Agence Fédérale pour la Sécurité de la Chaîne Alimentaire DIRECTION GENERALE DES LABORATOIRES TECHNIQUES D ANALYSE EN LABORATOIRE

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1 Agence Fédérale pur la Sécurité de la Chaîne Alimentaire DIRECTION GENERALE DES LABORATOIRES TECHNIQUES D ANALYSE EN LABORATOIRE Frmatin Certifiée Niveau B/C Versin 2 du 28/03/2014 Editeur respnsable : Geert De Prter

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3 AVANT-PROPOS En 2010, dans le cadre des frmatins certifiées, l Administratin des Labratires avait rganisé des frmatins techniques pur les niveaux A, B et C et édité un syllabus cmme dcument de base. Les thèmes abrdés cncernaient les principaux paramètres analysés et les méthdes les plus imprtantes utilisées dans ns prpres labratires. Mais les aspects qualité, envirnnement et sécurité étaient également évqués. Enfin le syllabus faisait également référence à la li d applicatin. Ce syllabus a été réactualisé en 2013 dans le but de rednner des frmatins, pur maintenir le niveau élevé des cnnaissances techniques du persnnel des labratires de l Agence. ir. Geert De Prter Directeur-general Directin des Labratires AFSCA

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5 Table des matières 1 INTRODUCTION LES RISQUES SANITAIRES ÉVOLUENT LE RISQUE MICROBIOLOGIQUE Les micr-rganismes et les aliments les plus suvent incriminés LE RISQUE CHIMIQUE Les cntaminants Les résidus TECHNIQUES BIOLOGIQUES MICROBIOLOGIE Cntexte Analyses micrbilgiques Aperçu des principales analyses micrbilgiques Méthde TEMPO Recherche des Escherichia cli shigatxines psitives (STEC) PHYTOPATHOLOGIE Les rganismes phytpathgènes Les méthdes d analyse en phytpathlgie Exemples d applicatin dans le cntexte AFSCA PCR ET OGM Fndements de la bilgie PCR : Plymerase Chain Reactin PCR et OGM MATRICES PARAMETRES INTRODUCTION COMPOSANT : STRUCTURE, EFFET ET TOXICITÉ, TECHNIQUES D ANALYSE Stilbenes et dérivés Agents antithyrïdiens Stérïdes: substances à effet andrgène, estrgène u gestagène Zéranl et dérivés ß-agnistes Les cmpsés Annexe IV ANTIBIOTIQUES Intrductin Sulfamides et Triméthprime ß-lactamines Flurquinlnes Macrlides Flrfénicl et Substances apparentées Tétracyclines Lincsamides Aminglycsides Plypeptides Glycpeptides Nitrfurans et Nitr-imidazles

6 Origine des résidus antibitiques dans la chaîne alimentaire Les effets ncifs des résidus d'antibitiques L'évaluatin des risques et la fixatin de LMR Détectin des substances à effet bactéristatique dans les prduits d'rigine animale ACRYLAMIDE Structure et/u les grupes principaux Techniques d analyse Txicité pur l'être humain et/u l animal DIOXINES Intrductin Structure et/u grupe principaux Téchniques d analyse Txicité pur l hmme et / u l animal MÉTAUX LOURDS ET ARSENIC Grupes principaux Techniques d analyse Txicité pur l hmme et/u l animal COCCIDIOSTATICA Généralités Structure et/u grupes principaux Les différents techniques d analyse Txicité pur l hmme et/u l animal MYCOTOXINES Nature et rigine Les risques assciés aux myctxines Myctxicse Cnditins de prductin des myctxines Ochratxine A (OA) Dexynivalenl (DON) Fumnisines Trichthécènes Zéaralénne Aflatxines Ergt de seigle La patuline LES ALLERGÈNES Les allergènes alimentaires L histamine MATÉRIAUX AU CONTACT DES DENRÉES ALIMENTAIRES Intrductin Migratins spécifiques VITAMINES Intrductin Vitamines, carence et excès Types de vitamines Techniques d analyse des vitamines TECHNIQUES D ANALYSE CHROMATOGRAPHIE EN PHASE LIQUIDE

7 4.1.1 Aspects généraux Classificatin seln la nature des phases Classificatin seln le phénmène chrmatgraphique Classificatin seln le prcédé utilisé Classificatin seln les phénmènes intervenants dans la séparatin Phases statinnaires en HPLC Chix de la méthde HPLC Aspects instrumentaux Applicatin pratique CHROMATOGRAPHIE IONIQUE Principe Applicatins Chix de l'éluant Préparatin de l'échantilln Clnnes Détectin Le suppresseur d ins de l électrlyte LA CHROMATOGRAPHIE EN PHASE GAZEUSE Généralités Dérivatisatin Injectin de l échantilln La séparatin Les détecteurs SPECTROMÉTRIE DE MASSE Généralités Principe Intrductin de l échantilln ICP / OES Principe de l ICP-OES Emissin L rigine du plasma Le prcessus de transfrmatin de l échantilln en particules raynnantes Générateur RF et puissance Plasmas axial et radial Détectin DOSAGE DES MÉTAUX LOURDS ET AUTRES ÉLÉMENTS PAR AMA, SAAFG, SAA GH, ICP-OES ET ICP-MS Quels éléments dans quelles matrices Préparatin des échantillns Détectin du mercure avec l AMA Détectin des métaux par SAA fur graphite Détectin des métaux par ICP-MS Detectin d'éléments par la technique de SAA Génératin d Hydrure Detectin des éléments par ICPOES IMMUNO-ASSAYS Intrductin Principe général RIA ELISA MICROSCOPIE

8 4.8.1 Généralités Micrscpie ptique Le micrscpe Méthdes de cntraste Applicatin pratique L IONISATION DES ALIMENTS Définitin et bjectifs Réglementatin eurpéenne Réglementatin natinale Les cntrôles de l AFSCA Technique de détectin La thermluminescence (MET-LFSAL-033) QUALITÉ SYSTÈME DE GESTION DE LA QUALITÉ ISO 9001 / ISO Accréditatin Cntrôle de la qualité Validatin des méthdes Incertitude de mesure pur les analyses chimiques quantitatives Le scpe d accréditatin : méthdlgie DG Lab Etalnnage EMAS / OHSAS Système de management de la sécurité au travail Système de management de l envirnnement ISO Système de management envirnemental EMAS Certificatin Système de management intégré FOODLIMS Intrductin Fdlims (Unilab) Intégratin avec d'autres applicatins Des mdules cmplémentaires adaptés Sftware d aide

9 1 INTRODUCTION Les risques sanitaires en rapprt avec la sécurité alimentaire peuvent appartenir à deux grandes catégries : les risques micrbilgiques, liés à des bactéries, des virus, des misissures, des parasites et les risques liés à des substances chimiques, qui cmprennent les prduits chimiques de l envirnnement, les résidus de médicaments u de pesticides, les métaux lurds u tut autre résidu qui se retruve, de façn nn vulue, dans la chaîne alimentaire au curs de la réclte, de l élevage, u des pératins de transfrmatin qui suivent. 1.1 Les risques sanitaires évluent Autrefis, les maladies infectieuses faisaient beaucup plus de ravages, les cnditins d hygiène étaient nettement mins bnnes, et de nmbreux risques tut à fait «naturels» n étaient ni cnnus, ni maîtrisés. Aujurd hui, de nmbreuses maladies qui tuchaient l Hmme via les animaux d élevage nt pratiquement disparues. D un autre côté, certains risques nuveaux snt apparus. C est par exemple le cas de l utilisatin de pesticides dans l agriculture u, d une manière beaucup plus large, de la pllutin de l envirnnement et de ses retmbées dans la chaîne alimentaire. Il s agit, en dehrs de certains accidents, de risques généralement mins aigus (il n y a pas de cnséquences immédiates) que ceux liés à l hygiène (une intxicatin alimentaire se manifeste généralement brutalement), mais plus insidieux (ils deviennent évidents à plus lng terme, cmme c est le cas du cancer). Les cancers ne snt tutefis pas l exclusivité des temps mdernes, et l n sait que certaines matières entièrement naturelles qui existent depuis bien lngtemps peuvent prvquer un cancer. Les scientifiques s accrdent à recnnaître que le niveau de sécurité alimentaire est glbalement plus élevé de ns jurs qu autrefis. 1.2 Le risque micrbilgique Les micr-rganismes représentent la principale cause d intxicatin alimentaire. Tus ne snt cependant pas dangereux : certains snt parfaitement inffensifs, d autres snt même très utiles. C est le cas de ceux utilisés, par exemple, dans la fabricatin du yaurt, de la chucrute, du pain, de la bière, des frmages, des saucissns, etc. C est aussi le cas d une grande partie de bactéries appartenant à la flre intestinale, qui se cmptent par milliards en chacun de nus et cntribuent ntamment au transit intestinal, à la prtectin cntre des bactéries nuisibles et à ns défenses naturelles. Mais, à l inverse, certains micr-rganismes peuvent nus rendre malades, d ù le nm de micrrganismes pathgènes. Cela peut résulter d un effet txique direct du micr-rganisme ingéré, u encre d une substance (txine) prduite par un micr-rganisme et qui se retruve dans ce que nus mangens (alrs que le micr-rganisme n est plus frcément présent). Il existe plus de 250 types d infectins alimentaires, qui peuvent être causées par des dizaines d agents pathgènes. Actuellement, dans ntre pays, les deux types de bactéries le plus suvent incriminés snt les Salmnelles et les Campylbacter. Les Salmnelles snt très largement répandues dans la nature et tuchent de façn plus particulière la vlaille et les iseaux. L ingestin 1

10 de denrées cntaminées peut prvquer une intxicatin appelée salmnellse. Les aliments les plus suvent incriminés snt les eufs crus u insuffisamment cuits, ainsi que les préparatins à base d œufs crus (cmme le tiramisu), ainsi que la viande hachée. De nmbreuses préparatins fnt appel à des aliments crus, qui peuvent présenter une menace, car ils permettent la multiplicatin des bactéries. C est, par exemple, le cas des préparatins à base d œufs crus, cmme le tiramisu, la musse au chclat u la purée «maisn». Pur cette raisn, n les cnsidère cmme des aliments «à risque». La cuissn des aliments détruit les bactéries, ce qui permet de diminuer les risques alimentaires du pint de vue hygiénique. À part certains aliments tels que les cnserves, qui nt fait l bjet d une stérilisatin, presque tus les aliments snt prteurs de micr-rganismes. Les aliments peuvent être cntaminés par des bactéries pathgènes lrs de la prductin, mais aussi à la maisn, par manque d hygiène (par exemple, les mains ne snt pas lavées après un passage aux tilettes). Les mauvaises pratiques d hygiène à la maisn snt cnsidérées cmme la première cause d intxicatin alimentaire. Ceci s explique surtut par un manque de cnnaissance de ce type de risque. La cntaminatin peut aussi être «crisée» : par exemple, il est fréquent de retruver des salmnelles sur la cquille des œufs. Cela ne psera pas de prblème si l œuf est cnsmmé «à la cque», dnc ébuillanté (les salmnelles sur la cquille snt alrs détruites par la chaleur). Par cntre, si après avir tuché des œufs crus, n prend un fruit sans se laver les mains, n peut retruver des bactéries de l œuf sur le fruit. Et si les œufs ne snt pas cnservés dans leur emballage u dans le cmpartiment prévu à cet effet dans le réfrigérateur, ils snt susceptibles de cntaminer d autres aliments avec lesquels ils entrent, à un mment u à un autre, en cntact (cntaminatin crisée) Les micr-rganismes et les aliments les plus suvent incriminés Bactéries Bacillus cereus : riz cuit réchauffé, viandes cuites, puddings à base de féculents, légumes et pissns. Une mauvaise manipulatin après la cuissn est une cause fréquente de cntaminatin à B. cereus. Clstridium perfringens : les aliments réchauffés, incluant les restes de buffets, la viande et la vlaille, les légumineuses, les sauces, les ragûts et les supes. Clstridium btulinum : bîtes de cnserve artisanales (légumes, pissn, viande et vlaille). Escherichia cli (E.cli) : salades et légumes crus, viande insuffisamment cuite, lait nn pasteurisé, frmage. Campylbacter jejuni : lait cru, vlaille. Listeria mncytgenes : lait nn pasteurisé et laitages tels les frmages à pâte mlle, viande crue, vlaille, fruits de mer, légumes, pâté, viande et pissn fumé, salade de chu cru. Salmnella enteritidis : vlaille insuffisamment cuite, viande, cquillages, salades, eufs et prduits laitiers. 2

11 Staphylcccus aureus : jambn, vlaille, eufs, crème glacée, frmages, salades, crème anglaise et pâtisseries à base de crème, sauce. Une mauvaise manipulatin après la cuissn et une mauvaise hygiène snt des causes fréquentes de cntaminatin. Vibri parahaemlyticus et autres Vibri marins : pissn cru et insuffisamment cuit, cquillages Parasites Trichinella spiralis : viande de prc insuffisamment cuite. Txplasma gndii : viande insuffisamment cuite, vlaille et lait cru Virus Hépatite A : cquillages, fruits et légumes crus snt les causes fréquentes d hépatite A. Celle-ci peut également se transmettre en cas de mauvaise manipulatin de l aliment. 3

12 1.3 Le risque chimique Les cntaminants Par cntaminant, n entend tutes les matières indésirables présentes de façn nn désirées dans les aliments (à la différence des additifs, dnt l ajut est vlntaire). Les cntaminants peuvent s y retruver au curs des différents stades de la prductin, du cnditinnement, du transprt u du stckage, u encre résulter d une cntaminatin de l envirnnement. Les cntaminants cnstituent dnc une grande famille extrêmement variée. Ils peuvent avir une rigine parfaitement «naturelle», cmme les myctxines. Ils peuvent être prduits par l Hmme (PCB et acrylamide) u avir une rigine naturelle et humaine (dixines). C est bien entendu sur l activité humaine que l n peut agir pur réduire la cntaminatin des aliments. Ntns cependant que l activité humaine, englbe tant les prductins industrielles à grande échelle, que celles de petites structures traditinnelles, u tut simplement des pratiques familiales (par exemple la cuissn au barbecue). Les métaux lurds (le plmb, le cadmium et le mercure) et l arsenic snt en grande partie des plluants liés à l activité industrielle. Le mercure cntamine surtut les pissns. Mercure et plmb snt txiques pur le système nerveux. Des limites maximales dans les aliments nt été fixées afin de limiter les risques pur la santé. Vir également Métaux lurds et arsenic. Les myctxines: il s agit de txines prduites par certains champignns u levures qui se dévelppent sur des aliments (aliments pur animaux et/u pur l Hmme). Elles peuvent être prduites au curs de la crissance de la plante, mais aussi, plus tard, lrs du stckage. Elles peuvent se retruver dans des aliments d rigine animale (viande, lait, œuf ) via la cntaminatin de l alimentatin des animaux. Les myctxines fnt l bjet d une surveillance régulière Les résidus La présence de certaines substances dans l alimentatin résulte d une utilisatin vlntaire. C est le cas des résidus de pesticides, et des médicaments pur animaux dans les aliments d rigine animale. Les pesticides (prduits phytsanitaires) snt utilisés pur cmbattre les ennemis des plantes. Ils divent faire l bjet d une évaluatin txiclgique avant d être autrisés, afin de mntrer qu ils n nt pas d effets néfastes décelables sur la santé de l Hmme. Des résidus de pesticides se retruvent dans les aliments et des cntrôles réguliers snt nécessaires pur s assurer qu ils respectent les nrmes. Les médicaments vétérinaires snt ntamment les antibitiques, utilisés pur prévenir u traiter une maladie chez l animal. Ils nt été aussi utilisés pur accélérer la crissance des animaux, mais l Unin Eurpéenne a interdit cette utilisatin depuis Des résidus de médicaments peuvent être décelés dans des viandes, du lait, sans que cela présente un risque direct pur la santé humaine. Tutefis, chez l animal cmme chez l hmme, l utilisatin d antibitiques peut favriser l apparitin de bactéries résistantes (qui nt dévelppé une résistance face à l antibitique administré), cnduisant ainsi à l apparitin de maladies de plus en plus difficiles à traiter (pur lesquelles il faut truver d autres antibitiques, cnduisant à une srte d escalade). 4

13 Dans tute l Eurpe les hrmnes dnnées au bétail pur accélérer sa crissance u augmenter la prductin de lait chez la vache snt interdites depuis 1988, ce qui fait l bjet d une cntrverse avec les Etats-Unis, ù certaines hrmnes snt autrisées à ces fin. Pur autant que les prescriptins légales sient respectées, ntamment la nature des prduits utilisés, les dses et les délais d attente, les résidus de pesticides et de médicaments vétérinaires ne psent pas de prblème grave pur l hmme. Tutefis, n ne peut pas exclure l existence de certains effets néfastes à lng terme. 5

14 2 TECHNIQUES BIOLOGIQUES 2.1 Micrbilgie Cntexte Les micrrganismes : des êtres vivants! Les micr-rganismes se truvent à peu près partut : dans l'eau, dans les aliments, dans le sl, etc. De ce fait, tut prduit n'ayant pas subi un traitement particulier est par nature cntaminé par des bactéries, des levures, des misissures, des virus, etc. Une différence imprtante avec les autres cntaminatins est que les micr-rganismes snt des êtres vivants : si les cnditins snt favrables, ils peuvent se dévelpper et se multiplier, alrs qu'en des circnstances défavrables, leur crissance s'arrête u ils meurent. Ceci signifie que le degré de cntaminatin d'un aliment au mment de sa cnsmmatin est nn seulement déterminé par la cntaminatin initiale, mais aussi par les traitements qu'il a subis et les cnditins dans lesquelles il a été cnservé jusqu'au mment de la cnsmmatin. Quant à savir si une cntaminatin micrbilgique initiale va augmenter u diminuer, cela dépend ntamment des cnditins envirnnementales suivantes: O O O O O la dispnibilité de l'eau (l'activité en eau) : sans eau, pas de dévelppement. la température : tut rganisme a une furchette de températures dnnée à l'intérieur de laquelle le dévelppement et la multiplicatin se dérulent de façn ptimale; en dehrs de cet intervalle, sit le dévelppement est arrêté (basse température), sit l'rganisme meurt (cuissn, cngélatin). les substances nutritives présentes (prtéines, sucres, graisses, vitamines, minéraux, ). Pur sn dévelppement, l'rganisme prélève des substances dans sn envirnnement et les transfrme en cmpsés cellulaires u les utilise cmme surce d'énergie. En l'absence de ces substances nutritives, sn dévelppement est inhibé. la présence u l'absence de substances nécessaires u inhibitrices tels l'xygène (nécessaire pur les aérbies, nuisible pur les anaérbies) u les antibitiques (frtement inhibiteurs u mrtel pur certains rganismes). certains facteurs d'envirnnement, cmme le ph, peuvent avir un effet inhibiteur sur certains rganismes. Quelles snt les valeurs ptimales de ces facteurs? Cela varie d'un rganisme à l'autre; ainsi les bactéries lactiques peuvent tlérer un ph assez bas, alrs que chez les autres bactéries, le dévelppement est généralement frtement inhibé. Il est clair que les cnditins de cnservatin d'un prduit snt extrêmement imprtantes si l'n veut éviter une augmentatin fâcheuse de la cntaminatin au mment de la cnsmmatin. 6

15 Ces caractéristiques snt également imprtantes pur la réalisatin des analyses micrbilgiques : la nature 'vivante' des rganismes implique que les cnditins de cnservatin d'un prduit après l'échantillnnage snt extrêmement imprtantes : si n ne prend pas les précautins adéquates pendant tut le prcessus du prélèvement jusqu'au résultat de l'analyse, les dénmbrements btenus peuvent très frtement différer des quantités réelles de micrrganismes présents au mment du prélèvement de l'échantilln. Un facteur supplémentaire qui est suvent négligé est le fait que les micr-rganismes ne snt pas répartis unifrmément dans un prduit. Dans un prduit, la multiplicatin des micr-rganismes va surtut avir lieu là ù ils rencntrent les cnditins ptimales de dévelppement (température, eau, substances nutritives, ). Un exemple : le beurre qui se cmpse surtut de graisse dans laquelle snt réparties de petites guttelettes d'eau. C'est seulement dans ces guttelettes d'eau que les micr-rganismes se dévelppent et peuvent se multiplier, et nn dans la phase grasse. Cet aspect est surtut imprtant pur les denrées alimentaires très hétérgènes, d ù cnséquence de ce phénmène : certaines parties peuvent être frtement cntaminées et d'autres peu Significatin de la cntaminatin par des micr-rganismes Dans la cntaminatin des denrées alimentaires, nus puvns cnsidérer tris aspects : la santé publique, et ce qui nus intéresse surtut, ce snt les pathgènes, rganismes qui peuvent prvquer des maladies (Salmnella, Listeria,...) u qui peuvent prduire des txines (myctxines, entértxines,...), les cnditins de prductin : certains rganismes ne snt pas en si des pathgènes mais servent plutôt d'indice des cnditins d'hygiène dans lesquelles le prduit a été fabriqué. Ainsi, la présence de E. cli dans des prduits animaux cnstitue un indicateur de cntaminatin fécale, ce qui, si n retruve cet rganisme en grands nmbres, augmente la prbabilité qu'il y ait également présence de pathgènes. la qualité du prduit : il s'agit d'rganismes qui prvquent des changements indésirables dans le prduit (dégradatin), ce qui réduit sa cnservatin. Dans cette ptique, c'est surtut la flre ttale qui est imprtante. Il faut tutefis tenir cmpte du fait que dans certains prcessus technlgiques, n ajute sciemment des micr-rganismes (levures, bactéries lactiques, ) afin de dnner au prduit des prpriétés caractéristiques (beurre, frmage, yaurt, salami, ), et en pareils cas, la 'flre ttale' ne dnne aucun renseignement sur la qualité du prduit Prcédés visant à prlnger la cnservatin A l'échelle industrielle, différents prcédés snt appliqués pur augmenter la cnservatin d'un prduit u pur inhiber u tuer les pathgènes présents. Ces prcédés snt: dans la transfrmatin de certains prduits crus (beurre, frmage au lait cru, saucissn ), une maturatin qui a pur but d'une part de cnférer au prduit un gût u une texture caractéristique, et d'autre part, de mdifier les cnditins dans le prduit de telle manière qu'elles deviennent défavrables à la multiplicatin d'rganismes indésirables (il s'agit le plus suvent d'une acidificatin). Cmme n n'applique pas de 7

