Approches pour l'étude des interactions protéine-protéine

Transcription

1 Approches pour l'étude des interactions protéine-protéine

2 L importance des interactions protéine-protéine? 1-Le nombre de gènes dans les génomes ne suit pas la complexité des organismes : -E. coli ~ S. cerevisiae ~ D. melanogaster ~ H. sapiens ~ La complexité des organismes est en grande partie due à l abondance des protéines, aux modifications post-traductionnelles des protéines et aux interactions protéine-protéine. 2-L'étude des interactions protéine-protéine est primordiale pour la compréhension de la fonction cellulaire des protéines : -la réplication, la transcription, la traduction, le splicing -la sécrétion -le contrôle du cycle cellulaire -la transduction de signal -le métabolisme... Fonctions assurées par des complexes protéiques

3 Pourquoi étudier les interactions protéine-protéine? Dans le monde académique : Approches qui reposent sur l adage : «Dis moi qui tu fréquentes et je te dirai qui tu es!» Approche ciblée pour qualifier la fonction cellulaire d une protéine donnée de fonction inconnue Approche non ciblée pour participer à l annotation fonctionnelle des génomes Dans le monde industriel : Cartographie d épitopedans le cadre de l autorisation de mise sur le marché d anticorps à effet thérapeutique Crosslink et analyse par spectrométrie de masse Échange isotopique H/D

4 Comment mettre en évidence les interactions physiques protéine-protéine Quelques technologies : Le système double hybride Blue Native / SDS-PAGE, BN/LC-MS-MS/PCP Co-immunoprécipitation Purification : -Pull down -Purification des interactants par chromatographie d affinité -Co-purification : TAP-tag Phage display Crosslinker

6 Le système double hybride TA DB Gal4p active la transcription de GAL1 et GAL10 Gal4p TA DB promoteur reporteur signal

7 Le système double hybride TA Y X + Y X DB promoteur reporteur Avantages : Facile à mettre en place (biologie moléculaire) Possibilité de faire des approches globales Inconvénients : L interaction physique a lieu hors contexte Cette méthode donne de nombreux faux positifs signal

8 Les faux positifs du système double hybride La protéine appât possède une activité «activation de transcription» La protéine proie possède une activité «fixation à l ADN» La protéine proie se fixe au domaine DB de Gal4p La protéine appât se fixe au domaine TA de Gal4p La protéine proie fixe une protéine de levure douée d une activité «fixation à l ADN» La protéine appât fixe une protéine de levure douée d une activité «activation de transcription» Une protéine de levure favorise l interaction entre X et Y

9 Les faux négatifs du système double hybride A côté de ces nombreux faux positifs : -Autoactivation -Protéine tierce -Transactivation, Il y a également des faux négatifs : -Repliement -Modification post traductionnelle -Ciblage dans le noyau -Interaction impossible dans un environnement nucléaire, Difficilement réalisable pour les protéines membranaires.

11 Principe BN/SDS-PAGE Complexes membranaires Détergent neutre BN-PAGE BN-PAGE SDS-PAGE ph dessalage 1 ère dimension Bleu de Coomassie Gradient Équilibration SDS Mercaptant 2 ème dimension Complexes cytosoliques

12 Principe d identification des complexes sur le gel BN/SDS-PAGE BN-PAGE SDS-PAGE Spots alignés verticalement et de même forme

13 BN/SDS-PAGE sur cytosol d E. coli 4% 18% 7% 12 % Inconvénients : Technologie délicate Limité aux complexes majeurs Masses des complexes entre Da et Da Analyse des gels difficile complexes hétéromultimériques cytosoliques

14 BN/LC-MS-MS/PCP 7-18% 7-12% % 998 protéines identifiées et quantifiées avec au moins 3 peptides trypsiques

15 BN/LC-MS-MS/PCP Protein Correlation Profiling

16 BN/LC-MS-MS/PCP PA4238 : RNA polymerase subunit alpha PA4750 : Dihydropteroate synthase like PA5272 : Adenylate cyclase like PA4269 : RNA polymerase subunit beta' PA4270 : RNA polymerase subunit beta

