La cytométrie en flux appliquée à l écologie virale aquatique: tentative de revue sur la question

Transcription

1 La cytométrie en flux appliquée à l écologie virale aquatique: tentative de revue sur la question Stéphan JACQUET INRA, Thonon-les-Bains

2 CONTENU DE L EXPOSE Introduction générale Techniques d observation et de comptage Principes Avantages Inconvénients - Comparaison La Cytométrie en flux et l écologie des virus aquatiques Quid de la littérature? Utilisation de la Cytométrie en flux On y retourne avec des exemples précis! Quelques recommandations s il en fallait Ce qui est vrai et ce qui ne l est pas forcément Conclusions et Perspectives Des avancés, des problèmes et des défis Remerciements

3 In the field of observation, chance favors the prepared mind Louis Pasteur

4

5 «L essentiel est invisible pour les yeux» Antoine de Saint-Exupéry

6 Small is beautiful John Raven

7 All the world is a phage William Shakespeare

8 Comprendre le rôle du vivant dans le fonctionnement des écosystèmes aquatiques nécessite de répondre au moins à 3 questions fondamentales :! Quels sont les organismes présents et quelle est leur abondance?! Quels sont leurs taux métaboliques et reproductifs?! Quels sont leurs rôles dans le fonctionnement de l écosystème? " Phytoplancton, zooplancton et poissons " Peu de travaux sur le compartiment microbien

9 Abondance des organismes dans 1 ml d échantillon d eau (lac, mer, océan) Virus / phages Bactéries hétérotrophes Bactéries photosynthétiques Protozoaires flag et ciliés < Algues < Zooplancton << 1 Poissons 0 Agents de mortalité cellulaire Agents recycleur de la MO Agents de contrôle de la diversité Agents intervenant dans les transferts et recombinaisons génétiques

10 # Faits marquants de l Écologie microbienne aquatique 1974 Importance des bactéries aquatiques (10 6 ml -1 ) Le réseau trophique microbien (Pomeroy) 1980 Production bactérienne élevée (Hagström) 1983 La boucle microbienne (Azam) Age de la bactériologie 1984 Prédation des bactéries par protozoaires (Sherr) 1989 Importance des virus (10 7 ml -1 ; Bergh) 1990 Incroyable diversité bactérienne (Giovanonni) 1990 Les virus réduisent la production primaire (Suttle) 1995 Les virus responsables de 50% de la mortalité bactérienne (Fuhrman) 1996 Les virus, redistributeurs de la MOD (Middelboe) Age de la virologie 1997 Concept du «killing the winner» (Thingstad) 1998 Les virus, agents d échange génétique (Paul) 2004 Incroyable diversité virale (Weinbauer)

11 # Faits marquants de l Écologie virale aquatique ~1950 Mise en évidence des bactériophages marins ~1970 Mise en évidence des virus d organismes photosynthétiques : Virus de cyanobactéries : Virus de Micromonas pusilla : Virus de Chlorella sp. > 1990 Isolement de virus du phytoplancton - Aureococcus anophagefference - Emiliana huxleyi - Phaeocyctis pouchetti - Chrysochromulina ericina - Chrysocromulina brevifilum, - Pyramimonas orientalis - Heterosigma akashiwo, - Heterocapsa sircularisquama - Rhizosolemia setigera > 1996 Isolation de virus à cyanobactéries filamenteuses marines Phormidium persicinum, Trichodesmium, Lyngbya majuscula

12 Torrella, F., and R. Y. Morita Evidence by electron micrographs for a high incidence of bacteriophage particles in the waters of Yaquina Bay, Oregon: ecological and taxonomical implications. Appl. Environ. Microbiol. 37: A minimum of 10 4 phage particles per ml was estimated It is assumed that the actual number of phage particles is higher than 10 4 particles per ml The implications of the presence of such concentrations in bays and estuaries with a certain level of eutrophication are of obvious importance in considering the microbial ecology of these environments

