Nouvelles mutations RAS

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1 Nouvelles mutations RAS dans les cancers colo-rectaux

2 Rappel RAS : interrupteur de plusieurs voies de signalisation ras MUTATION RAS /ras activé en permanence : signalisation continue de la prolifération cellulaire

3 Rappel Avant nouvel AMM juillet 2013 EXON 2 G12 G c DNA G G T G G C c35g>a G A T G G C G12D 30-37% c35g>t G T T G G C G12V 21-23% c38g>a G G T G A C G13D 16-17% c34g>t T G T G G C G12C 10,8% c34g>a A G T G G C G12S 7,1% G= glycine c35g>c c37g>t c37g>a G C T G G C G G T T G C G G T A G C G12A 6,4 % G13C 0,5% G13S 0,2 % D = a. aspartique V= valine C = cystéïne S= sérine A= alanine

4 Rappel Famille protéines RAS : 3 isoformes exprimées de façon ubiquitaire (K-Ras, H-Ras et N-Ras). Zone conservée (N terminal, résidu 5-166) : (C terminal ) Schubbert et al, Nature Review Cancer, 2007

5 Rappel Famille protéines RAS : 3 isoformes exprimées de façon ubiquitaire (K-Ras, H-Ras et N-Ras). Zone conservée (N terminal, résidu 5-166) : (C terminal ) Schubbert et al, Nature Review Cancer, 2007

6 Rappel EXON 2 EXON 3 EXON Q61 G12 G13 Schubbert et al, Nature Review Cancer, 2007

7 Fréquence des allèles mutés KRAS, NRAS exon 2,3 et 4 (sur 4 études: 4000 cas environ ) KRAS exon 2: 41 % KRAS Exon 3: 3,5 à 4,8 % Codon 59: 0,8 %. A59T et A59G Codon 61: 3,6 à 4,8 %. Q61H > Q61L>Q61R>Q61K Q61H: 183 A>C et A>T KRAS Exon 4: 3,3 à 7 % Codon 117: 0,8 à 1,2 %. K117N: 351 A>C et A>T Codon 146: 3,3 à 6,3 %. A146T > A146V >A146P + 13 % de mutations NRAS Exon 2: 1,9 à 4,7 % Codon 12: G12D> G12S> G12C> G12V>G12A Codon 13: G13D, G13R, G13V, G13C NRAS exon 3: 3, 1 à 4,5 % Codon 59: A59T Codon 61: Q61K > Q61R > Q61L>Q61H NRAS exon 4: 1% -codon 117: 1 Codon 146: 0 Prime : + 17 % FIRE 3: + 16 %

8 Compilation KRAS EXON 1 EXON 2 EXON 3 EXON à 41 % 3,5 à4,8% 3,3 à 7% NRAS EXON 1 EXON 2 EXON 3 EXON ,9 à 5 % 3, 1 à 6 % < 1% BRAF EXON 1 EXON 15 EXON 16

9 Modifications d AMM Panitumumab : AMM modifiée en juillet 2013 pour les patients avec KRAS et NRAS non muté Cetuximab : avis favorable du CHMP en novembre AMM prévue début 2014

10 Modification AMM 25 Juillet 2013 (panitumumab)

11 Avancement pour la mise en place des tests KRAS/NRAS sur les plateformes Nombre de laboratoires ayant mis en place l analyse de KRAS exon laboratoires 0 Av Sept Septembre Octobre Novembre Décembre 14 Octobre 2013 Plateforme Midi-Pyrénées

12 Plateforme Midi-Pyrénées 14 octobre 2013: pour toute nouvelle demande de génotypage «KRAS» en intention de traitement anti-egfr (panitumumab ou cetuximab): Recherche mutations RAS KRAS exons 2,3,4 NRAS exons 2, 3, 4 Recherche mutation BRAF V600E

13 Comment demander une recherche de mutation RAS sur un nouveau cas? Fiche ONCOMIP mise à jour Site ONCOMIP Prescription par le DCC

14

15

16 Comment demander une recherche de nouvelles mutations RAS sur un cas déjà typé KRAS exon 2 sauvage? Fiche ONCOMIP mise à jour Site ONCOMIP Prescription par le DCC Inscrire : «nouvelle mutation RAS» Indication: uniquement si KRAS exon 2 sauvage ( wild type, sans mutation sur codons 12 et 13 de KRAS) Car mutations RAS mutuellement exclusives Une mutation, quel que soit le gène, quel que soit le codon contre-indique la prescription d anti-egfr

17 Bilan Plateforme MP 14 octobre 31 Décembre 2013 (2 mois ½): 235 analyses RAS 80 % en 1 er intention 20% en 2 ème demande (KRAS exon 2 20% en 2 ème demande (KRAS exon 2 sauvage)

18 Plateforme MP: 235 cas typés RAS KRAS EXON 1 EXON 2 EXON 3 EXON % 0,8% 5 % NRAS EXON 1 EXON 2 EXON 3 EXON ,6 % 4,4 % 0 % BRAF EXON 1 EXON 15 EXON % de mutations

19 Quel délai pour la réponse?? + 1 jour supplémentaire soit 8 à 9 jours Nbre de cas Délai Moyen Délai Médian 01/11/2012 au 31/12/ ,5 7 01/11/2013 au 31/12/ , jour Année ,3 7,5 Que ce soit en 1 er intention ou en 2 ème intention Pourquoi c est plus long?

