1- Quelques rappels d'immunologie Reconnaissance de l'antigène

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1 Immunothérapies anti-tumorales Christine Sedlik, Laboratoire d'immunologie et Inserm U932, Institut Curie Quelques rappels d'immunologie Rationel pour l immunothérapie anti-cancer Différentes stratégies Immunomonitoring Exemples de développements précliniques à l'institut Curie Modèles animaux pour tester les immunothérapies

2 1- Quelques rappels d'immunologie Reconnaissance de l'antigène Capture et dégradation de l antigène

3 Reconnaissance de l'antigène à partir de cellules tumorales cellule tumorale: CMH classe I + CMH classe II gen t- L antigène provient de l intérieur de la cellule CPA: CMH classe I + CMH classe II + Capture et dégradation de - Antigène soluble - Cellules tumorales

4 Légende: 7. Recrutement et activation d effecteurs de l immunité innée et adaptative Granulocyte neutrophile Granulocyte éosinophile Macrophage Cellule dendritique Lymphocyte T CD8+ Lymphocyte B produisant des anticorps 1. Recrutement des cellules du système immunitaire inné Cellule NK Lymphocyte T CD4+ Peptides antigéniques 2. Capture des cellules tumorales mortes et débris cellulaires tumeur 6. Migration vers la tumeur des effecteurs CD4+ et CD8+ 5. Prolifération et activation des lymphocytes T CD4+ et CD8+ 3. Migration des cellules dendritiques vers les ganglions lymphatiques et apprêtement des peptides antigéniques sur les molécules du CMH 4. Reconnaissance de l antigène par les lymphocytes T CD4+ et CD8+ exprimant le bon TCR Ganglion lymphatique

5 Rationel pour l immunothérapie anti-tumorale 1909 : Paul Ehrlich prédit que le système immunitaire contrôle la croissance des carcinomes : Burnet and Thomas expose leur théorie de l immunosurveillance : «les néo-antigènes spécifiques de tumeur peuvent induire une réaction immunitaire efficace qui éliminerait le cancer en développement. Les cellules sentinelles dépendantes du thymus surveillent constamment les tissus de l hôte pour l apparition de nouvelles cellules transformées»

6 Lymphocyte-deficient mice are highly susceptible to MCA-induced tumour development Days post MCA treatment Shankaran et al. Nature 2001

7 Rationel pour l immunothérapie anti-tumorale 1909 : Paul Ehrlich prédit que le système immunitaire contrôle la croissance des carcinomes : Burnet and Thomas expose leur théorie de l immunosurveillance : «les néo-antigènes spécifiques de tumeur peuvent induire une réaction immunitaire efficace qui éliminerait le cancer en développement. Les cellules sentinelles dépendantes du thymus surveillent constamment les tissus de l hôte pour l apparition de nouvelles cellules transformées» augmentation de la fréquence des cancers en cas d immunosuppression: chez les patients immunodéprimés (déficits immunitaires congénitaux, SIDA, traitements immunosuppresseurs): augmentation des cancers (sarcome de Kaposi, lymphome B-EBV ) chez les patients traités par immunosuppresseurs pour les transplantations d organes: sur 20 ans, 40% développent un cancer (corrélé à la dose d imm.suppresseurs et à la molécule) (Stallone N Eng J Med 2005) théorie de l immunoediting (R. Schreiber et al.)