13 Il y a plusieurs méthodes connues pour détecter et compter les virus en milieu aquatique! Morphologie taille des particules EFM TEM - SEM FCM! Approches moléculaires DGGE - PCR AVS, DNApol, g20, etc PFGE - taille du génome PCR quantitative! Techniques de culture PFU MPN

14 Les méthodes traditionnelles et courantes pour compter les virus sont : - Plaque Assay - TEM - EFM - FCM Utilisées depuis > 50 ans Utilisées depuis > 10 ans Liées au développement des marqueurs fluorescents

15

16 Type: Titrage par plage de lyse Principe: Compter des plages de lyse, correspondant à l action d un ou plusieurs virus infectieux. Comptage: oeil Avantages On voit (on prétend!) les organismes Méthode relativement simple? Désavantages Mesure des virus «actifs» ou infectieux Sous estimation de la quantité réelle Pas si évident à réaliser Méthode lente: Jours à semaines Applications limitées: l Hôte doit être connu. Quid du problème de lysogénie?

17

18 Virus Bactérie Type: EFM Principe: Cibler l ADN bactérien et viral - fluorescence après excitation lumineuse. Utiliser un marqueur hautement fluorescent des acides nucléiques (SYBR Gold) Comptage: oeil Avantages Tous les virus sont comptés On voit (on prétend!) les organismes Méthode simple Méthode relativement rapide Désavantages Aucune identification possible / Bactvir? Oeil humain (reproductibilité?) Fluorescence des particules ( Fading ) Calcul de conversion entre comptage réel et concentration réelle

19 Il y a une limite de détection des particules virales EFM / SYBR Gold 11,2 kb ssrna Ø = 32 nm RsRNAV (Nagaski et al. 2004)

20 Stéphan JACQUET Équipe de Microbiologie Aquatique, INRA, Thonon Cytométrie en flux & Écologie Virale SFM, Paris, 10 novembre 2005

21 Bactérie Virus Type: TEM Principe: Diffraction d un flux d électrons par des composés colorés des bactéries et des virus Comptage: oeil Avantages Désavantages On voit (reconnaît?) tous les organismes Accès à de nombreux paramètres ou événements : Comptage, taille, forme, lyse, etc BS, FVIC, (FIC, VIBM) Oeil (reproductibilité?) Méthode longue, non routinière Personnel qualifié Conversion du nombre de virus compté au nombre réel? Conversion BS : VIBM?

22 Il n y a aucune limite de taille pour la détection des particules virales en TEM

23 Virus Bactéries Virus

24 Type: FCM Virus Bactéries Virus Principe: Cibler l ADN bactérien et viral - fluorescence après excitation lumineuse LASER. Utiliser un marqueur hautement fluorescent des acides nucléiques (SYBR Green I) Comptage: Machine Avantages Toutes les particules sont détectées Méthode rapide Grand nombre d échantillons Quantification en routine possible Grande reproductibilité Erreur faible Discrimination des particules Désavantages On voit des spots! Identification «spécifique» rarissime Surestimation des virus bactériophages? Limite de détection Substances humiques et autres particules!

25 Il y a une limite de détection des particules virales FCM / SYBR Green I 7.4kb ssrna / Ø=30nm (PV-1): limite de la détection 40 kb dsdna / Ø=60nm (Phage T7): Détectable (Brussaard et al. 2000) Poliovirus PV Kbp ssrna Bacteriophage T7 40 Kbp dsdna Counts Relative Green Fluorescence

26 PpV ( nm) Application of digital image analysis and flow cytometry to enumerate marine viruses stained with SYBR Gold Chen et AEM 67: Cyanophages et échantillons naturels Nanosphères en polystyrène (460 nm)

27 Coût, performances, simplicité d utilisation, préparation des échantillons, rendement, comptages les plus élevés : FCM > EFM > TEM The winner is : Les cytométres en flux commerciaux

28 Stéphan JACQUET Équipe de Microbiologie Aquatique, INRA, Thonon Cytométrie en flux & Écologie Virale SFM, Paris, 170 novembre 2005 Recherche bibliographique sur Internet Bases de données: CC, ISI, WOK, CAB, etc All years, all languages, all document types Flow cytometr* AND virus* Flow cytometr* AND virus* AND Aquatic Flow cytometr* AND virus* AND Marine Flow cytometr* AND virus*and Freshwater ~ Références ~ 50 Références ~ 100 Références 2 Références septembre 2005

