire. Mélangez bien la solution en inversant délicatement le tube à quelques reprises. Centrifugez brièvement pour faire descendre la solution au fond du tube, puis incubez à 42 C pendant 1 heure. (Utilisez le programme S-Affy2 du PCT100). 8. Le programme refroidit l échantillon à 4 C pendant au moins 2 minutes. Centrifugez brièvement pour faire descendre l échantillon au fond du tube. 9. Ajoutez 1 µl d ARNase H à chaque échantillon, pour un volume total de 21 µl. Mélangez bien la solution en inversant délicatement le tube à quelques reprises. Centrifugez brièvement pour faire descendre la solution au fond du tube, puis mettez le tube dans le PCR et lancez le programme d incubation pour 20 minutes à 37 C.

7 10. Le programme chauffe l échantillon à 95 C pendant 5 minutes, puis refroidit l échantillon à 4 C pendant au moins 2 minutes. Procédez immédiatement à l étape suivante. des composantes Étape 7 : synthèse du deuxième brin d ADNc, deuxième cycle 1. Préparez une nouvelle solution d amorces T7-Oligo(dT) (concentration finale de 5 µm). Mélangez 2 µl d amorces T7-Oligo(dT) 50 µm avec 18 µl d eau sans ARNase. 2. Ajoutez 4 µl de cette solution d amorces T7-Oligo(dT) à chaque échantillon, pour un volume total de 25 µl. 3. Inversez délicatement le tube à quelques reprises pour mélanger la solution. Centrifugez brièvement pour faire descendre la solution au fond du tube, puis mettez les tubes dans le PCR et lancez le programme d incubation pour 6 minutes à 70 C. 4. Le programme refroidit l échantillon à 4 C pendant au moins 2 minutes. Centrifugez ensuite brièvement pour faire descendre l échantillon au fond du tube. Il est indispensable de refroidir l échantillon à 4 C avant de passer à l étape suivante. L ajout de la solution de synthèse du deuxième brin d ADNc, deuxième cycle dans une solution à 70 C compromet l activité enzymatique. 5. Dans un autre tube, préparez la solution de synthèse du deuxième brin d ADNc, deuxième cycle. Eau sans ARNase 88 µl Solution de réaction 5X pour le 2 e brin 30 µl Pour 1 échantillon dntp, 10 mm 3 µl ADN polymérase I E. coli 4 µl total 125 µl 6. Mélangez bien la solution en inversant délicatement le tube à quelques reprises. Centrifugez brièvement pour faire descendre la solution au fond du tube. 7. Ajoutez 125 µl de solution de synthèse du deuxième brin d ADNc, deuxième cycle, à chaque échantillon, pour un volume total de 150 µl.

8 Mélangez en inversant délicatement le tube à quelques reprises. Centrifugez brièvement pour faire descendre la solution au fond du tube. 8. Disposez les tubes dans le PCR et lancez le programme d incubation pour 2 heures à 16 C. 9. Le programme refroidit l échantillon à 4 C pendant au moins 2 minutes. Centrifugez ensuite brièvement pour faire descendre l échantillon au fond du tube. 10. Ajoutez 2 µl d ADN polymérase T4 aux échantillons, pour un volume final de 152 µl. Inversez délicatement les tubes à quelques reprises pour mélanger, puis disposez les tubes dans le PCR. Lancez le programme d incubation pour 10 minutes à 16 C. 11. Le programme refroidit l échantillon à 4 C pendant au moins 2 minutes. Centrifugez ensuite brièvement pour faire descendre l échantillon au fond du tube. 12. Procédez à l étape de lavage ou congelez les échantillons à -20 C pour usage ultérieur. Ne laissez pas reposer les réactions à 4 C pendant de longues périodes. des composantes Étape 8 : lavage de l ADNc double brin 1. Mettez 600 µl de tampon d hybridation d ADNc dans des tubes à microcentrifugeuse de 1,5 ml, puis ajoutez les échantillons. 2. Mélangez au vortex pendant 3 secondes. Vérifiez que la solution est de couleur jaune (semblable au tampon d hybridation d ADNc sans la solution de synthèse d ADNc). Si la couleur est orange ou violette, ajoutez 10 µl d acétate de sodium 3 M à ph 5,0, puis mélangez. La solution prendra une couleur jaune. 3. Versez la solution dans une colonne de centrifugation pour lavage de l ADNc placée sur un tube collecteur de 2 ml, puis centrifugez 1 minute à g ( tr/min). 4. Versez de nouveau l éluat dans la colonne et centrifugez de nouveau 1 minute à g ( tr/min).

