Application des marqueurs TSM aux coquillages les premiers résultats

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1 Application des marqueurs TS aux coquillages les premiers résultats Gourmelon., ieszkin S., Alfansiah Y., auffret A., Lozach S., Caprais.P., Le Goff., Le ennec C. - arqueurs bactériens par PCR en temps réel (Bacteroidales et Catellicoccus marimammalium) - Bactériophages F ARN spécifiques (génogroupes I-IV) Brest (29) Lessay (50), ars 2012

2 Les marqueurs TS et les coquillages Etudes précédentes : - Bactéries (Roslev et al., 2009 et 2010, Gourmelon et al., 2010) - Virus (Caprais et al., 2009, Ley et al., 2002, Wolf et al., 2008 et 2010) - Cellules eucaryotes (ADN mitochondriaux) (Baker-Austin et al., 2010) Peu d études ont abouti à un protocole efficace pour l approche TS, notamment avec les marqueurs bactériens Brest (29) Lessay (50), ars 2012

3 Les marqueurs TS et les coquillages Développements méthodologiques Les bactériophages F ARN spécifiques génogroupes umain et Animal - Partie des coquillages analysées : les tissus digestifs - Optimisation et comparaison de 2 méthodes : - Culture / génotypage par RT-PCR - Analyse directe par RT-PCR (protocole similaire à celui utilisé pour la détection des virus entériques ; Le Guyader et al., 2010 et Zakhour et al., 2010) Brest (29) Lessay (50), ars 2012

4 Les marqueurs TS et les coquillages Développements méthodologiques Les marqueurs bactériens (sans étape de culture) - Analyse de coquillages artificiellement contaminés et de coquillages naturellement contaminés - Sélection des parties des coquillages les plus adaptées à l analyse par ces marqueurs - Comparaison de protocoles d extraction des ADN bactériens Brest (29) Lessay (50), ars 2012

5 Contamination artificielle des coquillages Contamination de lots d huîtres par des souches bactériennes (Bacteroides vulgatus ; Catellicoccus marimammalium), des fèces de porc, des bouses de vaches, effluents de station d épuration DAPI Coloration of C.marimammalium (Ifremer) - Dissection/analyse de différentes parties des huîtres : tissus digestifs, branchies, liquides intervalvaires, chairs totales - Comparaison de protocoles d extraction des ADN bactériens - Détection des marqueurs Bacteroidales

6 Résultats sur les coquillages artificiellement contaminés essais sur des huîtres Protocole le plus prometteur : liquide intervalvaire / kit Fast DNA for Soil Quantification des marqueurs Bacteroidales umain, Ruminant et du marqueur Oiseau dans les coquillages contaminés par ces sources Les autres tissus testés : moins adaptés à la détection directe de marqueurs bactériens

7 Résultats sur les coquillages contaminés naturellement (différentes provenances) Analyse de lots huîtres (n=38) : - eilleurs résultats également en analysant les liquides intervalvaires - Plus faible taux d identification de l origine de la contamination fécale (35 %) Analyses de lots de coques/palourdes (n=22) : - Protocole avec les liquides intervalvaires peu efficace - Pas de résultats quantitatifs Difficultés d identifier l origine de la contamination fécale avec les marqueurs bactériens

8 Les marqueurs TS et les coquillages Applications sur site - Site de Daoulas (29) Echantillonnage mensuel pendant 2 ans (juillet 2009 juin 2010) 2 sites - Site de l estuaire de l Elorn (29) Echantillonnage ars ai sites

9 Analyse des lots d huîtres du site de Daoulas - 2 sites Les bactériophages F ARN spécifiques - Analyse mensuelle pendant 2 ans Juillet 2009 Juin Faible contamination des lots analysés : Pointe du Château (n= 24) : 50 % des lots analysés < 230 E. coli / 100 g CLI Kerloziou (n = 24) : 71 % des lots analysés < 230 E. coli / 100 g CLI - arqueurs TS analysés : Bactériophages F ARN spécifiques Animal umain ixte Pointe du Château FRNAP I (4), FRNAP II (3) et FRNAP I et II (1) Kerloziou FRNAP I (3), FRNAP II (2) et FRNAP I et II (2) (résultats > 12 isolats de bactériophages) Origine de la contamination des huîtres variable Brest (29) Lessay (50), ars 2012