29

30 AFFINAGE De 1999 à 2005, Toutes langues, tout type de documents : Flow cytometr* AND virus* 1859 Références Flow cytometr* AND virus* AND Aquatic 11 Références Flow cytometr* AND virus* AND Marine 41 Références Flow cytometr* AND virus* AND Freshwater 2 Références Méthodologie, Détection, Caractérisation, Écologie (dynamique de populations ou communautés, Physiologie)

31 Nombre de références Nombre de références Écologie Méthodologie Isolement Physiologie Autre VLP, bacteriophages Virus de microalgues Cyanophages Autres virus

32 Marie et al AEM 65:45-52 Campagne MINOS, Mer Méditerranée (18 juin 1996)

33 Marie et al AEM 65:45-52 Campagne MINOS, Mer Méditerranée (18 juin 1996)

34 Marie et al AEM 65:45-52 Campagne MINOS, Mer Méditerranée (18 juin 1996) V1 vs. V2 V2 - Hbact V1 - phytopk VBR

35 g Red fluorescence Green fluorescence Nanoeukaryotes Picoeukaryotes Larsen et al & 2004 V2 E. huxleyi Unknown Beads Synechococcus sp. Side scatter Bacteria V1 V4 Cryptophytes Beads B Duhamel et al Goddard et al V3 C Side scatter

36 Échantillons naturels 2 à 4 groupes viraux! Marie et al Li & Dickie 2001 Castberg et al Chen et al Jacquet et al. 2002a, 2002b Larsen et al & 2004 Goddard et al Duhamel et al Jardillier et al. sous presse Personnic et al. en préparation Bactériophages? Cyanophages? Virus de microalgues? Autres virus? ADN Libre? Contaminants? Détritus? Travail à faire dans les années à venir

37 Complémentarité des méthodes Abondances des virus, bactéries, Synechococcus : FCM + Diversité virale totale : PFGE + Diversité des cyanophages : PCR-DGGE + Quantité réelle de cyanophages : RT-PCR + Identification formelle: séquencer les bandes dominantes des gels DGGE et PFGE FCM 600 PFGE mar 23.mar 12.apr 27.apr 11.mai 25.mai 29.jun 10.aug 12.aug 19.aug 21.sep 28.sep 06.okt 12.okt PCR-DGGE 02.nov Écologie des communautés écologie des populations Dynamique précise permettant de montrer le couplage entre les communautés planctoniques, de démontrer le rôle des virus comme agents de mortalité d un groupe donné, comme agents de contrôle des successions planctoniques RT-PCR

38

39 Eucaryotes autotrophes Cyanobactéries (Synechococcus sp.) Bactéries hétérotrophes h (E.coli) SSC- Height Bactéries hétérotrophesh Échantillon naturel eau de mer (Allemagne) Brussaard 2004 AEM 70:

40

41 CADRE SCIENTIFIQUE GENERAL PROCESSUS ETUDIES Stéphan JACQUET Équipe de Microbiologie Aquatique, INRA, Thonon Cytométrie en flux & Écologie Virale SFM, Paris, 10 novembre 2005 "Réseaux trophiques microbiens en milieu pélagique lacustre" NUTRIMENTS MINERAUX PRODUCTEURS PRIMAIRES Microalgues Cyanobactéries MOD ALLOCHTONE Activités La boucle de recherche microbienne (20) MOD AUTOCHTONE MATIERE ORGANIQUE DISSOUTE PARTICULAIRE "Facteurs de régulation ascendants et descendants des microorganismes de la boucle microbienne" QUALITÉ, TRANSFORMATION de la MOD Dynamique et Diversité METAZOAIRES ZOOPLANCTON - Crustacés -Rotifères PREDATEURS AMIBES NUES BACTERIES HETEROTROPHES + PICOEUCARYOTES + PICOCYANOBACTERIES BOUCLE MICROBIENNE PROTISTES FLAGELLES VIRUS Abondance, diversité et rôles INTERACTIONS TROPHIQUES Relations structure - fonction PROTISTES CILIES Lacs Léman, d Annecy & du Bourget

