CULTURE IN VITRO DU SAINT PAULIA

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1 THÈME : La mrphgenèse végétale et l'établissement du phéntype Niveau : Première S CULTURE IN VITRO DU SAINT PAULIA Extrait du BO : Le dévelppement du végétal est influencé par la répartitin des hrmnes en interactin avec les facteurs de l'envirnnement CADRE PÉDAGOGIQUE: Réalisatin d'expériences de clnage de végétaux.. On prélève un fragment de tissus que l n met en culture sur un milieu adapté après désinfectin.. Les cellules de la feuille se dédifférencient, se multiplient pur frmer des cals qui vnt subir une différenciatin partielle (micr feuilles).une mdificatin de la cmpsitin du milieu de culture va induire l apparitin de racines. La durée de la culture et le nmbre de butures btenues sulignent les avantages de cette bitechnlgie. OBJECTIFS : Objectifs de cnnaissances: Un exemple de bitechnlgie La ttiptence des cellules végétales permet le clnage. Les prprtins des différentes hrmnes (rapprt des cncentratins d'auxine et de cytkinine) cntrôlent l'rgangenèse (tige, racines). Objectifs méthdlgiques : Travailler en cnditins stériles Emplyer des techniques expérimentales. Suivre un prtcle. COIN LABORATOIRE : Matériel : Flacns réf , milieux de culture de micr prpagatin (sp1) réf (250 ml) et d enracinement (sp2) réf (600 ml) Autclave réf , Bécher réf.06533, Pinces réf (lt de 10), Scalpel réf , Gants réf , Masque réf (lt de 100), Eau de javel réf , Alcl réf , Eau distillée réf , Bec bunsen réf GN, GPL, Épnge, savn, prduit détergent, Saint Paulia. Armire de culture Réf Vidégramme «la culture in vitr du Saint Paulia» Réf Saint PIERRON Paulia 1 / 14

2 RÉALISATION: Gestin du temps une semaine avant le TP : mécher les buchns, stériliser les flacns et culer les milieux de culture, stériliser eau distillée, stériliser les bites de pétri. Cmpter entre 4 et 6 semaines de dévelppement avant d envisager les phases suivantes, micr prpagatin u enracinement sachant que les dsages hrmnaux des milieux de culture vnt varier. Fiche de préparatin Stérilisatin des flacns bien laver les flacns, puis mettre un buchn de cautchuc percé et ctnné stériliser 20 minutes à l'autclave à 120 C. Préparatin du milieu Les milieux utilisés snt des milieux cmplets déshydratés: mélanger la dse de pudre avec la quantité d'eau distillée nécessaire; chauffer en agitant u au micr-ndes jusqu'à une hmgénéisatin parfaite du milieu; culer le milieu encre chaud dans les flacns de culture (40 ml par flacn); - bien refermer les flacns et les stériliser, placer les flacns inclinés pur permettre une gélificatin laissant une grande surface de cntact avec l'explant et facilitant l'accès. Préparatin d'eau distillée stérile prter 500 ml d'eau distillée à ébullitin pendant 30 minutes dans un balln; fermer le balln avec un buchn de ctn et de gaze recuvert de papier d'aluminium avant sn refridissement; la cnservatin est limitée dans le temps, il faut la préparer la veille des manipulatins. Préparatin de la verrerie stérile prendre de la verrerie parfaitement lavée; pur les tubes, béchers, erlenmeyers, béchers u ballns faire un buchn de ctn et de gaze, recuvrir de papier d'aluminium, passer la verrerie 20 minutes à 120 C à l'autclave. Utilisatin d une armire de culture favrisant l éclairement (15h par jur) et limitant les variatins de température (vacances sclaires). 2/14