8 théorie de l immunosurveillance et immunoediting Dunn G.P Schreiber R.D Immunity phase infra-clinique phase clinique

9 15-20% of cancers

10 Réponse immune et cancer Réponses immunes naturelles contre des Ag de tumeurs donc le système immunitaire «voit» les tumeurs: patients atteints de mélanome: des régressions spontanées et vitiligo (réponse d autoimmunité anti-mélanocyte) Présence d'anticorps de type IgG contre les Ag tumoraux (p53, HER2/neu, Muc 1, GD2, NY-ESO1, HU, Cyclin B1, c-myc, IMP1, Koc, p62, survivin) dans le serum des patients cancéreux = traduit des réponses B et CD4 Présence de lymp T CD4 et/ou T CD8 dans le sang ou les TIL de patients (Cancer-testis antigen: Mage family, NY-ESO1 // Tumor differentiation antigens: Melan A, Tyrosinase, PSMA // Self antigens: Muc 1, HER-2/neu, Proteinase 3, survivin // Viral Ag)

11 Réponse immune et cancer Réponses immunes naturelles contre des Ag de tumeurs donc le système immunitaire «voit» les tumeurs: patients atteints de mélanome: des régressions spontanées et vitiligo (réponse d autoimmunité anti-mélanocyte) Présence d'anticorps de type IgG contre les Ag tumoraux (p53, HER2/neu, Muc 1, GD2, NY-ESO1, HU, Cyclin B1, c-myc, IMP1, Koc, p62, survivin) dans le serum des patients cancéreux = traduit des réponses B et CD4 Présence de lymp T CD4 et/ou T CD8 dans le sang ou les TIL de patients (Cancer-testis antigen: Mage family, NY-ESO1 // Tumor differentiation antigens: Melan A, Tyrosinase, PSMA // Self antigens: Muc 1, HER-2/neu, Proteinase 3, survivin // Viral Ag) Le système immunitaire est rarement spontanément efficace notamment par les mécanismes de tolérance active car la tumeur = tissu normal (souvent!)

12 Immunothérapie des tumeurs définition: Stratégie thérapeutique qui vise à stimuler/renforcer le fonctionnement du système immunitaire, pour lui permettre de reprendre le dessus contre le cancer. Ces traitements n agissent pas directement sur les cellules tumorales. Approches thérapeutiques très variées: - passsive: Acs monoclonaux - active: induction de réponses immunitaires: - stimulation globale du système immunitaire (cytokines), - vaccination thérapeutique spécifique d antigène.

13 Immunothérapie des tumeurs Traitement préventif = avant que la pathologie ne soit détectée vaccination classique contre les maladies infectieuses, rarement possible pour les cancers SAUF pour les cancers viro-induits (env. 15% des cancers) Efficacy of anti-hpv prophylactic vaccines in patients negative for HPV16 and 18 at inclusion Gardasil (Merck) : HPV6,11,16,18 Vaccine group Placebo External anogenital and vaginal lesions 0 60 Cervical lesions 0/ /2258 (Garland SM N Engl J Med 2007) Cervarix (GSK) : HPV16, 18 Vaccine group Placebo CIN2+with HPV16 or HPV18 DNA in lesion 2 * 21 Long lasting Infection (> 12 months ) 11/ /3437 (Paavonen J Lancet 2007)

14 Immunothérapie des tumeurs Traitement préventif = avant que la pathologie ne soit détectée vaccination classique contre les maladies infectieuses, rarement possible pour les cancers SAUF pour les cancers viro-induits (env. 15% des cancers) Efficacy of anti-hpv prophylactic vaccines in patients negative for HPV16 and 18 at inclusion Gardasil (Merck) : HPV6,11,16,18 Vaccine group Placebo External anogenital and vaginal lesions 0 60 Cervical lesions 0/ /2258 (Garland SM N Engl J Med 2007) Cervarix (GSK) : HPV16, 18 Vaccine group Placebo CIN2+with HPV16 or HPV18 DNA in lesion 2 * 21 Long lasting Infection (> 12 months ) 11/ /3437 (Paavonen J Lancet 2007) Traitement thérapeutique = lorsque la tumeur est déjà établie, stade variable