42 La problématique générale de l EMA évaluer la diversité, la dynamique et le fonctionnement des communautés microbiennes aquatiques des virus aux protozoaires Stratégie 2 échantillonnages par mois 7-8 profondeurs entre 0 et 50 m > juillet communautés: s: picocyanobactéries, petits eucaryotes, bactéries hétérotrophes, h virus, flagellés s (>2004), ciliés s (>2004). Comparaison entre les 3 lacs Léman, d Annecy et du Bourget

43 Lac du Bourget 10 Fluorescence chlorophylle a Petits eucaryotes Picocyanobactéries Billes Picocyanobactéries (cell.ml -1 ) août déc. avr. août déc. avr. août déc. 2e+4 4e+4 6e+4 8e+4 1e RALS Petits eucaryotes (cell.ml -1 ) août déc. avr. août déc. avr. août déc

44 Lac du Bourget 10 Fluorescence ADN-SYBR Green 1 Bactéries hétérotrophes RALS Billes Bactéries hétérotrophes (cell.ml -1 ) août déc. avr. août déc. avr. août déc. PAS DE DONNEES Virus (part.l -1 ) août déc. avr. août déc. avr. août déc e+6 2e+6 3e+6 4e+6 5e+6 6e+6 7e+6 2,0e+7 4,0e+7 6,0e+7 8,0e+7 1,0e+8 1,2e+8 1,4e+8 1,6e+8 1,8e+8

45 Lac du Bourget 10 Fluorescence ADN-SYBR Green 1 VLP3 Bactéries hétérotrophes RALS VLP2 VLP Virus 1 (part.ml -1 ) 50 févr. avr. juin août oct. déc Virus 2 (part.ml -1 ) 50 févr. avr. juin août oct. déc. 2,0e+7 4,0e+7 6,0e+7 8,0e+7 1,0e+8 1,2e+8 2e+6 4e+6 6e+6 8e+6 1e

46 Lac du Bourget 10 Fluorescence ADN-SYBR Green 1 VLP4 Bactéries hétérotrophes RALS Virus 3 (part.ml -1 ) 50 févr. avr. juin août oct. déc Virus 4 (part.ml -1 ) 50 févr. avr. juin août oct. déc. 2,0e+5 4,0e+5 6,0e+5 8,0e+5 1,0e+6 1,2e+6 2,0e+5 4,0e+5 6,0e+5 8,0e+5 1,0e+6 1,2e+6 1,4e+6

47 Corrélations de Pearson Vtot Picos euks Cil Flagnopig Flagpig Hbact Vtot Picos Euks Cil Flagnopig Flagpig Hiver Printemps Été automne P<0,05 Lac du Bourget

48 Variance des données étudiée par ACP Analyse exploratoire - Corrélations partielles Comparaison entre lacs 1,0 0,5 BOURGET Lake Association entre variables PC * VLP1 * VLP BOURGET Lake Association entre périodes Hypolimnion all dates Epilimnion end Oct- Nov Epilimnion Jul-Sept- early Oct Factor 2 : 14,89% 0,0 Si PO4 NO3 Chla AEP T c TOC Factor 2: 14,06% May -0,5 NH4 HB -3-4 Epilimnion April - May -1,0-1,0-0,5 0,0 0,5 1, Factor 1 : 48,95% Factor 1: 48,17%

49 Lac du Bourget Les virus VLP1 et les flagellés s hétérotrophes h ont un lien étroit avec la mortalité bactérienne au printemps, en été et en automne. Le bloom bactérien est suivi d un d pic de VLP1 tous les automnes - caractéristique ristique commune aux 3 lacs - VBR Les picocyanobactéries sont fortement corrélées avec les VLP2 (cyanophages?) Une forte corrélation existe entre les virus VLP4 et les petits eucaryotes photosynthétiques tiques Aucune relation entre la chla et les VLP1 mais avec VLP2 Personnic et al. en préparation

