Ingénierie moléculaire et cellulaire des anticorps monoclonaux thérapeutiques

Transcription

1 Ingénierie moléculaire et cellulaire des anticorps monoclonaux thérapeutiques - Quelques rappels - Modifications des anticorps - Systèmes d expression mammifères - Modifications cellulaires - Systèmes de production

2 Rappels sur les anticorps recombinants Différents fragments d anticorps monoclonaux utilisés en thérapeutique + Protéines de fusion avec fragments Fc: Etanercept (TNFRc-Fc)

3 Rappels sur les anticorps recombinants Hypermutations somatiques Site de fixation de l antigène = CDR 1,2,3 Ag CDR1 CDR2 CDR3 VL VH

4 Rappels sur les anticorps recombinants Rôle des différentes parties d un anticorps Chimerisation/humanisation

5 Rappels sur les anticorps recombinants Les différents types d anticorps recombinants monoclonaux Ac humanisé Ac humain Induction HAMA (Human Anti-Murine Antibody) Fréquent Induction HACA (Human Anti-Chimeric Antibody) Plus rare Non-immunogènes

6 Modification des anticorps Chimérisation des anticorps 1 Obtention Hybridome Ac de souris Prom VHm CHh polya VHm CHm Prom VLm CLh polya VLm CLm 2 Amplification par PCR des régions variables chaînes lourdes et légères 3 Clonage dans un vecteur d expression possédant les domaines constants humain 4 Transfection dans une lignée productrice VHm VLm Prom VHm Prom VLm CHh CLh polya polya Ac Chimérique

7 Optimisation des anticorps Humanisation Exemple d un anticorps humanisé: anti-cd52 (Campath ou Alemtuzumab) FR1 CDR1 FR2 CDR2 FR3 CDR3 FR4 Rat EVKLLESGGGLVQPGGSMRLSCAGS GFTFTDFY MNWIRQPAGKAPEWLGF IRDKAKGYTT EYNPSVKGRFTISRDNTQNMLYLQMNTLRAEDTATYYC AREGHTAAPFDY WGQGVMVTVSS Campath QVQLQESGPGLVRPSQTLSLTCTVS GFTFTDFY MNWVRQPPGRGLEWIGF IRDKAKGYTT EYNPSVKGRVTMLVDTSKNQFSLRLSSVTAADTAVYYC AREGHTAAPFDY WGQGSLVTVSS -Conservation des séquences animales uniquement dans le site de liaison à l antigène (CDRs): «CDR grafting» -Modification des AA exposés au solvants: «Resurfacing»

8 Optimisation des anticorps Humanisation Phage display Banques de domaines variables humains Ex: Morphosys > 7 VL et 7 VH puis changement CDRs > 1,6x10 10 possibilités

9 Optimisation des anticorps Techniques pour l amélioration de l affinité Mutagenèse aléatoire

10 Optimisation des anticorps Techniques pour l amélioration de l affinité Mutagenèse aléatoire cellulaire - Lignées cellulaires mutagènes (BL-2) IgH BL2 kappa Vecteurs de transfections Induction d hypermutations (Ag + PBL) Test affinité anticorps muté

11 Optimisation des anticorps Techniques pour l amélioration de l affinité Mutagenèse aléatoire Intégrée dans les systèmes de sélection d un anticorps - Hybridomes - Phage display - Ribosome display - RNA display

12 Optimisation des anticorps Techniques pour l amélioration de l affinité Mutagenèse dirigée Nécessite: Structure 3D Permet: Alanine-scanning Mutagenèse combinatoire

13 Rappels sur les anticorps recombinants Rôle des différentes parties d un anticorps Chimerisation/humanisation

14 Optimisation des anticorps Optimisation des régions Fc: rôles sur les fonctions effectrices Importance des interactions Fc/RcFc Permet de déterminer les AA importants dans la fixation de l Ac sur le récepteur Fc Mutagenèse aléatoire ou dirigée Exemple d une interaction avec le récepteur FcRn