3 SÉQUENCE 1 : PRÉLÈVEMENT ET MISE EN CULTURE Étape 1 : manipulatin en cnditins nn stériles prélever une feuille (pas trp grsse) en sectinnant sa tige; bien rincer la feuille à l'eau curante pur la nettyer; plnger la feuille dans une slutin d'un agent muillant pendant 2 minutes; placer la feuille dans une slutin désinfectante pendant 2 minutes; Étape 2 : préparatin du plan de travail stérile désinfecter le plan de travail à l'eau de Javel, puis dispser le matériel suivant le plan prpsé (pur un dritier); se laver les mains à l'eau et au savn, puis avant chaque manipulatin en cnditins stériles les passer à l'alcl (lin du bec Bunsen); allumer le bec Bunsen; travailler assis devant le plan de travail, et à chaque utilisatin de verrerie u d'instruments les passer rapidement dans la flamme avant et après usage; A partir de cet instant les manipulatins se fnt en cnditins stériles les instruments snt stérilisés par le prfesseur par flambage d'alcl à brûler au fnd du bécher 3/14

4 Culture in vitr : agencement du plan de travail Cupelle prte buchn Pt à instruments flambés Flacn stérile avec milieu de culture Slutin de désinfectant Bec bunsen Béchers de rinçage Bite de pétri stérile 15 cm Zne de stérilité 4/14

5 Étape 3 : manipulatins en cnditins stériles Srtir la feuille du désinfectant avec une pince; Tremper la feuille dans le premier bain de rinçage et agiter pur bien rincer, Recmmencer dans les bains de rinçage suivants; Pendant le quatrième rinçage, préparer la bîte de Pétri stérile; Srtir la feuille et la dépser dans la bîte de Pétri; Décuper un carré de 1 cm de côté avec un scalpel stérile; Prendre le flacn de culture et l'uvrir, dépser sn buchn sur une cupelle cntenant un papier filtre imbibé d'eau de Javel; Dépser délicatement l'expiant à la surface du milieu gélsé, face inférieure sur la gélse; Badigenner l'intérieur du cl avec un ctn tige imbibé d'eau de Javel avant de refermer le flacn; Indiquer vs références sur une étiquette à cller sur le fnd du flacn. Le flacn sera dépsé hrizntalement dans une armire de culture dans des cnditins ptimales de température et de lumière pur 4 à 6 semaines... Résultat btenus après 6 semaines de culture : le cal est recuvert de micrfeuilles. 5/14

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7 SÉQUENCE 2 : LA MICROPROPAGATION L'pératin cnsiste à diviser la culture btenue en plusieurs fragments et à les replacer sur un milieu de cmpsitin identique afin de les multiplier. Cette manipulatin s'effectue en cnditins stériles. Culture in vitr : agencement du plan de travail pur micrprpagatin Flacn stérile avec milieu de culture Bec bunsen Cupelle prte buchn Pt à instruments flambés Flacn avec micrfeuilles Bite de pétri stérile 15 cm Zne de stérilité Désinfecter le plan de travail avec de l'eau de javel; Dispser le matériel seln le plan de travail prpsé; Allumer le bec Bunsen; Mettre le masque et se nettyer les mains au savn puis à l'alcl; Ouvrir la bîte de Pétri stérile; Débucher le flacn renfermant la culture et pser le buchn sur un papier filtre imbibé d'eau de Javel; Srtir la tuffe de feuilles avec des pinces passées dans la flamme et la pser sur la bîte de Pétri; Diviser la tuffe en 4 parties avec les pinces et le scalpel passés à la flamme; Dispser 2 fragments dans chaque flacn en prenant bien sin de rester en cnditins stériles; Badigenner les cl des flacns avec de l'eau de Javel avant de les refermer; Cller une étiquette prtant la date et le numér du grupe au fnd du flacn; Les flacns sernt stckés hrizntalement dans les cnditins permettant leur dévelppement pendant 4 à 6 semaines. 7/14

8 SÉQUENCE 3 : L ENRACINEMENT L'pératin cnsiste à diviser la culture btenue en plusieurs fragments et les. replacer sur un milieu de cmpsitin différente afin de les cmpléter par des racines. Cette manipulatin s'effectue en cnditins stériles:. Culture in vitr : agencement du plan de travail pur enracinement Cupelle prte buchn Flacn stérile avec milieu de culture sp2 Bec bunsen Pt à instruments flambés Flacn avec micrfeuilles Bite de pétri stérile Zne de stérilité 15 cm 8/14