16 prcédé de destructin des rganismes, il peut tujurs y avir présence de pathgènes dans le prduit. chauffage.. En fnctin de la température et de la durée du traitement, ce dernier a pur but sit de tuer les pathgènes éventuels (pasteurisatin du lait) sit de stériliser cmmercialement le prduit pur prlnger sa durabilité (traitement tement uht pur les bissns, stérilisatin en verre u bîte à cnserve). diminutin de l'activité en eau.. En ajutant du sel (saumurage) u du sucre (cnfiserie), n diminue la dispnibilité de l'eau dans les denrées alimentaires, ce qui a un effet inhibiteur iteur sur le dévelppement des pathgènes. cntrôle du degré d'acidité.. Cmme la plupart des bactéries ne se plaisent guère à un ph faible, les prduits acides snt mins sensibles à la dégradatin. On peut augmenter l'acidité en ajutant de l'acide (acide acétique, ) u par fermentatin (acide lactique, acide prpinique). cntrôle de l'atmsphère. Le remplacement de l'xygène dans l'atmsphère d'un emballage par un autre gaz (azte, CO 2 ) permet de freiner le dévelppement de la flre de dégradatin, et de prlnger la cnservatin du prduit Analyses micrbilgiques Principes En raisn des dimensins généralement très faibles des micr-rganismes rganismes et de leur répartitin irrégulière dans une denrée alimentaire, il n'est généralement pas facile de détecter ces cellules directement, de les dénmbrer et de les identifier. C'est purqui n a le plus suvent recurs à 2 techniques pur établir leur présence de façn indirecte : la multiplicatin et l'inhibitin Multiplicatin Lrsqu'un micr-rganisme rganisme se truve dans des cnditins ptimales pur sn dévelppement et sa multiplicatin (température, ph, substances nutritives, ), le temps nécessaire au dédublement d'une seule cellule peut être très curt, de minutes à quelques heures. Ainsi, si une cellule a un temps de dédublement de 1h, elle dnne naissance après 24h à 16 millins de cellules. De ce fait, une seule cellule, invisible à l'œil nu, peut dnner naissance après quelques heures de dévelppement illimité, à des dizaines de millins de descendants. Dans un fluide, ceci se manifeste par un aspect truble, sur une surface slide, cela entraîne l'apparitin d'un petit amas de cellules visible à l'eil nu : une clnie. Faire se dévelpper une cellule en une clnie visible est l'un des principes de base des analyses micrbilgiques classiques. A cet égard, il cnvient de bien faire remarquer que l'hypthèse seln laquelle chaque clnie visible prvient d'une seule cellule ne représente pas la réalité. Suvent il est impssible de séparer entièrement les cellules l'une de l'autre pendant l'analyse, si bien qu'une clnie peut se frmer à partir d'un petit grupe de cellules, 8

17 et nn pas d'une seule cellule (par ex. staphylcques, qui se truvent par nature en petits grupes). De là vient l expressin d' unité frmant clnie' (ufc, cfu clny frming unit) et nn pas de 'cellule frmant clnie' Inhibitin sélective Dans un échantilln, il y a généralement de nmbreuses espèces différentes de micr-rganismes, dnt un nmbre limité seulement est imprtant, cmme un pathgène spécifique u un grupe d'rganismes indicateurs. Pur sélectinner l'rganisme u le grupe recherché, n dit, d'une part, appliquer les cnditins de dévelppement auxquelles les rganismes recherchés peuvent se multiplier, et d'autre part, freiner (inhiber) le dévelppement d'autres rganismes qui purraient gêner l'analyse, de telle srte qu'après un certain temps, l'rganisme recherché prenne le dessus sur tus les autres (survival f the fittest). L'inhibitin d'rganismes qui purraient perturber l'analyse peut se faire par le cntrôle de l'atmsphère (aérbies anaérbies), du ph, de la température de dévelppement, des substances nutritives présentes u de la présence de cmpsés inhibiteurs tels que les antibitiques. Ces paramètres divent évidemment être cntrôlés de telle manière que la crissance de l rganisme recherché en sit le mins pssible perturbée Dénmbrement et détectin Dans une analyse micrbilgique, n peut pser deux questins : cmbien de cellules d'un rganisme dnné snt présentes dans une quantité dnnée d'échantilln? C'est imprtant lrsqu'une limite maximum a été fixée à la présence d'un rganisme u d un grupe dnné dans un prduit (ex. : mins de 100 par gramme). pur y dnner une répnse, n dit effectuer un dénmbrement du nmbre d'rganismes recherchés. Avec cette technique, n cmmence par disperser les cellules pur les séparer, après qui n laisse ces cellules se dévelpper en clnies et n cmpte le nmbre de clnies caractéristiques. Dnc d'abrd disperser, ensuite multiplier. une variante est la méthde du nmbre le plus prbable (NPP) (MPN, Mst prbable Number), dans laquelle n ne cmpte pas des clnies mais n bserve le dévelppement u l absence de dévelppement sur plusieurs sus-échantillns. un rganisme dnné est-il présent dans une quantité dnnée d'échantilln? C'est imprtant pur les pathgènes, pur lesquels a été fixée une nrme disant que l'rganisme dit être absent dans une quantité dnnée de l'échantilln (par ex. absent dans 25 g de prduit). dans ce cas, n prcède à une détectin de l'rganisme dans la quantité en questin de l'échantilln. Cmme le nmbre de cellules présentes n'est pas imprtant (peu imprte s'il y en a 1 u 100 dans la quantité dnnée du prduit), n prcède d'abrd à un enrichissement, et ensuite à une cnfirmatin pur vir si l'rganisme est bien présent. Dnc d'abrd multiplier et ensuite cnfirmer. 9

18 Techniques micrbilgiques standards Dans l'analyse micrbilgique, n applique une série de techniques standards; une méthde d'analyse micrbilgique (classique) est une cmbinaisn dans un rdre bien déterminé de ces techniques, axé sur l'rganisme u le grupe d'rganismes à analyser. On truve ci-après un aperçu de ces techniques Enrichissement But : multiplier un petit nmbre d'rganismes présents dans un échantilln pur btenir un grand nmbre d rganismes afin de puvir déterminer facilement leur présence. Principe : mettre une prise d essai de l'échantilln (hmgénéisé) dans un milieu nutritif liquide et le cnserver un certain temps dans les cnditins ptimales de dévelppement. En cas d'enrichissement simple, tus les rganismes se dévelppant dans ces cnditins vnt se multiplier! On appelle dnc cela un enrichissement nn sélectif Pré-enrichissement But : dnner la pssibilité aux rganismes stressés (p.e. après un chc de température) de récupérer afin qu ils puissent tlérer les cnditins de stress aux étapes suivantes (surtut la présence des substances inhibitrices). Principe : mettre une prise d essai de l'échantilln (hmgénéisé) dans un milieu nutritif liquide et le cnserver un certain temps (suvent < 24 h) dans les cnditins ptimales de dévelppement. Le milieu est nn-sélectif u faiblement sélectif, ceci (avec le curt temps d incubatin) pur éviter la crissance d autres rganismes Enrichissement sélectif But : multiplier un petit nmbre d'rganismes présents dans un échantilln pur btenir un grand nmbre d rganismes afin de puvir déterminer facilement leur présence, mais de telle manière que cette multiplicatin ne cncerne que l'rganisme u le grupe recherché. Principe : réalisatin d'un enrichissement, mais dans un milieu nutritif liquide qui cntient des substances inhibitrices qui entravent le dévelppement des autres rganismes (p.ex. sels biliaires dans le cas de clifrmes). De ce fait, ce snt surtut les rganismes recherchés qui vnt se multiplier, et/u des rganismes qui leur snt apparentés Dilutin But : diluer de grandes quantités de cellules de telle srte que leur nmbre se retruve dans une gamme ù un dénmbrement fiable devienne pssible. C'est dnc en fait l'inverse d'un enrichissement. 10

19 Principe : n démarre avec une certaine quantité d'échantilln (1 g, 25 g, ). Cette quantité est mélangée avec une quantité de diluant stérile qui n'endmmage pas les micr-rganismes, après qui l'ensemble est hmgénéisé. Ensuite, n fait à partir de cet hmgénat une gamme de dilutins décimales (1 ml d'hmgénat + 9 ml de diluant frais, mélanger, prélever 1 ml du mélange + 9 ml de diluant frais, etc.), de telle srte que chaque dilutin ne cntienne qu'un dixième du nmbre de cellules de la dilutin précédente. Figure : principe de dilutins décimales Si l'n dilue suffisamment, n btient finalement 1 u 2 dilutins cntenant un nmbre d'rganismes dnnant lrs de la suite de l'analyse (étalement et dénmbrement) un résultat dénmbrable Etalement But : étaler les cellules individuelles cntenues dans une quantité d'échantilln sur un milieu nutritif slide, de telle srte que ne puisse se dévelpper à partir de chaque cellule qu'une clnie particulière distincte des autres clnies. Les clnies particulières peuvent sit être dénmbrées, sit servir de matériel de départ pur la suite de l'analyse. Principe : une quantité de milieu de dilutin (p.ex. 0,1 ml) est étalée sur un milieu nutritif slide, généralement dans une bîte de Petri. Ce milieu se cmpse de gélse un plysaccharide qui ne se dégrade pas et sert dnc de matrice slide qui cntient des substances nutritives et éventuellement des indicateurs (par ex. indicateur du changement de ph). Pendant le dévelppement, tutes les cellules issues d'une seule cellule restent au cntact de cette première cellule; lrsque la dilutin utilisée est assez grande, les cellules individuelles snt dispersées de façn suffisamment élignées les unes des autres pur que se frment des clnies islées distinctes. Le dévelppement peut entraîner des changements dans le milieu nutritif (acidificatin, frmatin d'un dépôt, dégradatin de certains cmpsants, ) qui peuvent se manifester par des changements de culeur etc. autur de la clnie (changement du ph par la frmatin d'acides cmme prduits de dégradatin lrs du dévelppement, le dépôt de FeS nir lrs de la dégradatin d'acides aminés sulfureux en H 2 S en présence de sels de fer, apparitin d'une zne claire lrs de la dégradatin par exemple de lécithine, etc.). De ce fait apparaissent des clnies ayant un aspect caractéristique (culeur, aspect, brillance, zne ), que l'n peut distinguer des clnies prvenant d'autres rganismes que l'rganisme recherché. 11

20 Etalement sur milieu sélectif But : étalement sur un milieu auquel nt été ajutées une u plusieurs substances inhibitrices afin d'empêcher le dévelppement de grupes d'rganismes indésirables (par ex. : sels biliaires en cas de clifrmes) Dénmbrement But : déterminer cmbien d'rganismes d'un grupe u d'une espèce dnné(e) snt présents dans une quantité dnnée d'échantilln. Il y a deux méthdes de base pur déterminer ce nmbre : le dénmbrement direct sur un milieu slide (cmptage par bîte) et la méthde MPN u méthde du nmbre le plus prbable. Principe du cmptage par bîte : si dans une bîte, il y a des clnies bien distinctes les unes des autres (vir 2.3.4) et que l'n sait à quelle quantité d'échantilln cela crrespnd (par ex. 0,1 ml ensemencé sur bîte d'une dilutin centésimale prvenant de 25 ml d'un hmgénat de 1 g d'échantilln), n peut cmpter le nmbre de clnies qu'elles sient u nn typiques sur cette bîte et les rapprter à la quantité d'échantilln prélevé. Dans ntre exemple : nus avns 1g d échantilln dans 25ml de diluant, sit par ml de diluant 1/25 = 0,04 = 4 x 10-2 g d'échantilln; la dilutin centésimale cntient 100 x mins d échantilln, sit 4 x 10-4 g/ml, et 0,1 ml de cette dilutin crrespnd encre à 10 x mins d échantilln dnc à 4 x10-5 g d'échantilln. Si n cmpte sur la bîte 20 clnies typiques, elles prvenaient de 4 x 10-5 g d'échantilln, u l'échantilln cntient par gramme 20/(4 x 10-5 )= 5 x 10 5 = ufc (unité frmant clnie, vir 2.1.1) par gramme. Principe du MPN (mst prbable number) : dans la technique du nmbre le plus prbable, n travaille avec un milieu liquide dans des tubes à essais. On établit une gamme de dilutins et par dilutin n ensemence plusieurs tubes à essais (généralement 3 u 5). Après incubatin durant un temps prescrit, n vérifie dans cmbien de tubes à essais un dévelppement s'est prduit (visible au fait que le milieu nutritif initialement clair est devenu truble). Su base du nmbre de tubes à essais ù il y a un dévelppement et de la dilutin crrespndante, n peut estimer à partir de tableaux cmbien d'rganismes se truvaient dans l'échantilln Islement d'une clnie But : s'assurer qu'une clnie qui va servir à cnfirmer la nature de l'rganisme prvient effectivement d'une seule cellule et n'est dnc pas un mélange de deux u plusieurs rganismes différents. Principe : dans le cas idéal, une clnie islée sur une bîte prvient d'une seule cellule et tutes les cellules de cette clnie en snt des clnes. En pratique, il peut se truver à prximité de cette cellule des cellules d'autres rganismes, qui dans les cnditins dnnées ne se dévelppent guère vire pas du tut, mais qui ne meurent pas nn plus. Si l'n repique cette clnie sur un autre milieu nutritif (par exemple pur identificatin), n curt le risque que ces cellules 'étrangères' se dévelppent et faussent le résultat des tests. C'est purqui il est nécessaire de cmmencer par isler une clnie après dévelppement avant de prcéder aux tests supplémentaires. Pur ce faire, n repique une clnie islée sur un autre milieu, généralement nn sélectif (ensemencement par stries). 12

21 La bîte est incubée jusqu'à ce qu'apparaissent des clnies distinctes, et n cntinue l analyse avec une de ces clnies islées. Les chances qu'une clnie après islement sit encre cntaminée par une cellule étrangère snt alrs devenues très minimes Cnfirmatin But : cntrôler si la clnie islée est effectivement l'rganisme recherché u déterminer l'identité d'une clnie islée (généralement au niveau de l'espèce). Principe d'une cnfirmatin bichimique : un certain nmbre de tests bichimiques est effectué sur une clnie islée. A cette ccasin, n cntrôle le dévelppement dans différentes cnditins et sur différents milieux nutritifs afin de vérifier s'il se prduit des réactins typiques telles qu acidificatin, fermentatin de certains sucres, dégradatin d'un cmpsé dnné, etc. Le tableau des réactins (par ex. la galerie API) permet de déduire si l'n est en présence de l'rganisme recherché u d'identifier un rganisme (espèce) à l'intérieur d'un grupe (par ex. déterminer l'espèce à l'intérieur du genre Listeria) Sértypage But : l'identificatin d'un rganisme à un niveau inférieur à celui de l'espèce (déterminatin de sérvars). Principe : dans ces tests, n mélange une clnie avec des anticrps spécifiques à certains cmpsants cellulaires (pari cellulaire, flagelle, ). L'agglutinatin indique la présence de ces cmpsants. Le sértypage est plus précis que les tests bichimiques (niveau du sérvar plutôt que de l'espèce). Le sértypage est effectué d'une part pur déterminer la traçabilité d'une cntaminatin (cmme pur les sértypes de Salmnella) et d'autre part pur déterminer la présence de facteurs de virulence et ainsi aussi la pssibilité de prvquer une maladie (cmme la présence de l'antigène H7 chez E. cli O157) Dérulement d'une analyse micrbilgique La détectin d'un rganisme u d'un grupe d'rganismes se dérule en plusieurs étapes : l'échantillnnage, l'analyse prprement dite, l expressin du résultat et sn interprétatin. Chacune de ces étapes est imprtante et peut influencer frtement l'évaluatin finale L'échantillnnage Sus bien des aspects, l'échantillnnage est le facteur le plus critique! En effet, il est absurde de se casser la tête sur l'interprétatin d'un résultat d'analyse si les prblèmes nt débuté dès le prélèvement de l'échantilln. Les aspects imprtants à cet égard snt : 13

22 la représentativité d'un échantilln u le degré dans lequel l'échantilln est représentatif du prduit qui se retruve dans l'assiette du cnsmmateur. Il va de si que la 'partie nn cnsmmée' d'une denrée alimentaire ne prcurera pas d'infrmatins. Quique cela ne sit pas tujurs aussi simple : la crûte d'un frmage fermenté u persillé dit-elle être cnsidérée cmme cnsmmable? Les pinins à ce sujet snt frt divergentes l'hmgénéité cncerne la répartitin des micr-rganismes dans le prduit. Pur les prduits liquides u en pudre, cela ne pse généralement guère de prblèmes, mais pur certains prduits slides (salades, certains types de frmage, pâté ), l'endrit du prélèvement (tut près de la surface u au cœur du prduit, quantité plus u mins grande d'un ingrédient particulier) peut avir un effet imprtant sur le résultat. De ce fait, un échantilln peut dnner une valeur faible pur un paramètre dnné, et un autre échantilln prélevé juste à côté une valeur élevée pur ce même paramètre. On peut remédier à ce prblème en prélevant plusieurs échantillns à des endrits différents, que l'n rassemble en un échantilln unique u que l'n analyse chacun séparément. Dans ce dernier cas, la dispersin des résultats peut dnner une indicatin sur l hétérgénéité de la cntaminatin à plus grande échelle. Surtut lrs de la recherche de très faibles nmbres d'un rganisme (ex. Salmnella), l'hmgénéité de l'échantilln cnstitue un pint critique. Si le prduit est peu hmgène, les chances de truver effectivement ces quelques bactéries présentes snt en crrélatin directe avec la prbabilité de prélever l'échantilln au 'bn' endrit La cnservatin de l'échantilln Vilà un autre pint critique, à savir la cnservatin de l'échantilln entre le mment de sn prélèvement et le début de l'analyse. Pendant la cnservatin, il faut empêcher la multiplicatin des rganismes sans pur autant les tuer. Il est dès lrs extrêmement imprtant de ne pas interrmpre la chaîne du frid depuis l'échantillnnage jusqu'à l'analyse, surtut pur les prduits dans lesquels un dévelppement est pssible; d'ù l'allégatin générale disant qu'une analyse micrbilgique dit être entamée dans les 24 heures suivant l'échantillnnage. Pur des raisns évidentes, c'est mins imprtant pur les prduits stérilisés, surgelés u secs L'analyse La réalisatin d'analyses micrbilgiques classiques suit un dérulement standard qui est basé sur la réalisatin des techniques standards (4.2.3) dans un rdre bien défini. Quelles techniques utilise-t-n? Cela dépend si l'n veut effectuer un dénmbrement u bien une détectin. Pur un dénmbrement, les étapes suivantes snt réalisées : hmgénéisatin d'une quantité d'échantilln (1g, 25g,...) Dans une quantité de diluant stérile but : répartitin hmgène des cellules dans l'hmgénat, établissement d'une gamme de dilutins décimales but : btentin d'une dilutin qui furnira des quantités dénmbrables, 14

23 étalement, à partir d'une série de dilutin, d'une quantité sur une bîte cntenant un milieu nutritif slide. But : disperser les cellules. Ce milieu nutritif peut être sélectif u nn sélectif, en fnctin de l'rganisme recherché. incubatin des milieux nutritifs ensemencés durant un temps bien déterminé à une température bien définie (par ex. 48 h. à 37 C) but : dévelppement le plus rapide pssible jusqu'à la frmatin de clnies visibles, dénmbrement du nmbre de clnies (typiques) sur les bîtes, au besin : sélectin d'une u plusieurs clnies typiques, islement et cnfirmatin qu'elles prviennent de l'rganisme recherché, calcul du résultat. Remarque : pur un dénmbrement, l'étalement se fait directement après l'hmgénéisatin de l'échantilln, de telle srte qu'il ne puisse se prduire de dévelppement dans l'intervalle. Pur une détectin, les étapes de l'analyse snt les suivantes : hmgénéisatin d'une quantité d'échantilln avec une quantité de milieu nutritif liquide nn sélectif but : dispersin hmgène des cellules dans l'hmgénat, incubatin du milieu nutritif durant un temps bien déterminé à une température bien définie (par ex. 18 h. à 37 C). But : dnner aux cellules, éventuellement légèrement endmmagées, le temps de se remettre et de se dévelpper, transfert d'une partie du milieu nutritif incubé dans un milieu d'enrichissement liquide sélectif. But : inhibitin des rganismes autres que l'rganisme recherché lrs de l'incubatin qui suit, incubatin du milieu d'enrichissement durant un temps bien déterminé et à une température bien définie. But : dévelppement sélectif de l'rganisme recherché, jusqu'à btenir un grand nmbre de cellules, islement à partir du milieu d'enrichissement sur une u plusieurs bîtes de milieu nutritif sélectif slide avec indicateurs. Pur ceci, n peut utiliser des bîtes avec différents milieux nutritifs. But : dévelppement de clnies typiques. incubatin du milieu nutritif ensemencé durant un temps bien déterminé à une température bien définie but : dévelppement jusqu'à la frmatin de clnies visibles, évaluatin des bîtes : si n ne truve pas de clnies typiques, c'est que l'rganisme recherché n'était pas présent dans l'échantilln, et l'analyse est terminée. Cmmunicatin du résultat cmme étant 'absent dans X g d'échantilln'; si n truve des clnies typiques : repiquer une u plusieurs clnies typiques, les isler et cnfirmer à l'aide de tests bichimiques u autres. Si l'rganisme est cnfirmé : cmmuniquer le résultat cmme étant 'présent dans X g d'échantilln'. 15

