Ecosystèmes microbiens des laits crus : un trésor et un challenge pour le fromager

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1 UMR STLO Science et Technologie du Lait et de l Oeuf Ecosystèmes microbiens des laits crus : un trésor et un challenge pour le fromager Sylvie Lortal 5 mars

2 Eau ( g/l) Le lait une matière première d une richesse exceptionnelle Proteines (32-35 g/l) Caseines (80%) Minérals(8-9 g/l), vitamines, Lipides / globules gras (34-44 g/l) Lactose (48-50 g/l) Proteines sériques (20%) qui n est pas faite pour se retrouver àl air libre. ph neutre aw élevée «stérile»mais se contamine donc rapidement par les microorganismes environnants 2

3 Salque M. et al., Nature, ans Croisades & Moines Femmes & diversification 100 % de fromages à partir de lait cru Héritage gastronomique et culturel précieux 1ère AOC 1925 Monde France 0-100% (PVD) 15% des fromages au lait «cru» JC Pasteurisation µbio pasteurienne Révolution : écologie moléculaire «les responsables de la fermentation semblent être de petits corps en forme de filaments» 3

4 Pourquoi un trésor?! Zéro levain! Qualité Préparation Lait cru Cond. d affinage Lait Ecosystème microbien Technologie Matrice fromage Protéolyse Lipolyse Catabolisme aa Acidification Apport d enzymes clés Biodiversité Sécurité Qualités organoleptiques 4

5 Pourquoi un challenge? Pas que des flores utiles + biodiversité espèces / souches Ecosystème microbien du lait cru Flores d altération Pseudomonas Acinetobacter Aeromonas Chryseobacterium Clostridium Bacillus Phages.. Flores utiles Lactococcus Lactobacillus Streptococcus Leuconostoc Enterococcus Propionibacterium Yeasts. Flores pathogènes Listeria Staphylococcus Campylobacter Salmonella Mycobacterium E. coli Fungi alfatoxines.. 5

6 Pourquoi un challenge?! Origine multi-factorielle / flux microbiens?? Batiments Animal Air, eau Fermier mamelle Herbe, sol Machine à traire Ustensiles (bois) Dynamique dans le temps Flores d altération Ecosystème microbien du lait cru Flores utiles Température de stockage Flores pathogènes 6

7 Devant tant d incertitudes, d absence de contrôle.. devant une pression médiatique croissante / sécurité. devant les changements d échelle qu impose l industrialisation Accroissement drastique de l hygiène Ecosystème microbien du lait cru Lait cru < /ml Perte d un log en 15ans* Microfiltration Traitement thermique 7

8 Lait cru Naturels Qualité Préparation Lait Cond. d affinage Lait Standardisation Ecosystèmes Matrice fromage Protéolyse Lipolyse Catabolisme aa Lait Traité thermiqueme nt Levains «Industriels» Traitement thermique + pratique d addition de levains Industriels a considérablement diminué la biodiversité microbienne à la disposition du fromager Qualités organoleptiques 8

9 Jusque dans les années Toutes les connaissances concernant les microorganismes du lait cru et les fromages qui en sont issus étaient obtenues par méthodes dite culture dépendante Soit 125 ans de microbiologie pour l essentiel Pasteurienne Bonne connaissance des flores utiles du lait cru, bactériennes surtout Bonne connaissance des flores pathogènes du lait cru Quelques connaissances sur flores d altération Bien peu au final sur l écosystème microbien du lait cru 9

10 Approches moléculaires directes - une révolution PCR 1990 Début du séquençage des génomes microbiens LAB Apparition techniques de séquençage à haut débit 2000 Explosion des séquences et des génomes microbiens de référence Exploration sans a priori des écosystèmes du lait cru et des fromages 2014 Extraction directe ADN/ARN microbien à partir du lait ou du fromage Approche métagénomique 10

11 Quels outils aujourd hui? ADN Amplicons ADNr 16S-23S séparation par TTGE, DDGE, SSCP pré-identification par bandes de référence identification par séquençage de bandes intéressant comparaison échantillons mais sensibilité et précision imparfaite ARN Métagénomique Séquençage à haut débit et identification via séquences de référence (database) grand nombre d échantillons possibles (code barre) Pyroséquençage - «Targeted» métagénomique. Métatranscriptomique quelles espèces sont les plus actives métaboliquement? Quels gènes exprimés? 11