15 Différentes stratégies d immunothérapie des tumeurs Transfert d effecteurs Anticorps (pourrait aussi générer indirectement une réponse cellulaire) Lymphocytes T CD8 ou CD4: lymphocytes spécifiques de la tumeur du patient prélevés et amplifiés ex vivo ± activation, avant d être re-injectés au patient. Des réponses encourageantes sur des grosses tumeurs Immunothérapie non-spécifique d antigène pour augmenter l activité globale du système immunitaire IL-2, IFN- Efficace dans certains cas mais beaucoup d'effets II aires Immunothérapie spécifique d antigènes tumoraux pour générer une réponse immune Réponse cellulaire nécessaire Identification des antigènes tumoraux, choix des Ag préférentiellement tumeur spécifique choix du système vaccinal Suivi de la réponse anti-tumorale (= immunomonitoring)

16 Anticorps monoclonaux l Ag cible est exprimé - à la surface des cellules tumorales, - spécifiquement sur les tumeurs les Ac sont ± humanisés à partir d Ac produits chez la souris efficacité prouvée et certains en traitement clinique: Trastuzumab = Herceptine : anti-her2/neu (cancer du sein) Rituximab: anti-cd20 (lymphomes B folliculaires) Cetuximab (Erbitux ): anti-egf-r1 (carcinome du colon) bevacizumab, Avastin : anti-vegf-a (cancer du colon metastatique) gemtuzumab: anti-cd33, Alemtuzumab: anti-cd52 (Acute Myeloid Leukemia) ) ipilimumab: anti-ctla4 (mélanome) le dernier approuvé par la FDA mécanismes d action: - Effet direct: * blocage du récepteur d'un facteur de croissance * Induction d'un signal d'apoptose - Effet indirect: * médié par le complément * ADCC (macrophages, NK), autres médiateurs de l'immunité innée

17 Anticorps monoclonaux développement en cours: - comme agent de ciblage de la tumeur: Ac conjugués à des agents cytotoxiques ou des radioisotopes - Nouveaux anticorps contre de nouvelles cibles (J.M. Richert. mabs 2011, 3:76) - La cible pourrait être soluble ou de localisation intracellulaire et pas seulement membranaire (K. Guo et al. Sci Transl Med 2011, 3:99ra85) - Anticorps bivalent (anti-cd3 et anti-cible tumeur spécifique) - Association anticorps et thérapeutiques conventionnelles (radiotherapie, chimiotherapie)

18 Immunothérapie spécifique d Ag de tumeurs: vaccination thérapeutique DLN V DLN T Vaccin Méta. Tumeur Antigène doit être exprimé par la tumeur sous une forme visible par le système immunitaire: expression de complexes HLA-peptide spécifique des antigènes tumoraux par les cellules tumorales ou le stroma But de la vaccination: Générer une réponse CD4 Générer une réponse CD8 cytotoxique Les effecteurs doivent aller dans la tumeur ou les métastases Les effecteurs doivent être efficaces et absence de suppression La tumeur doit être reconnue et sensible aux effecteurs

19 vaccination thérapeutique: différentes stratégies cellules dendritiques: différenciées ex vivo et chargées avec du lysat tumoral du patient (syngénique) ou une lignée tumorale allogénique ou des peptides ou du RNAm ou des exosomes vecteurs viraux: plutot assez immunogènes mais reponses importantes contre le vecteur viral, problème de sécurité protéines recombinantes: induit de bonnes réponses Ac mais peu de réponses cellulaires T CD8 peptides courts (correspondants aux epitopes minimum des antigènes): peu immunogènes, suit la restriction HLA de chaque patient, mais peu couteux long peptides: les épitopes CD4 et CD8 sont contenus dans le même peptide pour être plus efficace que les peptides séparés ADN: à nouveau prometteur grâce à l amélioration des technologies de transfection in vivo