24 .1.2 : bîte de Pétri cntenant des clnies nires typiques de Salmnella, Salmnella qui à un stade Figure ultérieur, divent être islées et cnfirmées. Remarquns que pur la détectin, n prcède d'abrd à un enrichissement et seulement après à un étalement, qui ui a pur but l'islement de l'rganisme. Le nmbre initial de cellules n'a pas d'imprtance. L'enrichissement permet de détecter même un très petit nmbre de cellules (par ex. 1 Salmnella dans 25 g d'échantilln). Pur réaliser u interpréter crrectement crrectement une analyse, qu'il s'agisse d'un dénmbrement u de la détectin d'un rganisme u d'un grupe de micr-rganismes, micr rganismes, il faut tenir cmpte d un certain nmbre de pints : quelles caractéristiques l'rganisme pssède-t-ilil? Certains rganismes se présentent présente en petits agrégats (cmme le Staphylcccus), ), et il n'est alrs pas tujurs simple d'btenir une bnne hmgénéisatin de l'échantilln au pint de n btenir que des cellules individuelles. Cmme un grupe de cellules dnne également lieu à une seule clnie, lnie, le résultat d'un dénmbrement de tels rganismes sera tujurs une susestimatin du nmbre réel d'rganismes. quel est l'état de l'rganisme dans l'échantilln? Surtut dans le cas de prduits ayant subi un traitement thermique, les rganismes snt snt 'stressés', ce qui entrave leur dévelppement, et ce d'autant plus si le milieu nutritif cntient des substances inhibitrices (dans le but d'éliminer les rganismes cncurrents). D u avec de tels échantillns, n passe par une brève 'étape de récupératin' récupératin' dans un milieu nn sélectif avant d'entamer l'analyse prprement dite. quel est le degré de sélectivité du milieu nutritif sur lequel l'rganisme est élevé? Suvent, il peut y avir cnfusin avec des rganismes apparentés qui frment des clnies ayant yant plus u mins le même aspect. C'est purqui des tests cmplémentaires snt parfis nécessaires pur cnfirmer la nature de la clnie suspecte. Pur la détectin de Salmnella, Salmnella, par exemple, n sélectinne les clnies suspectes, pur ensemencer des milieux ilieux différents, sur lesquels les clnies de Salmnella nt un autre aspect. Si cette étape indique aussi la présence de Salmnella,, n peut encre faire une série de tests bichimiques en vue d'une cnfirmatin définitive. quelle méthde dit être appliquée? Plusieurs méthdes qui déterminent le même paramètre ne dnnent pas nécessairement les mêmes résultats! Un milieu nutritif peut 16

25 être plus sélectif qu'un autre. Des méthdes différentes peuvent aussi être basées sur un principe différent. On peut, par exemple, détecter Salmnella avec une méthde classique (dévelppement, clnies typiques sur bîte, réactins bichimiques), mais aussi par une méthde immunlgique (ELISA) u par PCR. C'est suite à ce prblème de cmparaisn de méthdes que des méthdes de référence nt été fixées au niveau internatinal, et snt censées dnner le résultat 'exact', ce qui signifie qu'elles dnnent le même résultat dans différents labratires. Les méthdes alternatives ne snt pas nécessairement mins bnnes, mais elles snt généralement plus rapides Le résultat Les résultats micrbilgiques peuvent être exprimés de différentes manières, en fnctin de la méthde utilisée et du mde d'échantillnnage. Détectin Ce critère est valable pur les rganismes pathgènes tels que Salmnella et Listeria; généralement, n exige le cntrôle de l'absence dans une certaine quantité de prduit (par ex. absence dans 25 g u 25 ml). Le résultat est alrs exprimé cmme étant 'présence u absence' dans X g (u ml)' u cmme '< 1 / X g'. Dénmbrement Dans les dénmbrements, n dnne un résultat numérique parce que l'rganisme u le grupe d'rganismes peut être présent mais ne peut pas dépasser une limite fixée (nmbre de germes aérbies pur la durabilité, le nmbre de Staphylcques pur le risque de frmatin de txines). Ce qu'n dénmbre, ce snt des unités frmant clnie (ufc) pas des cellules. Une cnditin imprtante pur un dénmbrement crrect est que les clnies sient suffisamment séparées les unes des autres pur être recnnues cmme des clnies distinctes. S'il y en a de trp grands nmbres, les clnies se tuchent u se chevauchent, et un dénmbrement est impssible. De plus, les clnies se truvant trp près les unes des autres freinent leur dévelppement réciprque, ce qui rend les valeurs dénmbrées nn fiables. Cmme la taille d'une bîte de Pétri est limitée, le nmbre maximal de clnies séparées les unes des autres que l'n peut dénmbrer crrectement est également limité. En fnctin des caractéristiques des clnies, une limite de 150 à 300 clnies/bîte de Pétri est fixé. Etant dnné que les dénmbrements peuvent avir lieu sur des bîtes prvenant de dilutins différentes, les dilutins plus élevées cntiendrnt mins de clnies, de srte qu'en cas de bîtes 'indénmbrables', n purra recurir à des bîtes prvenant d'une dilutin plus élevée. Outre une limite supérieure de pur le nmbre de clnies, il y a aussi une limite inférieure. Cmme le dénmbrement de clnies est analgue au dénmbrement de particules, les faibles valeurs ne snt pas fiables. C'est purqui n fixe généralement une limite de 10; les valeurs inférieures à 10 snt trp peu fiables pur être transmises telles quelles. Si pssible, dans pareils cas, 17

26 n a recurt à une dilutin plus faible. C'est seulement lrsque aucune clnie n'est truvée qu'n peut dnner un résultat cmme étant < 1. Figure : l'effet des dilutins sur l'étalement et le dévelppement de clnies Le résultat final d'un dénmbrement s'btient en multipliant le nmbre de clnies dénmbrées par le facteur de dilutin de la bîte sur laquelle le dénmbrement a été fait, par ex. 54 (clnies dénmbrées) x 10 3 (dilutin de la bîte qui a fait l'bjet du dénmbrement). Ce résultat dit encre être ramené à la quantité d'échantilln dans la dilutin initiale (par ex. dans 1 g, dans 0,1 g u dans 0,01 g). Pur l'interprétatin du résultat, n peut encre faire remarquer ce qui suit : les unités snt des 'unités frmant clnie' (ufc u cfu clny frming units); ceci est suvent implicite, et n ne le précise pas (dnc 1200/g au lieu de 1200 ufc/g) étant dnné que le dénmbrement se fait entre 10 et clnies, le nmbre de chiffres significatifs est rarement supérieur à 2. un résultat de /g est dnc purement et simplement absurde! les résultats peuvent être exprimés nrmalement (ex ), sus frme expnentielle (5,4 x 104 u 7,1 x 108) u lgarithmique (4,7 lg ; 8,9 lg), ce qui est parfis plus pratique en cas de nmbres élevés. l'intervalle de cnfiance du résultat est relativement grand. n peut calculer que dans le cas idéal, l'intervalle de cnfiance d'un dénmbrement pur 10 clnies est d'envirn 120 %, pur 150 clnies il est d'envirn 33 % et pur 300 clnies il est d'envirn 23 % relatif. Ces calculs ne tiennent cmpte que de la dispersin des résultats prvenant du dénmbrement luimême; dans la pratique, cette dispersin est plus grande à cause de l'hmgénéisatin, des dilutins et de la technique d'étalement. En cnséquence, n dit cmpter, pur l'ensemble de l'analyse, sur un intervalle de cnfiance d'au mins 50 % relatif. Et 50 % est même encre une valeur ptimiste, car dans la pratique, la plus grande surce de dispersin est généralement l'échantillnnage, et pas tellement l'analyse! 18

27 Exigences du type n, M, m et c Certaines réglementatins fixent des exigences qui bligent à prendre en cnsidératin une cmbinaisn de critères. Le but est de se faire une meilleure idée de la répartitin de la cntaminatin, et en même temps d'intégrer une ntin d'avertissement. Dans ce cas, les critères snt représentés par les lettres n, M, m et c, n étant le nmbre d'échantillns individuels devant être prélevés (généralement 5, parfis 10), M une valeur maximum abslue qui ne peut être dépassée par aucun des n échantillns analysés, m une valeur maximum relative qui est tujurs inférieure à M, et c le nmbre d'échantillns parmi ces n qui peuvent dépasser la valeur m (mais qui divent évidemment tujurs être inférieurs à M). Il y a ainsi pur le nmbre de staphylcques dans le frmage au lait cru une exigence dnt les valeurs snt n = 5, M = /g, m = 1000 /g et c = 2. Cela signifie que 5 échantillns divent être prélevés, qu'aucun d'entre eux ne peut cntenir plus de staphylcques par gramme et qu'un maximum de 2 échantillns peuvent avir une valeur cmprise entre 1000/g et /g. Pur les pathgènes, suvent n ne mentinne que n et c=0, ce qui suppse implicitement que M = m = 0 (pathgène absent dans tus les n échantillns) Techniques classiques et mdernes Les techniques micrbilgiques ci-dessus, ensemencement de milieu de culture avec dévelppement de clnies typiques snt appliquées depuis des dizaines d'années, elles snt dnc cnsidérées cmme des techniques 'classiques'. Un des incnvénients des méthdes classiques est la durée de l'analyse, généralement de quelques jurs, nécessaire au dévelppement et à la cnfirmatin. Mais les techniques d analyses ne restent pas statiques et de nuveaux principes snt appliqués. On peut nter cmme principales évlutins : O O O un nuvel affinement des techniques classiques, surtut grâce au dévelppement de milieux nutritifs plus spécifiques qui permettent une meilleure détectin. au milieu des années '80, par exemple, la détectin de Listeria mncytgenes cnsistait en un lng enrichissement en milieu sélectif, suivi d'un étalement sur un milieu peu sélectif. Après incubatin, il fallait détecter les clnies bleu acier typiques de Listeria au micrscpe avec un éclairage blique. Ensuite, les clnies suspectes devaient être purifiées avant qu'une série de tests ne puissent être effectués afin d'identifier l'espèce mncytgenes. Actuellement, n étale sur un milieu nutritif (ALOA) sur lequel les clnies de Listeria mncytgenes peuvent être directement distinguées des autres espèces de Listeria. apparitin des milieux sélectifs basés sur une technique inhibigen. Une mlécule inhibigen est cnstituée de deux cmpsés, un inhibiteur spécifique et un substrat. Lié au substrat l inhibiteur n est pas txique, seuls les micrrganismes avec le mécanisme d assimilatin et les enzymes requis peuvent cliver l assciatin entre l inhibiteur et le substrat. Cette séparatin se fait à l intérieur de la cellule, l inhibiteur ainsi libéré interrmpt la synthèse de la pari cellulaire et cause la mrt de la cellule cncernée. L inhibiteur libéré ne peut pas s attaquer à d autres cellules, c est dnc une inhibitin ciblée. Ce qui en fait une alternative intéressante aux antibitiques pur inhiber les 19

28 bactéries nn recherchées. Le taux de recuvrance est améliré de deux façns : en réduisant la crissance de la flre cmpétitive et en minimisant l expsitin aux cmpsés inhibiteurs ptentiels. O O O O l'applicatin de l'elisa pur la détectin de certains pathgènes (VIDAS). Après enrichissement, n vérifie ici s'il y a dans l'échantilln des antigènes spécifiques prvenant d'un pathgène dnné. Le principal avantage est un raccurcissement de l'étape de détectin (une cnfirmatin par une méthde classique est tutefis encre le plus suvent nécessaire pur une certitude maximale). la PCR est une technique en plein essr. La détectin se fait par la recherche dans l'échantilln d'un fragment d'adn caractéristique prvenant d'un pathgène recherché. En première étape, un enrichissement est certes encre nécessaire afin d'btenir suffisamment d'adn, après qui les fragments recherchés snt multipliés par PCR (Plymerase Chain Reactin), et snt ensuite détectés. dans une variante récente, la real-time pcr la présence peut être déjà cnstatée pendant la réactin, si bien que la multiplicatin et la détectin snt simultanées. des méthdes de dénmbrement autmatisées apparaissent également sur le marché. On peut citer ici la méthde TEMPO. Celle-ci allie la technique du nmbre le plus prbable (3 dilutins décimales successives et 16 micr-tubes par dilutin) à la détectin de flurescence. Ces nuvelles méthdes permettent de ramener parfis de plusieurs jurs à quelques heures le temps d'analyse après enrichissement Paramètres de qualité des analyses micrbilgiques Parmi les paramètres de qualité des analyses micrbilgiques il faut distinguer ceux qui vnt être déterminés lrs de la validatin d une méthde de ceux qui vnt être utilisés pur apprécier les résultats d une analyse circulaire. Ces paramètres sernt également différents dans le cas d analyses quantitatives u de dénmbrements que dans le cas d analyses qualitatives u de détectin de la présence de micrrganismes pathgènes Validatin d une méthde Méthdes quantitatives Dans ce cas il est nécessaire d étudier la répétabilité, la reprductibilité et la justesse de la méthde. C est la nrme internatinale ISO 5725 qui va décrire la marche à suivre ainsi que le traitement des dnnées à effectuer pur mener à bien cette validatin. La fidélité est l étritesse de l accrd entre des mesures effectuées sur des prises multiples d un échantilln hmgène. La fidélité est estimée sur base de deux situatins extrêmes d analyse : la répétabilité et la reprductibilité ; 20

29 La répétabilité est une mesure de la fidélité, lrsque les mesures snt faites par un même pérateur, sur un même instrument, avec une méthde unique et dans un délai curt. La reprductivité est une mesure de la fidélité, lrsque les cnditins de mesure changent, plusieurs pérateurs et/u instruments et/u méthdes etc... La justesse est l étritesse entre une mesure et la valeur cnventinnelle vraie de l échantilln ; la valeur cnventinnelle vraie de l échantilln est furnie par cnsensus à partir des valeurs de mesures répétées. Méthdes qualitatives Les perfrmances de la méthde s exprimernt en terme d efficacité, de sensibilité, de spécificité et de taux de faux psitifs et de faux négatifs. La sensibilité est la fractin de tus les résultats psitifs crrectement attribués dans l analyse. La spécificité est la fractin de tus les résultats négatifs crrectement attribués dans l analyse. Le taux de faux psitifs est la fractin de psitifs bservés nn crrectement attribués. Le taux de faux négatifs est la fractin de négatifs bservés nn crrectement attribués. L efficacité est la fractin de résultats crrectement attribués. Dnc si n répartit les résultats en quatre catégries : O O O O le nmbre de résultats présumés psitifs, cnfirmés psitifs (vrais psitifs) (a) le nmbre de résultats présumés négatifs, s avérant psitifs (faux négatifs) (b) le nmbre de résultats présumés psitifs, s avérant négatifs (faux psitifs) (c) le nmbre de résultats présumés négatifs, cnfirmés négatifs (vrais négatifs) (d) Le calcul des paramètres de perfrmance se fait de la façn suivante : O O O O O sensibilité = a/(a+b) taux de faux psitifs = c/(a+c) spécificité = d/(a+d) taux de faux négatifs = b/(b+d) efficacité = a+d/(a+b+c+d) Mais il est également nécessaire de déterminer une limite de détectin pur les analyses qualitatives. Celle-ci est spécifique à chaque labratire. On détermine à partir de quel nmbre de cellules le labratire est capable de détecter la présence d un micrrganisme recherché dans une matière dnnée. 21

30 Analyses cmparatives Les paramètres utilisés pur qualifier la perfrmance d un labratire lrs d une analyse circulaire dépendent de l rganisateur de cette analyse. Méthdes quantitatives Les résultats vnt être examinés en fnctin de la fidélité et de la justesse. La fidélité reflète la répétabilité du travail du labratire. L écart type des résultats du labratire est cmparé à l écart type de l ensemble des résultats de l analyse circulaire. La justesse reflète la prximité des résultats du labratire à la valeur assignée de la cntaminatin de l échantilln. C est le Z scre qui est le plus cmmunément emplyé Z scre = (x X)/s u x est le résultat du labratire X est la valeur attribuée S est l écart type de tus les résultats de l analyse circulaire. Méthdes qualitatives La perfrmance est évaluée par la capacité à détecter uniquement les échantillns cntaminés par la bactérie à rechercher. Les résultats snt généralement classés en résultats justes, résultats faussement psitifs et résultats faussement négatifs. 22

31 2.1.3 Aperçu des principales analyses micrbilgiques Ce paragraphe a pur but de vus présenter brièvement la raisn u le but des différentes analyses micrbilgiques ainsi qu une brève descriptin du principe de l analyse. On distingue principalement les micrrganismes «témins de défaut d hygiène», germes ttaux (FMAT), levures et misissures, entérbactéries, clifrmes et Escherichia cli, des germes pathgènes respnsables de txi-infectin alimentaires, Staphylcques à cagulase psitive, Salmnelles, Listeria mncytgenes, E. cli O157 H7, Campylbacter, Bacillus cereus, Clstridium perfringens et C. btulinum, Yersinia enterclica et Vibri La Flre Mesphile Aerbice Ttale (FMAT) La flre mésphile aérbie ttale représente tus les micr-rganismes aptes à dnner naissance à des clnies visibles après une incubatin de 3 jurs à 30 C sur une gélse de dénmbrement de type Plate Cunt Agar (PCA). La FMAT est dnc un indice de la salubrité et de la qualité d un prduit. Sur un plan technlgique, une flre mésphile nmbreuse indique un haut risque d altératin micrbienne. Sur le plan hygiénique, il n y a pas de crrélatin étrite entre l imprtance de la flre ttale et la présence de micr-rganismes pathgènes. Le dénmbrement de la FMAT reste la meilleure méthde d appréciatin de la qualité micrbilgique générale Analyse Prcédure de dénmbrement de la FMAT : (ISO 4833 :2003) : O O O O O O prélever une quantité d échantilln, transférer dans du diluant et hmgénéiser, préparer les dilutins décimales, ensemencement en prfndeur de 1 ml d échantilln u de dilutin dans le milieu Plate Cunt Agar (PCA) incubatin à 30 C pendant 72 heures cmptage de tutes les clnies visibles calculer le nmbre de cfu à partir du nmbre de clnies, en tenant cmpte des dilutins réalisées. 23

32 Incubatin Figure : Bîte de milieu PCA Schema d analyse Dénmbrement des micr-rganismes Préparatin de l échantilln E c ha ntill n liq u id e u s u sp e n s i n m è re (p rise d e s sa i d e x g u x m l d a n s 9 x m l d e d ilua nt) D iluti ns d é c im a le s d a n s d u T ryp t ne se l E nse m e nc e m e nt e n p r f nd e u r d u m ilie u P C (M )A a ve c 1 m l (1 b îte p a r d ilu ti n) In c u b a ti n 7 2 ± 3 h ; 3 0 ± 1 C Dénmbrement C m p ta g e d e la t ta lité d e s c l n ie s 24

33 Levures et misissures Les misissures snt respnsables de détériratin des aliments, suvent de simples défauts d aspect, mais suffisants pur déprécier et rendre invendables les marchandises. Parfis elles peuvent présenter un danger pur le cnsmmateur, elles prduisent dans ce cas des txines appelées myctxines. Les levures peuvent également prduire, par leur dévelppement, des altératins, par frmatin de truble (cellules de levure), d deur u de gût anrmaux, prvquant suvent le gnflement des prduits u de leur emballage. Il n est dnc pas nécessaire de rechercher les levures et misissures d un pint de vue hygiénique, mais sur le plan technlgique, elles peuvent prvquer des pertes cnsidérables Analyse Prcédure de dénmbrement des levures et misissures : (ISO et 2 :2008) : O O O O prélever une quantité d échantilln, transférer dans du diluant et hmgénéiser, préparer les dilutins décimales si nécessaire, ensemencement en surface de 0,1 ml d échantilln u de dilutin dans le milieu Dichlran Rse Bengale chlramphénicl (DRBC) pur les échantillns dnt l activité en eau (aw) est supérieure à 0.95 et dans le milieu Dichlran Glycérl (DG18) pur les échantillns dnt aw < 0.95 incubatin à 25 C pendant 5 jurs dénmbrer tutes les clnies visibles après 3, 4 et 5 jurs, avec si nécessaire une distinctin entre levures et misissures (numératin après 3 et 4 jurs si la plaque risque d être cuverte de misissures), calculer le nmbre de cfu à partir du nmbre de clnies, en tenant cmpte des dilutins réalisées. Figure : Misissure sur milieu DRBC 25

34 Schéma d analyse Dénmbrement des levures et misissures Prélèvement et dilutin Echantilln liquide u suspensin mère (prise d essai de x g u x ml dans 9x ml de EPT 0,1%)) Dilutins décimales dans du peptne sel Incubatin Dénmbrement Ensemencement en surface du milieu DRBC (Prduit à a w supérieure à 0,95) DG18 (Prduit à a w inférieure u égale à 0,95) avec 0,1ml Incubatin 5 jurs; 25±1 C *** * Dénmbrement des clnies ** * Les bîtes snt cntrôlées après 3 et 4 jurs d incubatin ** Levures : clnies présentant le plus suvent un cntur régulier et une surface plus u mins cnvexe Misissures : germes plats u duveteux u clnies présentant suvent des fructificatins clrées et des frmes de sprulatin *** Enturer les bîtes de parafilm Incuber cuvercle vers le haut 26

35 Les entérbactéries Le nm d entérbactéries prvient du fait que ces bactéries snt en général des hôtes nrmaux u pathlgiques du tube digestif de l hmme et des animaux. Les entérbactéries cnstituent l une des plus imprtantes familles de bactéries, autant d un pint de vue quantitatif que qualitatif. On y retruve entre autres les clifrmes, plus particulièrement Escherichia cli, mais aussi des germes pathgènes tels que les Salmnelles, Escherichia cli entértxique, Shigella u Yersinia, ainsi que beaucup d autres bactéries. Elles snt recherchées pur déterminer la qualité sanitaire des aliments Analyse Le prcédure de dénmbrement des entérbactéries : (ISO :2004) : prélever une quantité d échantilln, transférer dans du diluant et hmgénéiser, préparer les dilutins décimales, ensemencement en prfndeur de 1 ml d échantilln u de dilutin dans un milieu gélsé à la bile, au cristal vilet et au glucse (VRBG), recuvrement avec une 2 ème cuche de VRBG (pur créer une semi-anaérbise), incubatin à 30 C pendant 24 heures, dénmbrer les clnies ruge-vilet typiques d un diamètre de 0,5 mm u plus, parfis enturées d une zne de précipité ruge-vilet, ainsi que les clnies inclres nn typiques. Si un dute subsiste, effectuez un test d xydase sur la clnie (les Enterbacteriaceae snt xydase négatif), calculer le nmbre de cfu à partir du nmbre de clnies, en tenant cmpte des dilutins réalisées. Figure : Bîte de milieu VRBG 27

36 Schéma d analyse: Dénmbrement des Enterbacteriaceae Préparatin de l échantilln Echantilln liqu ide u suspensin m ère (prise d essai de x g u x m l dans 9x m l de diluant) Dilutins décim ales dans du Tryptne sel * Incubatin Dénmbrement Ensem encem ent en prfndeur du m ilieu VRB G avec 1 m l (1 bîte par dilutin) Incubatin 24±2h; 30±1 C Cm ptage des clnies suspectes ** Cnfirmatin Nutrie nt Agar Incubatin 24±2h; 37±1 C Si tes t de l xidas e negative Test de l xydase Test de ferm entatin Incubatin 24±2h; 37±1 C * Pur les s wabs : + 100m l de diluant ** Prélèvem ent de 5 clnies u tutes les clnies si < 5, pur cnfirm atin 28

