Corrigé de l examen de BME Janvier 2006, sujet 1 (C. Vola)

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1 Corrigé de l examen de BME Janvier 2006, sujet 1 (C. Vola) 1) Les auteurs veulent étudier la fonction de la protéine nucléaire CBP (CREB Binding Protein), en relation avec p65 (RelA). - p65 est une des sous-unités du facteur NF-κB (l autre étant p50) qui induit l expression de plusieurs gènes impliqués dans la réponse inflammatoire dont la E-selectin. Les auteurs réalisent l expérience montrée sur la figure Figure 1 : Des cellules COS sont transfectées avec 2 µg de plasmide rapporteur contenant la séquence CAT (chloremphénicol acétyl transférase) sous le contrôle du promoteur de la E-selectin (EselCAT), 10 µg du vecteur d expression codant CBP (+) ou du vecteur vide (-) et 0, 0.1, 0.3, 1, et 3 µg du vecteur d expression codant p65. Dans chaque cas, l activité CAT mesurée est représentative de trois expériences. Quelles conclusions pouvez tirer de cette expérience? - P65 est un facteur qui active la transcription du gène cible E-selectin, en se liant au niveau du promoteur de ce gène (agit de façon dose dépendante jusqu à un certain seuil de saturation). - CBP est un co-activateur de p65 2) On réalise un Immunoblot avec les anticorps anti-p65 (ligne a et c) ou anti-sp1 (ligne b) après immunoprécipitation d un extrait cellulaire * avec des anticorps dirigés contre CBP (α CBP pistes 1 et 6) ou p65 (α p65 pistes 3 et 5). Input= un aliquot de l extrait cellulaire total sans immunoprécipitation (piste 4). αin= immunoprécipitation avec un serum non-immun (lane 7). * L extrait cellulaire provient de cellules endothéliales stimulées par le TNFα (A) ou non stimulées (B) Les résultats sont montrés sur la figure 2 ; Que signifient-ils? Quel est le mécanisme induit par la stimulation par le TNFα?

2 A B Figure 2 - Dans les cellules stimulées par TNF-α, CBP et p65 co-immunoprécipitent donc sont associées dans un même complexe alors que dans les cellules non stimulées, ces 2 protéines ne coimmunoprécipitent pas donc ne sont pas associées. - TNFα induit l activation et la translocation dans le noyau de NF-κB (p65/p50)par le mécanisme montré sur les schémas (voir cours). Donc dans les cellules non stimulées, p65 est dans le cytoplasme et après stimulation il se retrouve dans le noyau où il peut s associer à CBP qui est une protéine nucléaire.

3 3) La structure de la protéine CBP est schématisée sur la figure 3A, ainsi que les fragments N, M et C utilisés dans l expérience suivante dont le résultat est montré figure 3B Des billes de gluthation contenant GST ou GST-CBP [N (amino acids 1-771), M (amino acids ), C (amino acids )], sont mélangées avec un lysat de cellules COS. Après lavage, les protéines liées sont séparées sur un gel SDS/PAGE suivit d une analyse en Western blot pour p65, Sp1 and p50. Input= un aliquot de l extrait cellulaire total. Que pouvez conclure de cette expérience? N M C Figure 3A Figure 3B Cette expérience de GST pull down démontre que, in vitro, p65 interagit avec les domaines N et C terminaux de CBP ; en revanche la sous unité p50 de NF-κB n interagit pas avec CBP ; SP1 est un contrôle négatif, comme dans la fig2. 4) Les fragments -N ou C- de CBP (figure 3A) sont fusionnés au domaine de liaison à l ADN (BD) de la protéine Gal4 et insérés dans un vecteur d expression (vecteur pm) ; de la même façon, 2 fragments de p65 sont fusionnés au domaine d activation transcriptionnel (AD) de VP16 et insérés dans un autre vecteur d expression (VP16 p et VP16 p ). Ces vecteurs sont transfectés dans des cellules COS en présence d un plasmide rapporteur contenant la séquence CAT sous le contrôle de séquences UAS (pg5cat). Le système est schématisé sur la figure 4A. Dans chaque cas, l activité CAT est mesurée et les résultats représentatifs de 3 expériences sont montrés sur la figure 4B

4 A N,C CBP pg5cat UAS Figure 4A B Figure 4B Quel est le principe de cette expérience et son but? Que signifient les résultats obtenus? Il s agit d une expérience de Double hybride dans des cellules de mammifères, dont le principe est le même que dans des cellules de levure. Les cellules sont transfectées avec 3 plasmids : un contenant un gène rapporteur, ici la CAT, plaçé sous le contrôle de séquences UAS. Puis 2 autres plasmids hybrides : le premier contenant la protéine dite appat, ici les fragments N ou C ter de CBP, fusionnée à un domaine de liaison à l ADN (BD), ici celui de Gal (facteur de transcription) qui reconnaît et se fixe sur la séquence UAS ; le second contient la protéine dite proie, ici les domaines N (1-292) ou C ( ) de p65, fusionnée à un domaine d activation de la transcription (AD), ici celui de VP16. Si les deux protéines, appat et proie, interagissent, cette interaction permet de reconstituer un facteur de transcription contenant les 2 domaines nécessaires à son activité : le BD et l AD et on aura alors

5 transcription du gène rapporteur. Autrement dit, l activation du gène rapporteur (grâce à l AD de VP16) ne peut se faire que s il y a interaction entre les 2 protéines. Activité CAT= interaction. Les résultats de ce test double hybride montrent que les domaines N et C ter de CBP n interagissent qu avec la partie C ter de p65. 5) Les auteurs de ce travail propose le modèle ci-dessous pour expliquer leurs résultats ; Commentez le en quelques lignes et en particulier expliquez quel est le rôle de CBP. Model of the TNFα-induced E-selectin enhancer. (The binding of HMG I(Y) at multiple sites increases the binding of NF-kB and bends DNA in a way that facilitates the formation of a higher-order complex). CBP constitue un lien entre les facteurs de transcription et la machinerie transcriptionnelle ; CBP est un co-activateur qui porte par son Bromo domaine une activité histone acetyltransferases (HATs) ; il n interagit pas directemeent avec l ADN mais est recruté par interaction avec les facteurs de transcription comme c-jun et la sous unité p65 de NFκB au niveau de l enhanceosome de la E-selectin (c est la même chose pour l interféron β que nous avons vu en cours) Les coactivateurs comme CBP intègrent les fonctions activatrices des facteurs de transcription et coordonnent le remodelage de la chromatine et le recrutement du PIC