9 5. Jetez l éluat et le tube collecteur, puis transférez la colonne sur un nouveau tube collecteur de 2 ml. 6. Pipettez 750 µl de tampon de lavage de l ADNc dans la colonne. Centrifugez 1 minute à g ( tr/min). Jetez l éluat. Le tampon de lavage de l ADNc est fourni en solution concentrée. Vérifiez que celui-ci contient de l éthanol. 7. Ouvrez le capuchon de la colonne et centrifugez 5 minutes à vitesse maximum ( g). L ouverture du capuchon pendant la centrifugation assure l assèchement complet de la membrane. Placez les colonnes à tous les deux godets de la centrifugeuse. Orientez les capuchons vers le godet vide adjacent de manière à ce qu ils pointent dans la direction opposée à la rotation. Cela évite d endommager les capuchons. 8. Jetez l éluat et le tube collecteur. 9. Transférez la colonne dans un tube collecteur de 1,5 ml, puis pipettez 14 µl de tampon d élution de l ADNc sur la membrane de la colonne. Incubez 1 minute à la température de la pièce, puis centrifugez 1 minute à vitesse maximum ( g) pour éluer. 10. Après le lavage, passez à l étape de synthèse de l ARNc biotinylé.

10 Étape 9 : synthèse de l ARNc biotinylé Matrice d ADNc 12 µl Eau sans ARNase 8 µl Tampon pour le marquage in vitro 10X 4 µl Pour 1 échantillon Mélange NTP pour le marquage in vitro 12 µl Mélange enzymatique pour le marquage in vitro 4 µl total 40 µl Ne préparez pas la réaction sur la glace, car la spermidine contenue dans le tampon de marquage 10X pourrait provoquer la précipitation de l ADNc. 1. Mélangez délicatement les réactifs et centrifugez brièvement pour faire descendre la solution au fond du tube. 2. Disposez les tubes dans le PCR et lancez le programme pour une incubation de 16 heures à 37 C. Le programme refroidira ensuite la solution à 4 C et se mettra en attente. des composantes Étape 10 : lavage de l ARNc biotinylé Eau sans ARNase 60 µl Tampon d hybridation d ARNc 350 µl Pour 1 échantillon total 410 µl 1. Mettez 410 µl de tampon d hybridation d ARNc/eau sans ARNase dans un tube pour microcentrifugeuse, puis ajoutez la solution de réaction in vitro. 2. Mélangez et au vortex, puis centrifugez. 3. Ajoutez 250 µl d éthanol ( %) à la solution, puis agitez à fond avec la pipette. Ne centrifugez pas. 4. Versez l échantillon (700 µl) dans une colonne de centrifugation pour le lavage de l ARNc placée sur un tube collecteur de 2 ml. Centrifugez 15 secondes à g ( tr/min). 5. Versez l éluat dans la colonne de lavage de l ARNc, puis centrifugez 15 secondes à g ( tr/min).

11 6. Jetez l éluat et le tube collecteur. 7. Transférez la colonne dans un nouveau tube collecteur de 2 ml (fourni). Pipettez 500 µl de tampon de lavage de l ARNc dans la colonne. Centrifugez 15 secondes à g ( tr/min) pour laver. Jetez l éluat. Le tampon de lavage de l ARNc est fourni en solution concentrée. Vérifiez que celui-ci contient de l éthanol (voir l avertissement IMPORTANT avant de commencer). 8. Pipettez 500 µl d éthanol 80 % (v/v) dans la colonne, puis centrifugez 15 secondes à g ( tr/min). Jetez l éluat. 9. Ouvrez le capuchon de la colonne et centrifugez 5 minutes à vitesse maximum ( g). Jetez l éluat et le tube collecteur. Placez les colonnes à tous les deux godets de la centrifugeuse. Orientez les capuchons vers le godet vide adjacent de manière à ce qu ils pointent dans la direction opposée à la rotation. Cela évite d endommager les capuchons. 10. Transférez la colonne dans un nouveau tube collecteur de 1,5 ml, puis pipettez 20 µl d eau sans ARNase sur la membrane de la colonne. Prenez soin de pipetter l eau directement sur la membrane. 11. Centrifugez 1 minute à vitesse maximum ( g) pour éluer. 12. Pipettez 20 µl d eau sans ARNase sur la membrane de la colonne. Prenez soin de pipetter l eau directement sur la membrane. Centrifugez 1 minute à vitesse maximum ( g) pour éluer. des composantes Étape 11 : mesure de la concentration d ARNc et fragmentation Un facteur de dilution initial de 50 à 125 est recommandé. Nota : nm = 40 µg/ml d ARN ou 0,04 µg/µl d ARN Avec un facteur de dilution de 50, une DO de 0,3 correspond à un échantillon d une concentration de : 50 * 0,3 * 0,04 = 0,6 µg/µl