50 Impact des virus et des protozoaires sur la mortalité bactérienne Eau du lac filtrée sur 0,02 µm 0% Contrôle 20% 40% 70% 100% Eau du lac filtrée sur 2 ou 11 µm

51 La lyse virale est responsable de 10% de la mortalité bactérienne journalière re dans l él épilimnion du lac Léman L au mois de mai Duhamel et al RSE (sous presse)

52 Et les autres travaux in situ (1)? Concentration et distribution des virus obtenues en routine Obtention de séries temporelles Lien évident entre les Communautés VBR etc Norvège, UK, France, Canada! VLP ayant la plus basse fluorescence = bactériophages ; les autres VLP = Cyanophages ou virus de microalgues sur la base des abondances et ratio entre communautés planctoniques! Les virus sont intimement liés aux autre communautés planctoniques et ne peuvent plus être Ignorés! Le VBR augmente pendant les périodes de transition et suggèrent l activité virale! Les virus semblent jouer un rôle plus important dans le contrôle de la composition bactérienne dans les écosystèmes lacustres les plus eutrophisés Des expériences ciblées facilitées: mesure d impacts par la méthode de dilution UK, Norvège, Hollande, Canada, France Les virus sont responsables de 9 à 25% de la mortalité de Micromonas, 5 à 30% de la mortalité des bactéries hétérotrophes. Résultats bizarres pour Synechococcus! Quid de Prochlorococcus? Un cas particulier: Emiliana huxleyi et son/ses virus spécifique(s) Norvège, UK! Travail à haute fréquence! Changement morphologique enregistrée dans la population hôte infectée! Rôle important de N et P dans les interactions virus-hôte et dans la production virale! Rythme circadien dans la production virale! Persistance de la population hôte / Diversité phénotypique/génotypique de l hôte et des virus?

53 Et les autres travaux in situ (2)? Un autre cas particulier : Phaeocystis globosa et ses virus spécifiques Hollande! PgV est une source de contrôle via une mortalité importante du bloom de ce prymnesiophyte sous sa forme unicellulaire sur les côtes de la mer du Nord (7-76%)! Sous sa forme coloniale, l action virale est réduite voire inexistante : succès du bloom! Le degré d infectivité évolue dans le temps et le% de mortalité de PgV est importante! Les relations entre l hôte et ses virus dépendent fortement de la quantité de lumière et des nutriments Complémentarité des méthodes: Successions planctoniques / relations entre communautés affinées grâce à l utilisation conjointe FCM + PCR-DGGE + PFGE + TEM/LM Bergen, Plymouth, Hiroshima, Hollande! Clarification de l identité des particules et de leur rôle (ex: E. huxleyi)! Les virus ne terminent pas forcément les blooms algaux ou bactériens mais plutôt empêchent les populations hôtes de proliférer («Kill the winner «)! VLPx est composé de plusieurs types de virus - pas forcément représentant d un seul hôte! La même signature virale peut correspondre à différents génotypes au cours d un bloom Susceptibilité de l hôte? Variation génétique? Degré d infectivité du/des virus?

54 Et les autres travaux au laboratoire (3)? Virus de microalgues haptophytes, prymnesiophyte, prasinophyte : Pp, Po, Eh, Mp, Ce Norvège, France! Processus et caractéristiques de l infection (croissance cellulaire, viabilité cellulaire, cycle cellulaire, paramètre physiologique, production virale, host-range, résistance, etc) $ Calcul précis de la période de latence (PL) et du burst size (BS) et Hypothèses sur le rôle de ces virus pour expliquer que certaines espèces «blooment»et d autres pas : PL BS Emilana huxleyi h Chrysochromulina ericina h Pyramimonas orientalis h Micromonas pusilla 12 h 45 Phaecystis pouchetii h $ L infection de ces cellules se traduit par des changements très marqués des paramètres relatifs à leur taille, à la fluorescence de leur contenu en chlorophylle, à leur cycle cellulaire $ Il n est toutefois pas possible de généraliser à partir de ces paramètres de diffraction ou de fluorescence pour savoir si les cellules sont infectées ou pas par des virus - Applicable en cas de bloom monospécifique $ Les colorants SYTOX (dead) et CALCEIN-AM (alive) ont permis de calculer avec précision le moment et la durée de la mort cellulaire suite à l infection virale de Pp et Mp Application à Eh in situ $ L infection et la production virale ne se font pas à n importe quel moment du cycle cellulaire $ Il y a toujours, après une infection massive, une partie de la population hôte qui repousse $ Les virus sont susceptibles à l action des UVB mais ils assurent aussi une protection accrue aux cellules hôtes. $ etc