10 Application des marqueurs TS sur des huîtres de l estuaire de l Elorn arqueurs Bacteroidales Bactériophages F ARN spécifiques Le Passage - 3 campagnes de prélèvements (ars ai 2010) : 6 sites de prélèvements au niveau de l estuaire : 18 eaux dans l estuaire, 18 lots d huîtres et 6 eaux de rivières Landerneau Camfrout Pouldu Pen an Trein Vervian

11 Protocole appliqué au niveau des huîtres Bactériophages F ARN spécifiques : 2 méthodes RT-PCR Génotypage par RT-PCR Extraction directe des ARN Culture Tissus digestifs 28 huitres collectées à marée basse sur chaque site Dissection E. coli Dénombrement par méthode NPP sur CLI Tissus digestifs Dissection Liquide intravalvulaire Extraction des ADN Extraction des ADN arqueur Bacteroidales par PCR en temps réel : AllBac, um-1-bac, Rum-2-Bac et Pig-2-Bac

12 arqueurs Bacteroidales : liquides intervalvaires Estuaire de l Elorn, 1 ère campagne (30 mm pluie/48h), quantification des marqueurs Sites E. coli a AllBac b um-1-bac b Rum-2-Bac b Pig-2-Bac b Landerneau NQ c NQ Vervian NQ NQ Pen an Trein NQ Plouldu NQ Camfrout NQ Le Passage NQ NQ a PN/100 g CLI ; b copies/ml IL ; c Non quantifié Estuaire de l Elorn, 3 ème campagne (6 mm pluie/48h), quantification des marqueurs Sites E. coli a AllBac b um-1-bac b Rum-2-Bac b Pig-2-Bac b Landerneau NQ NQ c NQ Vervian 251 NQ NQ NQ NQ Pen an Trein NQ NQ NQ Plouldu NQ NQ NQ Camfrout NQ NQ Le Passage NQ NQ NQ a PN/100 g CLI ; b copies/ml IL ; c Non quantifié

13 Résultats sur l origine de la contamination fécale dans les eaux et les huîtres - Estuaire de l Elorn ars - ai 2010 Eaux estuariennes Lots huîtres 30mm rainfall/48h Bacteroidales FRNAP 30mm rainfall/48h Bacteroidales FRNAP 1-Culture/ genotyping 2- qrt-pcr 1-Culture/ genotyping 2- qrt-pcr Landerneau Landerneau Vervian Vervian Pen ar Trein Pen ar Trein Pouldu Pouldu Camfrout Camfrout Le Passage Le Passage <10 mm/48h (2 campaigns) <10 mm/48h (2 campaigns) Landerneau Landerneau No id. Vervian Vervian Pen ar Trein Pen ar Trein Pouldu No d. Pouldu Camfrout Camfrout Le Passage Le Passage Classification Classification : human, No Id: not identified: : mixed : human, No Id: not identified: : mixed Origine humaine Origine animale Origine mixte : humaine et animale - Contamination humaine ou mixte - Contamination plus importante après la pluie - Bactériophages : plus de résultats par la méthode culture/génotypage et dans les huîtres

14 Les marqueurs TS et les coquillages Conclusions Les bactériophages F ARN spécifiques : - Présence fréquente dans les coquillages - Détection possible par culture/génotypage et RT-PCR directe - FRNAP II montre une contamination humaine FRNAP I intérêt plus limité, contamination animale mais pas bovine Les marqueurs bactériens : - Détection possible dans les coquillages mais moins fréquente - ise en évidence des marqueurs associés à l homme, aux ruminants, aux porcs et aux oiseaux (goélands) lors de contaminations en bassin Brest (29) Lessay (50), ars 2012