12 Un tampon de fragmentation, qui contient principalement des sels, est employé pour fragmenter 20 µg d ARNc. Les fragments finaux devraient avoir une longueur d environ 100 pb. 1. Ajoutez les composantes suivantes à chaque tube de PCR. 20 µg d ARNc Variable Tampon de fragmentation 5X 12 µl Pour 1 échantillon Eau sans ARNase Variable total 60 µl 2. Mélangez délicatement les réactifs et centrifugez brièvement pour faire descendre la solution au fond du tube. 3. Disposez les tubes dans le PCR et lancez le programme FRAG. Ce programme incube 35 minutes à 95 C, refroidit la solution à 4 C, puis se met en attente. des composantes Étape 12 : pré-hybridation et hybridation De l ADN de sperme de hareng est ajouté à la solution pour bloquer l hybridation non spécifique par compétition. L oligo contrôle B2 forme un motif en damier sur la bordure de la micro-puce, observable au balayage optique. L ajout d un anticorps biotinylé et de SAPE à la micro-puce, après la coloration initiale avec la SAPE seule, amplifie l intensité du signal. 1. Insérez un embout de 10 µl dans chacune des ouvertures de caoutchouc au dos de la micro-puce. 2. Au moyen d un long embout de chargement pour gel, injectez l échantillon dans l ouverture située au coin inférieur gauche de la micro-puce. 3. Ajoutez 200 µl de tampon d hybridation 1X dans la micro-puce à la température de la pièce (ou 80 µl si vous utilisez une micro-puce de test). 4. Incubez la micro-puce à 45 C pendant 10 minutes avec rotation (60 tr/min).

13 Tampon d hybridation 2X 150 µl ADN de sperme de hareng (10 mg/ml) 3 µl Pour 1 échantillon BSA acétylée (50 mg/ml) 3 µl Contrôle eucaryote 20X 15 µl Oligo contrôle B2 (3 µm) 5 µl ARNc fragmenté (15 µg) 45 µl DMSO 30 µl Eau sans ARNase 49 µl total 300 µl 5. Incubez la solution d ARNc cible d abord 5 minutes à 99 C, puis 5 minutes à 45 C. Centrifugez 5 minutes à vitesse maximum. 6. Enlevez le tampon d hybridation de la micro-puce, puis ajoutez 200 µl de solution d ARNc cible. 7. Incubez la micro-puce à 45 C pendant 16 heures avec rotation (60 tr/min). 8. Transférez la solution d ARNc cible de la micro-puce au tube original (conservez l échantillon d ARNc à -80 C pour la prochaine hybridation). Ajoutez 200 µl de tampon de lavage A dans la micro-puce. La solution d hybridation ainsi conservée peut être réutilisée deux fois sans dégradation notable du signal. Étape 13 : coloration et balayage optique 1. Préparez la solution de coloration et mettez-la dans des tubes eppendorf ambrés (la solution de coloration est utilisée avant et après la coloration par anticorps, soit la coloration 1 et la coloration 3, respectivement). Tampon de coloration 2X 300 µl BSA acétylée (50 mg/ml) 24 µl Pour 1 échantillon SAPE 6 µl Eau sans ARNase 270 µl total 600 µl 2. Préparez la solution d anticorps et mettez-la dans des tubes eppendorf transparents (coloration 2). Tampon de coloration 2X 300 µl

