Wnt3a bloque la différenciation des hépatocytes tumoraux au stade de progéniteurs
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- Damien Rivard
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1 Wnt3a bloque la différenciation des hépatocytes tumoraux au stade de progéniteurs Siham Mebarki, Mireille Desille, Cédric Coulouarn, Denise Glaise, Elise Lavergne, Marie Sicard, Bruno Clément et Orlando Musso INSERM UMR 991 Foie, Métabolismes et Cancer 03 Octobre ème journées de l AFEF 1
2 Nous n avons pas de conflits d intérêts
3 Les altérations génétiques dans le carcinome hépatocellulaire (CHC) ~50% Wnt/β-caténine Guichard et al., Nature Genetics,
4 Voie de signalisation Wnt/β-caténine Wnt Voie Wnt/β-caténine ON LRP5/6 Frizzled Dsh β-caténine β-caténine β-caténine APC Co-répresseur TCF/LEF β-caténine 4
5 Voie de signalisation Wnt/β-caténine Dkk Wnt SFRP Voie Wnt/β-caténine OFF Frizzled Dsh LRP5/6 β-trcp Protéasome APC S33 P β-caténine β-trcp S37 P T41 P S45 P Co-répresseur TCF/LEF REPRESSION TRANSCRIPTION 5
6 Activation de la voie Wnt/β-caténine dans le cancer Mutations Altérations de la balance : Agonistes/Inhibiteurs APC β-caténine Wnt SFRP Microenvironnement Wnt 6
7 CHCs activés Wnt en absence de mutation β-cat CTNNB1 Chiang classes Hoshida classes S1 β-catenin nucl and cyto β-catenin membrane GS CTNNB1-mutation Lachenmayer A et al., Clin Cancer Res,
8 Objectifs Wnt Remaniements tissulaires et microenvironnement Wnt dans le CHC COL4A LAM SMA Wnt Phénotype cellules tumorales Dkk LRP 5/6 Wnt Frizzled SFRP Matrice extracellulaire A P C Dsh β-caténine β-caténine TCF/LEF ++ 8
9 Fact 2 : 16,33% Fact 2 : 16,33% Fact 2 : 22,28% Fact 2 : 22,28% Fact 2 : 14,40% Fact 2 : 14,40% Association : remodelage du microenvironnement & éléments extracellulaires de la voie Wnt Projection des des variables sur sur le le plan plan factoriel (1x2) (1x2) Projection des des variables sur sur le le plan plan factoriel (1x2) (1x2) SFRP2 SFRP2 SFRP5 SFRP5 Col Col 4 SMA 4 SMA Lam Lam SFRP1 SFRP1 FZ7 FZ7 DKK1 DKK1 Wnt2 Wnt2 Contrôles n n = = SFRP5 SFRP1 SMA SMA Col Col 4 4 FZ7 FZ7 Lam Lam SFRP2 Wnt2 Wnt2 DKK1 DKK1 FNT n n = = Fact Fact 1 : 138,36% : Projection des variables sur le plan factoriel (1x2) Fact Fact 1 : 1 : 54,68% SFRP2 Lam Col 4 SMA Wnt2 DKK1 SFRP1 SFRP5 FZ7 CHC n=45 SFRP2 Lam Col 4 SMA Wnt2 DKK1 SFRP1 SFRP5 FZ7 CHC n=45 Fact 1 : 50,33% Fact 1 : 50,33% 9
10 La Lignée HepaRG Prolifération Sub-confluence Confluence Différenciation CTNNB1 P53 Axine 1 WT S1 Hoshida? Gripon et al., PNAS, 2002; Cerec et al., Hepatology,
11 Taux de cellules Cellules en phase S (% Cellules proliférantes BrdU positives) 28,80 25,70 NT CT Wnt3a 14,56 14,30 5,41 5,41 3,26 6,99 7,14 2,09 5,14 7,88 J1 J3 J5 J7 J10 J13 Contrôle Wnt3a 11