20 Génotypage KRAS exon 2 1- Extraction ADN 2- détection d un mutant par HRM 3- Identification de la mutation par sondes Taqman

21 Génotypage KRAS, NRAS exon 2,3,4 1- Extraction ADN 2- détection d un mutant par HRM X 6 ( x8)!!!!! 3- Identification de la mutation par sondes Taqman /séquençage

22 KRAS exon 2 NRAS exon 2 Echantillon muté Echantillon normal KRAS exon 3 NRAS exon 3 KRAS exon 4 (codon 117) NRAS exon 4 (codon 117) KRAS exon 4 (codon 146) NRAS exon 4 (codon 146)

23 Routine cancer colorectal Cible Méthode Codons ciblés Amorce HRM Amplicon (pb) Amorce d'amplification Séquençage Amplicon Séquençage (pb inclulant tags) KRAS Exon2 HRM + Taqman 12, 13 KRAS F4R4 84 KRASF4Tag 124 KRAS Exon3 HRM + Séquençage (tags) 61 KRAS_x3_F1 / R1 105 KRAS_x3_F1_tag1; KRAS_x3_R1_tag2 145 KRAS Exon4 HRM + Séquençage (tags) 117 KRAS_x4_F11 / R KRASx4F11Tag2 /R11Tag KRAS_x4_F8 / R8 93 KRASx4F8Tag1 / RTag2 133 NRAS Exon2 HRM + Séquençage (tags) 12, 13 NRAS F /R 105 NRAS12_105FTag1 / RTag2 145 NRAS Exon3 HRM + Séquençage (tags) 61 NRAS 61-73F / R 73 NRAS61_73FTag1 / Rtag2 113 NRAS Exon4 HRM + Séquençage (tags) 117 NRASx4F1 / R1 105 NRASx4F1Tag1 / RTag NRASx4F2 / R2 90 NRASx4F2Tag1 / R2Tag2 130 BRAF Exon15 Taqman 600 NA BRAF113F et R 153 Une tumeur = 1 ADN extrait = 6 (8) analyses pour RAS + 1 analyse BRAF Taille des amplicons: 84 pb pour KRAS ex 2 mais 143 pb KRAS ex 4 impact sur la qualité du résultat: possible non amplifié!!

24 Résultat EXAMEN DE BIOLOGIE MOLECULAIRE : KRAS exon 2 (séquence référence : NC_ ) ADN n : A Technique HRM : 14/01/2014 Limite de détection de la mutation: 5% Qualité analyse HRM (valeur Cp échantillon) : 27,91 Analyse codon : Normal Commentaire technique HRM : Conclusion : Pas de mutation des codons 12 et 13 de KiRAS EXAMEN DE BIOLOGIE MOLECULAIRE : Recherche de mutations RAS ADN n : A Technique : HRM +/sonde Taqman KRAS exon 3 : non muté KRAS exon 4 : non muté NRAS exon 2 : muté : c.35g>t ; p.g12v NRAS exon 3 : non muté NRAS exon 4 : non muté Commentaire technique : Conclusion : Mutation NRAS exon 2 : c.35g>t ; p.g12v

25 Résultat EXAMEN DE BIOLOGIE MOLECULAIRE : KRAS exon 2 (séquence référence : NC_ ) ADN n : A Technique HRM : 14/01/2014 Limite de détection de la mutation: 5% Qualité analyse HRM (valeur Cp échantillon) : 28,88 Analyse codon : Normal Commentaire technique HRM : Conclusion : Pas de mutation des codons 12 et 13 de KiRAS EXAMEN DE BIOLOGIE MOLECULAIRE : Recherche de mutations RAS ADN n : A Technique : HRM KRAS exon 3 : non muté KRAS exon 4 : non muté NRAS exon 2 : non muté NRAS exon 3 : non muté NRAS exon 4 : non muté Commentaire technique : Conclusion : Pas de mutation KRAS (exon 3 et 4). Pas de mutation NRAS (exon 2,3,4) CONCLUSION : Pas de mutation KRAS (exon 2, 3 et 4). Pas de mutation NRAS (exon 2,3,4) Pas de mutation c.1799t>a, p.v600e de BRAF Prière d utiliser les fiches de prescription générées sur le DCC d ONCOMIP

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