Formation Permanente INSERM 2015 Histologie & Immunohistologie

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1 Formation Permanente INSERM 2015 Histologie & Immunohistologie «De la préparation de l échantillon à l observation» Du 12 au 16 octobre Institut des Neurosciences de Montpellier - Intervenants Enseignement théorique Chantal Ripoll (IE-INSERM-RHEM) - Présentation Plateau Histologie RHEM-INM. (Réseau d Histologie Expérimentale de Montpellier) Hassan Boukhaddaoui (IR-INSERM-MRI) - Présentation du plateau Imagerie MRI-INM. (Montpellier Rio Imaging) Marc Lenoir (CR-INSERM-RAM) - Présentation du plateau Animalerie RAM-INM (Réseau des Animaleries de Montpellier) Jean-Philippe Hugnot (MCU-UM) - Principe de base d histologie - Principes d immunodétection sur coupes et cellules Stéphane Tarton (IE-INSERM) - Hygiène et Sécurité et BPL Chantal Cazevieille (IR-UM-MRI) - Introduction à la Microscopie Électronique Valérie Rigau, Anatomopathologiste (CHU de Montpellier) - Histologie des tissus pathologiques à l hôpital Sylvain Derossi (IE-INSERM-MRI) -Principe de la microscopie Sar Chamroeun (IE-UM-MRI) -Présentation des logiciels d analyse d image 2D et 3D 1

2 Déroulement de la formation théorique Séminaires Séminaire I : Principes généraux d histologie : 2h15 intervenant - JP Hugnot Fixation : les différents agents fixateurs Inclusion : Inclusion en paraffine, à congélation, en agarose, en résine époxy Coupes : vibratome, cryostat, microtome Coloration des tissus Séminaire II : Principes d immunohistologie : 1h00 intervenant - JP Hugnot Prétraitements des coupes : perméabilisation, blocage, démasquages, diminution du bruit de fond Immunodetection par fluorescence et révélation enzymatique Techniques d amplification : Biotine, tyramide Marquages des noyaux Détection des cellules en prolifération et en apoptose, Choix et contrôle qualité des anticorps, contrôles essentiels en immunohistologie Artéfacts et pièges en immunohistologie Séminaire III : Hygiène et Sécurité, BPL : 1h00 intervenant - Stéphane Tarton Séminaire IV : Histologie des tissus pathologiques à l hôpital : approches, qualité, points critiques et pièges : 1h00 intervenant - Valérie Rigau Séminaire V : Microscopie électronique : 1h30 intervenant - Chantal Cazevieille Principes Microscopie électronique à transmission (MET) et techniques de préembedding et de post-embedding Microscopie électronique à balayage (MEB) Séminaire VI : Principe de microscopie : 1h30 Intervenant - Sylvain Derossi Imagerie en transmission (Contraste de phase, fond noir, contraste interférentiel/dic/nomarski) Principe de l épifluorescence Appareillages pour la microscopie Séminaire VII : Présentation des logiciels d analyse d image 2D et 3D (Metamorph, Definies, Imaris) : 1h15 intervenant - Sar Chamroeun 2

3 Documents fournis Clés USB/stagiaire - Bibliographie-Ouvrages recommandés - Présentations des intervenants (Power Point) - Sites internet - Liste des Fournisseurs - Protocoles d histologie 3

4 Formation Permanente INSERM 2015 Histologie & Immunohistologie «De la préparation de l échantillon à l observation» Du 12 au 16 octobre Institut des Neurosciences de Montpellier - Intervenants en Histologie Enseignement pratique Sophie Guelfi (PHD) - Perfusion intracardiaque, immunofluorescence sur cellules Ripoll Chantal - Congélation des tissus, coupes cryostat, coupe paraffine, colorations, immunomarquages Sassetti Isabelle (TRS-INSERM) - Congélation, coupes cryostat Teigell Marisa (AI-BioCampus) - Perfusion intracardiaque, coupes vibratome, immunomarquages Intervenants en Imagerie Boukhaddaoui Hassan - Microscopie confocale Sar Chamroeun - Scanneur de lames haute définition Sylvain Derossi - Apotome 4

