Confirmation microbiologique: aspects méthodologiques dans l analyse des aliments

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1 Confirmation microbiologique: aspects méthodologiques dans l analyse des aliments Journée TIAC Pays de Loire, 23 octobre 2012 Bertrand LOMBARD Anses-Laboratoire de sécurité des aliments, Maisons-Alfort (94) bertrand.lombard@anses.fr Tél: octobre 2012 B Lombard 1

2 Plan Introduction Méthodes d analyse en 1 ère intention pour les contaminations bactériennes Méthodes d analyse de confirmation/caractérisation pour les contaminations bactériennes Méthodes d analyse des virus 23 octobre 2012 B Lombard 2

3 INTRODUCTION 23 octobre 2012 B Lombard 3

4 Finalité des analyses microbiologiques des aliments, dans le cadre de l investigation d une TIAC = retrouver l aliment à l origine de la contamination bactérienne (y compris toxines et métabolites) virale ou parasitaire Focus sur les microorganismes couverts par le laboratoire Listeria monocytogenes (Laboratoire National de Référence -LNR/Laboratoire de Référence de l Union Européenne -LRUE) Staphylococcus aureus (et entérotoxines) (LNR/LRUE) Salmonella (LNR associé) Histamine (LNR) Escherichia coli producteurs de shigatoxines (STEC) Virus (hors coquillages) 23 octobre 2012 B Lombard 4

5 Organisation des analyses En général en 2 étapes Détection/quantification de l agent pathogène dans l aliment Autocontrôles effectués par les producteurs et distributeurs, analyses par laboratoires prestataires de service Contrôles officiels effectués par les DD(CS)PP, analyses par les laboratoires de contrôle officiel ( 80, LDA/LVD, SCL) Confirmation/caractérisation de l agent pathogène En général par le LNR Sauf cas particuliers Analyse seulement par laboratoires de contrôle officiel Ex: histamine Analyse directement par le LNR Danger émergent, analyse trop récente/pas assez fréquente/technologie avancée, LDA non formés, Ex: virus 23 octobre 2012 B Lombard 5

6 MÉTHODES D ANALYSE EN 1 ÈRE INTENTION POUR LES CONTAMINATIONS BACTÉRIENNES 23 octobre 2012 B Lombard 6

7 Objectif Détection/quantification de la bactérie pathogène dans aliment Genre: Salmonella, Campylobacter Espèce: Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Clostridium perfringens/botulinum, Vibrio parahaemolyticus/cholerae Sérotype: E. coli O157:H7 Gènes de virulence: STEC/E. coli porteurs des gènes stx, eae 23 octobre 2012 B Lombard 7

8 Méthodes (1) 1. Méthodes de référence normalisées Microbiologie conventionnelle Large domaine d application: tous aliments pour homme et animaux, environnement de transformation et stockage + dans certains cas production primaire Ex: Salmonella, L. monocytogenes, Campylobacter, S. aureus, C. perfringens, B. cereus, V. parahaemolyticus/cholerae Technologies récentes (quand microbiologie conventionnelle non satisfaisante) IMS pour extraction/séparation: E. coli O157:H7 PCR ciblant des gènes de virulence de production des neurotoxines: C. botulinum de virulence: STEC 23 octobre 2012 B Lombard 8

9 Méthodes (2) 2. Méthodes alternatives Kits commercialisés Technologies récentes Résultats plus rapides, automatisation A condition d être validées Par rapport à la méthode de référence correspondante (résultats équivalents) Selon protocole de la Norme NF EN ISO Par tierce-partie: AFNOR Certification, ou MicroVal Liste à jour des méthodes certifiées + rapports synthétiques de validation sur site Internet Afnor 23 octobre 2012 B Lombard 9

10 Méthodes (3) 3. Méthodes LNR/LRUE Détection d E. coli 0104:H4/graines germées Détection des entérotoxines de staphylocoques Extraction par dialyse/concentration Détection immunoenzymatique par kits commercialisés Quantification de l histamine par HPLC 4. Ou toute autre méthode adaptée/optimisée couple (analyte, matrice) très spécifique Ex: Salmonella dans poudres de lait ou saucisson? 23 octobre 2012 B Lombard 10