20 vaccination thérapeutique: différentes stratégies cellules dendritiques: différenciées ex vivo et chargées avec du lysat tumoral du patient (syngénique) ou une lignée tumorale allogénique ou des peptides ou du RNAm ou des exosomes développement de cellules dendritiques pour l application thérapeutique vecteurs viraux: plutot assez immunogènes mais reponses importantes contre le vecteur viral, problème de sécurité patient avec tumeur protéines recombinantes: induit monocytes de bonnes réponses Ac mais peu de réponses cellulaires T CD8 + cytokines Différentiation Ex-vivo des CD peptides courts (correspondants aux epitopes minimum des antigènes): peu immunogènes, suit la restriction HLA de chaque patient, mais peu couteux Réinjection + antigène(s) tumoral long peptides: les épitopes CD4 et CD8 sont contenus dans le même peptide des CD autologues pour être plus efficace que les peptides séparés manipulées ex-vivo GM-CSF + IL-4 CD chargées ADN: à nouveau prometteur grâce à l amélioration + signal de des maturation technologies de transfection in vivo TNF-a, CD40L CD matures chargées

21 vaccination thérapeutique: différentes stratégies cellules dendritiques: différenciées ex vivo et chargées avec du lysat tumoral du patient (syngénique) ou une lignée tumorale allogénique ou des peptides ou du RNAm ou des exosomes vecteurs viraux: plutot assez immunogènes mais reponses importantes contre le vecteur viral, problème de sécurité ADN: à nouveau prometteur grâce à l amélioration des technologies de transfection in vivo protéines recombinantes: induit de bonnes réponses Ac, des réponses CD4 mais peu de réponses cellulaires T CD8 peptides courts (correspondants aux epitopes minimum des antigènes): peu immunogènes, suit la restriction HLA de chaque patient, mais peu couteux long peptides: les épitopes CD4 et CD8 sont contenus dans le même peptide pour être plus efficace que les peptides séparés amélioration par le ciblage vers les DC (couplage Ag/anti-DEC205, /anti-dc-sign, /toxines (CyaA, Shiga toxine))

22 Néanmoins, la plupart des vaccins utilisant des peptides ou protéines n induisent pas de réponses T CD8 cytotoxiques suffisantes, Adjuvants nécessaires pour augmenter l efficacité de nombreux vaccins antigène-spécifique, augmentation du recrutement et /ou de l activation des CPA: - huile minérale (IFA, Montanide) - cytokines: GM-CSF, IFN-a - anti-cd40 - ligands de Toll-like-recepteurs: - CpG -poly-ic

23 comparaison d adjuvant associé à un vaccin peptidique CD8+ T-cell responses against tyrosinase (370D) peptide in HLA*A0201+ melanoma patients dérivé végétal, saponine-like Schaed S.G. Clin Cancer Res 2002, 8:967.

24 Immunothérapies actives : quelques exemples le 1 er vaccin therapeutique anti-cancer autorisé par la FDA produit par une société privée Sipuleucel-T (Provenge de Dendreon): pour les cancers de la prostate métastatiques hormono-resistants, PBMC autologues du patient activés ex vivo avec la proteine de fusion Ag tumoral (PAP)/ GM- CSF, puis re-injection au patient (contient des CPA et des effecteurs) essai de phase III: vaccin contre placebo, peu de regression tumorale et pas de benefice sur la progression sans tumeur MAIS «overall survival» de 4,1 mois patients Kantoff et al. New Engl. J.Med. 2010, 363:411

25 Les lymphocytes T peuvent exprimer des récepteurs inhibiteurs expliquant leur incapacité à répondre

26 Immunothérapies actives : quelques exemples blocage de CTLA-4 par anticorps, approuvé depuis sept Ipilumimab (Bristol-Myers Squibb): pour les mélanomes métastatiques - aucun effet de l Ag tumoral (gp100) - presque doublement de la survie à 1 an ou 2 ans - des patients encore en vie à 4,5 ans Hodi F.S. et al. New Engl. J.Med. 2010, 363:711

27 Pourquoi l immunothérapie n a pas plus de succès? - les cellules tumorales développent des mécanismes d echappement au SI (perte d expression des CMH classe I ) - de nombreux mécanismes sont capables de bloquer l activation du système immunitaire Lizee, G. et al. Clin Cancer Res 2007