9 Désinfecter le plan de travail avec de l'eau de javel; Dispser le matériel seln le plan de travail le plus adapté; Allumer le bec Bunsen; Mettre le masque et se nettyer les mains au savn puis à l'alcl; - uvrir la bîte de Pétri stérile; Débucher le flacn avec la culture et pser le buchn sur un papier filtre imbibé d'eau de Javel; Srtir la tuffe de feuilles avec des pinces passées dans la flamme et la pser sur la bîte de Pétri; Diviser la tuffe en 4 parties avec les pinces et le scalpel passés à la flamme; Dispser un fragments dans chaque récipient en prenant bien sin de rester en cnditins stériles; attentin,ces récipients resternt debut; Badigenner les cls des récipients avec de l'eau de Javel avant de les refermer avec du film transparent; Cller une étiquette prtant la date et le numér du grupe sur une pari du récipient; Les récipients sernt stckés verticalement le temps nécessaire à la frmatin des racines, dans les meilleures cnditins de dévelppement pssible. Résultat après 6 semaines 9/14

10 SÉQUENCE 4 : TRANSFERT EN SERRE Enlever délicatement la plante de sn milieu nutritif pur le dispser dans un gdet empli de terreau de remptage; Placer le u les gdets dans une mini serre bien éclairée 10/14

11 REMARQUES : 1-GESTION DU TEMPS La durée de cette manipulatin est imprtante. L intérêt est dnc de démarrer cette manipulatin le plus rapidement pssible dans l année sclaire : une mise en culture en Septembre permet de récupérer des en Mai. Si n veut sensibiliser les élèves aux bitechnlgies, n peut réaliser les séquences 2 et 3 dans la même séance, une mitié des élèves réalise la séquence 2, le reste la séquence 3 ce qui permet de gagner au mins six semaines. Cette manière de prcéder est intéressante si n veut suligner l influence des hrmnes sur l rgangenèse en utilisant le dcument cmparant la cmpsitin des milieux de culture sp 1 et sp 2. Si l bjectif se limite au clnage, n peut passer directement de la séquence 1 à la séquence 3 2-ACTIVITÉS PÉDAGOGIQUES ASSOCIÉES En fnctin des niveaux et des aptitudes des élèves, n peut leur demander de réaliser Des dessins d bservatin, Des cupes micrscpiques, Des bservatins micrscpiques pur les élèves de première S, ces activités permettent d abrder la ntin de différenciatin cellulaire, sit en réalisant les cupes micrscpiques (mais c est délicat), sit en utilisant des cupes de substitutin (méristème d ail et cupe transversale de feuille) REALISER UN DESSIN D'OBSERVATION (Fiche d'aide méthdlgique) Il dit rendre cmpte de la réalité: ce n'est pas un schéma. SA RÉALISATION : 1- Dessiner ce que l'n vit: chisir un angle, ne rien inventer, ne pas trp simplifier, 2- Déterminer une frme gémétrique simple qui cntient l'bjet à dessiner; 3- Faire la mise en page en dessinant cette frme; 4- Faire une esquisse avec les différentes prprtins; 5- Faire les traits définitifs nets; 6- Mettre une légende; 7- Écrire un titre cmplet. SA PRÉSENTATION : 1- Le titre: suligné et cmplet; 2- La u les marges pur aligner les légendes snt à effacer; 3- Les traits de rappel: hrizntaux, à la règle, ne se crisant jamais; 4- La mise en page crrecte: dessin centré, ccupant tute la place dispnible; 5- Un travail prpre avec des traits nets; 6- Tut écrit au crayn de papier. 11/14