12 Migration de fragments d ADN amplifiés en TTGE Haut GC % Bas GC % 4 fromages Différentes espèces en mélange Une bande = une ou plusieurs espèces Détection des espèces dominantes profondeur 1 /100 e Identification présumée MAIS +++ pour comparer échantillons Parayre et al., Lb. helveticus, Strep. thermophilus, Lac. lactis, L. fermentum, P.freuderechii 2- Lb. helveticus, Strep. thermophilus, Lac. lactis, L. fermentum, Leuconostoc 3-Lb.paracasei, Lb. reuteri, Lb. plantarum, Ent. fecaelis 4- Lb. fermentum 5- Lb. plantarum 6- Lb. helveticus 7- Ent. fecaelis 8-Lc. lactis 9- Leuconostoc 10- Strep. thermophilus 11- Lb. reuteri 12- Lb.paracasei 13-PF 14- Fromage Prato A 15-Fromage Prato B 16- Fromage Prato C 17- Fromage Prato D

13 Illustrations récentes Ecosystèmes lait cru d une exploitation sur un an Importance des pratiques de traite Importance des ustensiles en bois Laits crus et fromages ANR Food microbiome 13

14 Exemple 1 : Biodiversitébactérienne de laits crus observée par clonage et séquençage des ADNr 16S Analyse intra exploitation (expérimentale caprine) sur un an 118 échantillons de lait cru Grande diversité de populations microbiennes 7 espèces de bactéries lactiques 27 espèces de bactéries non lactiques Gram positives 13 espèces de bactéries Gram négatives 11 espèces de levures Surprises? Coryne, gram-négatives, halophiles! Changement des profils microbiens ( bactéries levures) en fonction des saisons associés àdes changements d alimentation, de volume de production de lait Changement ponctuel àl intérieur d une saison Montel MC INRA Aurillac Danish raw milks / Masoud et al., 2012 Food Microbiol., 25. Lait de vache séquençage haut débit : 256 espèces microbiennes 14

15 uncultured Flavobacteriaceae Chryseobacterium unidentified Proteobacteria Sphingobacterium sp. division TM7 uncultured Clostridiaceae/ Ruminococcus/ fecal bacterium Alcaligenes sp. Enterobacter cloacae Acinetobacter sp. Arthrobacter arilaitensis ou nicotianae swine manure pit bacterium Questions des bactéries Gram( ) 3 articles en 2012 Ralstonia pickettii S. thermophilus Streptococcus dysgalactiae Lactococcus lactis Montel M-C / Callon

16 Do milking practices influence the bacterial diversity of raw milk? Verdier Metz et al Food Microbiol., 25. OUI!!! 67 laits crus / savoie et Haute savoie Analyse SSCP Facteurs : pratiques hygiéniques / trayon et / machine à traire 3 groupes de Laits crus par SSCP, seulmt 2 dominés par bactéries lactiques Écho àmichel et al via méthodes cultures dépendantes. «la flore microbienne des laits crus de vache : diversitéet influence des conditions de production». 16

17 Exemple 2 : Biodiversitémicrobienne apportée par les systèmes traditionnels tels que outils en bois en contact avec le lait cru Cuves Planches Emballage Vacherin Mont d or 17

18 AEM, 2007 TINA PCR-TTGE S. thermophilus Absence complète de pathogènes Lortal et al., IJFM. 18

19 Rôle technologique majeur de ce biofilm lactique Acidification spontanée 37 C (CINAC) Lait stérile Lait après 10 min de contact / ensemencement LAB par biofilm surface Tina biodiversité 3 tinas Salers en 2011 idem Caciocavallo en 2012 idem A G R I C U L T U R E DIET E N V I R O N M E N T 19