14 BSA acétylée (50 mg/ml) 24 µl Pour 1 échantillon IgG de chèvre (10 mg/ml) 6 µl Anticorps biotinylés (0,5 mg/ml) 3,6 µl Eau sans ARNase 266,4 µl total 600,0 µl 3. Allumez les appareils Scanner et Fluidics Station, puis lancez le programme GeneChip. 4. Créez un dossier dans le répertoire «Today» en suivant la nomenclature suivante. ASAAMMJJ ; p. ex. AS011230ba AS : Initiales de l usager (Alya a Sammak) AAMMJJ : Date (011230) Le dossier «Today» se trouve dans : H:/ChipData/Today sur Tournesol. 5. Pour que le programme MicroArray Suite dirige les fichiers de résultats vers le dossier qui a été créé à l étape précédente, allez à : Tools/Defaults/File Locations/Experiment Data et mettez le dossier que vous venez de créer comme dossier par défaut (default location). des composantes 6. Sélectionnez Experiment Info dans Run. Entrez l information A) Nom de l expérience GBAAMMJJMPNN: GB : Initiales de l usager (GeBing) AAMMJJ : Date (040216) MP : Type de micro-puce** NN : Numéro (01, 02...) HE ** Human HuGeneFL Array Human U95 A ou B ou C ou D ou E Human U133 A ou B Human U133+2 Murine U74 A ou B ou C Murine MOE430 A ou B Murine MOE430v2 Rat U34 A ou B ou C Rat RAE230 A ou B Rat RAE230v2 Yeast Genome S98 Array Arabidopsis Genome Array ATH1 HGF HGA, HGB, HGC, HGD, H133A, H133B H133P MGA, MGB, MGC MOA, MOB MOT RGA, RGB, RGC RAA, RAB RAT YGS AtG ATH

15 Canine Genome Array Drosophila P53 Zebrafish ChipGene Test3 DOG DRO P53 ZEB GT3 B) Probe array type Indiquez le type de micro-puce dans le menu qui paraît à l écran. C) Probe array lot Tapez le numéro de lot de la micropuce. D) Operator name Tapez vos initiales. E) Sample type Indiquez la méthode d extraction de l ARN. F) Sample description Tapez le nom de l échantillon. 7. Sélectionnez Experiment Info dans Run. 8. Allumez le laser au moins 15 minutes avant de commencer le balayage optique. Sélectionnez Scanner dans Run. Cliquez sur TurnOn Laser. 9. Sélectionnez Fluidics dans Run. Amorcez le système Fluidics Station : Changez les bouteilles (utilisez les tampons de lavage A et B) Sélectionnez le protocole Prime, puis Run. 10. Coloration et lavage. a. Sélectionnez le protocole EukGE-WS2v5. b. Insérez la micro-puce dans le bloc de lavage. c. Mettez la solution de coloration 1 (tube ambré). d. Cette procédure prend environ 40 minutes. e. Ajoutez la solution d anticorps (solution de coloration 2). À la fin de cette étape, (10 minutes), remplacez la solution d anticorps par la solution de coloration 3. f. Si la micro-puce contient des bulles à la fin de cette procédure, remettez simplement la micro-puce dans le bloc de lavage et recommencez la procédure. La Fluidics Station purgera automatiquement la micro-puce et la remplira de nouveau avec du tampon de lavage A. Répétez la procédure jusqu à ce que la micropuce ne contienne plus de bulles. g. Bouchez les ouvertures de la micro-puce avec des Tough-spots. Essuyez la surface de verre avec une Kimwipe et de l eau pour enlever la poussière et les autres saletés.

16 h. Sélectionnez Scanner dans Run et choisissez le nom de la lecture. Tapez 2 dans Number of scans, puis cliquez sur Start. Insérez la micro-puce, puis cliquez sur OK. N oubliez pas d éteindre le laser après la dernière lecture. Laissez le laser refroidir 15 minutes avant d éteindre le lecteur optique. 11. Une fois que toutes les micro-puces ont été lues, rendez-vous à Tools/Analysis settings/expression, indiquez le type de micro-puce et laissez les autres paramètres par défaut. 12. Allez ensuite à Run/Batch analysis/add et chargez les fichiers appropriés. Appuyez sur Analyze. 13. Ouvrez chaque fichier et sauvegardez la section Metrics. Ouvrez chaque fichier séquentiellement et sauvegardez la section Pivot en employant la nomenclature décrite précédemment.