15 Optimisation des anticorps Optimisation des régions Fc: rôles sur les fonctions effectrices Mutagenèse dans la région Fc: Amélioration de l ADCC (Fixation sur RcFγIII + RcFγI) Amélioration de la CDC (Fixation à C1q) Mais aussi: inhibition d une fonction ex: Telixizumab (anti-cd3) IgG1 muté pour inhiber ADCC et CDC Optimisation des régions Fc: rôles sur la pharmacocinétique Amélioration de la demi-vie des anticorps par optimisation de la fixation au FcRn PEGylation (ScFv)

16 Récepteurs Fc: activateurs et inhibiteurs CD64 et CD16 (NK): Récepteurs Fc activateurs (ITAM), phagocytose ou cytotoxicité (ADCC) CD32: Récepteurs Fc inhibiteurs (ITIM), rôle dans ma régulation de la réponse immune > Certains allotypes de CD16 fixent moins les IgG: diminution de l ADCC NK

17 Récepteurs FcRn: Néonatal Fc récepteur Rôle dans le transport des IgG de la mère vers l enfant (placenta) Exprimé par les cellules endothéliales et les macrophages: permet le recyclage des IgG après endocytose > augmentation de la ½ vie sérique des IgG

18 Vecteurs d expression Exemple d un vecteur d expression pour cellules mammifères ScaI Amp Promoteur/enhancer intron Heavy Chain polya néo HK bp polya Promoteur/enhancer Promoteur PolyA intron Light Chain polya promoteur DHFR

19 Vecteurs d expression Vecteur générique d Ac recombinant VH Prom/enh polya néo Amp HK bp HC Gamma1 (CH1, 2, 3) polya prom/enh Possibilité d intégrer n importe quel domaine variable promoter PolyA polya Ckappa VL promoter DHFR

20 Vecteurs d expression Les incontournables Amp polya néo promoter PolyA HK bp DHFR Prom/enh intron promoter HC LC polya polya prom/enh intron Promoteurs/Enhancers: hcmv, LTR RSV, pef1α, Eµ/pVH, etc Doivent être testés dans la lignée de production (parfois lignée-spécifique comme Eµ) Enhancers (contiennent des sites de fixations à des facteurs de transcription) peuvent être situés dans le promoteur ou séparément de celui-ci Intron: Placé en amont ou dans le gène d intérêt (jamais après le codon STOP: NMD), Stabilisation et exportation de l ARN. Forte augmentation des taux de production Gène d intérêt: Séquence de Kozak (GCCGCC(A/G)CCATGG), éviter les séquences fortes en GC en amont du site d initiation de la traduction, séquence leader optimale. Site de polyadénylation: BGHpolyA, HGHpolyA, late SV40 polya, polya synthétique, etc Comme pour promoteur, doit être testé dans la lignée de production choisie Gène de sélection: Néo, Puro, Hygro, GPT, etc Sert à sélectionner les clones ayant intégré le vecteur d expression

21 Amp intron HC Vecteurs d expression Prom/enh Les «plus» polya néo promoter PolyA HK bp promoter LC polya polya prom/enh intron Gène d amplification: DHFR (dihydrofolate reductase) ou GS (glutamine synthetase). Systèmes de sélection permettant l amplification du nombre de copies du transgène en présence respectivement de MTX (méthotrexate) ou MSX (methionine sulfoximine) DHFR Gène de sélection «diminué»: permet, en parallèle à des doses élevées d antibiotiques, de cibler des sites à haute activité transcriptionnelle IRES: expression bicistronique de deux gènes. Permet des taux d expression équivalents de deux gènes

22 Modifications cellulaires Simplification et augmentation de la productivité Lignées «taguées» dans un hot-spot de transcription Clone fort producteur Ac n 1 Lignée d expression 1 Transfection transitoire GS Vecteur de ciblage Transfection classique FRT FRT L1 H1 Site d intégration H1 L1 GS Clone fort producteur Ac n 2,, n Site d intégration H2 L2 GS Site d intégration FRT 3 2 Co-transfection avec vecteur Flp GS Vecteur Flp ou Cre Lignée taguée L2 H2 Vecteur d expression nouvel anticorps Autre méthode: knock-in dans site connu (locus Ig par ex.)