17 BN-PAGE/PCP/SILAC (Blue Native-PAGE /Protein Correlation Profiling/Stable Isotope Labelling by Aminoacids in Cell culture) Physiologie 1 M E I K A H C N B L G J Physiologie 2 M E I K A H B L C N G J

18 BN-PAGE/PCP/SILAC (Blue Native-PAGE /Protein Correlation Profiling/Stable Isotope Labelling by Aminoacids in Cell culture) Physiologie 1 Physiologie 1 Physiologie 2 Lys 12 C 14 6 N 2 Lys 13 C 14 6 N 2 Lys 13 C 15 6 N 2 light medium heavy extrait ultrafiltration extrait ultrafiltration extrait ultrafiltration light Heavy/Medium BN-PAGE

19 BN-PAGE/PCP/SILAC (Blue Native-PAGE /Protein Correlation Profiling/Stable Isotope Labelling by Aminoacids in Cell culture) light Heavy/Medium LC/MS/MS

20 BN-PAGE/PCP/SILAC (Blue Native-PAGE /Protein Correlation Profiling/Stable Isotope Labelling by Aminoacids in Cell culture) Heavy MS MS MS MS MS MS Cas d un peptide trypsique d une protéine MS MS MS MS MS MS Medium light Temps de rétention

21 BN-PAGE/PCP/SILAC (Blue Native-PAGE /Protein Correlation Profiling/Stable Isotope Labelling by Aminoacids in Cell culture) Cas d un peptide trypsique d une protéine light Medium Heavy light Medium Heavy light Medium Heavy light Medium Heavy light Medium Heavy

22 BN-PAGE/PCP/SILAC (Blue Native-PAGE /Protein Correlation Profiling/Stable Isotope Labelling by Aminoacids in Cell culture) Intégration des intensités des différents peptides d une protéine light Medium Heavy light Medium Heavy light Medium Heavy light Medium Heavy light Medium Heavy

23 BN-PAGE/PCP/SILAC (Blue Native-PAGE /Protein Correlation Profiling/Stable Isotope Labelling by Aminoacids in Cell culture) Intégration des intensités des différents peptides de 2 protéines qui appartiennent au même complexe light Medium Heavy light Medium Heavy light Medium Heavy light Medium Heavy light Medium (H/L)/(M/L) Heavy

24 BN-PAGE/PCP/SILAC (Blue Native-PAGE /Protein Correlation Profiling/Stable Isotope Labelling by Aminoacids in Cell culture) Intégration des intensités des différents peptides de 2 protéines qui appartiennent au même complexe light Medium Heavy Quantités similaires de complexe dans les deux physiologies Quantités différentes de complexe dans les deux physiologies

26 La co-immunoprécipitation Extrait + Anticorps spécifique de SDS-PAGE Protéine A sépharose Identification par spectrométrie de masse

27 La co-immunoprécipitation Avantages : Facile à mettre en œuvre Protéine appât native L affinité Ag/Ac est généralement très forte Possibilité de faire des lavages à forte force ionique Inconvénients : Reconnaissance de l épitope pas toujours possible Difficile à mettre en œuvre pour les protéines membranaires Protéine A ou protéine G sepharose selon l origine de l Ac Présence de l anticorps sur le gel SDS-PAGE Si la quantité d appât est trop faible, la quantité de complexe isolé sera insuffisante pour l identification Possibilité d évaluer les contaminants non-spécifiques (protéome de la bille) par analyse protéomiquequantitative (expérience réalisée avec anticorps spécifique versus expérience réalisée avec anticorps non spécifique)

28 Comment mettre en évidence les interactions physiques protéine-protéine Quelques technologies : Le système double hybride Blue Native / SDS-PAGE, BN/LC-MS-MS/PCP Co-immunoprécipitation Far Western Purification : -Pull down -Purification des interactants par chromatographie d affinité -Co-purification : TAP-tag Phage display Crosslinker