37 Les clifrmes et Escherichia cli Pur détecter une cntaminatin, il est pssible de rechercher directement les espèces pathgènes u, si cela présente des avantages de cmmdité, de rapidité u de sensibilité, de rechercher une espèce u un grupe d espèces de la même assciatin. Cette espèce u ce grupe d espèces cnstitue alrs un indice u un témin de la cntaminatin. Les clifrmes et Escherichia cli snt des micrrganismes vivant nrmalement dans l intestin de l hmme et des animaux. Ainsi ils snt recherchés en tant qu indice de cntaminatin fécale. La surveillance de ces indicateurs permet de cntrôler le respect des nrmes d hygiène au lng de la chaîne de prductin Analyse des clifrmes Prcédure de dénmbrement des clifrmes : (ISO 4832 :1991) : prélever une quantité d échantilln, transférer dans du diluant et hmgénéiser, préparer les dilutins décimales si nécessaire (en cas de valeurs élevées), ensemencement en prfndeur de 1 ml d échantilln u de dilutin dans un milieu gélsé à la bile, au cristal vilet et au lactse (VRBL), recuvrement avec une 2 ème cuche de VRBL (pur créer une semi-anaérbise) incubatin à 30 C pendant 24 heures cmptage des clnies d un diamètre égal u supérieur à 0.5 mm de culeur vilacée u purpre cnfirmatin, sélectinner cinq clnies de chaque type duteux et ensemencer des tubes de builln lactse, bilié au vert brillant, incuber à 30 C pendant 24 heures, les clnies pur lesquelles n bserve une frmatin de gaz dans les clches de durham, snt cnsidérées cmme étant des clifrmes calculer le nmbre de cfu à partir du nmbre de clnies, en tenant cmpte des dilutins réalisées. Figure : Bîte de milieu VRBL 29

38 Analyse E. cli Prcédure pur le dénmbrement d E. cli : (ISO ) : O O O O O O prélever une quantité d échantilln, transférer dans du diluant et hmgénéiser, préparer les dilutins décimales si nécessaire (en cas de valeurs élevées), ensemencement en prfndeur de 1 ml d échantilln u de dilutin dans un milieu gélsé tryptne-bile-glucurnide (TBX) incubatin à 44 C pendant 24 heures cmptage des clnies de culeur bleue calculer le nmbre de cfu à partir du nmbre de clnies, en tenant cmpte des dilutins réalisées. Figure : Bîte de milieu TBX 30

39 Schéma d analyse : Dénmbrement des Escherichia cli Echantilln liquide u suspensin mère (prise d essai de x g u x ml dans 9x ml de diluant) Dilutins décimales dans du tryptne sel Ensemencement en prfndeur du milieu TBX avec 1ml (1 bîte par dilutin) Incubatin 21±3h; 44±1ºC Cmptage des clnies bleues 31

40 Staphylcques à cagulase psitive Si les Salmnelles snt les agents principaux de txi-infectins alimentaires (TIA), les staphylcques ccupent le deuxième u trisième rang seln les années. Mais cmpte tenu des symptômes relativement bénins qu elles entraînent, il est frt prbable que les intxicatins staphylccciques snt largement sus-estimées. Les intxicatins alimentaires dues aux staphylcques snt principalement prvqués par les txines prduites par ces rganismes. La cntaminatin par Staphylcccus aureus a deux rigines : l animal (mammites) et l hmme. Ce germe fait partie de la flre de la peau et des muqueuses. Des suches de S. aureus d rigine variée peuvent cntaminer les aliments crus. Etant thermsensibles, elles snt généralement détruites au curs de la pasteurisatin u de la cuissn des aliments (les txines snt relativement résistantes à la chaleur). La présence de S. aureus dans les aliments chauffés et manipulés après cuissn est plutôt un indice de cntaminatin humaine. Le niveau de cntaminatin est habituellement faible, mais si l aliment est cnservé dans des cnditins favrables à la multiplicatin et à la prductin de txines, les entértxines peuvent être prduites en quantité suffisante pur déclencher une intxicatin. Un critère imprtant pur la détectin de S. aureus est la présence de cagulase, une enzyme qui déclenche la première étape de la cagulatin. L absence de cagulase implique que la suche n est pas S. aureus Analyse La prcédure de dénmbrement des staphylcques : (ISO :1999) : O O O O O O O prélever une quantité d échantilln, transférer dans du diluant et hmgénéiser, préparer éventuellement une dilutin décimale (si n prévit des valeurs élevées), ensemencement en prfndeur de 1 ml d échantilln u de dilutin dans un milieu gélsé au plasma de lapin et au fibringène [Baird Parker + supplément RPF (Rapid Plasma Fibringen)] incubatin à 37 C pendant 24 à 48 heures cmpter le nmbre de clnies typiques : clnies nir-gris enturées d une zne laiteuse u truble, en cas de dute : cnfirmer les clnies suspectes à l aide d un test cagulase, calculer le nmbre de cfu à partir du nmbre cmpté de clnies, en tenant cmpte des dilutins réalisées. 32

41 Figure : Bîte de milieu Baird-Parker 33

42 Schéma d analyse Dénmbrement des Staphylcques à cagulase psitive Echantilln liquide u suspensin mère (prise d essai de x g u x ml dans 9x ml de diluant) Dilutins décimales dans du tryptne sel Ensemencement en prfndeur du milieu BP + RPF avec 1ml (une bîte par dilutin) Incubatin 24+/-2h; 37+/-1 C * t e n m b re m é n D Dénmbrement des clnies gris-nir avec un hal * Si aucune clnie typique, les bîtes snt incubées 24h supplémentaires 34

43 Les Salmnelles Les salmnelles snt dnc la cause principale des txi-infectins alimentaires. Elles fnt partie des Entérbactériacées et snt riginaires du tube digestif des animaux à sang chaud. Leur présence s explique en général par une cntaminatin d rigine fécale prvenant d individus malades u prteurs. Salmnella est capable de se maintenir plus u mins lngtemps en dehrs des matières fécales et peut ainsi cntaminer l eau et les aliments Analyse Recherche des Salmnelles : (ISO 6579 :2002) : O O prélever une quantité d échantilln, transférer dans de l eau peptnée tampnnée et hmgénéiser, pré-enrichissement nn sélectif en incubant à 37 C pendant 18 heures, O enrichissement sélectif sur deux milieux en parallèle : 0,1 ml de culture de pré enrichissement dans un builln Rappaprt Vassiliadis Sja (RVS) et incubatin 24 heures à 41,5 C 1 ml de culture de pré enrichissement dans un builln Muller Kauffmann (MKTTn) et incubatin 24 heures à 37 C O O islatin à partir de chaque enrichissement sélectif (RVS et MKTTn) sur deux milieux agar différents (Xylse Lysine Désxychlate agar, XLD, et Brillance Salmnella), en étalant à l aide d une ese, puis incuber pendant 24 heures à 37 C, si l n bserve sur ces milieux agar des clnies avec l apparence typique de Salmnella (clnies nires u clnies ruges avec un centre nir sur XLD, clnies purpres sur Brillance Salmnella), effectuer la phase de cnfirmatin en prélevant quelques clnies typiques, en les replaçant sur Nutrient Agar (NA) et en les incubant pendant 24 heures à 37 C, et effectuer ensuite un certain nmbre de tests bichimiques (la galerie API) pur cnfirmer que l rganisme bservé est effectivement Salmnella. Recherche des Salmnelles par PCR: (AFNOR iq-check Salmnella II (BRD 07/06 07/04)) : prélever une quantité d échantilln, transférer dans de l eau peptnée tampnnée et hmgénéiser, pré-enrichissement nn sélectif en incubant à 37 C pendant 21 heures, extractin de l ADN de 100 µl de culture de pré enrichissement avec 100µl de réactif de lyse, incuber 10 min à C, centrifuger, prendre 5 µl de surnageant, ajuter 45 µl de mix PCR et réaliser le screening PCR enrichissement sélectif sur deux milieux en parallèle et réalisatin de la PCR : ml de culture de pré enrichissement dans un builln Rappaprt Vassiliadis Sja (RVS) et incubatin 24 heures à 41,5 C ml de culture de pré enrichissement dans un builln Muller Kauffmann (MKTTn) et incubatin 24 heures à 37 C 35

44 islatin à partir de chaque enrichissement sélectif (RVS et MKTTn) sur deux milieux agar différents (Xylse Lysine Dexychlaat agar, XLD, et Brillance Salmnella), en étalant à l aide d une ese, puis incuber pendant 24 heures à 37 C, si l n bserve sur ces milieux agar des clnies avec l apparence typique de Salmnella (clnies nires u clnies ruges avec un centre nir sur XLD, clnies purpres brillantes sur Brillance Salmnella), effectuer la phase de cnfirmatin en prélevant quelques clnies typiques, en les replaçant sur Nutrient Agar (NA) et en les incubant pendant 24 heures à 37 C, et effectuer ensuite un certain nmbre de tests bichimiques (la galerie API) pur cnfirmer que l rganisme bservé est effectivement Salmnella. Figure : Bîte de milieu XLD 36

45 Schéma d analyse Recherche de Salmnella spp. Pré-enrichissement Prise d essai x g + 9x ml d eau peptnée tampnnée * Incubatin 18±2h; 37±1 C Enrichissement 0,1ml de culture + 10ml de builln RVS Incubatin 24±3h; 41.5±1 C 1ml de culture + 10ml de builln MKTTn Incubatin 24±3h; 37±1 C Islement XLD Incubatin 24±3h; 37±1 C Brillance Salmnella Incubatin 24±3h; 37±1 C XLD Incubatin 24±3h; 37±1 C Brillance Salmnella Incubatin 24±3h; 37±1 C ** Nutrient agar Incubatin 24±2h; 37±1 C Cnfirmatin Si galerie API 20E et test d agglutinatin psitifs Galerie API 20E Incubatin h; 37±1 C Tests d agglutinatin Déterminatin du sértype et si d applicatin du phagtype et de l antibirésistance à l ISP * Pur les swabs : + 100ml d eau peptnée tampnnée ** 1 clnie typique d un des milieux et si celle-ci n est pas cnfirmée, cnfirmatin sur 4 clnies supplémentaires 37

46 Schéma d analyse Détectin des Salmnella spp. (Méthde PCR) Annexe : Schéma d analyse Détectin des Salmnella spp. (méthde PCR) Prise d essai x g u ml + 9x ml d eau peptnéetampnnée * Incubati n 21+/-1h; 37+/-1 C 100 µl µl de réactif de lyse Prévir un éch. blanc (100 µl d eau stérile) Vrtexer Incubatin 10 min.à C Vrtexer Centrifuger 2 à rpm *** *** R C P 45 µl de Mix PCR par puits ** + 5 µl du surnageant Sceller les puits Screening par PCR 0,1ml de culture + 10ml de builln RVS Incubatin 24+/-3h; 41,5+/-1 C 1ml de culture + 10ml de builln MKTTn Incubati n 24 +/-3h; 37+/-1 C XLD Incubatin 24 3h; 37+/-1 C Brilliance Salmnella Incubatin 24 3h; 37+/-1 C XLD Incubatin 24 3h; 37+/-1 C BrillianceSalmnel la Incubatin 24 3h; 37+/-1 C Si galeri e API 20 E et tests d agglu tinati n psit ifs **** Nutrientagar Incubati n 24+/-2h; 37+/-1 C Galerie API 20E Incubatin 18+/-3h; 37+/-1 C Tests d agglutinatin Déterminatin du sértype et si d applicatin du phagetype et de l antibirésistance à l ISP * Pur le s sw abs : m l d eau p ept n ée t am pn né e ** Prép ar ati n d u M ix PCR : réa ctif C ( slu tin d am plific ati n) + r éac tif B (s nd es flu re sce nte s). À pr épa re r en f ncti n du n mb re d éch an tilln s à a naly ser et des c ntr ôles à eff ect ue r (1 cn tr ôle p sitif et 1 cn trô le né gat if par sér ie) *** Si PC R p sitive **** 1 cl nie ty piqu e d u n d es m ilieux et si c elle- ci n est p as cn firm ée, cn firm ati n su r 4 c ln ies su pplé m ent air es 38

47 Listeria mncytgenes De très nmbreuses denrées peuvent être cntaminées par L. mncytgenes : végétaux, lait et prduits laitiers, carcasses de vlailles, viandes de prc, viande de bvins, viande d vins, prduits carnés, pissns et prduits dérivés, cquillages et crustacés. Mais un aliment cntaminé n est pas tujurs dangereux. Des résultats de dénmbrement nt mntré que la plupart des cas de listérise humaine snt dus à un aliment cntaminé avec plus de 100 L. mncytgenes par gramme u millilitre. Les prduits les plus sensibles snt ceux qui peuvent favriser la crissance de Listeria, qui nt une durée de vie lngue et qui peuvent être cnsmmés sans être chauffés. Un des principaux prblèmes rencntrés avec L. mncytgenes est sa capacité de se dévelpper à des températures avisinant 0 C Analyse Recherche de L. mncytgenes ( ISO : 1998 partie 1) : prélever une quantité d'échantilln, transférer dans un milieu liquide avec une cncentratin réduite en cmpsants sélectifs (Half Fraser Brth) et hmgénéiser, pré-enrichissement semi-sélectif en incubant à 30 C pendant 24 heures, enrichissement secndaire, transfert de 0,1 ml de la culture d enrichissement primaire dans un builln sélectif avec cncentratin cmplète en agents sélectifs (Fraser) et incubatin 48 heures à 37 C islement, étalement à l aide d une anse de la culture d enrichissement primaire et secndaire sur un milieu gélsé seln OTTAVIANI AGOSTI (ALOA), incubatin 24 heures à 37 C si l'n bserve sur ALOA des clnies avec l'apparence typique de L. mncytgenes (1-2 mm de grandeur, de culeur bleu clair et avec un hal clair) alrs cnfirmatin, étalement sur une gélse Tryptne Sja Yeast Agar (TSYEA) des clnies caractéristiques, incubatin 24 heures à 37 C. On effectue ensuite un test d hemlyse, un test de Camp et un certain nmbre de tests bichimiques (la galerie API) pur cnfirmer que l'rganisme bservé est effectivement bien L. mncytgenes. Dénmbrement de L. mncytgenes ( ISO : 1998 partie 2) : prélever une quantité d'échantilln, transférer dans de l'eau peptnée tampnnée et hmgénéiser, incuber pendant une heure à 20 C pur dnner le temps aux rganismes stressés de récupérer, ensemencement en surface de 1 ml de la dilutin réparti sur 3 bîtes de milieu d'islatin sélectif (ALOA), 0,1 ml de la dilutin sur 1 bîte et incuber pendant 48 heures à 37 C, cmpter le nmbre de clnies sur ala avec l'apparence typique de L. mncytgenes (1-2 mm de grandeur, de culeur bleu clair et avec un hal clair). Si l'n bserve ce type de clnies, effectuer alrs la phase de cnfirmatin en prélevant quelques clnies typiques, en les repiquant sur Tryptne Sy Yeast Extract Agar (TSYEA), et en incubant pendant 24 à 37 C, et ensuite réaliser un test d hémlyse, un test de Camp et un certain 39

48 nmbre de tests bichimiques (la galerie API) afin de cnfirmer que l'rganisme bservé est effectivement bien L. mncytgenes. s'il est cnfirmé que les clnies prélevées snt effectivement des L. mncytgenes, calculer alrs le nmbre de cfu à partir du nmbre cmpté de clnies, en tenant cmpte des dilutins réalisées. Recherche de L. mncytgenes par la méthde VIDAS (Vidas LMO2 validé AFNOR n BIO-12/11-03/04) : prélever une quantité d'échantilln, transférer dans un milieu liquide avec une cncentratin réduite en cmpsants sélectifs (Half Fraser Brth) et hmgénéiser, pré-enrichissement semi-sélectif en incubant à 30 C pendant 24 heures, enrichissement secndaire, transfert de 0,1 ml de la culture d enrichissement primaire dans un builln sélectif avec cncentratin cmplète en agents sélectifs (Fraser) et incubatin 48 heures à 37 C Test immun-enzymatique permettant la détectin d antigènes de Listeria mncytgenes grâce au système autmatisé Vidas Cnfirmatin des résultats psitifs par ensemencement d une gélse ALOA et d une gélse RAPID L. Mn (RLM) Figure : Tubes de builln Fraser et Fraser demi Figure : Bîte de milieu ALOA 40

49 Schéma d analyse Dénmbrement des Listeria mncytgenes 41

50 Schéma d analyse Détectin des Listeria mncytgenes par la méthde Vidas Annexe: Schéma d analyse Détectin des Listeria mncytgenes par la méthde Vidas Pré-enrichement Prise d essai x g (f ml) + 9x ml builln demi-fraser Incubatin 24-26h; 30±1 C Enrichement 0.1 ml + 10 ml de builln Fraser Incubatin 24-26h; 37±1 C Screening 500 µl dans les barrettes Vidas LM02 Screening par Vidas Si Vidas psitif Cnfirmatin Etalement d une öse de builln Fraser sur ALOA et RLM Incubatin 24±2h; 37±1 C Si une des deux gélses est psitive Sértypage à l ISP Tableau d interprétatin Résultat VIDAS Résultat ALOA Résultat RLM Interprétatin - Absence Présence Présence Présence Absence 42

51 E. cli O150 :H7 Parmi les E. cli, il existe des suches qui prduisent une cyttxine particulière, la vértxine u vércytxine (VTEC). Mais tus les VTEC ne snt pas pathgènes pur l hmme. Le sértype le plus fréquent et le plus pathgène est O157 :H7 u E. cli enterhémrragique. Le cde O157:H7 renvie à des antigènes spécifiques sur la pari cellulaire et le flagelle de la bactérie. Cmme les autres E. cli, il s agit d une bactérie fécale. Elle se transmet par la nurriture cntaminée, la viande principalement d rigine bvine, le lait cru et d autres aliments (sandwichs, pmme de terre, jus de pmme,...) et par l eau (eau de distributin, mais surtut eau de baignade), surtut des denrées traitées thermiquement u insuffisamment cuites Analyse Recherche de E. cli O157:H7 : prélever une quantité d'échantilln, transférer dans le milieu d enrichissement liquide Tryptne Sy Brth (TSB) et hmgénéiser, pré-enrichir en incubant à 41,5 C pendant 7 heures, enrichissement secndaire, transfert de 1 ml de la culture d enrichissement primaire dans un builln Mac Cnkey (CT-MAC) avec antibitiques, incubatin 18 heures à 37 C ensuite n peut sit effectuer un test ELISA à partir du milieu sélectif CT-MAC (détectin immunlgique de O157:H7, VIDAS), n effectue en cas de résultat psitif une immuncncentratin pur btenir une cncentratin plus élevée en cellules de E. cli O157:H7, sit n effectue directement depuis CT-MAC une cncentratin avec des billes immunmagnétiques dans le même but, islement, étalement à l aide d une anse de milieu d enrichissement cncentré sur une gélse CT-SMAC (CT-MAC avec ajut de srbitl) et sur un milieu chrmgène et incuber 24 heures à 37 C si n bserve sur CT-SMAC u sur le milieu chrmgène des clnies avec l'apparence typique (inclre, parfis brunâtre, diamètre > 1 mm sur CT-SMAC, purpre, diamètre > 1 mm sur milieu chrmgène), effectuer alrs la phase de cnfirmatin en prélevant quelques clnies typiques, les repiquer sur Nutrient Agar, incuber pendant 24 heures à 37 C, et ensuite effectuer un certain nmbre de tests bichimiques (la galerie API, test d'agglutinatin) afin de cnfirmer que l'rganisme bservé est effectivement E. cli O157:H7. 43

52 Figure : Bîte de milieu CT-SMAC 44

53 Schéma d analyse - Détectin de E. cli O157 par la méthde Vidas Prise d essai x g (u ml) * + 9x ml mtsb (acriflavine f nvbicine) Incubatin 6-7h; C t n e m s e is h ric n E 1ml de culture + 9ml CT-MAC Incubatin 18 1h; 37 1 C g in n c r e S 1 ml de culture 15min; 100 C 500µl dans une barrette Vidas ECO Screening par Vidas Si Vidas psitif 500µl dans une barrette Vidas ICE Immun-cncentratin par Vidas CT-SMAC Incubatin 21 3h; 37 1 C CHROMagar O157 Incubatin 21 3h; 37 1 C ** Nutrient-agar ** 24 2h; 37 1 C Test de cnfirmatin API 20E Incubatin h; 37 1 C Si API psiti f Si l agglu tinatin est psitive Test d agglutinatin Déterminatin du facteur de virulence par AZ-VUB * Pur les swabs: + 100ml m-tsb (nvbicine) ** 1 clnie typi que d un des milieux et si celle-ci n est pas cnfirmée, cnfirmatin sur 4 clnies suppl émentaires 45

54 Campylbacter La présence de Campylbacter dans les aliments indique une cntaminatin fécale car l habitat de ce germe se limite au tube digestif des hmmes et des animaux. La cntaminatin se fait par cntact des aliments avec des persnnes malades u prteuses. Les prduits laitiers, les vlailles et, dans une mindre mesure les viandes, snt les aliments les plus prpices aux campylbactérises. Les principales causes de txi-infectin alimentaires dues à Campylbacter prviennent de la cnsmmatin de denrées crues u insuffisamment cuites et par cntaminatin crisée. Cependant il n est pas rare que, dans les pays en vie de dévelppement, des épidémies sient dues à l ingestin d eau cntaminée Analyse Recherche de Campylbacter (ISO :2006) : prélever une quantité d'échantilln, transférer dans un milieu liquide sélectif (Bltn Brth) et hmgénéiser. Eliminer autant que pssible l'air du sac avec le milieu d enrichissement inculé (cnditins micr-aérphiles). première étape du pré-enrichissement en incubant à 37 C pendant 4 à 6 heures, deuxième étape du pré-enrichissement en incubant à 41,5 C pendant 44 heures, islement à partir du pré-enrichissement vers deux milieux agar différents : mccda (mdified charcal cefperazne dexychlaat agar) et un agar chrmgène en étalant à l'aide d'une ese, suivie par une incubatin dans des cnditins micr-aérphiles pendant 44 heures à 41,5 C. si l'n bserve sur les plaques des clnies avec l'apparence typique de Campylbacter (gris, plat, humide avec tendance à s'étendre sur mccda, petit, ruge fncé à ruge-range, parfis avec un reflet métallique sur agar chrmgène), effectuer alrs la phase de cnfirmatin en prélevant quelques clnies typiques, repiquer sur l'agar au sang Clumbia et incuber dans des cnditins micr-aérphiles pendant 24 à 48 heures à 41,5 C. effectuer les tests de cnfirmatin sur les clnies gris fncé typiques sur l'agar au sang Clumbia : analyse micrscpique, test de mbilité, test de crissance à 25 C (micraérphile) et à 41,5 C (aérbie) et un test xydase. Réaliser un certain nmbre de tests bichimiques (la galerie API) afin de cnfirmer que l'rganisme bservé est effectivement bien Campylbacter. Dénmbrement de Campylbacter (ISO : 2006) : prélever une quantité d'échantilln, transférer dans l eau peptnée tampnnée et hmgénéiser ensemencement en surface de 1 ml de la dilutin reparti sur 3 bîtes de milieu d'islatin sélectif (mccda), 0,1 ml de la dilutin sur 1 bîte et incuber pendant 44 heures à 41 C Dénmbrement des clnies suspectes. Cnfirmatin des clnies suspectes par examen micrscpique (mrphlgie et mbilité caractéristiques), crissance sur gélse au sang Clumbia en atmsphère micr-aérbie à 25±1 C et en atmsphère aérbie à 44.5±1 C, test de l xydase 46