20 ST38 JIM10033 H-S Fr. start ST38 JIM10022 H-S Fr. cooked pr. ch. 200 ST38 JIM10026 H-S Fr. cooked pr. ch. 200 ST103 CNRZ1579 Lombardia It. soft ch. 19 ST19 CNRZ1120 Fr. Comte ch. start ST14 CNRZ24B Jura Fr. Comte ch. start. 1 ST56 CNRZ779 Fr. start ST56 CNRZ160 Fr. yog. start ST5 JIM7455 Fr. start. ST5 CNRZ404 Fr. yog. start ST5 CNRZ1588 Lombardia It. soft ch ST5 CNRZ1066 Fr. yog. start Unpublished data ST14 CNRZ456 Jura Fr. Comte ch. start. 1 ST14 CNRZ21 Jura Fr. Comte ch. start. 19 ST38 JIM10037 H-S Fr. start ST46 JIM10114 Fr. start ST97 JIM10156 Fr. ch ST24 CNRZ388 Fr. yog. start ST52 JIM10093 H-S Fr. whey 1984 ST57 CNRZ446 Fr. yog ST24 CNRZ386 Fr. yog. start ST15 CNRZ1447 Dahli India ferm. milk 199 ST111 JIM9156 Eg. trad. Kariesh ch ST111 JIM10176 Eg. trad. Kariesh ch. 200 ST49 JIM10076 H-S Fr. whey 1985 ST54 JIM10100 Fr. milk 2001 ST59 CNRZ403 Fr. yog. start ST6 LMG18311 UK yog ST59 CNRZ389 Fr. yog. start ST65 JIM1004 Bulg. env. ST105 CNRZ406 Sarthe Fr. start ST9 CNRZ385 Japan sweet yog ST109 JIM9160 Eg. trad. Laban Rayeb ch. ST4 JIM7446 Fr. start. ST17 CNRZ1595 Austria Emm. ch ST65 JIM10155 S Fr. milk 2009 ST7 CNRZ759 Bulg. yog. start ST65 CNRZ778 Kondareva Bulg. yog. start. ST108 JIM10174 Eg. trad. Kariesh ch. 200 ST114 JIM9154 Eg. trad. Kariesh ch ST116 JIM10180 Eg. trad. Laban Rayeb ch. ST112 JIM10177 Eg. trad. Kariesh ch. 200 ST113 JIM10178 Eg. trad. Kariesh ch. 200 ST94 JIM9139 Eg. trad. Zabady ch ST26 JIM10119 India trad. ch ST107 JIM10173 Eg. trad. Laban Rayeb ch. ST106 JIM10169 Eg. trad. Laban Rayeb ch. ST106 JIM10171 Eg. trad. Kariesh ch. 200 ST108 JIM9150 Eg. trad. Laban Rayeb ch. ST106 JIM9151 Eg. trad. Kariesh ch ST106 JIM10170 Eg. trad. Laban Rayeb ch. ST106 JIM10172 Eg. trad. Kariesh ch. 200 ST39 JIM10106 Fr. start ST39 JIM10089 H-S Fr. whey 1985 ST40 JIM10095 Fr. wet ch ST39 JIM10059 S Fr. whey 1986 ST39 JIM10032 H-S Fr. milk 1999 ST81 CNRZ27 Neth. bioghurt 1960 ST39 JIM10024 H-S Fr. cooked pr. ch. 200 ST39 JIM10098 Fr. wet ch ST74 JIM10013 Bulg. env. ST11 CNRZ781 Fr. start ST11 CNRZ368 Neth. yog. start ST72 JIM10011 Bulg. env. ST71 JIM10010 Bulg. env ST79 CNRZ409 Sarthe Fr. start ST70 JIM1009 Bulg. env ST30 JIM10124 Fr. soft ch ST64 JIM1003 Bulg. env. ST45 JIM10050 H-S Fr. start ST43 JIM10104 Fr. start ST43 JIM10039 H-S Fr. start ST43 JIM10099 Fr. milk 2001 ST38 JIM10112 Fr. start ST38 JIM10054 H-S Fr. start ST38 JIM10034 H-S Fr. start ST60 JIM10045 H-S Fr. start ST38 JIM10042 H-S Fr. start ST31 JIM10001 H-S Fr. cooked pr. ch. 200 ST67 JIM1006 Bulg. env. ST82 CNRZ308 Jura Fr. ch. start ST86 JIM10014 Bulg. env. ST12 CNRZ702 Gr. Gr. sheep yog ST61 CNRZ1157 Crete Gr. trad. sheep yog. ST10 CNRZ1213 Gr. Gr. yog ST25 CNRZ1202 Gr. Gr. yog ST98 CNRZ1593 Kiel Germ. start ST104 CNRZ1237 Crete Gr. trad. yog ST37 JIM10021 H-S Fr. cooked pr. ch. 200 ST34 JIM10013 H-S Fr. cooked