11 MÉTHODES D ANALYSE DE CONFIRMATION/ CARACTÉRISATION POUR LES CONTAMINATIONS BACTÉRIENNES 23 octobre 2012 B Lombard 11

12 Objectif: caractérisation plus poussée que taxonomique (genre/espèce) pour affiner la correspondance entre souches humaines et souches alimentaires tracer l origine alimentaire de la TIAC En général menée par les LNR LNR en bactériologie des aliments L. monocytogenes: Anses-LSAl Staphylocoques: Anses-LSAl Salmonella: Anses-Ploufragan/LSAl Campylobacter: Anses-Ploufragan STEC: VetAgroSup, Marcy l Etoile Coquillages: IFREMER Vibrio: Anses-LSAl, site Boulogne Antibiorésistance: Anses (leader: Fougères, LSAl associé) Histamine: Anses-LSAl, site Boulogne 23 octobre 2012 B Lombard 12

13 En collaboration étroite avec CNR correspondant Méthodes utilisées Echanges de données de caractérisation Et autres partenaires de l investigation de la TIAC Niveau national: InVS, DGAl, DGCCRF, DGS Niveau local: DD(CS)PP, labo 1 ère intention, ARS, CIRE 23 octobre 2012 B Lombard 13

14 Salmonella Sérotypage Agglutination Demain: moléculaire (puce ADN)? Sous-typage moléculaire PFGE, MLVA, CRISPOL Antibiorésistance Antibiogramme par diffusion en milieu gélosé = tri facile, économique (cf souches humaines) Si besoin, gènes ABR (puce ADN) Base de données Salmonella d origine non humaine (LSAl-unité CEB) identification précoce origine TIAC signaux d alerte 23 octobre 2012 B Lombard 14

15 Listeria monocytogenes Typage par agglutination ou génotypage (PCR) Sous-typage moléculaire: PFGE Base de données: profil PFGE + données épidémiologiques associées Souches PS/PC DGAL + DGCCRF Souches «alertes produits» DGAL, transmises par le CNR (IP) 23 octobre 2012 B Lombard 15

16 Au LNR STEC Détection par PCR temps réel des gènes codant pour les 5 sérogroupes majeurs: O26, O103, O111, O157 et O145 Isolement des souches et caractérisation Au LSAl (plateforme Identypath) Caractérisation plus poussée des souches Biopuce, PCR très haut débit Epidémiosurveillance moléculaire dans le temps et dans l espace 23 octobre 2012 B Lombard 16

17 Entérotoxines de staphylocoques Typage + quantification des entérotoxines de staphylocoques (SEA-SEE) par méthode ELISA du LNR Détection par PCR temps réel des gènes de staphylocoques codant pour 13 ES 11 toxines émétiques: SEA-SEE, SEG-SEI, SER SEJ, SEP 23 octobre 2012 B Lombard 17

18 MÉTHODES D ANALYSE DES VIRUS 23 octobre 2012 B Lombard 18

19 Analyses au LSAl (unité VAE) Norovirus (génogroupes I & II) Pas de modèle cellulaire pour test par culture Détection génome viral par PCR transcriptase inverse en temps réel Virus de l hépatite A & E VHA: modèle cellulaire avec souche labo mais souches terrain très difficile à cultiver Même principe: PCR Rotavirus: même principe (en cours de validation) 23 octobre 2012 B Lombard 19

20 Caractérisation complémentaire Typage par séquençage Si nécessaire Par le CNR: CHU Dijon (norovirus) ou Paul Brousse, Villejuif (VHA-E) 23 octobre 2012 B Lombard 20

21 CONCLUSION 23 octobre 2012 B Lombard 21

22 Organisation efficace pour l analyse d aliments pour l investigation de TIAC Réseau dense et compétent de laboratoires de contrôle officiel, coordonné par les LNR Large choix de méthodes d analyse normalisées ou validées pour les analyses de 1 ère intention Confirmation/expertise en 2 ème intention: par LNR, en lien étroit avec CNR Perspectives Meilleure investigation des TIAC virales, à Bacillus cereus 23 octobre 2012 B Lombard 22