28 comment améliorer l immunothérapie? induction de réponses cellulaires T CD4 / T CD8 et production d Ac mais aussi: Association à des inhibiteurs des mécanismes de suppression ou de résistance (blocage de CTLA4 ou PD-1, déplétion des Treg ou des macrophages suppresseurs, etc ) identifier de nouveaux adjuvants déterminer les meilleures doses / meilleur calendrier de traitement (approche différente des traitements de cancers par les chimiothérapies) sélectionner les patients les plus appropriés à chaque immunothérapie (étude des «signatures moléculaires» des cancers suggérant des traitements personnalisés) association de l immunothérapie avec chimiothérapie ou radiothérapie (dites thérapies conventionnelles) association de l immunothérapie avec les «petites molécules» ciblant des voies de signalisation (inhibiteur de tyrosine kinase )

29 But: comment mesurer l efficacité de l immunothérapie? Monitoring de la réponse immune anti-tumorale spécifique Avant traitement : existe-t-il des lymphocytes T spécifiques? Après traitement : leur fréquence ou leurs caractéristiques sont elles modifiées? Comprendre les raisons des succès et des échecs des immunothérapies De nombreuses questions Où? Sang, tumeur, ganglion drainant, site d'injection du vaccin Quand? 7, jours après immunisation? Quelle type de réponse : CTL, lymphokine (TNF, IFNg, IL-2) Quelle technique : sensibilité / spécificité Affinité des TCR détectés

30 Monitoring de la réponse immune anti-tumorale spécifique Fréquences des lymphocytes T antitumoraux sont 100 à fois plus faibles que pour les réponses antivirales!!! donc diffile à détecter Techniques classiques non adaptées: Mesure de la prolifération lymphocytaire Tests de cytotoxicité Techniques modernes pas toujours assez sensible Tétramères Elispot Immuno-fluorescence intra-cytoplasmique pour les cytokines, captures des cytokines et billes magnétiques Microcultures (pseudo-dilution limite) Expansion des précurseurs pendant 15 jours: les effecteurs peuvent ils proliférer in vitro? Technique très lourde: un prélèvement = 3 semaines pour 1.5 technicien lecture en tétramère Nécessité de consensus techniques internationaux pour comparer les essais cliniques

31 tetramères fluorescents : miment les complexes CMH-peptide et reconnaissent les lymphocytes T CD8 de la spécificité cherchée

32 Utilisation de tétramères

33 ELISPOT détection du nombre de cellules produisant une cytokine Sur lymphocytes totaux + peptides Sur Lymphocytes CD8 ou CD4 purifiés + APC + peptides Cellules Culture Révélation Anti-IFN- coaté lympt déposés bruit de fond 3-10 spots sensibilité = 1/ max

34 Monitoring of CD4+ T cell responses Intracellular cytokine analysis cells antigen FACS assay ELISPOT cells + antigen Sensitivity of detection : 5x10-5 Coat antibody and add immune cells stimulation Inhibition of vesicular transport Cytokine release and capture Permeabilize, add MoAbs Add biotinylated antibody and avidin-enzyme conjugate analysis Cytokine Secretion Assay cells antigen Diapo fournie par P. Van Der Brugen stimulation labeling with Cytokine secretion period fluorescent labeling Catch Reagent

35 Principe des microcultures pour amplifier des lympt Ag-spécifiques très rares

36 Immunothérapies actives à l'institut Curie essais cliniques chez les patients: Vaccination par peptides courts (8-9 AA) dans les mélanomes cutanées et oculaires (achevé, pas de réponses cliniques corrélées à une réponse immune) - Longs peptides dans les cancers du col utérin Développement préclinique pour le mélanome oculaire D'un long peptide chimérique De vaccination ADN Validation de ces stratégies en utilisant des modèles animaux pertinents