29 Le Pull Down GST GST + GST GST Glutathion sépharose GST GST lysat SDS-PAGE Identification par spectrométrie de masse GST GST Glutathion sépharose GST Variantes : -fixation préalable de la protéine de fusion sur la colonne de Glutathion séparose -autres étiquettes : 6His, Streptavidine, HaloTag,

30 Le Pull Down Avantages : Simple et rapide à mettre en œuvre Inconvénients : Fait en dehors du contexte cellulaire La protéine appât est une protéine recombinante : l étiquette peut empêcher des interactions l étiquette peut favoriser des interactions Il faut valider les interactions mises en évidence par une autre technique, si possible «in vivo».

31 La purification des interactants par chromatographie d affinité lysat NHS activated sepharose SDS-PAGE Identification par spectrométrie de masse

32 La purification des interactants par chromatographie d affinité Avantages : Simple et rapide à mettre en œuvre La protéine appât présente tous ses domaines potentiels d interaction Possibilité de rechercher des complexes mineurs Inconvénients : Interaction en dehors du contexte cellulaire Attention aux protéines «collantes» Difficile à mettre en œuvre pour les protéines membranaires Il faut valider les interactions mises en évidence par une autre technique, si possible «in vivo».

33 La co-purification : TAP-Tag Calmoduline Binding Peptide Protéine appât Site de clivage de la protéase du TEV Fragment ZZ de la protéine A 2 IgG Sepharose Calmoduline Sepharose 1 3

34 La co-purification : TAP-Tag Avantages : Simple et rapide à mettre en œuvre Possibilité de faire des approches globales Haut degré de purification Possibilité de rechercher des complexes mineurs Inconvénients : Difficile à mettre en œuvre pour les protéines membranaires Difficile de faire des approches globales en dehors de la levure La protéine appât est une protéine recombinante : l étiquette peut empêcher des interactions

36 Le phage display Banque de phage M13 avec PIII rec ou PVIII rec Sélection Lavage Elution Amplification et re-sélection

37 Le phage display Avantages : Simple et rapide à mettre en œuvre Très sensible (amplification) Inconvénients : L inconvénient repose en la nature de virus non lytique. Ainsi, toutes les protéines avant d être incorporées dans la capside doivent être exportées dans le périplasme et traverser la membrane bactérienne. Périplasme Périplasme

38 Le phage display NHS Biotine Tissus ou microorganismes Sulfo-SAED Protéines Sulfo-SAED 23.6 Å UV -NH 2 Fluorescent λ ex = 345 nm λ ém = 450 nm -nucleophiles -NH -CH UV

39 Le phage display Purification streptavidine Elution : DTT + ph2.2 Séparation & concentration sur gel SDS-PAGE Identification par LC/MS/MS

41 Cross-linking couplé à la spectrométrie de masse NH2 COOH NH2 COOH Cross-linking Trypsine COOH NH2 COOH NH2 I Analyse MS I Analyse MS Cross-linker d 0 /d 4 m/z m/z Grande taille Charge 4+ Echangeuse de cations SCX Phase réverse de type C4 X!Link

42 X!Link Cross-linking couplé à la spectrométrie de masse

43 Cross-linking couplé à la spectrométrie de masse Effet du Mg2+ sur l oligomérisation de Hsp90 MALDI-TOF équipé d un détecteur haute masse

44 BN-PAGE Jean Paul Lassère Slovénie Pyndhia Géraldine Gourgues Equipe plateforme Stéphane Claverol Jean William Dupuy Delphine Lapaillerie Anne Marie Lomenech Sébastien Vilain Equipe recherche Jean Marie Schmitter Kathel Bathany Corinne Buré Stéphane Chaignepain Bouteyna Frih Luc Négroni Merci de votre attention CovalX Alexis Nazabal Jérôme Haustant