23 Modifications cellulaires Augmentation de la productivité Contrôle de l apoptose Surexpression de protéines anti-apoptotiques (Bcl2, Bcl-XL) Diminution de l expression de protéines apoptotiques par ARN interférence (Caspase3) Contrôle de la croissance (biomasse) Inhibition du cycle cellulaire (expression de kinase inhibitrices du cycle cellulaire telles que p21 CIP ou p27 KIP ) Amélioration de la sécrétion Surexpression de protéines chaperones (BiP, HSP70) Amélioration de la transcription Surexpression de facteurs de transcription (SRF, TFII-I, etc )

24 Modifications cellulaires Augmentation de la productivité Leçon de la nature: Mécanismes impliqués dans la transformation des cellules B en usine à anticorps, les plasmocytes UPR: unfolded protein response Blimp1 augmente expression Ig Réponse UPR: XBP1s augmente capacités sécrétoires de la cellule Application aux lignées productrices d Ac: surexpression de XBP1s

25 Modifications cellulaires Optimisation de la glycosylation: rôle sur les fonctions effectrices Surexpression de la GalTIII (beta 1,4 N- acetylglucosaminyltransferase) : amélioration de l ADCC % of lysis E/T= CHO YB2/0 KO ou diminution par ARNi de Fut8: amélioration de l ADCC (Lignées CHO Lec-13, YB2/0 ou KO Fut8) Exemple d ADCC dans CHO versus YB2/0: rôle du fucose mab concentration (ng/ml)

26 Résumé (non exhaustif!) des moyens permettant d améliorer la production des anticorps (et protéines thérapeutiques en général) Voir dia KI ou hot-spots Introns, polya... Bip, Xbp1s, peptide leader, glycosyl transferases, choix lignée Xbp1s, optimisation codons

27 Systèmes de production des anticorps thérapeutiques Lignées mammifères CHO: Chinese Hamster Ovary 70% des anticorps du marché sont produits dans CHO -Bon taux de production, stabilité et connaissance du génome, adhérentes ou en suspension, adaptation aux milieux sans sérum, bien adaptées scale-up (fermenteurs) NSO: Myélome murin non sécréteur d Ig -Bon taux de production, peut servir à fusion avec cellules de souris humanisées, génome moins stable que CHO, uniquement en suspension, adaptation milieu sans sérum plus délicat Sp2/0, YB2/0: hybridomes - Partenaires de fusion avec cellules de souris humanisées, problèmes de stabilité du génome (perte de chromosomes ou du transgène), adaptation sans sérum délicate, peu adaptés au scale-up Autres lignées: BHK21 (hamster), Per.C6 (humaine), EBx (aviaire) Arrivent sur le marché en connaissant les défauts des autres lignées

28 Systèmes de production des anticorps thérapeutiques Les autres systèmes de production Bactéries Levures (glycofi, Glycode) Cellules d insectes Plantes et cellules végétales Animaux transgéniques (GTC Biotech/LFB) Principales difficultés: glycosylations

29 Systèmes de production: Optimisation des milieux Adapter le milieu à la lignée utilisée et au mode de culture (batch, fed-batch etc ) Diminuer ou éliminer le sérum animal (réglementaire et purification)

30 Systèmes de production T-flasks Rollers

31 Systèmes de production Les types de fermenteurs Cuvée (batch) Cuvée-alimentée (fedbatch) Chemostat filtrat Perfusion

32 Systèmes de production Les fibres creuses (hollow fibers)

33 Systèmes de production Bioréaction: les paramètres Température ph (CO2, NaOH) Composition du milieu (Glutamine, Glucose) Agitation Aération (oxygène) Asepsie

34 Congélation MCB/WCB Exemple d étapes nécessaires à la réalisation d une Working Cell Bank (WCB)

35 Amplification par DHFR MTX (méthotrexate) Acide Folique Clone amplifié (x nombre de copies transgène) DHFR Blocage de l enzyme Bases Puriques (Adénine, Guanine) + Thymidine MTX (méthotrexate) Acide Folique DHFR Blocage insuffisant Bases Puriques (Adénine, Guanine) + Thymidine

36 Ciblage de sites à forte activité transcriptionnelle Site à faible activité transcriptionnelle Prom Faible Kozak non optimal NEO polya faible Transcription de Neo insuffisante à forte dose de G418 Site à forte activité transcriptionnelle NEO Transcription de Neo suffisante même à forte dose de G418