pr. ch. 200 ST35 JIM10014 H-S Fr. cooked pr. ch. 200 ST27 JIM10020 H-S Fr. cooked pr. ch. 200 ST27 JIM10079 H-S Fr. whey 1984 ST27 JIM10123 Fr. soft ch ST27 JIM10120 Fr. soft ch ST27 JIM10066 S Fr. whey 1985 ST27 JIM10064 S Fr. whey 1984 ST27 JIM10060 S Fr. whey 1985 ST44 JIM10047 H-S Fr. start ST44 JIM10085 H-S Fr. whey 1986 ST44 JIM10055 Isere Fr. whey 1985 ST100 CNRZ1208 Crete Gr. trad. yog ST99 CNRZ1156 Crete Gr. trad. sheep yog. ST75 CNRZ26 Fr. ch. start ST63 JIM1002 Bulg. env ST55 JIM1001 Bulg. env ST23 JIM10117 India trad. ch ST78 CNRZ761 Fr. yog. start ST77 CNRZ785 Fr. start ST83 CNRZ447 Fr. yog ST18 CNRZ758 Bulg. yog. start ST66 JIM1005 Bulg. env. ST80 CNRZ457 Doubs Fr. Comte ch. start. ST28 JIM10121 India trad. ch ST73 JIM10012 Bulg. env. ST110 JIM10175 Eg. trad. Kariesh ch. 200 ST102 CNRZ1584 Lombardia It. soft ch. 19 ST101 CNRZ1587 It. soft ch ST85 JIM10359 S Fr. env ST85 JIM10153 S Fr. env ST85 JIM10151 S Fr. env ST8 JIM10254 H-S Fr. cow teat 2007 ST8 LMD-9 USA ch. ST20 CNRZ1691 Ir. yog. start ST21 CCHSS9 Fr. H. bl. Hosp ST58 CNRZ302 Jura Fr. Comte ch. start. 1 ST58 CNRZ310 Jura Fr. Comte ch. start. 1 ST53 JIM10031 H-S Fr. milk 1999 ST3 JIM10300 H-S Fr. ch ST3 CNRZ701 Helsinki Fin. Emm. ch. start ST3 CNRZ703 Mong. ferm. milk 1974 ST3 CNRZ1592 Germ. yog. start ST2 JIM8232 Fr. milk 2002 ST42 JIM10097 Fr. wet ch ST1 JIM10309 Fr. yog. start ST1 JIM10118 Fr. start ST1 JIM7443 Fr. start. ST1 JIM7442 Fr. start. ST51 JIM H-S Fr. whey 1984 ST22 JIM7444 Fr. start. ST48 JIM10072 H-S Fr. whey 1986 ST33 JIM10010 H-S Fr. cooked pr. ch. 200 ST36 JIM10018 H-S Fr. cooked pr. ch. 200 ST36 JIM10016 H-S Fr. cooked pr. ch. 200 ST36 JIM H-S Fr. start ST50 JIM H-S Fr. whey 1986 ST47 JIM10058 Fr. whey 1988 ST32 JIM10006 H-S Fr. cooked pr. ch. 200 ST62 JIM10256 H-S Fr. yog. start ST41 JIM10096 Fr. wet ch ST29 JIM10122 Fr. soft ch ST69 JIM1008 Bulg. env. ST84 JIM10358 S Fr. milk 2008 ST115 JIM10179 Eg. trad. Kariesh ch. 200 ST68 JIM1007 Bulg. env. ST96 JIM10152 Fr. milk 2009 ST96 JIM10154 Fr. milk 2009 ST16 CNRZ1575 It. soft ch Comparaison avec 160 autres souches de S. thermophilus Neighbbour-joining tree from bp concatened sequences (bootstrap values 98%) ST92 CIRM387 It. trad. Ragu. ch. ST92 CIRM366 It. trad. Ragu. ch. ST89 CIRM368 It. trad. Ragu. ch. ST95 CIRM406 It. trad. Ragu. ch. ST91 CIRM388 It. trad. Ragu. ch. ST91 CIRM392 It. trad. Ragu. ch. ST90 CIRM373 It. trad. Ragu. ch. ST76 CNRZ22 Jura Fr. Comte ch. start. 19 ST93 CIRM334 It. trad. Ragu. ch. ST87 CIRM348 It. trad. Ragu. ch. ST87 CIRM336 It. trad. Ragu. ch. ST13 JIM10116 Slov. trad. Brin. ch ST88 CIRM360 It. trad. Ragu. ch. ST88 CIRM342 It. trad. Ragu. ch. Souches uniques... qui contribuent aux qualités organoleptiques du Ragusano Les souches siciliennes isolées de Tina forment un cluster séparé DIET A G R I C U L T U R E E N V I R O N M E N T 20

