THEME 1-A ANALYSE DES RISQUES MICROBIOLOGIQUES DANS L ESTUAIRE DE SEINE

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1 PROGRAMME SEINE AVAL 2 : ANNEE 2003 L analyse et la gestion environnementales Volet n 1 «recherche finalisée» THEME 1-A ANALYSE DES RISQUES MICROBIOLOGIQUES DANS L ESTUAIRE DE SEINE Coordinateur : Fabienne PETIT, Laboratoire de microbiologie du froid, UPRES 2123, Université de Rouen

2 Equipes impliquées dans le thème Laboratoire de parasitologie médicale ADEN EA 3436 CHU Rouen (L.Favennec) Ecologie des Systèmes Aquatiques, Université Libre de Bruxelles (P.Servais) LMDF UPRES 2123 Equipe Biodiversité et Environnement, Rouen (F.Petit) Chimie des contaminants et modélisation, IFREMER, Toulon (B.Thouvenin) 1

3 1 - OBJECTIFS ET DEMARCHE : Lors du programme Seine aval 1, la qualité sanitaire des eaux de l estuaire était appréhendée sous deux aspects, d une part un travail sur la dynamique des coliformes fécaux/thermotolérants dans la perspective d une modélisation, et en complémentarité avec les études développées dans le cadre du PIREN Seine, d autre part, des études plus spécifiques étaient menées sur la recherche de Salmonella et des entérovirus dans les eaux de l estuaire, en s aidant de méthodologies récentes plus appropriées à ce type d environnement. A l issue de cette première phase, un des objectifs clairement affiché du programme Seine aval 2 était l évaluation de la qualité sanitaire des eaux estuariennes, afin d identifier un risque sanitaire potentiel et de développer un outil prédictif, 6 actions du programme ont ainsi spécifiquement été définies : Amélioration de la connaissance des agents pathogènes présents en Seine Validité de l évaluation de la qualité microbiologique via la flore indicatrice Etude expérimentale de la dynamique des contaminants microbiens Modélisation de la dynamique des contaminants microbiens. Recherche d agent microbien traceur Recherches épidémiologiques dans le domaine microbien Dans le cadre du projet DYVA cette problématique a été étendue à l étude des vasières dans l action : Zones connexes, fonctionnement des vasières. Dès le début, l ensemble de ces travaux s est inscrit dans une démarche d analyse du risque, préconisée aujourd hui pour appréhender le risque sanitaire dans l environnement, où le danger étudié correspond à la présence d agents pathogènes à différents niveaux de l estuaire de Seine. Au cours de ces 3 années 3 équipes se sont impliquées dans ce thème ( L. Favennec, ADEN parasitologie, P. Servais, ESA, Université Libre de Bruxelles, CHU Rouen, F.Petit LMDF, Rouen). En 2003, dans le cadre de la modélisation de la dynamique des coliformes fécaux/thermotolérants, B.thouvenin (Ifremer, Toulon) et P.Dufrantel ( société Prolexia) ont participé à ce thème. Une stratégie d échantillonnage, commune à l ensemble des équipes impliquées dans cette thématique, reposait sur l analyse des eaux d amont en aval de l estuaire en intégrant la zone du bouchon vaseux où s accumulent les matières en suspension dans la colonne d eau, les vasières où se déposent les particules, les différentes sources potentielles de contamination bactérienne (apport amont, affluents et effluents traités de stations d épuration) et les moules de la baie de Seine, vecteurs potentiels de passage à l Homme. Dans le cadre du programme Seine aval 2 il a ainsi été possible de structurer les actions de recherche qui relevaient du thème «Analyse du risque sanitaire» en 3 volets d études complémentaires. Le premier volet était la recherche de bactéries pathogènes (y compris sous leur forme non cultivable) et de kystes de Cryptosporidium parvum et de Giardia duodenalis, à différents niveaux de l estuaire. La majorité des pathogènes responsables de toxi-infections d origine hydrique étant associés à une contamination fécale d origine humaine ou animale, la qualité microbiologique des eaux s évalue classiquement par le dénombrement de flores indicatrices de contamination fécale. Le suivi de ces flores, méthode indirecte, constitue un moyen efficace pour déceler des conditions qui peuvent être responsables de la présence d'organismes entéropathogènes et donc d une perte de la maîtrise de la qualité des eaux. Toutefois, en milieux marin ou estuarien, l utilisation de ces indicateurs peut être parfois confrontée à des interférences avec des microorganismes d origine autochtone pouvant conduire à une surévaluation du nombre de ces bactéries indicatrices de contamination fécale. Le second volet de cette étude a donc été d évaluer l abondance des flores indicatrices de contamination d origine fécale en estuaire de Seine afin d étudier la relation entre l abondance de ces flores et la présence de microorganismes pathogènes (Kystes de protozoaires, bactéries). Le troisième volet qui 2