55 Figure : Bîte de milieu Clumbia 47

56 Schéma d analyse - Détectin de Campylbacter spp. Prise d essai x g (u ml) + 9x ml de b uilln Bltn * Incubatin 4-6h; 37+/-1 C Incub atin 44+/-4h; 41.5+/-1 C En atmsphère micraérbie Gélse mccda Incubatin 44+/-4h; 41.5+/- 1 C En atmsphère micraérbie Gélse a u sang Clumbia Incuba ti n 24-48h; /-1 C En atmsphère micraérbie Gélse Campyfd ID) Incubatin 24-48h; 41.5+/-1 C En atmsp hère micraérbie ** ** 1ml de Builln Brucella Micrscpie Mrphl gie et mbilité n ti a m fir n c e d s i t est S itifs ps Oxydase Gélse au sang Clumbia Incubatin 44+/-4h; 41.5+/-1 C En atmsphère aérbie Gélse au sang Clumbia Incubatin 44+/-4h; 25+/-1 C En a tmsphère micraérbie Dé terminatin d e l antibirésistance à l ISP * Pur les swabs: + 100ml de builln Bltn ** 1 clnie typique d un des milieux et si celle-ci n est pas cnfirmée, cnfirmatin sur 4 clnies supplémentaires 48

57 Schéma d analyse - Dénmbrement de Campylbacter spp. Prise d essai x g (u ml) + 9x m l d eau peptnée tampnnée Ensemencement en surface du milieu m CCDA (1ml réparti sur 3 bîtes et 0.1 m l sur une bîte) Incubatin 44±4h; 41.5±1 C En atm sphère micraérbie Dénm brement des clnies suspectes * Gélse au sang Clumbia Incubatin 24-48h; 41.5±1 C En atmsphère micraérbie 1m l de Builn Brucella Micrscpie Mrphlgie et mbilité n ti a m n fir c itifs e s d p ts s i te S Oxydase Gélse au sang Clum bia Incubatin 44±4h; 41.5 ±1 C En atmsphère aérbie Gélse au sang Clumbia Incubatin 44±4h; 25±1 C En atmsphère micraérbie Déterminatin de l antibirésistance à l ISP * Sélecti nner 5 cl nies susp ectes u tu tes le s clnie s si < 5 49

58 Bacillus cereus Bacillus cereus est une bactérie que l n retruve surtut dans le sl. Elle va dnc cntaminer les aliments lrsque ceux-ci snt suillés par de la terre. Ainsi n la retruve fréquemment en faible cncentratin dans les aliments crus, séchés et transfrmés. Mais elle n est dangereuse pur l hmme qu à des dses supérieures à 10 5 germes par gramme d aliment. Les aliments les plus sensibles snt le riz, les salades u purée de pmme de terre, les salades de légumes, les épices, les céréales etc Analyse Dénmbrement de Bacillus cereus (ISO 7932:2004) : prélever une quantité d'échantilln, transférer dans du diluant et hmgénéiser, préparer les dilutins décimales, ensemencement en surface avec un étaleur de 0.1 ml d échantilln u de dilutin d un milieu sélectif slide au Mannintl egg Ylk Plymyxin Agar (MYP) et incubatin 18 à 24 heures à 30 C cmpter le nmbre de clnies typiques sur les plaques cntenant l'agar MYP (grandes clnies rses enturées d une zne de précipitatin). Si l'n bserve ce type de clnies, effectuer alrs la phase de cnfirmatin à l'aide d'un test d hémlyse : prélever quelques clnies typiques, effectuer une inculatin en stries sur l'agar au sang et incuber pendant 24 heures à 30 C. Une zne claire autur de la clnie témigne de l'hémlyse. s'il est cnfirmé que les clnies prélevées snt effectivement B. cereus, cmpter alrs le nmbre de cfu à partir du nmbre cmpté de clnies, en tenant cmpte des dilutins réalisées. Figure : Bîte de milieu MYP 50

59 Schéma d analyse - Dénmbrement des Bacillus cereus présmptifs Dénmbement Préparatin de l échantilln Incubatin Echantilln liquide u suspensin mère (prise d essai de x g u x ml dans 9x ml de diluant) Dilutins décimales dans du tryptne sel Ensemecement en surface du milieu MYP agar avec 0.1ml Incubatin 18-24h; 30±1 C * Dénmbrement des clnies suspectes ** Cnfirmatin Gélse au sang de mutn Incubatin 18-24h; 30±1 C * Si aucune clnie typique, les bîtes snt incubées 24h supplémentaires ** Prélèvement de 5 clnies u tutes les clnies si < 5 51

60 2.1.4 Méthde TEMPO Généralités La méthde TEMPO est une méthde de dénmbrement des micrrganismes autmatisée. Elle est basée sur la technique du nmbre le plus prbable (NPP), mais alrs que la technique NPP classique demande l ensemencement de 3 u 5 tubes de 3 dilutins successives, la carte TEMPO permet l analyse de 16 micrtubes de 3 dilutins successives. sur la mesure de l apparitin u de la disparitin de la flurescence. Cette méthde a fait l bjet d une validatin AFNOR suivant la nrme ISO pur le dénmbrement de la flre mésphile aérbie ttale, des staphylcques cagulase psitive, des Escherichia cli et des entérbactéries dans les denrées alimentaires. Limites d utilisatin de la méthde : La méthde n est pas applicable pur les échantillns trp clrés (épices, caca, ), la culeur puvant cacher la flurescence et dnc dnner un résultat errné. Elle n est pas indiquée nn plus pur les échantillns présentant une activité enzymatique u cntenant des substances inhibitrices Principe Des indicateurs de ph flurescents snt présents dans les milieux de crissance. Deux principes snt appliqués suivant l analyse effectuée Disparitin de la flurescence Dans le cas des staphylcques et des entérbactéries, la mlécule indicatrice de ph est la 4- méthylumbelliférne (4MU) (Figure ). Cette mlécule est flurescente à ph 7 et perd sa flurescence lrsque le ph est inférieur u égal à 6. Lrs de la crissance des bactéries recherchées, le métablisme des glucides des micrrganismes prvque une acidificatin du milieu et dnc une disparitin de la flurescence. Figure : Mlécule de 4-méthylumbelliférne 52

61 Apparitin de la flurescence En ce qui cncerne le dénmbrement des Escherichia cli et de la flre mésphile aérbie ttale, la 4-méthylumbelliféryl-β-D-glucurnide, mlécule nn flurescente, est présente dans le milieu. Si elle snt présentes, la crissance des bactéries recherchées va libérer de la β-glucurnidase. Celle-ci va prvquer la dissciatin de la 4-méthylumbelliféryl-β-D-glucurnide en une mlécule nn flurescente (β-d-glucurnide) et une mlécule flurescente (4MU) (fig ) Figure : Apparitin de la flurescence suite à l activité enzymatique bactérienne Appareillage Matériel spécifique nécessaire à l applicatin de la méthde : - Flacns de milieux déshydratés spécifiques à chaque micrrganisme (Figure a) - Dispensettes d eau stérile - Cartes de dilutins spécifiques à chaque micrrganisme (Figure b) - Autmate TEMPO filler + PC (Figure c) - Autmate TEMPO reader + PC (Figure d) Le TEMPO filler remplit et scelle les cartes. Un prcessus de mise sus vide puis une augmentatin de la pressin dans l appareil vnt prvquer l aspiratin de la suspensin (4ml) et sa répartitin dans les 3 séries de 16 tubes miniaturisés. Dans la première série, chaque tube reçit 225µl de l échantilln, dans la deuxième, 22,5µl et dans la trisième, 2,25µl. Le TEMPO filler va ensuite sceller hermétiquement la carte pur éliminer tut risque de cntaminatin extérieure. 53

62 Figure a: Flacns de milieux déshydratés (EB : Entérbactéries, EC : Escherichia cli) Figure b: Cartes de dilutin Figure c: Pste de préparatin : TEMPO Filler (à drite) avec les dispensettes au centre, les cartes et les flacns crrespndants sur l étagère. Le TEMPO reader lit les cartes grâce à une caméra sus lumière UV. Un scanner relève le cde barre présent sur la carte et établit la cnnexin entre le numér de l échantilln, la dilutin et le micrrganisme recherché. 54

63 Figure : Pste de lecture : TEMPO reader ( à drite) Recherche des Escherichia cli shigatxines psitives (STEC) Généralités Les Escherichia cli prducteurs de shigatxines (STEC) représentent tutes les suches de E. cli pssédant les gènes stx cdant pur une shigatxine u vértxine (ces E. cli snt aussi dénmmées VTEC). Les suches STEC les plus dangereuses fnt partie du grupe des EHEC (E. cli entérhémrragiques). Ces suches nt les mêmes caractéristiques cliniques et épidémilgiques que les E. cli O157 :H7 et pssèdent les mêmes facteurs de virulence. La cmplicatin la plus grave des infectins à EHEC est le syndrme hémlytique et urémique (SHU). Les suches qui nt été clairement assciées aux frmes les plus sévères d affectin, cmme le SHU, appartiennent aux sérgrupes O157, O26, O103, O111 et O145. En plus d un gène stx, ces suches pssèdent le gène eae cdant pur l intimine. Elles fnt partie du grupe de STEC prvquant des lésins d attachement et d effacement Tutefis, il est nécessaire de cnsidérer tutes les suches STEC cmme pathgènes pur l Hmme dans la mesure ù tutes peuvent être à l rigine d affectins sévères seln le risque asscié à la présentatin de la denrée alimentaire (prête à être cnsmmée u bien destinée à être cnsmmée après un traitement technlgique (pasteurisatin, cuissn, ) et seln l état de santé du cnsmmateur Analyse La méthde de recherche des STEC décrite dans la nrme ISO est basée sur la réactin de plymérisatin en chaîne en temps réel (RT-PCR). 55

64 Expressin des résultats Échantillns négatifs pur les gènes stx : nn détectin de suche STEC dans la prise d essai de x g u x ml Si aucune suche STEC n est islée à partir des échantillns psitifs pur la présence de gènes stx en criblage PCR: Échantillns psitifs pur les gènes stx : détectin présumée de suches STEC dans la prise d essai de x g u x ml. Échantillns psitifs pur les gènes stx et le gène eae : détectin présumée de suches STEC prvquant des lésins d attachement et d effacement dans la prise d essai de x g u x ml. Échantillns psitifs pur les gènes stx et le gène eae ainsi que pur les gènes assciés à l un des sérgrupes O26, O103, O111, O145 et O157 : détectin présumée de suches STEC du sérgrupe XX dans la prise d essai de x g u x ml. Si une suche STEC est islée à partir des échantillns psitifs pur la présence de gènes stx en criblage PCR et cnfirme la suspicin. Suches d E. cli islées psitives pur les gènes stx : présence de suches STEC dans la prise d essai de x g u x ml. Suches d E. cli islées psitives pur les gènes stx et le gène eae : présence de suches STEC prvquant des lésins d attachement et d effacement dans la prise d essai de x g u x ml. Suches d E. cli islées psitives pur les gènes stx et le gène eae ainsi que pur les gènes assciés à l un des sérgrupes O26, O103, O111, O145 et O157 : présence de suches STEC du sérgrupe XX dans la prise d essai de x g u x ml. 56

65 Schéma d analyse Recherche des E. cli shigatxines psitives par RT-PCR Préparatin de l échantilln Prise d essai x g (u ml) + 9x ml EPT* (+ acriflavine (10mg/l) pur les prduits laitiers) Viande crue de bœuf : Incubatin 10 ± 2h; 41.5 ± 1 C Autres prduits : Incubatin 18 ± 2h; 37 ± 1 C Prduits laitiers Viande crue de beuf Autres prduits Transférer 1ml de culture dans un micrtube stérile Centrifuger 5 à 500g ± 50g à température ambiante Préparatin de la PCR Transférer 900µl du surnageant dans un tube de lyse Centrifuger 5 à 10000g ± 250g à température ambiante Eliminer le surnageant Suspendre le cult dans 200µl de tampn de dilutin Transférer 50µl de culture dans un tube de lyse Lyse : 10 à 100 C Analyse RT-PCR RT-PCR En cas de résultat psitif pur un gène stx : - effectuer l analyse RT-PCR pur sértypage mléculaire.(détectin présumée) disque EHEC - envyer un aliqut du milieu enrichi envyé au labratire de cnfirmatin *Pur les swabs + 100ml EPT 57

66 2.2 PHYTOPATHOLOGIE Les plantes fnt partie intégrante de ntre écsystème terrestre. Eléments indispensables au maintien de l équilibre cnditinnant la vie telle que nus la cnnaissns, les plantes snt aussi un mailln crucial dans la chaîne alimentaire et leur (nn-)dispnibilité a des répercussins imprtantes sur ntre sciété humaine, ntamment sur les plans de l écnmie et de la santé publique. S assurer de la bnne santé des plantes représente un enjeu capital. Pur ce faire, une surveillance rigureuse et bien rganisée est de mise, afin de limiter la prpagatin des dégâts en cas de prblème. Cette surveillance implique la cnnaissance des rganismes phytpathgènes et la dispnibilité de méthdes d analyse pur pser un diagnstic. Dans le premier chapitre qui suit, les grandes catégries d rganismes phytpathgènes snt présentées, tandis que les méthdes d analyses actuelles snt dévelppées dans le chapitre deux. Enfin, quelques exemples d applicatin en labratire snt brièvement présentés dans le chapitre tris Les rganismes phytpathgènes Les maladies des plantes résultent de perturbatins causées par des facteurs nn-vivants u vivants. Dans la première catégrie, il s agit par exemple de mdificatins nn adaptées de la température, du taux d humidité, de la luminsité, des sels minéraux, etc. Ces facteurs snt en général facilement maîtrisables dans le cadre du suivi des cultures. Dans la deuxième catégrie, il s agit d rganismes dits «phytpathgènes». Il en existe différents types, généralement assciés aux ensembles taxnmiques suivants : bactéries et mllicutes, champignns, nématdes, insectes et autres arthrpdes, virus et virïdes. Les bactéries et mllicutes : ces rganismes appartiennent au grupe des prcarytes, ç-àd. Dépurvus de nyau cellulaire. Les bactéries pssèdent une pari rigide tandis que les mllicutes (littéralement «peau mlle») en snt dépurvus. Parmi les mllicutes, n distingue les phytplasmes (= mycplasmes pathgènes de plantes) et les spirplasmes (= mllicutes spiralés). L absence de pari chez ces dernières leur cnfère une sensibilité diminuée aux antibitiques, mais une plus grande fragilité, ntamment par rapprt à la pressin smtique. Les bactéries nt une taille turnant autur de 1-2 µm tandis que les mllicutes les plus petits mesurent 0,1 µm. Le génme des mllicutes est également de taille inférieure. Dans la classificatin taxnmique de ces rganismes interviennent les ntins de pathvar et de race. La pathvar (pv.) Est, au sein d une espèce, un grupe mntrant une spécificité parasitaire vis-à-vis d un type de plante dnnée, par exemple Pseudmnas syringae pv. Tabaci. La race u bitype est, au sein d un pathvar, un grupe qui n attaque que des cultivars dnnés d une espèce végétale. On parlera aussi de bivars quand la classificatin repse sur des différences d activité métablique. Les micrrganismes nt une capacité imprtante de survie dans divers milieux (terre, eau, plantes-réservir, ), snt facilement prpagés (y cmpris par l air et les insectes) et clnisent extrêmement vite les tissus végétaux d intérêt. 58

67 Les maladies causées par les bactéries snt variées, cmme par exemple des galles (genre Agrbacterium) (figure 2.2.1a), des purritures (ex. Ralstnia slanacearum respnsable de la purriture brune de la pmme de terre), des flétrissements (ex. Clavibacter michiganensis sur tmate) u encre des nécrses (ex. Pseudmnas syringae pv. Phaselicla sur harict). Les phytplasmes se lcalisent presqu exclusivement dans les cellules du phlème (figure 2.2.1b) et affectent l appareil reprducteur et végétatif des plantes, causant nanisme, jaunisse, «balais de srcières» (crissance anarchique), défrmatin des fruits, etc. les spirplasmes parasites snt mins bien cnnus, seules deux maladies snt décrites, dnt le nanisme du maïs. Les mllicutes snt transmis par les insectes et difficiles (si pas impssible) à cultiver en cnditins artificielles. Figure 2.2.1a : Pht de gauche : bactéries Agrbacterium tumefaciens vues au micrscpe électrnique à balayage. Pht de drite : tumeurs induites par A. tumefaciens sur plante. Figure 2.2.1b : Pht de gauche : phytplasmes (flèches) de la maladie du jaunissement de l Aster à balais de srcière (Aster yellws Witches brm u AY-WB) bservés au micrscpe électrnique à transmissin dans une cupe de cellules (se1 et se2) du phlème (canaux cnducteurs de la sève) d une feuille d Aster. Barre d échelle = 1µm. Pht de drite : Aster en bnne santé (gauche) et Aster infecté par le phytplasme AY-WB. 59

68 Les champignns : il s agit d un grupe hétérgène d eucarytes (à nyau cellulaire) dnt le pint cmmun est la nutritin hétértrphe («hétér» autre et «trphe» nurriture) par absrptin. Près de la mitié des maladies des plantes snt causées par des champignns phytpathgènes, parmi lesquels n dénmbre plus de espèces cnnues. Leur taille va de quelques micrmètres à plusieurs millimètres, vire centimètres. La majrité des champignns a la pssibilité de se reprduire tant de manière sexuée qu asexuée. Les spres sexuées représentent en général les surces d inculum primaire, assurant le maintien de l existence de la maladie. Les spres asexuées snt prduites en grand nmbre pur la dispersin de la maladie. Tris grand grupes peuvent être cnsidérés : les champignns à plasmde (cellule amibïde plynuclée dépurvue de pari) : parasites bligatires des plantes supérieures, attaquant surtut les rganes suterrains et les tiges, et juant un rôle en tant que vecteurs de virus. Exemple : Plymyxa betae, vecteur du virus de la rhizmanie de la betterave (Figure pht de gauche). les champignns à thalle filamenteux cencytique (c-à-d. mycelium nn clisnné) : prvquent diverses maladies telles que des fntes de semis (purritures des graines et jeunes plantules), des purritures racinaires sur plantes ligneuses u herbacées, des mildius (ex. Plasmpara viticla sur la vigne) (Figure pht du milieu), des ruilles blanches. Ils attaquent aussi les parties aériennes des plantes. les champignns à thalle filamenteux septé u «champignns vrais»: causent une multitude de maladies telles que des défrmatins d rganes (ex. Taphrina defrmans causant la clque du pêcher), des ïdiums (dépôt blanchâtre à la surface de l hôte), des chancres (ulcères entraînant la réductin de crissance vire la mrt), des attaques sur fruits (ex. Claviceps purpurea u ergt de seigle, tavelures du pirier, ), des maladies vasculaires avec flétrissements, des ruilles (pustules sur feuilles et tiges) u encre des charbns (ex. Tilletia causant la carie du blé) (Figure pht de drite). Figure : Pht de gauche : Rhizmanie de la betterave causée par un virus transmis par le champignn Plymyxa betae. Pht du milieu : attaque d une vigne par le mildiu Plasmpara viticla. Pht de drite : maladie de la carie du blé causée par Tilletia indica. 60

69 Les nématdes : appellés aussi «vers rnds», ces eucarytes frment un grupe assez hmgène quant à leur mrphlgie - à savir d apparence vermifrme cmprise entre 0,2 et 12 millimètres (pur les phytpathgènes) (figure 3 pht de gauche) avec une épaisse cuticule - mais hétérgène quant au mde de vie. Ils peuvent vivre dans le sl, l eau, u encre parasiter des animaux u des végétaux. Ils pssèdent un tractus génital, et la reprductin se fait via pnte d œufs. Il existe différents stades juvéniles et un stade adulte, entre lesquels se prduisent des mues. Ils pssèdent aussi un tractus digestif et certains snt capables de «mrdre» le tissu végétal à l aide de dents u d un stylet afin d y injecter des enzymes digestives. D autres entrent carrément dans les cellules de l hôte. Par ailleurs, ils pssèdent une musculature permettant la mbilité. Ils ne pssèdent pas de systèmes circulatire et respiratire. Leur recnnaissance sur base visuelle nécessite un bn entraînement. Ils causent divers prblèmes aux cultures, cmme des prblèmes de crissance (nanisme), des diminutins de rendement, vire la mrt. Ils snt aussi vecteurs d autres maladies. Parmi les nématdes les plus prblématiques, n distingue ntamment les nématdes à kyste (ex. Glbdera rstchiensis et Glbdera pallida) et les nématdes à galles (ex. Melidgyne chitwdi et Melidgyne fallax). Les kystes résultent de la transfrmatin de la femelle après fécndatin : la femelle meurt et sn crps cnstitue un sac rempli d œufs (jusqu'à 1000!). Les kystes peuvent être visibles à l œil nu, sus frme de petites bules jaunes u brunes lcalisées sur les racines (ex. Plants de pmme de terre) u dans le sl (figure pht du centre). Les kystes snt extrêmement résistants, même à des températures basses, et nt une viabilité puvant atteindre ans. Les galles les galles apparaissent sur les racines et tiges suterraines (rhizmes ex. Tubercules de pmme de terre), sus frme de bsses et prtubérances (figure pht de drite). Figure 2.2.3: Pht de gauche: Nématdes du pin; la barre d'échelle représente 100 µm. Pht du milieu: kystes de Glbdera rstchiensis sur racines. Pht de drite: galle sur cartte prvquée par Melidgyne fallax. 61