5 Déroulement de la formation pratique Histologie - Fixation souris par perfusion intra cardiaque - Guelfi, Teigell - Dissection cerveau - Guelfi, Teigell - Inclusion : froid - Ripoll, Sassetti, paraffine - Ripoll - Coupes : microtome - Ripoll, cryostat - Sassetti, vibratome - Teigell - Colorations - Ripoll - Immunofluorescence en double marquage sur tissus et cellules - Guelfi, Ripoll, Teigell - Immunopéroxidase sur tissus - Ripoll, Teigell - Marquages des noyaux - Ripoll, Teigell - Montages en milieu permanent et aqueux - Ripoll, Teigell - Montages en milieu aqueux avec Dapi - Guelfi Imagerie - Microscopie plein champs et Apotome - Derossi - Microscopie confocal - Boukhaddaoui - Nanozoomer et Ananlyse Images - Sar Documents fournis - Protocoles des manips d immunomarquages et de coloration - Fiches techniques des anticorps utilisés - Fiches techniques des appareillages utilisés 5

6 - Accueil des participants à partir de 8h30 - Lundi 12/10 9h-12h30 Mardi 13/10 9h-12h30 Mercredi 14/10 8h30-13h Jeudi 15/10 9h-13h Vendredi 16/10 9h-13h 9h00 à 9h15 Accueil-Présentation INM Pr Jean-Luc Puel (Directeur de l INM) MRI-IMAGERIE 9h15 à 9h30 Présentation INM-RHEM. Chantal Ripoll 9h30 à 9h45 Présentation INM MRI Hassan Boukhaddaoui 10h00 à 11h30 Présentation INM-RAM Marc Lenoir 11h30 à 12h30 Stéphane Tarton - Séminaire III : Hygiène et sécurité/bpl 9h00 à 10h30 Chantal Cazevieille - Séminaire V : Microscopie électronique. 10h45 à 12h30 Introduction aux TP JP. Hugnot 8h30 à 10h30 -coupes vibratome -coupes paraffine -coupes cryostat 10h45 à 13h00 Immunomarquage sur coupes et cellules : -anticorps primaires. 9h00 à 10h30 Sylvain de Rossi Séminaire VI : Base de la microscopie 10h45 à12h00 Séminaire VII : Chamroeun Sar, Analyse d image 12h à 13h Valérie Rigau Séminaire IV : Histologie au quotidien au service d anapath du CHU de Montpellier 9h00 à 13h00 - Microscopie Confocal - Microscopie champs plein / Apotome - Automatisation et analyse d images 9h45-10h00 10h30-10h45 10h30-10h45 10h30-10h45 9h45-10h00 PAUSE café Pause-déjeuner Pause-déjeuner Pause-déjeuner Pause-déjeuner Pause-déjeuner 14h -18h 14h-18h30 14h-18h 14h-18h30 14h-18h MRI-IMAGERIE 14h00à 16h15 JP Hugnot Séminaire I : Principe d histologie. 16h30 à 18h00 J.P Hugnot - Séminaire II : Principe d histologie, suite. 14h00 à 18h30 -Perfusion intracardiaque -Dissection -Congélation 14h00 à 16h15 -Anticorps secondaires 16h30 à18h00 -Marquages des noyaux/montage des lames et lamelles 14h00 à 16h15 -Révélation peroxydase 16h30 à 18h30 -Marquage des noyaux/ montage des lames -colorations 14h00 à 18h00 Suite - Microscopie Confocal - Microscopie champs plein / Apotome - Automatisation et analyse d images 16h15-16h30 16h15-16h30 16h15-16h30 16h15-16h30 16h15-16h30 PAUSE café PAUSE café A partir de 20h00 Repas des participants au centre de Montpellier 18h30 Evaluation de la formation. 6