21 Exemple 3 : Short-read whole shotgun séquençage des fromages Food Microbiome (ANR ) 120 génomes d espèces fromagères séquencées (souches référence) 40 fromages français analysés Spécificité : short-reads (haut débit / cout) 21

22 Exemple: un fromage à croûte lavé(à partir de lait pasteurisé) 35x coverage of this genome, with 99.5% perfect matches! Biodiversitélarge due àdes souches non inoculées (housemicroflora) Présence de groupes microbiens et faiblement caractérisés quantification de population subdominante 1/ Présence de lectures non assignées (e.g. ~30%) groupes microbiens encore inconnus?? MICA Division SA3.022

23 Quigley, L. et al., Molecular approaches to analysing the microbial composition of raw milk and raw milk cheese. International Journal of Food Microbiology 2011, 150(2-3), Quigley, L. et al. High-Throughput Sequencing for Detection of Subpopulations of Bacteria Not Previously Associated with [62]Artisanal Cheeses. Applied and Environmental Microbiology 2012, 78(16), Quigley et al., The complex microbiota of raw milk. FEMS Microbiol. Rev.,

24 Chambers et al. / Effect of milk pasteurisation on flavor properties of seven commercially available french cheese types. Journal of Sensory Studies 2010,25(4), Franciosi, et al., Microbial analysis of raw cows' milk used for cheese-making: influence of storage treatments on microbial composition and other technological traits. World Journal of Microbiology & Biotechnology 2011, 27(1), [ C et écrémage -DDGE ] 24

25 Lavoie, et al., Characterization of the fungal microflora in raw milk and specialty cheeses of the province of Quebec. Dairy Science & Technology 2012, 92(5), Masoud, W. et al., The fate of indigenous microbiota, starter cultures, Escherichia coli, Listeria innocua and Staphylococcus aureus in Danish raw milk and cheeses determined by pyrosequencing and quantitative real time (qrt)-pcr. International Journal of Food Microbiology 2012, 153(1-2), Monsallier, F. et al. Variability of microbial teat skin flora in relation to farming practices and individual dairy cow characteristics. Dairy Science & Technology 2012, 92(3), A suivre!!!!! 25

26 Ecosystèmes des laits crus conclusions Une biodiversitéinsoupçonnée / àpréserver / potentiel innovation[crb] Lien +++ avec qualités organoleptiques Robustesse et gratuité Un «coaching»possible via pratiques d élevage???... Grâce aux nouveaux outils moléculaires? Vers une hygiène mieux raisonnée? Quid effet santéd une consommation régulière de flores diversifiées? Réduction des allergies Apport de vitamines et de micronutriments Digestibilité Impact sur équilibre de la flore intestinale.dans un contexte d appauvrissement général de la biodiversité microbienne des aliments fermentés? 26

27 Conclusion générale Vive la biodiversité microbienne! Merci de votre attention! 27