70 Les insectes et autres arthrpdes : une grande diversité d'arthrpdes est nuisible aux végétaux, sit de manière directe, en tant que phytphages (ç-à-d. Qui mangent les tissus végétaux) sit indirecte, en transmettant des maladies (par ex. Des virus et bactéries phytpathgènes). Il peut aussi s'agir des deux à la fis. Les phytphages peuvent s'attaquer à différents tissus: feuilles (phyllphages), tiges (cauliphages), racines (radiciphages), butns flraux et fleurs (flriphages), fruits (frugiphages), bis (xylphages), etc. Leur appareil buccal est adapté à la fnctin, par exemple de type piqueur-suceur u capable de mrdre et bryer. Tant les frmes adultes que juvéniles snt susceptibles d'attaquer les plantes. Les larves de papillns, appellées vulgairement chenilles, snt ntamment des terribles ravageurs de cultures. Plusieurs rdres d'insectes snt phytpathgènes, citns par exemple les lépidptères (papillns et chenilles, ex. la teigne du bananier (figure pht du centre)), les cléptères (ex. le dryphre, le capricrne asiatique (figure pht de gauche)), les rthptères (ex. le criquet), les hémiptères hmptères (ex. le pucern, la cicadelle), les hémiptères hétérptères (ex. la punaise), les thysanptères (ex. le thrips, appellé aussi "bête d'rage"), les diptères (ex. la muche du chu), les hyménptères (ex. le cynips du chataîgnier), etc. Dans le grupe des arthrpdes, à côté des insectes, n retruve par exemple des acariens nuisibles cmme les tetranyques (ex. araignée ruge) (figure pht de drite). Le diagnstic passe au mins par une bservatin, de préférence au micrscpe, par du persnnel expérimenté. Figure 2.2.4: Pht de gauche: Anplphra u Capricrne, insecte phytphage cléptère. Pht du centre: larve de Opgna sacchari u teigne du bananier, insecte phytphage lépidptère. Pht de drite: Tetranychus urticae u araignée ruge, acarien phytphage. Les virus et virïdes : les virus snt des entités cmpsées d'acides nucléiques (ADN u ARN) cntenus dans une envelppe de prtéines appelée capside. Dans de rares cas, la capside inclu en utre des lipides u une enzyme arn plymérase. La taille des virus phytpathgènes varie en myenne de quelques dizaines à quelques centaines de nanmètres, mais peut atteindre 2 µm pur les frmes allngées. Dans ce dernier cas, n parlera de frmes filamenteuses; mais il existe aussi des frmes ismétriques (par ex. de type hexagnale), des frmes glbuleuses, des frmes de bâtnnets, etc. (figure 2.2.5a). 62

71 Les virïdes snt structurellement plus simples que les virus, puisqu'ils snt cnstitués exclusivement d'une mlécule d'arn circulaire de maximum 400 nuclétides. Leur détectin ne peut se faire que par des méthdes mléculaires (ex. PCR) et nn par bservatin au micrscpe cmme c'est le cas pur les virus. Virus et virïdes snt des parasites intracellulaires bligatires de cellules vivantes, dnt ils utilisent la machinerie métablique (facteurs de réplicatin, transcriptin, traductin) pur se multiplier. Les virus et virïdes se déplacent dans la plante sit en passant de cellule en cellule via les plasmdesmes (canaux intercellulaires de cmmunicatin entre cytplasmes), sit sur des plus lngues distances via le phlème (canaux de circulatin de la sève élabrée). Pur faciliter le passage intercellulaire, les virus utilisent des prtéines de muvement, qui plymérisent éventuellement en tubules. Le passage de plante à plante se fait sit par transmissin verticale (d'un plant mère à la descendance par multiplicatin végétative), sit par transmissin hrizntale, ç-à-d. par cntact au site d'une blessure, par greffe, par l'intermédiaires de vecteurs cmme des champignns, nématdes, acariens, insectes, etc. Les virus phytpathgènes snt classés dans cinq grupes, définis sur base du type d'acide nucléique et des stratégies de réplicatin: GROUPE 1 : VIRUS À ARN MONOCATÉNAIRE (= SIMPLE BRIN) MESSAGER (POSITIF +) GROUPE 2 : VIRUS À ARN BICATÉNAIRE (= DOUBLE BRIN) GROUPE 3 : VIRUS À ARN MONOCATÉNAIRE ANTIMESSAGER (NÉGATIF -) GROUPE 4 : VIRUS À ADN MONOCATÉNAIRE GROUPE 5 : VIRUS À ADN BICATÉNAIRE AVEC ARN INTERMÉDIAIRE. La majrité des virus phytpathgènes se truvent dans le grupe 1. A l'intérieur des cinq grupes, des sus-classements (familles, genres, espèces, etc.) Prennent encre en cmpte la mrphlgie, les prpriétés du génme (nmbre de prduits cdés, hmlgies de séquences, ), les prpriétés bilgiques (type d'hôte, mde de transmissin, ) et les prpriétés sérlgiques (type de prtéines). Les virïdes phytpathgènes snt classés dans deux grupes: les pspviridae (cntenant la majrité des virïdes) et les avsunviridae. L'infectin virale tuche sit des rganes précis de la plante (ex. système vasculaire) sit la plante entière. Les symptômes quand ils snt visibles - snt variés: cmme des changements de culeur, des malfrmatins, des nécrses, etc. Citns quelques exemples de virus et virïdes: ALFALFA MOSAÏC VIRUS (AMV) (Figure 4.2.5a pht de gauche), grupe des ARN mncaténaires (+), famille des Brmviridae, genre Alfamvirus, respnsable de maladies chez diverses plantes cmme par exemple la msaïque de la lucerne, la nécrse de la pmme de terre et de la tmate (Figure 4.2.5b pht de gauche). CITRUS PSOROSIS VIRUS (CPSV), grupe des ARN mncaténaires (-), famille des Ophiviridae, genre Ophivirus, cause des dmmages aux arbres du genre Citrus, cmme par exemple des crevasses de l'écrce du trnc des rangers (Figure 4.2.5b pht du centre) et des taches fliaires. 63

72 TOMATO YELLOW LEAF CURL VIRUS (TYLCV), grupe des ADN mncaténaires, famille des Geminiviridae, genre Begmvirus, respnsable de la maladie des feuilles jaunes en cuillère de la tmate, impliquant des défrmatins, des limitatins de crissance et des pertes de rendement en fruits. POTATO SPINDLE TUBER VIROID (PSTVD), grupe des virïdes, attaque les tmates et pmmes de terre, dnnant des plants rabugris, à crissance plus lente, des tubercules défrmés et plus petits (Figure 4.2.5b pht de drite), une nécrse u une taille anrmalement petite des feuilles, vire un dépérissement. Figure 2.2.5a : Images de différents virus phytpathgènes, négativement clrés et bservés au micrscpe électrnique à transmissin, illustrant quelques mrphlgies pssibles. Image de gauche : Alfalfa msaïc virus. Image du milieu : Tbacc msaïc virus. Image de drite : Tmat bushy stunt virus. Tutes les images résultent d un agrandissement x. Figure 2.2.5b: Pht de gauche: maladie du virus Alfalfa msaïc sur plant de tmates. Pht du centre: attaque de l'écrce d'un ranger par le virus Citrus psrsis. Pht de drite: tubercules de pmme de terre de plants infectés par le Ptat spindle tuber virïd (partie gauche de la pht) dnt la taille est anrmalement réduite cmparé aux tubercules de plants sains (partie drite de la pht). Autres rganismes phytpathgènes: mises à part les cinq catégries citées cidessus, il existe encre d'autres rganismes ennemis des plantes, marginaux u peu décrits. Parmi ceux-ci, n retruve des prtzaires (animaux unicellulaires) de type trypansmatides (même catégrie que le pathgène de la maladie du smmeil!), cmme par exemple les prtzaires laticifères causant des atrphies du manic. On truve par ailleurs des plantes parasites d'autres plantes: il s'agit de plantes à fleurs qui nt perdu leur auttrphie au curs de l'évlutin, et qui déturnent l'eau, les glucides et sels minéraux de la plante-hôte à l'aide de structures aspirantes appelées suçirs. Un exemple cnnu est celui du gui (prte-bnheur sus lequel n s'embrasse traditinnellement au nuvel-an!) Parasite de cnifères. 64

73 2.2.2 Les méthdes d analyse en phytpathlgie La première apprche d un végétal malade, lrs de sa décuverte, est avant tut visuelle. L apparence anrmale u le dépérissement de la plante u de parties précises de celle-ci cnstitue suvent le premier signal d alerte de l existence d une pathlgie. Des symptômes caractéristiques de maladies bien cnnues, vire la présence sur le végétal de parasites clairement visibles, cntribuent plus u mins frtement à l rientatin du diagnstic. Ceci cncerne principalement les insectes, qui laissent apparaître des indices plus u mins flagrants, cmme par exemple : attaque typique des tiges, présence de larves sur graines, grsses masses blanches de cchenilles, défrmatin caractéristique «en rsette» de l extrêmité des pusses assciée à la présence de miellat, mines (galeries) dessinant des frmes particulières sur les feuilles, anneau de tissu abîmé autur de l apex des fruits, peltes fécales sur des galles, psitin spéciale du crps de l insecte, etc. Tutefis, un diagnstic certain et définitif, uniquement sur base visuelle des symptômes, n est pas tujurs facile et fiable. La majrité des maladies chez les plantes entraînent des symptômes généraux nn caractéristiques (flétrissement, jaunissement, apparitins de taches, de duvet, de reliefs, détériratin des tissus, limitatin de la crissance, etc.) puvant entraîner la cnfusin. Par ailleurs, certaines pathlgies ne laissent pas apparaître des symptômes facilement détectables, et dans certains cas, les symptômes peuvent même être absents, par exemple pendant une phase de latence (exemple : phase latente du feu bactérien sur piriers en hiver). Ceci étant, des tests apprfndis en labratire s impsent dans la plupart des cas. En phytpathlgie, les méthdes d analyse actuelles snt diversifiées, et en dévelppement cntinu. A côté des méthdes simples et classiques, auquel n recurt encre aujurd hui, des méthdes plus sphistiquées snt adaptées u dévelppées à l attentin des phytpathlgistes. Dans le premier pint qui suit, les principales méthdes classiques snt présentées, et dans le deuxième pint, quelques méthdes plus mdernes u en prjet Méthdes classiques Bitests sur plantes et phytpathgénicité Parmi les méthdes de diagnstic en phytpathlgie, un grand classique est le bitest sur plantes. Des plantes indicatrices snt inculées à partir d un échantilln suppsé cntaminé par un pathgène dnné, et après une péride d incubatin, les plantes snt analysées afin de déceler des symptômes de maladie (Figure 6). L bservatin peut se faire à l œil nu, cnsidérant l état général de la plante, u bien par analyse micrscpique des tissus végétaux, après traitement clrant, afin de mettre en évidence des znes abîmées plus discrètes. Les plantes test peuvent aussi être utilisées pur multiplier le suppsé pathgène, et ensuite mettre en évidence sa présence avec plus d aisance, en l islant à partir des plantes après incubatin. Des autres méthdes snt alrs utilisées, cmme l islement sur milieu de culture et la PCR, ntamment. 65

74 Figure : Test de phytpathgénicité sur plants de vigne de cépage Cabernet Sauvignn. Dans le bassin de gauche, des plants inculés avec la misissure Phaemnella chlamydspra, et dans le bassin de drite, des plants cntrôle, inculés avec de l eau stérile Tests nutritinnels Le prfil d utilisatin des nutriments, et plus précisément les surces de carbnes, peut cnstituer un indicateur de l identité des micrrganismes, en général pur les bactéries et champignns. Actuellement, il existe des kits cmmerciaux pur btenir plus u mins rapidement (de quelques heures à quelques jurs) le «prfil métablique» d un micrrganisme étudié. Nus reprenns ici les exemples des systèmes BIOLOG et des galeries API Mrphlgie sur milieu de culture Quand cela est envisageable, c est-à-dire pur les bactéries et les champignns, une des premières manipulatins qui s impse naturellement est l islement et la multiplicatin du phytpathgène d intérêt en labratire. Il devient alrs accessible en quantité illimitée, et peut être sumis à une batterie de tests. L islement cnstitue déjà suvent en lui-même un test, car la vitesse de crissance de l rganisme islé et la mrphlgie qu il laisse apparaître rientent plus u mins frtement le diagnstic. En effet, une variété de frmes, culeurs, deurs, textures, tailles, etc. existent au niveau des bactéries et misissures pathgènes des plantes. Plusieurs renseignements peuvent être cumulés grâce à l usage de différents milieux de culture ; il existe des milieux nn sélectifs, semi-sélectifs, ttalement sélectifs en fnctin par exemple des nutriments dispnibles, u encre de la présence d un inhibiteur tel qu un antibitique auquel résiste nrmalement l rganisme d intérêt, etc. La prductin stimulée de mlécules faciles à détecter, cmme par exemple des pigments, des flurchrmes u des plysaccharides, est d une aide précieuse. Cette méthde est en général facile à mettre en œuvre et abrdable au niveau des prix. Par cntre, elle ne suffit pas tujurs pur prnncer le diagnstic définitif. 66

75 Analyse visuelle à la lupe u au micrscpe Un autre analyse qui va de si est l bservatin directe de l rganisme, à l œil nu, à la lupe u au micrscpe. L bservatin à l œil nu u à la lupe cncerne les insectes, nématdes et misissures. Les structures mrphlgiques snt passées au peigne fin, avec un suci du détail prnncé, car la différence entre 2 espèces (u autre niveau taxnmique) tient parfis à une caractéristique discrète de la mrphlgie. Pur les insectes et les nématdes, des dessins et clefs de déterminatin snt ntamment dispnibles dans la littérature. Un dissectin sus micrscpe est envisageable, u encre un pré-traitement (fixatin, clratin, ) pur faciliter l analyse Analyse des acides nucléiques Technlgie mise au pint dans les années 1980, la PCR pur «Plymerase Chain Reactin» cnsiste à répliquer en un grand nmbre de cpies une séquence d ADN ciblée, à l aide d une enzyme ADN plymérase. Cette mise en évidence peut servir de preuve de la présence d un rganisme pur lequel cette séquence d ADN est spécifique, dans le cntexte diagnstic. La PCR est extrêmement ppulaire, vire la technique la plus utilisée actuellement en bilgie mléculaire. Elle est applicable à tus les vivants, dès lrs qu n dispse d ADN u d ARN. C est une méthde sensible, car même une infime quantité d ADN deviendra détectable après la réactin d amplificatin. C est aussi une technique relativement rapide : en quelques heures, le résultat peut être dispnible. Au niveau du cût, cela reste raisnnable, dès lrs qu n a acheté le thermcycleur (quelques milliers d eurs) et le matériel d électrphrèse (quelques centaines à quelques milliers d eurs). Les réactifs (enzymes, nuclétides) snt faciles à truver dans le cmmerce. Les amrces snt sit vendues pré-définies (par exemple sus frme de kit, pur l amplificatin de tel gène chez tel rgansime), sit à définir au chix par le client, et synthétisées par une firme. La PCR présente aussi quelques désavantages : beaucup de prtcles nécessitent encre une étape préliminaire d extractin d ADN à partir de l rganisme étudié, augmentant la durée d expérience, et faisant appel à des méthdes d extractin pas tujurs simples d utilisatin (par exemple des techniques de purificatin de l ADN faisant appel à des slvants délicats à manipuler tels que le phénl, etc.). Une autre difficulté est qu il faut en général cnnaître au mins partiellement la séquence de la zne génmique que l n suhaite amplifier, afin de définir les amrces de PCR, alrs que la séquence des génmes de tus les vivants n est pas encre dispnible. Un autre prblème ptentiel, en raisn de la sensibilité de la technique, est le risque de cntaminatin ; en effet, il suffit de l intrductin malencntreuse d une tute petite quantité d ADN dans le tube test pur btenir un faux psitif. A l inverse, la réactin PCR peut dans certains cas être inhibée par des mlécules nn suhaitables dans le tube, cmme par exemple des cmpsés phénlés présents dans les extraits de plantes sur lesquelles n cherche à mettre en évidence la présence d un rganisme phytpathgène ; n btient alrs des résultats faussement négatifs. De mutiples cntrôles divent dnc être intégrés à une expérience de PCR. Il est difficile de recenser tus les travaux dans la littérature ayant fait appel à la PCR, pur le diagnstic des maladies des plantes. A titre indicatif, si l n entre les mts clés «PCR» + «plant» + «pathgen» dans un mteur de recheche tel que Pubmed (www.ncbi.nlm.nih.gv/sites/entrez), n btient 1272 références de publicatins. 67

76 La PCR est une méthde dnt il est désrmais difficile de se passer pur les diagnstics. Elle reste encre à dévelpper pur certains rganismes phytpathgènes (y cmpris les nématdes et les insectes), et cnnaît par ailleurs des améliratins extrardinaires (vir plus lin Variantes de la PCR ) Analyse des prtéines Le cntenu en prtéines d un individu est aussi une bnne surce de renseignements pur l rientatin du diagnstic. En principe, cette technique dit puvir s appliquer à tus les phytpathgènes. Les prtéines snt extraites et sumises à une analyse, généralement l une des 2 suivantes: prfil général des prtéines ttales après séparatin par électrphrèse détectin d une activité enzymatique particulière Méthdes chimiques et analyse des acides gras A côté des méthdes mléculaires ciblant l ADN et l ARN, et les méthdes ciblant les prtéines, il existe des analyses chimiques, chrmatgraphiques et spectrscpiques, ciblant des métablites et cmpsés tels que des sucres, des lipides et acides gras et des mlécules vlatiles (pur ce dernier, vir plus lin à prps du nez électrnique) Sérlgie Les techniques sérlgiques snt assez fréquemment utilisées, en parallèle des techniques mléculaires. Elles snt tutes basées sur l utilisatin d anticrps dirigés cntre des antigènes spécifiques du phytpathgène recherché. Différentes méthdes existent, nus en décrivns tris ciaprès: sér-agglutinatin, ELISA et immunmarquage Méthdes mdernes Séquençage Le génme déterminant l identité de chaque rganisme, la cnnaissance de celui-ci, sus frme de séquences de nuclétides, pur chaque pathgène, est un atut majeur dans le dmaine du diagnstic des maladies, y cmpris les maladies des plantes. Dans ce cntexte, le séquençage des génmes amène 2 types d infrmatins, suite à un travail de cmparaisn des séquences dispnibles: d une part, les éléments cmmuns entre les différents génmes séquencés permettent des rapprchement entre individus, c est-à-dire le psitinnement dans un arbre phylgénétique, et d autre part, la décuverte de nuvelles séquences/mutatins génmiques, uniques à un grupe d rganismes dnné, uvrent la vie au dévelppement d utils mléculaires pur le diagnstic de rutine, cmme par exemple la PCR. 68

77 Barcding L idée ambitieuse du «barcding» est d attribuer à chaque vivant cnnu sur Terre un cde-barre unique, sus frme d une u plusieurs curtes séquences d acides nucléiques, caractéristique(s) du génme de cet individu, de la même manière que snt assciés des cde-barres numériques aux prduits du cmmerce! En phytpathlgie ntamment, ces cde-barres snt d une grande utilité, car ils facilite(r)nt l apprche diagnstic, au niveau de l utilisatin des technlgies mléculaires La technlgie du nez électrnique Le nez électrnique est un appareil qui cntient différents senseurs capables de recnnaître diverses mlécules rganiques vlatiles à partir d une mixture armatique. Le signal de chaque senseur est réceptinné et analysé de manière infrmatique via un réseau neural artificiel, transfrmé en empreinte digitale, et la cmbinaisn des différentes empreintes crrespndant à la mixture dnne un prfil u «signature armatique» qui est identifié par cmparaisn avec une banque de signatures pré-encdées. Ce type d appareil n est pas nuveau, mais sn utilisatin s est jusqu ici en général limitée aux cntrôles qualité dans le secteur alimentaire (vérificatin de la fraîcheur des aliments, recherche de cntaminatins de la viande, ) u médical (recherche de pathgènes dans des tissus humains malades, ). L idée d utiliser cette machine cmme util diagnstic pur les maladies des plantes est assez récente (Figure 2.2.7), illustrée par quelques publicatins ces dernières années. Figure : Exemple de mntage d un nez électrnique sur le terrain dans le cadre d une analyse en phytpathlgie. 69

78 Micrarrays (Puces à ADN) en tant que nuvel util de diagnstic La technique des micrarrays est basée sur un principe d hybridatin entre des séquences d acides nucléiques cmplémentaires. Ces séquences snt, d une part, des brins d ADN greffés de manière régulière sur une lame de verre, tus différents et crrespndant à des régins génmiques variées d un rganisme d intérêt, représentant si pssible tus ensemble le génme cmplet de l rganisme, et d autre part, des brins d ADN libres, auxquels n a vlntairement greffé des mlécule d un flurchrme Analyse du pint isélectrique : capillary iselectric fcusing La technique de capillary iselectric fcusing (CIEF) cnsiste à séparer des éléments sur base de leur pint isélectrique, en les faisant migrer dans un capillaire de silice (de l rdre de 100 micrmètres de diamètre), dans lequel un gradient de ph est installé par l applicatin d un curant électrique sur une série d amphlytes ayant des valeurs de pint isélectrique différentes (résultant en un ph acide à l ande et basique à la cathde). Le principe est que la substance s arrête de migrer dès que sa charge glbale est nulle, ce qui se prduit à un ph dnné. L élément étudié peut être par exemple une prtéine mais aussi une bactérie intacte! Variante des tests en sérlgie : Lateral Flw Device Les tests sérlgiques nt pruvé leur efficacité en matière de diagnstic, et restent parmi les favris. Dès lrs, ils n échappent pas à la tendance actuelle, rientée vers la mise au pint de tests tujurs de plus en plus simples et rapides, avec le maintien dans la mesure du pssible d un bn niveau de sensibilité et de spécificité. Nus décrivns ici un test ultra-simple tentant de répndre à ces critères : le Lateral Flw Device u «LFD». Littéralement, il s agit d un dispsitif à flux latéral, se présentant sus 2 frmes pssibles : sit la tigette, sit le dispsitif type «test de grssesse» Variantes de la PCR A côté de la PCR classique (vir supra), inspirées du principe de cette technlgie, des variantes existent désrmais, dévelppées en vue d amélirer des critères capitaux cmme la sensibilité, la spécificité, la rapidité, la facilité, etc. Ci-après, nus décrivns quelques-unes de ces méthdes Analyses acustiques Une nuvelle méthde riginale récemment prpsée est la recnnaissance d insectes xylphages directement sur les lieux suspectés cntaminés, via l écute des bruits prduits par ces pathgènes, dnt la signature est caractéristique pur chaque type d rganisme dnné. Ces bruits peuvent résulter des muvements de l insecte, u encre des mrsures de celui-ci dans le bis. 70