55

56 Compter et comparer - SYBRs (I, II, Gold, Safe) - Tampons (FW, TE, TAE, TBE, PBS) - FCM vs EFM - Préservation (PFA, FA, GLU) - Congélation (4 C, 20 C) Dorigo, U., S. Personnic, S. Jacquet Necesary tests for counting freshwater bacteria and viruses in alpine lakes Water Research (accepté) SYBR Green II (x 10 6 cells.ml -1 ) : SYBR Green I (x 10 6 cells.ml -1 )

57 Résultats majeurs FCM EFM Bactéries Virus Bactéries & Virus Fixation GA 2 % Pas nécessaire n.n. Marquage avec SYBR Green I (10-4 ) SYBR Gold (2 x 10-5 ) SYBR Gold (10-3 ) Temps de marquage 15 min min n.t. Solution de Dilution TE (n.n. autoclavé) TE (autoclavé, ph 7-8) Pas de dilution Incubation T ( C) ambiante 75 C n.t. Analyses recommandées T = 0 (ou après 1 j) T = 0 T = 0-30 jours si conservation à 20 C Conservation 1 j à 4 C Pas de données 1 mois à 20 C

58

59 En résumé: recommandations et autres vérités sur FCM Faire ses propres tests! Meilleurs cytos : ceux de paillasse type FACS car ayant souvent la plus haute sensibilité : vrai Échantillon à analyser tout de suite, une fois fixée avec glutaraldéhyde 0,5% min, à congeler dans l azote liquide, à conserver à -80 C, à décongeler 5 min avant l analyse, à marquer et chauffer : globalement, vrai Pas de différence entre Glu et PFA : pas toujours vrai SYBR Green 1 : marine / SYTO 9 : Freshwater (1/20 000) : pas toujours vrai SYBR Gold Pas de relation entre taille du génome et fluorescence virale : vrai Dilution avec un tampon de type TRIS-EDTA à ph=7-8 : Vrai Sheath fluid: Mieux vaut utiliser de l eau MilliQ : Vrai Coincidence : virus par seconde pour les FACS : Vrai Pas de dilution: coïncidence Trop grande dilution: perte dans le signal d émission : Vrai

60 En conclusion FCM est une méthode de comptage des particules qui est plus rapide que la microscopie et qui minimise les erreurs associées au comptage «humain» Cela a permis d acquérir, par quelques labos et sûrement d autres à venir, des données sur l abondance et la distribution des virus dans les écosystèmes aquatiques beaucoup plus rapidement qu aucune autre méthode ne l aurait fait à ce jour Parce que toutes les particules dans l échantillon sont comptées, la significativité statistique des données est considérablement améliorée Parce que les particules sont mesurées aveuglément, des contrôles et tests appropriés sont nécessaires de façon à s assurer que le signal mesuré ne reflète pas la mesure de particules détritiques, d ADN libre ou autres contaminants FCM a encore été très peu utilisé pour l écologie virale des eaux douces FCM seule n est pas suffisante/satisfaisante. Ce qu il faut à l avenir, c est jouer sur la complémentarité des méthodes et développer les possibilités de comptage spécifique: - distinguer les organismes infectées et non-infectées (marquage immunologique); - pouvoir s assurer de l identité des particules comptés (marquage immunologique)

61 REMERCIEMENTS Gérald GREGORI & Philippe LEBARON (organisation et invitation) Membres de l EMA & de la SHL