12 10 9 Transition épithéliomésenchymateuse SNAIL HepaRG proliférantes Voie Wnt Canonique BIRC TWIST HepaRG S Mc L Mc Wnt3a 0h CK19 12h HepaRG S Mc L Mc Wnt3a SMA C-MYC HepaRG S Mc L Mc Wnt3a 0h 12h HepaRG S Mc L Mc Wnt3a 0h 12h 0h 12h 12
13 Expression relative en ARNm Effet du traitement Wnt3a (13j) 16,00 14,00 12,00 10,00 8,00 6,00 4,00 2,00 0,00 Non traitées LGR5 Wnt3a 1,20 1,00 0,80 0,60 0,40 0,20 0,00 AldB GGT1 Notch2 Non traitées Wnt3a 13
14 Expression relative en ARNm 5,00 4,50 4,00 3,50 3,00 2,50 2,00 1,50 1,00 cellulaire 0,50 0,00 Spécificité 82% des gènes du signal modulés Wnt par canonique Wnt3a dépendent de la β-caténine Cellules proliférantes Suspension LGR5 WB sirna CTNNB1 sirna1 Contrôle Wnt3a Contrôle Wnt3a Contrôle Wnt3a Contrôle Wnt3a sirna1 sirna2 Scrambled Non transfectées SCR NT 72h b-catenin 88kDa HSC 70 MicroporatorR (Neon Transfection System- Invitrogen)_SynNanoVect 14
15 Expression relative en ARNm Inhibition extracellulaire de la voie Wnt 18,00 Cellules 16,00 proliférantes LGR5 FZ8_CRD 14,00 12,00 10,00 8,00 6,00 0h 24h 72h 4,00 2,00 0,00 Contrôle Arrêt! Contrôle Wnt3a Wnt3a FZ8_CRD Wnt3a + FZ8_CRD FZ8_CRD Wnt3a + FZ8_CRD 65% des gènes induits par Wnt3a sont inhibés par FZ8_CRD Hendaoui I et al., Plos One, 2012; Lavergne E et al., Oncogene,
16 CONCLUSION ET PERSPECTIVES Agonistes Wnt Inhibiteurs Wnt Remodelage tissulaire Microenvironnement Wnt : Blocage de la différenciation hépatocytaire Prolifération, TEM 82% des gènes dépendent de la β-caténine 65% sont inhibés par l extracellulaire Communications croisées avec d autres voies?
17 PERSPECTIVES TMA Marqueurs d activation Wnt validation : GS, b-cat, EpCAM et CK19 B-cat mutés 17
18 Expression relative en ARNm HepaRG proliférantes Wnt3a ou milieu Contrôle J0 J3 J5 J7 J10 J13 3,39 3,03 SMA 1 1,26 1,87 2,07 2,83 1 1,96 1,50 1,23 1,31 COl4A 16,10 LGR5 1 8,34 4,58 7,30 10,18 Non traitées Traitées Wnt3a = Wnt3a/Contrôle 18
19 Expression relative en ARNm Hépatocytes différenciés Wnt3a ou milieu Contrôle 0h 1h 2h 4h 6h 8h 12h 7,25 SNAIL 1 2,52 1,96 3,32 2,90 0,72 COL4A 1 1,95 1,02 1,34 1,59 1,70 1,25 4,40 3,20 LGR5 1 2,03 1,82 1,33 1,17 Non traitées Traitées Wnt3a = Wnt3a/Contrôle 19
20 Fact 2 : 14,40% Fact 2 : 22,28% Projection des variables sur le plan factoriel (1x2) Projection des variables sur le plan factoriel (1x2) SFRP5 SFRP1 SMA Col 4 FZ7 Lam 40 FNT SFRP2 SFRP5 Col 4 SMA Lam SFRP1 23 contrôles SFRP2 Wnt2 DKK1 FZ7 DKK1 Wnt2 Fact 1 : 54,68% Projection des variables sur le plan factoriel (1x2) Fact 1 : 38,36% Fact 2 : 19,25% SFRP5 SFRP1 Lam DKK1 SFRP2 Col 4 FZ7 SMA Wnt2 11 NHF Fact 1 : 38,36%
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