4 s inscrivait dans la poursuite des travaux initiés dans le cadre du programme Seine aval 1, était la modélisation de la dynamique des coliformes fécaux/thermotolérants. L objectif a terme, est l élaboration d un modèle prédictif de la qualité sanitaire des eaux de l estuaire, qui intégrerait l ensemble des résultats des trois volets de cette étude, afin de prédire la probabilité de présence de ces pathogènes dans l estuaire en fonction de l abondance des coliformes fécaux/thermotolérants. 2 - SYNTHESE DES RESULTATS OBTENUS : Au cours de ces trois années d études, de nombreuses campagnes communes 1 ont été effectuées et l exploitation totale des données n est pas encore achevée. Une première synthèse des résultats les plus importants peut toutefois être réalisée. Présence de bactéries Salmonella, Listeria monocytogenes et de kystes de Cryptosporidium parvum et Giardia duodenalis, en estuaire de Seine Les principales sources d apport de ces 2 bactéries pathogènes et Giardia duodenalis dans l estuaire sont les effluents traités des STEP et certains affluents qui, au moins dans le cadre de nos campagnes, se sont révélés des sources de contamination importante (Robec, Risle). Par contre, Cryptosporidium parvum, de faible prévalence chez l homme mais qui correspond à la première cause de diarrhée chez les veaux, est retrouvée en quantité faible mais significative dans les effluents traités de STEP et est surtout présente dans les eaux de l Eure et du Robec. L étude de l impact de la contamination de ces affluents sur la présence de pathogènes dans l estuaire, demanderait à être poursuivie afin d augmenter le nombre de données. L analyse des eaux de l estuaire montre que la zone comprise entre les pk : 243 et 259,7 présente une plus forte probabilité d être contaminées par des Salmonella, et Giardia duodenalis quelles que soient les conditions hydrologiques, alors qu une contamination importante par Cryptosporidium n a été observée dans cette zone qu en période d étiage (juillet 03). la zone de l embouchure est moins souvent contaminé en Salmonella mais présente un niveau de contamination non négligeable en Cryptosporidium et en Giardia. La zone amont (dans la limite de notre échantillonnage), présente un niveau de contamination en pathogène bactérien et protozoaires plus faible que la zone de l agglomération rouennaise. Dans les eaux de l estuaire nous avons aussi observé une contamination en pathogènes issue du compartiment animal ou présent dans les sols, très probablement consécutive à des phénomènes de ruissellement. Ainsi, la présence de Listeria monocytogenes est souvent associée à des évènements pluvieux. L intérêt de l étude de cette bactérie qui perd rapidement sa cultivabilité et sa viabilité en milieu salin, est qu elle indique l éventualité d un apport de germes pathogènes via le ruissellement de sols, notamment ceux des zones pâturées. Les résultats obtenus sur Cryptosporidium parvum souligne aussi l importance de ce phénomène avec des données de typage moléculaire qui montre que les oocystes de Cryptosporidium présentes dans les dreissènes de l estuaire, appartiennent au génotype 2. Ce génotype est majoritairement retrouvé en Haute Normandie chez les bovins. 1 campagnes de prélèvements communes à 2 ou 3 équipes: eaux de Seine (7 campagnes SNS), bouchon vaseux (2 campagnes spécifiques), effluents de 5 STEP (2 campagnes) 7 affluents (3 à 4 campagnes), moules de baies de Seine (3 campagnes), dreissènes de l estuaires ( 3 campagnes, 4 sites), 3 vasières (9 campagnes), eaux de ruissellement (2 campagnes) 3