12 2.2- COUPES MINCES D'ORGANES VEGETAUX (Fiche d'aide technique) PRINCIPE: Il faut réaliser des cupes suffisamment minces: pur une bnne bservatin au micrscpe phtnique la lumière dit traverser la préparatin. On btient des cupes transversales si la cupe est réalisée perpendiculairement à l'axe de symétrie. PROCÉDÉS: * Réalisatin de la cupe: Utiliser un bâtn de melle de sureau afin de maintenir l'rgane à cuper: n creuse le bâtn pur cincer l'rgane à l'intérieur; Tenir le bâtn entre le puce et l'index gauche, pérer avec une lame de rasir dans la main drite, une première sectin franche dnnera une surface nette; Exécuter les cupes en imprimant à la lame un déplacement latéral, un peu blique pur que la lame se déplace vers l'pérateur; Les cupes, les plus minces pssible, même incmplètes, snt dépsées dans un verre de mntre rempli d'eau. * Clratin de la cupe: Il s'agit de traiter les cupes afin de visualiser les structures. Elles vnt dnc passer de bain en bain en les prenant délicatement avec des pinces. Eau de javel: elle permet de détruire les cellules en ne laissant que les paris suffisantes pur la déterminatin des tissus; n les y laisse le temps qu'elles se déclrent entièrement; Lavage rapide à l'eau; Passage 4 minutes dans l'acide acétique très dilué (élimine l'eau de Javel et facilite la clratin); Bain dans le vert d'ide une minute, pur clrer en vert les paris lignifiées; Lavage rapide à l'eau; Bain dans le carmin aluné 10 minutes pur clrer en rse les paris pectcellulsiques; Lavage à l'eau; Mnter les cupes entre lame et lamelle dans de l'eau. 12/14

13 2.3- LA DIFFÉRENCIATION CELLULAIRE Pur mieux cmprendre le phénmène bilgique qui permet la culture et sa multiplicatin, nus allns bserver des cellules cmparables à celles du cal, de même type que celles d'un burgen, et cmparables à celles de la feuille. La taille des cellules nécessite l'utilisatin du micrscpe phtnique. On rappelle qu'un ensemble de cellules identiques cnstitue un tissu. Observatin de la préparatin: "cellules méristématiques d'ail": Ces cellules snt semblables à celles rencntrées au niveau du cal. centrer la préparatin avec le faible grssissement; chisir, avec le grssissement myen, un ensemble de 6 cellules situées à prximité de la pinte de la racine; faire un dessin de ces cellules à frt grssissement. Observatin de la préparatin: "cupe transversale de feuille": Ces cellules snt semblables à celles de la micrfeuilles de Saint-Paulia. centrer la préparatin avec le faible grssissement; repérer avec le grssissement myen 3 types différents de cellules; faire un dessin de 3 cellules des 3 types repérés, au frt grssissement. Bilan: Cmparez les cellules crrespndant au cal et les cellules cnstituant les feuilles. Le passage d'une cellule de type cal, à une cellule de type feuille, est un phénmène bilgique fndamental: la différenciatin cellulaire. 3- ÉVALUATIONS Les évaluatins pssibles snt multiples et liées aux différentes activités : Évaluatin du travail en cnditin stérile : la nn cntaminatin est le facteur de réussite. Évaluatin des cupes : respect des cnsignes Évaluatin de l bservatin micrscpique. Évaluatin du suivi des manipulatins : une cmpilatin des phts numériques prises tut au lng des séquences. 13/14

14 Cmpsitin des milieux de culture spécifiques milieu 1 milieu 2 Macr éléments mg/l KNO NH 4 NO MgSO 4, 7 H CaC 12, 2H KH 2 PO Micr éléments Mn SO 4 4H ,3 11,15 ZnSO 4, 7H 2 0 8,6 4,3 H 3 B0 3 6,2 3,1 KI 0,83 0,415 Na 2 MO 4, 2H 2 0 0,25 0,125 CuSO 4, 5H 2 0 0,025 0,0125 CC 12, 6H 2 0 0,025 0,0125 FeNa EDTA 36,7 18,4 Vitamines et acides aminés més-insitl pyridxine 0,5 0,5 acide nictinique 0,5 0,5 thiamine 0,5 0,5 pantthénate de calcium 0,5 0,5 bitine 0,01 0,01 Glucides Saccharse gélse ph 5,7 5,7 Hrmnes auxine (AIA) 0,2 - cytkinine (BAP) 0,2-14/14