37 Why long peptides? Long peptides advantages: MHC class I and II epitopes on the same molecule and presented on the same APC CD4 display anti-tumor activity CD4 help is necessary for CD8 effector functions Endocytosis and intracellular processing leading to preferential presentation by the "best" APC: Dendritic cells Easy and «cheap»(?!) production for clinical applications

38 C. Melief unpublished results Based on the experience from K. Melief (Leiden, Netherlands) 13 overlapping AA HPV 16 E6 et E7 peptides Montanide Isa 51 (only emulsion, not an immune adjuvant) 4 injections ex: Protéine E6 d'hpv 16 9 peptides synthétiques de 25 à 32 AA et se recouvrant de 14 AA Good tolerance with some clinical responses ( Advanced cervical cancer (48 pts): 1 CR (26 mo), several >18 mo SD, VIN (19 evaluable patients): 12 complete long lasting CR, 4 PR, 3 PD, Cervical cancers (adjuvant setting): on-going) and Immune responses (multi-epitopic and multi-cytokine immune responses, Strong CD4 responses, smaller CD8 responses, Increase in Treg numbers: to be confirmed)

39 The Curie Experience: Early recurrence of cervical cancer D0 D7 D49 D91 D133 D161 Leucopheresis 300 µg/peptide 100 µg/peptide 100 µg/peptide 100 µg/peptide Leucopheresis SC in Montanide Isa 51 PBMCs Freezing -> 84 amp. 20 x 10.6 cell Proliferation assay : Peptides HPV16 E6/ E7 Influenza MRM Proliferation assay IFN-g Elispots : Peptides HPV16 E6/ E7 Influenza MRM 4 inclusions No clinical response

40 neg neg Pool 1 Pool 2 Pool 3 Pool cpm neg neg Pool 1 Pool 2 Pool 3 Pool cpm 8 x 10 4 Pre vacc. Proliferative response E6 E7 FLU 8 x 10 4 Post vacc E6 E7 FLU

41 spots / PBMCs spots / PBMCs IFN- vaccinal response: D0 2 x 10.5 cell/96 wells in SYN-H long peptides: 5 µg/ml proteins: 20 nm 24H ELISPOT measurement of specific spots 250 protein 200 Peptides(22 AA) PRE E6 E7 MRM 0 E6 overlapping long peptides E7 overlapping long peptides NS POST E6 E7 MRM E6 overlapping long peptides E7 overlapping long peptides NS

42 Immunomonitoring long peptide HPV trial Strong immune response in 4 out 4 patients: 1/1 000 > f > 1/ Proliferation Th1 et Th2 lymphokine secretion Multiple epitopes. Mostly CD4, can be measured ex vivo No detectable CD8 response when using 22 AA peptides No in vitro presentation? Not detectable because of the strong CD4 response? True absence of response?

43 Pre-clinical validation of chimeric long peptide to vaccinate patients with metastatic ocular melanoma LP48 CD8 epitope NA17-A 1-11 CD4 epitope EBV derived * expressed in 50% of melanomas 100% of occular melanomas *HLA-A2 restricted *coded by a cryptic promotor located in an intron * not detected at mrna level in normal tissues * viral antigen, non tumoral * recognized in several HLA haplotypes: DR52a, 52b, 52c, DR7, DQ2, DQ7, DR1, DR16 * epitope recognized by 40% of EBV seropositives donors * could activate memory CD4 TH1 cells

44 Is our synthetic peptide LP48 a good candidate for tumor vaccine? 1/ presentation of the long peptide to CD4 T cells? Done to CD8 T cells Done? 2/ Is the long peptide able to induce in vitro priming of naive T cells? Done 3/ in vivo immunogenicity of the long peptide using human HLA transgenic mice: Done 4/ Improving the immunogenicity of the long peptide by covalent linkage to TLR ligand(s) Ongoing 5/ Testing the anti-tumor activity using a spontaneous tumor model expressing the human tumor Ag in an human MHC context In preparation

