Présentation du service d immunomonitorage pour la caractérisation de rats transgéniques ou de rats knockout

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1 Présentation du service d immunomonitorage pour la caractérisation de rats transgéniques ou de rats knockout Applications à deux modèles : - Rats transgéniques pour le Bcl-2 humain - Rats knockout pour les IgM de rats Séverine Ménoret Anne-Laure Iscache Gen2Bio Lorient 29 mars 2012

2 Plateforme Plate-forme Transgenèse Microinjection de petite ou de grande construction d ADN (BAC, YAC) Production de rats transgéniques par microinjection d une construction d ADN dans un ovocyte fertilisé (Sprague-Dawley). Environ ovocytes injectés. Un minimum de 3 fondateurs transgéniques garantis pour une petite construction d ADN. Microinjection via l utilisation de vecteurs lentiviraux Environ ovocytes injectés (titre minimum requis 10 8 UI/ml). Un minimum de 3 fondateurs transgénques garantis. Génération de rats Knock-out via l utilisation de "Zinc-Finger" nucléases ou de " TALE" nucleases. Génotypage PCR Southern-blot Taq-Man (determination du statut HO/HE) Genome walking (determination du site d insertion du transgène dans le génome) Cryopréservation préservation des lignées par congélation d embryons.

3 Plateforme Plate-forme Immunomonitorage Autres activités Support Technique Conseils techniques (promoteurs, construction d ADN, techniques de screening) Disponibilité des rats transgéniques qui ont déjà été générés Recherche et Développement Développement de nouvelles techniques Communication Organisation de congrès et de workshops Formation d étudiants et de personnels techniques

4 Présentation du service d immunomonitorage

5 Plateforme Plate-forme Immunomonitorage Immunophénotypage cellulaire Analyse des organes par cytométrie en flux ou des tissus par immunohistologie (rate, thymus, ganglions lymphatiques, moelle osseuse ainsi que le sang) Lymphocytes T : CD4, CD8α, CD8β, CD25, CD90, TCRαβ, incluant Treg cells (CD4+CD25+, CD8+CD45RClow), etc ; simple et multi-couleur Lymphocytes B : IgM, CD45R, IgD; simple et multi-couleur Cellules NK Cellules Dendritiques : mdcs (CD4+, CD4-), pdcs Monocytes/macrophages Cytokines/immune mediators (IDO 1, IDO 2, heme-oxygenase-1, inos, IFNgamma, etc) Détermination de la concentration en immunoglobulines dans le sérum par ELISA IgA, IgE, IgM, IgG et les sous types IgG1, IgG2a, IgG2b et IgG2c Analyse des réponses immunitaires in vitro Réactions mixtes lymphocytaires Prolifération lymphocytaire induites par la Concavalin-A ou par stimulation CD3/CD28 Analyse des cytokines sécrétées en culture après stimulation (ELISA) Tests de cytotoxicité cellulaire Tests de suppression pour analyser les Tregs Analyse des réponses immunitaires in vivo Immunisation par KLH ou OVA et analyse des anticorps et des réponses cellulaires induites Greffes de coeur ou de peau et analyse des anticorps et des réponses cellulaires allogéniques

6 Présentation du service d immunomonitorage Caractérisation des rats transgéniques pour le BCL2 humain

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8 Analyse des rats transgéniques pour le BCL2 humain Introduction Anti-apoptotique Identifié comme locus lié à la chaîne lourde des immunoglobulines par la translocation des chromosomes 14:18 (Bakhshi et al, 1985; Tsujimoto et al, 1984) associé avec le développement de lymphomes Expression bien régulée : pre-b, cellules B quiescentes, cellules B prolifératives mais expression diminuée dans les cellules B différenciées (Graninger et al, 1987) Modèles de souris transgéniques hbcl-2 ont été utilisés pour étudier le développement des B et des T Cellules B: augmentation des B dans la rate, les ganglions et la moelle osseuse (McDonnell et al, 1989; Strasser et al, 1991), survie plus longue in vitro, augmentation des IgG, IgM, IgA (Strasser et al, 1991)

9 Analyse des rats transgéniques BCL2 Choix des lignées transgéniques Génération de 6 lignées de rats transgéniques Augmentation des IgM et IgG dans les sérums (Strasser et al, 1991) ELISA IgM ELISA IgG

10 Analyse des rats transgéniques BCL2 Plate-forme Vérification de la présence du transgène dans les lignées transgéniques sélectionnées Lignée 70815: 1 insertion 1 copie Lignée 70818: 1 insertion plusieurs copies

11 Analyse des rats transgéniques BCL2 Immunomonitorage Détermination des concentrations en immunoglobulines dans les sérums IgM, IgG, IgA et IgE par ELISA Immunophénotypage cellulaire Analyse des cellules B par cytométrie en flux Test in vitro Analyse de l effet d un inducteur de l apoptose (staurosporine) sur les lymphocytes B par cytométrie en flux

12 Analyse des rats transgéniques BCL2 Concentration en immunoglobulines dans le sérum IgM, IgG, IgE and IgA Ig M IgG IgA IgE

13 Analyse des rats transgéniques BCL2 Immunophénotypage cellulaire Expression de Bcl-2 dans les cellules B et T de la rate et de la moelle osseuse Rate Moelle osseuse 38% des cellules B expriment Bcl-2 73% des cellules B expriment Bcl-2