5 Relation entre l abondance de ces flores et la présence de microorganismes pathogènes (Kystes de protozoaires, bactéries). La relation entre la présence de ces pathogènes et l abondance des flores indicatrices montre tout d abord que le dénombrement des E.coli semble la flore indicatrice la plus pertinente dans la zone d eaux douces. La relation entre l abondance d E.coli et celle des coliformes fécaux/thermotolérants varie le long de l estuaire. L analyse des résultats de parasitologie montre aussi que la relation entre l abondance des coliformes fécaux/thermotolérants varie d un facteur 10 entre la zone du bouchon vaseux et la zone de l agglomération rouennaise. Il serait donc nécessaire d évaluer le facteur de pondération à introduire dans le modèle qui simule la dynamique des coliformes fécaux/thermotolérants dans l estuaire, en vue de l utiliser comme modèle prédictif pour évaluer la probabilité de présence de Salmonella et des kystes de parasites dans les eaux. Dans la partie plus saline, notamment la zone de l embouchure, il serait probablement nécessaire d utiliser les entérocoques comme flore indicatrice et de rechercher la relation existante entre la présence de pathogènes d origine fécale, résistant aux conditions de salinité et leur abondance à ce niveau de l estuaire. Les sédiments de vasières sont le siège d une contamination fécale avec des niveaux de contamination plus importants dans la vasière de Oissel. Ces sédiments, peu propices au maintien de la viabilité des bactéries d origine fécale, sont rarement contaminés par des Salmonella, même si il a été possible d isoler ces germes dans ces environnements hostiles. Dans ces conditions, ces vasières constituent plutôt des zones d épuration, voire des zones de stockage temporaire dans l hypothèse d une resuspension de sédiments contaminés très peu de temps après leur dépôts. Les premiers résultats des expériences de typage des souches d E.coli, considéré dans notre étude comme agent pathogène traceur, suggèrent la présence de différentes populations d E.coli le long de l estuaire sur la base des différences de profils de résistances aux antibiotiques. Cette étude qui doit être renforcée par une analyse statistique appropriée des données, et complétée par des expériences de typage moléculaire, et montre aussi la présence en milieu estuarien de souches E. coli multirésistantes. A défaut de constituer un risque sanitaire patent, en l absence d un passage à l homme démontré, ces résultats montrent également que l environnement estuarien peut constituer un réservoir de gènes de résistance susceptibles d être transférés à des bactéries sensibles. Dynamique des coliformes : quantification des sources et bilan des apports en coliformes fécaux dans l estuaire Afin de poursuivre l étude de la dynamique des coliformes fécaux/thermotolérants en estuaire de Seine initiée dans le cadre du programme Seine aval 1, une évaluation des principaux apports de ces microorganismes a été effectuée. En complément aux études préalablement effectuées sur les apports de l amont, un accent plus particulier a été porté sur l évaluation des sources diffuses de coliformes via le lessivage des sols, des affluents de la Seine et les eaux rejets d eaux usées par les STEPs intraestuariennes. Il a ainsi été possible dans un premier temps d établir un premier bilan comparatif des apports de coliformes à l estuaire pour un débit intermédiaire (débit de 568 m 3 /s) qui intègre les rejets de STEPS, les affluents et l apport amont présenté dans la figure ci dessous CF/jour (24%) Barrage de Poses STEPs Apport par l amont Estuaire de Seine Baie de Seine CF/jour (64%) Affluents CF/jour (12 %) 4

6 A débit plus élevé, vu l augmentation de la teneur en coliformes fécaux / thermotolérants avec le débit, la contribution de l amont devrait être encore plus importante que dans la situation décrite cidessus. Par contre, à débit d étiage (200 m 3 /sec à Poses), le flux de coliformes fécaux / thermotolérants venant de l amont serait de CF/jour, soit une valeur inférieure au flux sortant des STEPs dont on peut imaginer qu il est indépendant des conditions de débit. Dans ces conditions, on peut penser que les apports dominants de bactéries fécales seraient les rejets des STEPs intraestuairiennes. Puis, les apports de coliformes fécaux/thermotolérants des 7 principaux affluents se jetant dans l estuaire ont été étudiés et ont pu être estimés à 1, jusque 3, UFC/jour. Toutefois il n a pas été possible, à ce stade de l avancée des travaux, d intégrer l impact des variations des conditions hydrologiques. Dans une perspective de modélisation, ces travaux ont été complétés par des expérimentations en laboratoire afin d évaluer les différents processus contrôlant la dynamique des bactéries dans l estuaire : la disparition de ces coliformes fécaux dans les eaux estuariennes consécutif à une lyse, aux broutage par les protozoaires, à la sédimentation, et la perte de culturabilité. Ces différents paramètres indispensables à la modélisation ont ainsi pu être évalués. La relation entre les coliformes et les matières en suspension dans l estuaire ont mis en évidence l importance de la fraction des CF attachés aux MES dans l estuaire, en particulier dans la zone du bouchon vaseux. Il apparait donc important de distinguer ces deux groupes de bactéries lors de la modélisation. A cet effet, des mesures de la fraction de coliformes fécaux/thermotolérants attachés aux MES a été réalisées sur divers échantillons d eaux et a permis d estimer à environ 50 % la proportion de coliformes fécaux apportés par les rejets de STEPs, et à 15 % de CF attachés pour les eaux de Poses et ses affluents (des mesures complémentaires sont en cours de réalisation pour affiner ces pourcentages). Enfin, dans le modèle, une valeur de mortalité de h -1 qui intègre la perte de culturabilité a été estimée pour les coliformes libres et de h -1 pour les coliformes attachés aux MES, en considérant qu ils ne sont pas affectés par le broutage par les protozoaires, ni par la perte de culturabilité. Modélisation de la dynamique des CF avec le modèle SiAM-3D En 2003, un compartiment permettant de décrire la dynamique des CF dans l estuaire a été ajouté au modèle SiAM-3D et des premières simulations ont été réalisées en utilisant l interface SimuSA développée par Ph. Dufrancatel de la Société Prolexia. Cette interface permet de lancer des simulations à distance et de récupérer les résultats de ces simulations. Une première simulation faite sur un profil longitudinal de la teneur en coliformes fécaux/thermotolérant ( formes libres et attachées aux MES) et en coliformes fécaux/thermotolérants attachés aux MES, pour une même situation de débit, a permis de mettre clairement en évidence l importance croissante des coliformes attachés aux MES de l amont à l aval, ce qui est en accord avec les résultats expérimentaux. De même, la simulation, après calcul de la fluctuation temporelle de la teneur en CF libres à Honfleur dans la zone du bouchon vaseux montre l importance des fluctuations liées au cycle de marée. La phase de validation du modèle qui consiste à comparer les données des calculs du modèle avec des données expérimentales est actuellement en cours de réalisation dans le cadre d une action affichée pour 2004 dans le programme Seine Aval. 3 - CONCLUSIONS PERSPECTIVES. L ensemble des informations acquises au cours de cette 2 ème phase du programme est encore en cours d exploitation, et doit donner lieu à une analyse commune par l ensemble des équipes impliquées dans cette thématique. Une analyse statistique des données acquises est en cours et 5