45 immunogénicité In vivo du long peptide Na-17 modèle experimental: Ag tumoral humain (Na-17) à injecter dans des souris pour évaluer la réponse immune donc nécessité d utiliser des souris exprimant des CMH humaines: A2 + /DR1 + murine MHC KO CD8/CD4 Long peptide Day 0 Day 14 Day 21 Spleen Day 28 Directly ex vivo: tetramer, -IFN + in vitro restimulation: tetramer, -IFN

46 CD8 CD8 In vivo immunization with Na-17 long peptide in A2 + /DR1 + murine MHC KO mice PBS Ex vivo tetramer-na17/a IFN

47 Couplage covalent du long peptide à des ligands de TLR CpG oligo, TLR-9 ligand Or Pam3CysS lipid, TLR-2 ligand Or Flagellin (TLR-5 ligand) or Poly IC (TLR-3 ligand) LP48 increase of DC maturation increase of specific CD4 or CD8 T cells activation by CpG-LP conjugate en cours

48 DNA vaccination Flexibility of the sequence, several constructs can be easily associated (containing several antigens ± targeting sequences) Easily produced commercially. Cost efficient (relatively) More secure than viral vectors Administration with electroporation was shown to be 10 to 50 fold more efficient than naked DNA combination with chemotherapy to increase the antitumor efficacy If efficiency high enough, the dose required for efficacy in mice could be transposed to humans

49 Pre-clinical evaluation of the vaccine for antitumor responses is required to define the optimal combination 1/ Transplantable tumor systems (cell lines) Advantages: Ag is well defined (transfected) Ag is expressed only by the tumor cells Availability of Ag specific TCR Tg cells Easy, synchroneous tumors, rapid growth Problems: Genetic differences (minor Histocompatibility Ags) with the host mouse Tumor graft starts with thousands cells Vasculature is different from spontaneous tumors At the time of implantation Traumatism Ag release Leading to immune activation

50 Pre-clinical evaluation of the vaccine for antitumor responses is required to define the optimal combination 1/ Transplantable tumor systems (cell lines) Advantages: Ag is well defined (transfected) Ag is expressed only by the tumor cells Availability of Ag specific TCR Tg cells Easy, synchroneous tumors, rapid growth Problems: Genetic differences (minor Histocompatibility Ags) with the host mouse Tumor graft starts with thousands cells Vasculature is different from spontaneous tumors At the time of implantation Traumatism Ag release Leading to immune activation 2/ Induced spontaneous tumors Advantages: more relevant to physiological tumors: tumor architecture and vascularization no artefact due to the graft of a great number of exogenous cells Problems: No identified antigen Expression of the oncogenic Ag (when immunogenic) - long time lapse to the development of a detectable tumor

51 induced spontaneous tumor: Conditional activation of oncogenic K-ras genetically modified mice +/ * Lung (inhale) 1 STOP * 1 K-ras LSL strain CRE Cre-mediated recombination 1 * 1 Expression of oncogenic K-ras and lung tumorigenesis

52 New induced spontaneous tumor systems expressing nominal antigens (T. Jacks lab, MIT, Boston) STOP K-RasG12D p53 Luciferase antigen SIN-LTR SIN-LTR Cre W intranasal administration Lentivirus Lung tumors with luciferase and Ag expression K-RasG12D

53 Acknowledgments Institut Curie / INSERM U932 Alexandra Jacquet Nathalie Joncker Julie Helft Hiroshi Kitamura Lea Torrieri Heloïse Flament Virginie Premel Christine Sedlik Jordan Denizeau Philippe de la Rochere James Vigneron Isabelle Peguillet Delphine Robert Collaborators T. Jacks (MIT) A. Cheung M. Dupage J. Disanto (Pasteur) M. Albert (Pasteur)