14 Analyse des rats transgéniques BCL2 Immunophénotypage cellulaire Analyse des cellules B dans la rate Rate

15 Analyse des rats transgéniques BCL2 Plate-forme Immunophénotypage cellulaire Analyse des cellules B dans la moelle osseuse Moelle osseuse

16 Analyse des rats transgéniques BCL2 Plate-forme Analyse in vitro Analyse de l apoptose : Cellules B purifiés issues de la moelle osseuse d0 d1 d4 d7 DAPI LM Tg Annexin V Annexin - DAPI - =cellules vivantes Annexin + DAPI + =cellules apoptotiques tardives Annexin + DAPI - =cellules apoptotiques Annexin - DAPI + = cellules necrotiques Percentages and mean ± SD of each the four cell populations (n=3, p<0.05).

17 Présentation du service d immunomonitorage Caractérisation des rats KO IgM

18 Analyse des rats KO IgM En 2009, 1 er rats générés par la technologie des ZFN (Geurts et al, Science, 2009)

19 Analyse des rats KO IgM Zing-Finger Protéine * AA -1 * AA 2 * AA 3 β β * AA 6 hélice α ~30 AA Schéma d'une structure en doigt de zinc. Un atome de zinc central stabilise le repliement de la protéine en établissant quatre liaisons avec deux résidus cystéine et deux résidus histidine. Ce genre de ZFP est retrouvée sur les facteurs de transcription. - Existent naturellement, reconnaissent des motifs d ADN modulaires - Structure biologique distincte - Reconnaissent des séquences d ADN définies - Reconnaissent des séquences malléables de 3 bp d ADN pour une Zinc Finger Klug A., Ann. Rev. Biochem 2010

20 Analyse des rats KO IgM Zing-Finger Nucléase A ce domaine de reconnaissance, on a couplé le domaine endonucléasique de l'enzyme Fok I (indépendant de son site de fixation spécifique). -Coupure de l'adn après dimérisation du domaine nucléasique de Fok I. - Chaque ZFN reconnaît une séquence de neuf nucléotides séparés par six nucléotides, un espace nécessaire pour l'action de l'endonucléase. Cette action n'est possible qu'après dimérisation de cette dernière.

21 Analyse des rats KO IgM Mécanisme de clivage induit par les ZFN et réparation ZFNs ZFNs FokI FokI Séquence cible (exon d un gène codant) Coupure double-brin Non-Homologous End Joining Homology-directed repair (HDR) (Template) KO Imperfect repair Targeted Gene Knockout KI Precise repair (user defined) Targeted Gene Integration

22 Analyse des rats KO IgM Immunomonitorage Analyse anatomo-histochimique Analyse de plusieurs marqueurs dans la rate Détermination des concentrations en immunoglobulines dans les sérums IgM, IgG, IgA et IgE par ELISA Immunophénotypage cellulaire Analyse des lymphocytes B et T par cytométrie en flux Analyse in vivo Greffe de cœur et de peau et analyse des alloanticorps

23 Analyse des rats KO IgM Analyse anatomo-histochimique rate Ganglions lymphatiques thymus WT IgM KO WT IgM KO WT IgM KO CD45RA (OX33) (B) TCR (T) CD4 CD8 CD68 (macrophages) Rate WT Rate IgM KO

24 Analyse des rats KO IgM Concentration en immunoglobulines IgM IgG IgM (mg/ml) WT IgM KO IgG (µg/ml) WT IgM KO p<0.01 p<0.001 IgE IgA IgE (ng/ml) WT IgM KO IgA (µg/ml) WT IgM KO

25 Analyse des rats KO IgM Immunophénotypage cellulaire Analyse des cellules B dans la rate, les ganglions lymphatiques et la moelle osseuse IgM Rate Ganglions lymphatiques Moelle osseuse wild type IgM KO CD45R

26 Analyse des rats KO IgM Immunophénotypage cellulaire Analyse des cellules T dans la rate Rate wild type Rate IgM KO CD4 TCRαβ TCRαβ CD8

27 Analyse des rats KO IgM Analyse in vivo Greffe de cœur et de peau 1A Skin graft 1A Skin graft 1A Skin graft 1A Heart graft SPD WT ou SPD KO IgM D - 21 D - 14 D - 7 D - 0 Cœur rejeté en 4-8h pour SPD WT et après plusieurs jours pour SPD IgM KO Rats WT : Rejet en quelques heures Rats IgM KO : Rejet après plusieurs jours p<0.05 test Kaplan Meier

28 Analyse des rats KO IgM Analyse in vivo Analyse des alloanticorps 1A Skin graft 1A Skin graft 1A Skin graft 1A Heart graft SPD WT ou SPD KO IgM D - 21 D - 14 D - 7 D - 0 Cœur rejeté en 4-8h pour SPD WT et production d alloanticorps P<0.05 IgM KO vs WT à tout les points, test Mann Whitney test

29 Merci de votre attention PF, Inserm UMR1064, Nantes Ignacio Anegon Séverine Rémy Séverine Ménoret Anne-Laure Iscache Claire Usal Reynald Thinard Laurent Tesson Plate-forme