7 devraient être présentée lors du colloque de l ECSA en septembre 04. Deux thèses seront soutenues sur cette thématique (A.Touron, Microbio, Rouen ; T.Garcia-Armisen, ESA bruxelles) et la rédaction de publications communes est envisagée. Même si dans le cadre du programme Seine aval 3, il n a pas été retenu clairement un thème sur l analyse du risque sanitaire, il semble important de poursuivre les études entamées. En terme de risque sanitaire, l identification des différents apports en pathogènes bactériens et parasites montre l importance de l impact des rejets de l agglomération rouennaise et des affluents sur la présence de pathogènes dans les eaux de seine. Ces travaux mériteraient d être poursuivis. Il devraient être complétés par les résultats de l étude sur l impact des évènements pluvieux, action retenue dans le cadre du programme Seine aval 3. La modélisation sur la dynamique des coliformes dans l estuaire doit être poursuivie par une validation du modèle avec des données de terrain. Il serait aussi intéressant de prendre en compte la dynamique des bactéries sur toute la colonne d eau, principalement liée aux cycles de marée, et de renforcer les données acquises dans la zone de l embouchure de l estuaire. Ce modèle sur la dynamique des coliformes fécaux/thermotolérants doit pouvoir constituer un outil d aide à la décision, particulièrement pour les gestionnaires de STEPs, afin de maîtriser la qualité microbiologique des eaux de l estuaire (versus abondance des coliformes fécaux/thermotolérants) via les rejets des effluents traités dans l estuaire. Il est aussi important de poursuivre le travail sur la modélisation de la dynamique des flores des coliformes fécaux/thermotolérants car ce modèle doit pouvoir servir de base pour établir à terme, un modèle prédictif sur la probabilité de présence de différents pathogènes dans les eaux de Seine. En effet, dans un premier temps il devrait être envisageable d élaborer un modèle prédisant la probabilité de présence de Salmonella et de kystes de Giardia, au moins dans la partie eaux douces, à partir du modèle sur la dynamique des coliformes fécaux/thermotolérants. Pour cela il serait nécessaire de poursuivre l étude de la relation entre l abondance d E.coli et celle des coliformes fécaux/thermotolérants d une part, et l étude de la relation entre la présence de pathogène et l abondance d E.coli d autre part. Enfin, pour permettre à ce modèle d appréhender le risque sanitaire dans son ensemble, il serait indispensable de compléter les études initiées en bactériologie et en parasitologie par le volet virologie. Il est à noter que le suivi de la qualité microbiologiques des dreissènes semble un outil approprié pour l évaluation de la contamination des eaux de l estuaire en parasitologie et très probablement pour l avenir en virologie. A défaut de conclure à un risque sanitaire lié a la consommation des moules de baies de Seine, car il faudrait que le passage à l homme soit démontré, cet outil devrait constituer un outil d aide à la décision sur l usage des eaux de Seine à des fins récréatives. En effet, si aujourd hui l usage des eaux de l estuaire est essentiellement destiné au transport fluvial, voire à la pêche pour la zone de l embouchure. Pour autant, l usage des eaux à des fins récréatives est loin d être anecdotique (base jeunesse et sports d Hénouville, base de voile de St Aubin les elbeufs, base d avirons à Rouen.) sans oublier l usage des eaux de Seine pour l irrigation. 6