7 Groupes TPs 7

8 Mardi 13/10 de 14h à 18h30 Perfusion/Dissection/fixation/congélation Groupe 1 : de 14h à 16 h : 2 postes de perfusion-dissection : 2 groupes de 3 personnes - Guelfi - Teigell Groupe 2 : de 14h à 16h : 2 postes de congélation : 2 groupes de 3 personnes - Ripoll - Sassetti Groupe 1 : de 16h à 18h30 : 2 postes de congélation : 2 groupes de 3 personnes - Ripoll - Sassetti Groupe 2 : de 16h à 18h30 : 2 postes de perfusion-dissection : 2 groupes de 3 personnes - Guelfi - Teigell 8

9 Mercredi 14/10 de 8h30 à 13h Microtomie/ Immunomarquages Session 1 : 4 personnes /groupe Groupe A : de 8h30 à 9h30 : 1 poste coupe vibratome Groupe B : de 8h30 à 9h30 : 1 poste coupe au cryostat Groupe C : de 8h30 à 9h30 : 1 poste coupe en paraffine Session 2 : 4 personnes /groupe Groupe A : de 9h30 à 10h30 : 1 poste de paraffine Groupe B : de 9h30 à 10h30 : 1 poste de vibratome Groupe C : de 9h30 à 10h30 : 1 poste de cryostat Session 3 : 4 personnes /groupe Groupe A : de 10h30 à 11h30 : 1 poste de cryostat Groupe B : de 10h30 à 11h30 : 1 poste de paraffine Groupe C : de 10h30 à 11h30 : 1 poste de vibratome Teigell Sassetti Ripoll Ripoll Teigell Sassetti Sassetti Ripoll Teigell Groupe A : de 11h30 à 13 h Immunomarquages sur : coupes vibratome, coupes congelées, coupes paraffine et sur cellules : 1 er anticorps Groupe B : de 11h30 à 13 h Immunomarquages sur : coupes vibratome, coupes congelées, coupes paraffine et sur cellules : 1 er anticorps. Groupe C : de 11h30 à 13 h Immunomarquages sur : coupes vibratome, coupes congelées, coupes paraffine et sur cellules : 1 er anticorps. Guelfi Ripoll Teigell 9

10 Mercredi 14/10 de 14h à 18h Immunomarquages suite Groupe A +Groupe B +Groupe C : De 14h à 18 h Immunomarquages sur : coupes vibratome, coupes congelées, coupes paraffine et sur cellules : 2 ème anticorps/marquage des noyaux/ Montage des lames et lamelles en milieu aqueux (montage antifading pour la fluorescence) Guelfi - Ripoll - Teigell Jeudi 15/10 de 14h à 18h30 Révélation enzymatique/montage des lames Groupe A +Groupe B +Groupe C De 14h à 16h15 : Révélation enzymatique/marquages des noyaux/montage des lames en milieu permanent (déshydratation des coupes). Ripoll - Teigell Groupe A +Groupe B +Groupe C De 16h30 à 18h30 : Coloration des coupes vibratome, coupes congelées, coupes Paraffine (Hématoxyline/Eosine, Bleu de toluidine) Ripoll - Teigell 10

11 Vendredi 16/10 de 9h00 à 18h00 Imagerie / Analyse d images Microscopie plein champ / Apotome - Derossi Groupe A : de 9h00 à 11h30 Groupe B : de 9h00 à 11h30 Groupe C : de 9h00 à 11h30 Microscopie Confocal - Boukhaddaoui Groupe B : de 11h30 à 13h00 / de 14h00 à 15h30 Groupe C : de 11h30 à 13h00 / de 14h00 à 15h30 Groupe A : de 11h30 à 13h00 / de 14h00 à 15h30 Automatisation Nanozoomer et Analyse d images - Sar Groupe C : de 15h30 à 18h00 Groupe A : de 15h30 à 18h00 Groupe B : de 15h30 à 18h00 11