79 Imagerie satellite Le principe de cette méthde est de surveiller par imagerie satellite à haute définitin l état des plantatins et frêts du glbe. En effet, certaines maladies entraînent des symtpômes ptentiellement détectables à partir d un pint d bservatin suffisamment éligné pur avir une vue d ensemble : par exemple, le nématde des pins entraîne un brunissement général assez rapide (envirn 3 mis) des frêts infectées. Par ailleurs, le spectre infraruge (réflectance) émis par la végétatin se mdifie en cas de maladie. Le dévelppement de cette méthde est en prjet au Ryaume-Uni (Rutherfrd Appletn Labratry) Exemples d applicatin dans le cntexte AFSCA Au niveau de l'afsca, les phytpathgènes cntrôlés snt ceux de quarantaine, qui snt désignés "paramètres phytsanitaires". Il s'agit d'rganismes dnt il faut à tut prix éviter l'intrductin sur le territire, u au pire limiter la disséminatin et tenter d'éradiquer les fyers, car ils représentent une grande menace pur les cultures et plantatins. Chaque année, la liste est revue (par la DG plitique de cntrôle) et cmmentée par le Labratire Natinal de référence. Pur l'année 2012, 41 paramètres précis nt été fixés pur des recherches ciblées, ainsi que des listes génériques de bactéries, virus, champignns, nématdes et insectes pur des recherches plus générales face à tut végétal malade, ntamment lrsqu'ils snt imprtés. Citns quelques exemples de paramètres appartenant à la liste des cibles: Champignns: Claviceps purpurea (ergt de seigle) sur céréales, Guignardia citricarpa sur citrus, Phytphtra kernviae sur plantes de type Rhddendrn, Bactéries: Ralstnia slanacearum sur pmme de terre, plantes et eaux de surface, Erwinia amylvra sur rsacées, Xanthmnas fragariae sur fraisiers, Phytplasmes: Apple prliferatin mycplasm sur plantes ntamment de type pmmier et pirier, Pear decline mycplasm sur plantes telles que le pirier, Virus: Plum px virus (Sharka) sur arbres fruitiers à nyau type prunus, Pepin msaïc virus sur tmates et autres plantes, Tmat sptted wilt virus sur tmates et autres plantes, Virïdes: tus virïdes du grupe des Pspivirïdes Nématdes: Glbdera spp. sur terre, Melidgyne chitwdi sur pmmes de terre et autres plantes, Ditylenchus dipsaci (parasite de plants d'ignns) sur terre, Insectes: Anplphra chinensis (Capricrne asiatique) sur plantes et bis, Diabrtica virgifera virgifera (Cléptère chrysmèle des racines du maïs) dans les pièges à phérmnes, Opgna sacchari (lépidptère teigne du bananier), Tutes les analyses snt réparties dans 5 labratires: 2 LABO'S EXTERNES FORMANT LE LNR maladies des plantes: l'ilvo situé à Merelbeke: tutes catégries de phytpathgènes le CRA-W situé à Gemblux: virus, virïdes, champignns et phytplasmes 71

80 1 LABO EXTERNE SUPPLEMENTAIRE: le BLGG situé aux Pays-Bas (à partir de 2009): pur les nématdes et une misissure de plants d'ignns 2 LABO'S INTERNES: le LFSAM: pur les nématdes drés Glbdera spp. le LFSAGx: pur la bactérie du feu bactérien Erwinia amylvra et les purritures brune (Ralstnia slanacearum) et annulaire (Clavibacter michiganensis sepednicus) de la pmme de terre. Les méthdes utilisées dans les différents labratires varient seln le type d'rganisme: n retruve par exemple beaucup d'analyses micrscpiques pur les insectes et les nématdes, beaucup de PCR u RT-PCR pur la virlgie et la myclgie, de la culture sur milieu pur la myclgie et la bactérilgie, etc. Ainsi, les techniques dites "classiques" snt encre beaucup utilisées actuellement, même pur des rganismes de quarantaine. 72

81 2.3 PCR et OGM Fndements de la bilgie La cellule Nus cnstatns que pratiquement tus les êtres vivants snt cnstitués d une u de plusieurs cellules (les virus peuvent dans ce cntexte être cnsidérés cmme des parasites extrêmes). Ces cellules pssèdent tutes une structure fndamentalement identique et utilisent des mlécules assez analgues pur remplir des fnctins dans la cellule. D une manière plus précise, nus puvns partager les cellules en deux grands grupes sur base de la structure interne : La cellule prcaryte : le type de cellule le plus simple qui a été décuvert chez les micrrganismes des grupes Eubactéries et Archébactéries. La cellule prcaryte ne pssède pas de structure interne (il y a des exceptins telles que les cyanbactéries) et peut être plus simplement représentée cmme une membrane cellulaire, avec à l intérieur, du cytplasme, un agglmérat de mlécules qui assurent les prcessus de la vie («une pche de mlécules»). Il y a parfis présence de structures externes (flagelles, ). La cellule eucaryte : une cellule avec une structure beaucup plus cmplexe qui a été décuverte chez les unicellulaires (Prtistes), les levures et misissures (Fungi), les plantes (Plantae) et les animaux (Animalia). La cellule eucaryte pssède une structure interne cmplexe : la cellule se cmpse d une membrane avec à l intérieur un cytsquelette avec du cytplasme; ici se retruvent des rganites qui remplissent des fnctins définies. Les rganites les plus imprtants snt : le nyau cellulaire, les mitchndries, les chlrplastes (chez les plantes), l appareil de Glgi, les lyssmes, les vacules,... Des prcessus déterminés de la vie prennent place dans des cmpartiments déterminés : prductin d énergie dans les mitchndries, excrétin dans l appareil de Glgi, dégradatin dans les lyssmes, infrmatin génétique dans le nyau cellulaire, phtsynthèse dans les chlrplastes, cntrôle smtique dans les vacules... Figure Une cellule de bactérie 73

82 Figure Les deux types de cellules eucarytes Pur leur structure et leur fnctinnement, les cellules utilisent un nmbre limité de mlécules de base. Les plus imprtantes de ces mlécules snt les acides aminés, les sucres, les acides gras et les nucletides Acides aminés et prtéines Les prtéines snt des mlécules cmplexes cnstituées d une chaîne d acides aminés. Etant dnné que les acides aminés se différencient par leurs prpriétés chimiques, les prpriétés des prtéines avec une chaîne cnstituée de suites d acides aminés différents se différenciernt par leurs prpriétés. Ainsi, la seule différence de suite d acides aminés fait qu il existe un nmbre quasi indéfini de prtéines ayant des prpriétés différentes. Les acides aminés snt des mlécules dnt la structure de base peut être représentée cmme dans la figure. Dans la figure, R est un chaîne latérale qui diffère d acide aminé à acide aminé, ce grupe détermine des prpriétés telles que la plarité (grupements hydrphiles u hydrphbes), prpriétés acide/base, caractéristiques armatiques, taille dans l espace etc. Dans la nature, n truve une vingtaine d acides aminés «universels» qui snt utilisés par chaque type de cellule. Le squelette de l acide aminé a la structure H 2 N CH(R) COOH. Cette structure cntient un grupement amine et un grupement carbxyle. Entre 2 acides aminés, le grupement amine de l un peut réagir avec le grupement carbxyle de l autre et frmer ainsi un liaisn peptidique : 74

83 Figure : Frmatin d une liaisn peptidique Pareille réactin peut se répéter jusqu à ce que nus btenins de cette manière une lngue chaîne d acides aminés: un plypeptide. Les prtéines diffèrent l une de l autre par la successin d acides aminés : n appelle cette suite la structure primaire. Des parties de la chaîne peuvent prendre une structure dans l espace : la plupart du temps une hélice u une structure en feuillet plissé. C est la structure secndaire de la prtéine. Cette structure secndaire peut également se replier d une manière analgue en une structure tertiaire. C est la structure la plus imprtante chez les enzymes parce que c est dans la structure tertiaire que se frme le centre actif, siège des réactins chimiques. Dans certains cas, le plus suvent en présence de structure cmplexe de prtéines, différentes prtéines peuvent se rassembler et frmer une structure quaternaire. Un exemple cnnu est l hémglbine qui est cnstituée de 4 unités : 2x une prtéine alpha-hémglbine et 2x une prtéine beta- hémglbine. 75

84 Figure : Aperçu des différents niveaux de structure chez les prtéines Nuclétides et acides nucléiques Les nuclétides snt les matériaux de cnstructin de l ARN, de l ADN et de quelques mlécules stckant / furnissant de l énergie (ATP). Les nuclétides snt cnstitués de 3 cmpsants : une base se présentant sus 5 frmes universelles différentes : Adénine (A), Cytsine (C), Guanine (G), Thymine (T) et Uracile (U), un sucre, se présentant dans la nature sus 2 frmes différentes : Ribse en Désxyribse, 76

85 1 à 3 grupements phsphate (mn, di et tri). Un nuclétide est issu de la cmbinaisn d une base avec un sucre, à laquelle un u plusieurs grupements phsphate snt liés. Les nuclétides snt les éléments de cnstructin des acides nucléiques qui snt des mlécules linéaires cnstituées d une chaîne dnt les maillns snt des nuclétides. Tut cmme 2 acides aminés snt reliés par une liaisn peptidique, le grupement phsphate d un nuclétide peut frmer une liaisn avec un grupement sucre d un autre nuclétide et frmer une liaisn sucre-phsphate. Un acide nucléique est une chaîne de nuclétides qui se cmpse dnc d un squelette sucrephsphate avec des bases cmme chaînes latérales. Et cmme chez les prtéines, c est ici aussi la successin des bases qui est caractéristique pur un acide nucléique. Cette successin de bases cntient les infrmatins pur le piltage de la cellule (cntrôle, prductin des prtéines, ) ; les acides nucléiques snt dnc les prteurs d infrmatin dans la cellule. 77

86 Figure : Représentatin schématique d une chaîne d acides nucléiques. En fnctin du type de sucre et des nuclétides présents, nus puvns distinguer deux types d acides nucléiques: ARN acide ribnucléique. Ici se retruvent seulement les bases A, C, G et U (dnc pas T) et le sucre ribse. Une mlécule arn se présente cmme un simple brin; dans les lngues chaînes des interactins entre des parties déterminées peuvent apparaître et L ARN peut prendre une frme dans l espace. Dans la cellule, 3 types d ARN snt présents: ARNm (ARN messager), une lngue chaîne qui est utilisée pur la synthèse des prtéines (vir plus lin), ARNt (ARN de tranfert) qui est utilisé pur le transfert des acides aminés pendant la synthèse des prtéines, et ARNr (ARN ribsmial), ARN qui fait partie des ribsmes, des cmplexes de prtéines ù se réalise la synthèse des prtéines. ADN acide désxyribnucléique. Ici snt présentes seulement les bases A, C, G et T (dnc pas U) et le sucre est le désxyribse. L ADN se présente la plupart du temps cmme une mlécule à duble brin qui est cnstituée de 2 chaînes cmplémentaires l une à l autre : Les bases peuvent frmer des liaisns hydrgène cmme chaînes latérales avec d autres bases. Seulement 2 paires stables peuvent être frmées : A avec T (2 liaisns hydrgène) et C avec G (3 liaisns hydrgène). Cela signifie que 2 chaînes ADN cmplémentaires (chaînes dnt une base A dans une chaîne crrespnd à une base T dans l autre chaîne et une base C à une base G) peuvent frmer une duble chaîne stable par appariement des bases. La structure spatiale d une duble chaîne est une duble hélice : 2 simples brins s enrulent l un sur l autre. Une duble hélice A 2 sillns: un grand et un petit. Une des cnséquences de la frmatin de la duble hélice fait que L ADN est plus stable que L ARN; cela fait de L ADN le prteur idéal de l infrmatin dans la cellule. 78

87 Figure : Structure schématique d une duble hélice ADN (gauche) et la structure dans l espace crrespndante (drite) Figure : Représentatin simplifiée avec des lettres d une chaîne d ADN. Remarquez la cmplémentarité des bases. Un aspect imprtant des chaînes d acides nucléiques est la plarité, un terme qui permet de cmprendre les différences chimiques entre les extrémités des chaînes. Un mrceau d acide nucléique cmprte 2 extrémités : une tête en psitin 5 et un début en 3 (vir Figure 4.3.6). Dans la duble hélice de l ADN, la plarité des 2 brins est ppsée : un brin va de 5 vers 3 tandis que le brin cmplémentaire va de 3 vers 5. Cette plarité est très imprtante pur la lecture d un brin! 79

88 ADN et gènes La fnctin de l acide nucléique dans la cellule est duble : l ADN est l archive qui cntient l infrmatin pur le piltage de la cellule (archive permanente), l ARN est le prteur d infrmatin pur la fabricatin des prtéines ( tempraire après chaque utilisatin, est à nuveau détruit et recyclé). Le principe général est le suivant : l infrmatin de l ADN est cpiée vers l ARN ( prduit dans le nyau des eucarytes), après qui l ARN est lu par les ribsmes pur la synthèse des prtéines : ADN => ARN => prtéine. L étape ADN => ARN est la transcriptin, l étape ARN => prtéine est la traductin. Figure : Schéma de la transfrmatin de l infrmatin ADN en prtéine L ADN cntient l infrmatin pur la fabricatin des prtéines; chaque unité (successin de bases) dans l ADN qui cntient tute l infrmatin pur une prtéine est un gène. La ttalité de tus les gènes dans la cellule est le génme. Un gène cntient : Tutes les infrmatins pur déterminer la successin d acides aminés d une prtéine, L infrmatin pur le cntrôle de la synthèse des prtéines. Chez les eucarytes, l ADN cntient, à côté des parties cdantes effectivement utilisées pur l infrmatin, des parties nn-cdantes qui snt suvent des fssiles mléculaires issus de l histire de l évlutin de l espèce (pseudgène, junk ADN,...). 80

89 La structure générale d un gène est cnstitué (vir la figure) : De séquences de cntrôle : O au début : le prmteur, une séquence qui détermine ù le gène cmmence ; il est le pint de départ pur la transcriptin de l ADN vers l ARN, O à la fin : le terminateur, une séquence qui indique ù le gène se termine ; il dit dnc stpper la transcriptin vers l ARN. Entre le prmteur et le terminateur : la séquence qui dit être transpsée en ARN et qui détermine la successin d acides aminés pur la fabricatin d une prtéine. La plupart du temps, n cnstate aussi la présence d éléments-cntrôle supplémentaires qui piltent la transcriptin; par exemple, des gènes qui cdent pur une prtéine qui peut blquer un prmteur, etc. Ces éléments secndaires peuvent se retruver sur l ADN parfis lin du gène à cntrôler. La fnctin de cela est surtut de veiller que les gènes sient seulement lus quand c est nécessaire ; d autre part, cnstruire en cntinu une prtéine qui est déjà présente en suffisance dans la cellule, u qui n est pas vraiment nécessaire à ce mment là, cnstitue un gaspillage d énergie et de matériaux. Chez les eucarytes, le gène est suvent plus lng que l ARN nécessaire pur la synthèse de la prtéine; après la transcriptin, l ARN frmé est décupé pur enlever les mrceaux superflus ( splicing ) avant que la synthèse des prtéines ne sit réalisée ADN, ARN et synthèse des prtéines La synthèse des prtéines est une traductin d une suite de bases dans l ADN via l ARN vers la successin d acides aminés d une prtéine. Snt cncernés par ce prcessus aussi bien l ADN, les différentes srtes d ARN que les prtéines; le prcessus de la synthèse des prtéines se dérule dans les ribsmes ( petite machine à prtéines ): O l ADN est l archive cntenant l infrmatin nécessaire et ne prend pas part elle-même activement à la fabricatin des prtéines, O l ARN est directement cncerné par la synthèse des prtéines : ARNm : ARN messager amène l infrmatin de l ADN vers les ribsmes, ARNt : ARN transprteur prte les acides aminés vers les ribsmes. Il existe différents ARNt qui diffèrent l un de l autre par la successin de 3 bases ( le triplet ) ; à chaque ARNt différent est lié un autre acide aminé, ARNr : ARN ribsmial est un cmpsant essentiel des ribsmes. 81

90 Le prcessus de la synthèse des prtéines se dérule cmme suit (vir figure) : La première étape est la transcriptin : la fabricatin de ARNm avec ADN cmme matrice. Cette étape cmmence avec l enzyme ARN-plymérase qui se lie avec l ADN sur le prmteur du gène. Il uvre l hélice jusqu à ce que les 2 brins d ADN s écartent l un de l autre. Le plymérase fait une cpie cmplémentaire du gène en fabriquant un brin d ARNm. Cmplémentaire signifie qu à chaque A dans l ADN crrespnd un U dans l ARNm, à chaque T un A, à chaque C un G et à chaque G un C. La transcriptin s arrête lrsque l ARN-plymérase atteint le terminateur, puis l ARNm est libéré. La secnde étape est la traductin: la fabricatin d une prtéine avec l ARNm cmme matrice. Cela se prduit sur/dans les ribsmes. L ARNm est aggripé par un ribsme, puis l ARNm est lu par grupes de tris bases. Pur chaque grupe de tris bases l ARNt crrespndant est utilisé dnt la mlécule d acide aminé est lié à la mlécule d acide aminé de l ARNt précédent par une liaisn peptidique. De cette manière une nuvelle prtéine est frmée qui peut ensuite se replier en une structure secndaire et tertiaire La réplicatin de l ADN Quand une cellule se divise, chaque cellule fille dit recevir une cpie identique de l ADN de la cellule-mère. Il est dnc nécessaire que la cellule dispse d un mécanisme pur faire une cpie exacte de l ADN présent. Ce prcessus est appelé la réplicatin de l ADN. Le prcessus de réplicatin suit les étapes suivantes : les 2 brins étant enrulés en hélice dans l ADN, ils divent d abrd être «désenrulés» par l enzyme hélicase pur être accessibles à l enzyme qui exécutera la cpie. Une furche de réplicatin (qui se présente cmme un Y) est frmée ù a lieu la réplicatin prprement dite. 82

91 Figure : Le dérulement de l hélice d ADN par l hélicase lrsque les deux brins nt été séparés, nus avns dnc deux simples brins. Sur chacun d eux, un brin cmplémentaire peut être synthétisé par l enzyme ADN-plymérase. Deux prblèmes se présentent : 1. L ADN-plymérase ne peut prlnger qu un brin cmplémentaire existant et le prcessus ne peut pas cmmencer de nv. Ce prblème est réslu par une autre enzyme, la primase. Celle-ci synthétise, sur un brin d ADN simple, une curte amrce d ARN : le primer u amrce. L ADN-plymérase peut utiliser ce primer cmme séquence de départ et, à partir de là, prlnger la chaîne cmplémentaire. Figure : Synthèse de l amrce ARN et sn allngement par l ADN-plymérase 83

92 2. Les brins d ADN pssèdent une plarité (vir ci-dessus) ; suite au désenrulement des brins, nus btenns dnc deux simples brins avec une plarité inverse. La DNAplymérase ne peut effectuer l élngatin des brins que dans le sens 5 -> 3 ce qui veut dire que seul 1 des 2 brins purrait être synthétisé. La slutin est la synthèse du brin cmplémentaire à l autre chaîne par petits segments dans le sens inverse, ceux-ci sernt ensuite reliés entre eux. Ces segments snt appelés fragments d Okazaki. Figure : Synthèse des fragments d Okazaki La cellule prcaryte Sur le plan génétique, le génme des prcarytes présente les caractéristiques suivantes : Il est circulaire : l adn se présente sus frme d un anneau. Il cmprend les gènes essentiels au fnctinnement de la cellule prcaryte. Les gènes snt rganisés en pérns : un pérn est une unité génétique dans laquelle les différents gènes remplissant une même fnctin (par exemple, une synthèse bichimique) se truvent regrupés, le cntrôle de l expressin de l pérn entier est régi par une seule structure de cntrôle, ainsi, cette structure de cntrôle maîtrise la fnctin entière. l exemple d pérn le plus cnnu est le lac-pern des E. cli qui régule le métablisme du lactse. Cet pérn cnsiste en une séquence [Prmteur Opérateur gènes de structure pur le métablisme du lactse - Terminateur]. L Opérateur est l interrupteur qui détermine l expressin de l pérn et est à sn tur dirigé par la présence u absence de lactse dans la cellule. 84

93 Figure : Structure du lac-pérn A côté des gènes essentiels se truvant sur le génme circulaire, une cellule prcaryte peut aussi cntenir des gènes islés qui cdent pur des caractéristiques nn essentielles de la cellule et dnc qui, en principe, peuvent être absents. Ces gènes se truvent également sur des segments d ADN circulaire et snt appelés plasmides. Leur nmbre est variable dans la cellule ; ils se multiplient de façn autnme, indépendamment du cycle de réplicatin du génme. Quelques exemples de plasmides : plasmides avec les gènes de résistance aux antibitiques (R-plasmides), plasmides avec les déterminants du sexe (F-plasmides) ils juent un rôle lrs l échange de matériel génétique, les déterminants de la virulence chez les pathgènes (Salmnella, ) Les plasmides expliquent purqui dans certains cas les suches bactériennes peuvent perdre leur virulence (perte du plasmide) u purqui d autres rganismes peuvent devenir très vite résistants aux antibitiques (échange entre rganismes des plasmides respnsables de la résistance). Dans la nature, certaines espèces de prcarytes se rencntrent dans des cnditins extrêmes. Elles snt cnnues cmme extrêmphiles et nt cmme caractéristiques qu elles peuvent crître et se multiplier malgré des valeurs extrêmes de ph, cncentratin en sel, température, ins métalliques, etc. Les thermphiles et les hyperthermphiles vivent à des températures allant jusqu à 120 C. Elles pssèdent des prtéines et des enzymes thermstables qui ne snt pas dénaturés à ces hautes températures. L ADN-plymérase est également thermstable. Vici quelques prcarytes imprtants dnt nus reparlerns par la suite : Thermus aquaticus ( Taq ). Cet extrêmphile vit dans les surces d eau chaude, ce qui induit que les enzymes, y cmpris ceux qui snt impliqués dans la réplicatin de l ADN, snt tujurs actifs à haute température (aux envirns de 100 c). Ceci est particulièrement imprtant dans l exécutin de la technique PCR qui utilise une ADNplymérase thermstable (la Taq-plymérase ), Agrbacterium tumefaciens. Il s agit d un pathgène des plantes qui prvque la frmatin de galles sur les feuilles d un grand grupe de plantes. Agrbacterium dispse d un mécanisme pur transférer un plasmide (le Ti-plasmide) dans la plante. Après qui, 85

94 ce plasmide est intégré dans l adn des cellules végétales. Un certain nmbre de gènes dans ce plasmide deviennent alrs actifs et pussent la plante à prduire des galles. En utre, le plasmide cntient aussi des gènes par lesquels la plante peut synthétiser des acides aminés spéciaux (pines) utilisés cmme surce d azte par Agrbacterium. L pine la plus imprtante chez A. tumefaciens est la npaline ; l enzyme servant à sa synthèse est la npaline synthase (NOS). Le gène cdant pur ns est flanqué d une séquence prmteur (pns) et d une séquence terminateur (tns). Par sa prpriété d intégrer le Ti-plasmide dans l ADN de la cellule végétale, ce plasmide est suvent utilisé pur l insertin de gènes étrangers dans les végétaux (mdificatin génétiques, ingénierie génétique). Figure : Le Ti-plasmide de A. tumefaciens. ri est le site de démarrage de la réplicatin, le T- ADN est le fragment par lequel la plante est infectée (le reste du plasmide n est pas transféré dans la plante. Ce fragment cntient des gènes tumraux par lesquels la plante prduit des galles, et des gènes de synthèse de la npaline. En utre, le plasmide cntient également des gènes pur réaliser l infectin de la plante avec le T-ADN et des gènes grâce auxquels A. tumefaciens cmmande le métablisme de la npaline (une pine) par la plante Virus et phages Les virus peuvent être cnsidérés cmme les parasites ultimes : ils snt entièrement dépendant du mécanisme de réplicatin de l hôte pur leur multiplicatin. Il y a des virus végétaux, des virus animaux et des virus bactériens u bactériphages (u simplement phages). En temps que parasites ultimes, leur structure est tellement simplifiée qu elle ne cmprte guère plus que du matériel génétique, une envelppe prtéique, éventuellement une structure d injectin (surtut chez les phages) pur intrduire le matériel génétique dans l hôte, et parfis une envelppe supplémentaire de glycprtéines. 86

95 Figure : Structure du virus de l influenza (gauche) et d un phage (drite) Seln la nature du matériel génétique (celui-ci peut être de l ADN u de l ARN et se présenter sus frme mncaténaire u bicaténaire) et la façn dnt il est transcrit en ARNm (qui dit servir à la synthèse des prtéines pur la frmatin des nuveaux cnstituants viraux), les virus peuvent être classés en plusieurs grupes différentes. Un virus intéressant pur la suite, est le virus de la msaïque du chu-fleur (CaMV, Cauliflwer Msaic Virus) qui affecte les crucifères. Ce virus pssède une envelppe prtéique dans laquelle se truve un ADN circulaire duble brin. Cet ADN cntient un prmteur (le prmteur 35S u p35s) qui est suvent utilisé dans les mdificatins génétiques La cellule eucaryte L rganisatin de l ADN dans la cellule eucaryte présente des différences imprtantes avec celle bservée dans la cellule prcaryte : l ADN est cncentré dans la nyau, l ADN est scindé en chrmsmes, cmplexes d ADN et de prtéines de base (histne), Figure Structure d un chrmsme les différents gènes impliqués dans une même vie bichimique snt dispersés dans l ADN et peuvent même se truver sur des chrmsmes différents et il existe plusieurs structures de cntrôle, 87

96 l ADN cntient beaucup de régins nn cdantes ( junk-dna ), suvent au sein d un gène cdant pur une prtéine déterminée. Ces segments nn cdants cntenus dans les gènes snt appelés intrns ; les segments cdants étant appelés exns. Lrs de la transcriptin de L ADN en ARN, les intrns divent être éliminés afin d btenir un brin de ARNm entièrement cdant. La synthèse des prtéines chez les eucarytes peut dnc être représentée cmme ADN => pré-arnm=> ARNm => prtéines Relatins Nus puvns classer les rganismes terrestres en plusieurs grands grupes qui snt relatées parce qu ils nt un ancêtre cmmun. Ces relatins évlutinnaires expliquent un certain nmbre de cnstatatins : tute vie utilise les mêmes acides aminés, tute vie est basée sur l ARN et l ADN, tute vie utilise les mêmes principes pur la réplicatin, la transcriptin et la traductin. Dans ce cntexte, il n est dnc pas surprenant que l échange d éléments génétiques entre rganismes appartenant à des dmaines très différents sit pssibles PCR : Plymerase Chain Reactin Le prblème analytique Suppsns que nus vulins détecter la présence d un gène dnné, u de manière plus générale une séquence d ADN dnné dans une cellule. Nus nus heurtns alrs à tris prblème : O O O la séquence cible ne repésente qu une très petite partie de l ensemble de l ADN présent, le nmbre de cpies de cette séquence est généralement très faible, parfis il n y a qu une cpie présente dans la cellule, ce qui rend la détectin impssible et n recherche une aiguille dans une bte de fin : cmment puvns nus différencier la séquence ciblée du reste de l ADN? Nus avns dnc à faire à un prblème de basse cncentratin et à un manque de spécificité. La slutin à ce prblème est de chercher, d une manière u d une autre, à multiplier la séquence cible de telle srte que sa cncentratin devienne suffisamment imprtante pur rendre une détectin pssible et chercher que cette multiplicatin n augmente que la séquence cible et pas le reste de l ADN. Nus avns dnc besin d un myen de multiplicatin sélectif. 88

97 La slutin analytique : la PCR La slutin au prblème psé cnsiste à utiliser pur la multiplicatin de la séquence cible le prcessus naturel de multiplicatin de l ADN, mais cela en fnctin de ns bjectifs. Cette technique, cnnue sus le nm de PCR (Plymerase Chain Reactin u Réactin en Chaine par Plymérase) a été prpsée par Kary Mullis qui a reçu le Prix Nbel en Le pint de départ pur la PCR est la réplicatin de l ADN cmme cela se passe dans la nature. Mais pur réaliser ce prcessus in vitr, certaines mdificatins nt été apprtées à ce schéma : la séparatin des 2 brins n est pas réalisée par l hélicase mais par dénaturatin: l ADN est réchauffé u à haute température n passe de dubles brins d ADN à des simples brins d ADN. les amrces ne snt pas synthétisées par la primase mais snt ajutées prêt à l empli dans le tube à essai. Ceci est très imprtant, car cela signifie que l n peut de cette manière avir un cntrôle sur la séquence de l amrce cmme nus le verrns, ceci est essentiel pur la PCR. En refridissant les amrces présentes en slutin vnt s attacher sur les simples brins d ADN aux emplacement cmplémentaires. le cmplexe amrce-adn ainsi frmé est le pint de départ pur la fixatin de l ADNplymérase après qui la plymérase prcède à l élngatin à partir de l amrce dans le sens 5 =>3 de telle srte qu un nuveau duble brin d ADN est frmé. Ce prcessus est présenté de manière schématique dans la figure suivante : 89

98 Le pint le plus imprtant de ce prcessus est que la réplicatin puet être répétée! Lrs de chaque cycle pur lequel le prcessus cmplet est réalisé, l ADN est multiplié depuis lámrce. Si n réalise crrectement de nmbreux cycles - chaque cycle crrespnd alrs à un dublement - alrs la cncentratin peut finalement être suffisamment haute pur être détectée. Pur la PCR, il y de nmbreux aspects qui divent être pris en cmpte pur que les principes de la PCR puissent être appliqués de manière judicieuse : l ADN plymérase dit résister à la température de dénaturatin de l ADN (95 C). Une plymérase thermstable peut être utilisée qui prvient d rganisme thermphile. Généralement n utilise la plymérase de Thermus aquaticus (Taq-plymérase). dans la slutin les nuclétides individuels (A, T, C, G) divent être présents, sans cela la plymérase ne peut évidement pas remplir sa fnctin. Les cnditins divent être apprpriées à l activité de la plymérase, cmme la frce inique, la présence de Mg ++, K + etc, les amrces apprpriées divent être présents dans la slutin. Les amrces snt cruciaux car ils déterminent le pint de départ depuis lequel le brin d ADN cmplémentaire sera allngé ; ils divent aussi être cmplémentaire à la séquence de ce pint de départ. Cela signifie que lrsque l n suhaite détecter une séquence dnnée, les amrces divent se fixer dans le visinage de la séquence cible. En pratique deux amrces snt utilisés : le 90

99 premier est cmplémentaire à une séquence prche du début du fragment chisi ( frward primer, amrce sens) et un secnd cmplémentaire avec une séquence située à la fin ( reverse primer, amrce anti-sens). Schématiquement le principe est le suivant : On cmmence avec une slutin cntenant le simple brin d ADN (après dénaturatin), les ins apprpriés et les nuclétides, un primer et l ADN-plymérase. Une séquence de départ (start) est la régin de l ADN sur laquelle l amrce cmplémentaire se fixe: durant le premier cycle, lrs du refridissement, l amrce se lie à la séquence cmplémentaire d ADN et frme un petit duble brin. La Taq-plymérase utilise ce petit duble brin cmme pint de départ pur l élngatin de la chaîne cette élngatin se prduit en principe jusqu à la fin de la chaine. Il y a dnc un duble brin d ADN qui cmmence à l amrce. lrs de l augmentatin de la température les deux brins se séparent et le prcessus peut alrs se répéter. 91

100 remarquez que dans cette exemple à chaque cycle une seule nuvelle chaine est frmée. Cela signifie que le nmbre de chaînes nuvellement frmées augmente peu à peu (1 par cycle), chaque nuvelle chaine frmée cmmence au primer et se termine là u la plymérase s arrête. Ce qui signifie que la nuvelle chaine est généralement plus lngue que la séquence cible. Cette méthde est dnc peut efficace. Pur rendre le prcessus plus efficace, n ajute une secnde amrce, l amrce anti-sens (reverse primer) : cette secnde amrce se lie à un brin cmplémentaire d ADN à une place prche de la fin de la séquence cible, parce ce que cet amrce se liée à un brin cmplémentaire, l élngatin par la plymérase se fait dans le sens 5 => 3 sur ce brin, c est purqui l élngatin se fait d arrière en avant vu du premier brin. C est la raisn pur laquelle cette secnde amrce est appelée reverse primer (amrce anti-sens) tandis que l amrce qui se lie au premier brin est appelé frward primer (amrce sens). Avec l utilisatin de ces paires de primer le prcessus de la PCR devient plus efficace : 92

101 Avec l utilisatin d une secnde amrce le premier cycle se dérule maintenant cmme suit : dénaturatin par réchauffement de la duble hélice d ADN en deux simples brins d ADN, lrs du refridissement : liaisn de l amrce sens sur le premier brin du cté du début du fragment cible et l amrce anti-sens se lie sur le brin cmplémentaire du cté de la fin du fragment cible. la Taq-plymérase allnge les deux chaines depuis chaque amrce dans le sens 5 => 3 il y a à ce mment deux dubles brins partiels séparés frmés à partir des deux brins riginaux (lgeur cmplète) et deux nuveaux brins différents et plus curts qui cmmencent chacun à un primer différent et qui nt des lngueurs différentes. Le secnde cycle se passe le manière suivante : lrs du cycle de chauffage suivant, les dubles brins snt séparés, n btient 4 brins uniques: les 2 riginaux cmplets et les 2 nuveaux plus curts, lrs de la diminutin de la température les amrces se lient à des sites cmplémentaires tant sur les brins riginaux que sur les nuveaux brins. ntez que les amrces se lient "quelque part au milieu" des chaines (vir figure), la Taq plymérase allnge les chaines depuis chaque amrce dans les 5 '=> 3', il ya maintenant un ttal de 8 brins: brins riginaux de la lngueur cmplète, brins 'plus curts nuvellement créés : 2 avec un de la lngueur (thérique) qui va de l'amrce sens jusqu à la fin de la séquence d rigine et 2 brins avec une lngueur (thérique) qui va du début de la séquence d rigine jusqu à l amrce anti-sens (cmplémentaire), brins curts dnt la lngueur est la distance entre les amrces sens et anti sens (indiquée par des flèches dans la figure). 93

102 Les brins curts d'adn cmprennent la séquence d ADN recherchée ; idéalement, la lngueur de ces brins est exactement la même que celle de la séquence cible, mais dans la pratique elle peut être un peu plus curte u un peu plus lngue (les amrces spécifiques pur le début et la fin de la séquence cible peuvent par exemple ne pas être assez sélectif, u le fragment peut être trp lng pur être crrectement dupliqué). Les fragment avec une lngueur cmpris entre l amrce sens et l amrce anti sens est appelé l amplicn. Lrs de chaque cycle PCR ultérieur le nmbre de brins augmente cmme suit : il y a tujurs deux nuveaux brins "plus curts", chaque brin plus curt est le mdèle pur un nuveau brin curt, chaque brin curt est le mdèle pur un nuveau brin curt d exactement la même lngueur. Cela signifie que lrs de chaque cycle le nmbre de brins curts est dublé. 94

103 Si n calcule le nmbre de chaque srte de brins pur chaque cycle, n btient le tableau suivant : Tableau : Lng est le nmbre de brins avec la lngueur ttale (= brin d ADN riginal, il en reste 2 tut au lng de l analyse). Plus curt est le nmbre de brins d ADN avec une lngueur allant del amrce jusqu à la fin du brin riginal, Curt 1r duplex dnne la multiplicatin expnentielle du premier brin curt (lngueur allant de l amrce sens à l amrce anti sens ) et Curt Ttal le nmbre de brins curts présents lrs du cycle (nter que lrs de chaque cycle un nuveau duplex est frmé) Il ressrt clairement de ce tableau que le nmbre de brins curts augmente de façn expnentielle, si bien qu'après une 15aine de cycles il y a déjà une augmentatin par un facteur de Cette augmentatin élevée de la cncentratin, qui en pratique peut être quantifiée sur base des curtes chaines (=fragment cible), rend la détectin pssible. Cela peut être fait avec un détecteur UV (l ADN absrbe frtement à 260 nm), mais en pratique, n utilise des méthdes de flurescence (vir cidessus). 95

104 Lrsque la réactin est suivie par un instrument spécialement cnçu pur cela (un thermcycleur avec un détecteur en temps real (Real-Time), n btient le graphique suivant : On peut diviser chaque curbe de ce graphique en différente partie: d'abrd une phase statinnaire (A): l'augmentatin du nmbre d amplicns est trp petite pur être détectée, ensuite une phase expnentielle (B): le nmbre d'amplicns devient détectable et augmente de façn expnentielle. La réactin se passe bien et l'augmentatin est presque uniquement liée à l'augmentatin des curtes chaines. enfin, une phase de ralentissement (C) se terminant par un plateau (D): la réactin est inhibée et l augmentatin n est plus expnentielle. La raisn de cette inhibitin est généralement que l n arrive à curt de certains réactifs (amrces et nuclétides). L'augmentatin expnentielle du nmbre d'amplicns, peut être transfrmé en valeurs lgarithmiques, de cette manière la phase expnentielle est une ligne drite dans le graphique: 96

105 Pur un dérulement idéale de l analyse, n btient en lgarithme base 10 une pente de 3,3 si n travaille en lgarithme base 2, la pente est d exactement de 1, Cnditins pur la PCR Pur la réalisatin de la PCR, les éléments suivants divent être pris en cmpte en ce qui cncerne les réactifs : la cncentratin de l'adn matrice (= l ADN de l'échantilln ù le fragment cible dit être détecté) ne dit pas être trp élevé, car cela peut interférer avec la détectin et va généralement de paire avec une cncentratin élevée en inhibiteurs, la plymérase utilisée elle dit résister à la température de dissciatin de L'ADN (95 C), la Taq plymérase est généralement utilisée et supprte des cycles répétés de 95 C la Taq plymérase a une activité exnucléase 5 '=> 3' et peut dnc décmpser la séquence qu elle rencntre en nuclétide. la Taq plymérase n'effectue pas de crrectin d'épreuves ( «relecture») de la cpie de synthèse et rend ainsi les erreurs relativement fréquentes dans la synthèse d'une nuvelle chaîne (envirn 1 erreur par nuclétidiques). Cela signifie que, après 30 cycles, envirn 50% des amplicns nt subis une u plusieurs mutatins! les amrces deux amrces snt nécessaires, une amrce «sens» et un «anti sens», les amrces divent avir la séquence crrecte : les amrces divent être dévelppées en fnctin du fragment cible et synthétisés sur cmmande. Cnditins pur avir de bnnes amrces snt qu ils divent être uniques pur la séquence cible du fragment (sélectivité), qu ils n nt pas des dmaines cmplémentaires (risque de frmatin des dimères entre eux) et qu ils ne snt pas trp curtes. Généralement, n chisi des amrces d une lngueur de 20 à 30 bases. 97

106 Les nuclétides libres da, dt, dc et dg divent être présents en tant que blcs de cnstructin pur les nuvelles chaines, parfis dt est remplacé par du du. On a alrs un type de chaîne qui n existe pas dans la nature (ADN avec U au lieu de T). Pur la réalisatin de la réactin cela n a pas d imprtance, la Taq plymérase ne fait aucune distinctin entre dt et du et les incrpre tus les deux dans la chaine en curs d élngatin. De plus, l'utilisatin d'u a un avantage ; en évitant la cntaminatin par des prduits de réactin d'une analyse antérieure. la cncentratin idéale de nuclétides est d'envirn 1mM. cnditins de réactin dans le mélange réactinnel Mg ++ et K + divent être présents, Mg ++ est ajuté sus frme de MgCl 2 (ca. 2 mm) pur la Taq plymérase (Mg ++ est un cfacteur de la plymérase) la cncentratin idéale est de 50 mm pur le K +, ntamment pur la régulatin de la frce inique. absence d inhibiteurs les inhibiteurs snt des cmpsants qui peuvent ralentir la réactin. Les plus curants snt des plysaccharides (matériel végétal!), l'éthanl et l'isprpanl (> 1%), le NaCl (> 25 mm), d'edta (> 0,5 mm), SDS, phénl,... La plupart de ces inhibiteurs snt malheureusement suvent utilisés dans l'une des étapes de l'extractin de l'adn Détectin Il existe deux grands types de PCR: la PCR classique et la RT-PCR (Real time PCR, parfis aussi appellé QRT-PCR pur PCR Quantitative en temps réel, ceci pur faire une distinctin avec la Reverse transcriptase PCR dnt l abréviatin est aussi RT-PCR). Via la PCR classique le résultat de l analyse est cnnu après que l analyse sit cmplètement terminée: n analyse le mix de réactin a psteriri quant à la présence des prduits de réactin. C est la plus ancienne frme de PCR qui est surtut utilisée actuellement quand n suhaite travailler directement avec les prduits issus de la réactin. La détectin s père principalement par électrphrèse au myen de laquelle les prduits snt séparés et identifiés de manière semiquantitative. L électrphrèse permet aussi d identifier la lngueur des amplicns présents, ce qui peut cnstituer une cnfirmatin du fait que les prduits engendrés par la réactin snt bien ceux que l n cherche. Les désavantages de la PCR classique snt d une part que le résultat de l analyse n est cnnu que par la suite, et d autre part qu il faut un lcal indépendant à cause d un risque élevé de cntaminatin. Via la RT-PCR n a déjà un suivi de la réactin pendant sn dérulement, de telle manière qu n a déjà une idée du résultat avant que l analyse ne sit terminée. A cet effet, un certain nmbre 98

107 d adaptatins a été apprté (par rapprt à la PCR classique) qui rend la détectin pssible en direct. Il existe deux systèmes de base pur la détectin pendant la RT-PCR : détectin nn-spécifique par la frmatin d un cmplexe-adn flurescent, détectin spécifique via un prduit de dégradatin qui est frmé pendant l élngatin de l ADN. Il existe plusieurs variantes basées sur ce principe ; le plus cnnu est le système Taqman Détectin nn spécifique avec un cmplexe-adn flurescent Cette méthde de détectin implique l ajut d un clrant intercalant au mélange de réactin : un liant qui se lie à l ADN duble-brin («dsdna») en s intercalant entre les bases dans le silln mineur de la duble-hélice d ADN. Le clrant intercalant le plus utilisé est le SybrGreen I, un cmpsé de cyanine. Figure : Intercalatin du SybrGreen dans l ADN duble brin et apparitin de la flurescence. Le cmplexe SybrGreen-ADN duble-brin frmé absrbe la lumière d une lngueur d nde de 488 nm (bleue) et émet en retur de la flurescence à 560 nm (verte, d ù le nm) ; ainsi, sur base de l intensité de la flurescence, n peut déduire la quantité d ADN duble-brin. La liaisn avec l ADN n est abslument pas spécifique en ce sens que le SybrGreen se lie à tus les ADN duble-brin, et dnc la flurescence émise est relative à un nmbre d emplacements (sur l ADN) ù du SybrGreen est lié (c est-à-dire à une quantité dnnée d ADN duble-brin), mais ne renseigne en aucun cas sur la nature même de cet ADN. La liaisn du SybrGreen avec l ADN duble-brin est réversible : quand la température augmente et que le duble brin se scinde en ADN simple-brin (ssdna), le clrant est relibéré en slutin et la flurescence disparaît. Lrs du refridissement, quand les ADN simple-brin se rassemblent pur frmer du ADN duble-brin, le cmplexe SybrGreen-ADN se frme à nuveau et la flurescence apparaît également à nuveau. Cela signifie aussi que la mesure dit être faite à des températures assez basses car l ADN dit se truver sus frme duble-brin. 99

108 Ce cmprtement réversible est la base de l établissement d une curbe de fusin. Pur ce faire, n démarre avec une température basse, à laquelle l ADN est présent sus frme d ADN duble-brin et les mlécules de SybrGreen y snt liées, et dnc la flurescence émise est frte. On augmente ensuite lentement la température ; à partir d une température dnnée l ADN duble-brin cmmence à se dénaturer et la frce liant chaque élément l un à l autre diminue. A ce mment-là, la flurescence diminue. Lrsque l n atteint une température dnnée, dans une zne délimitée à quelques degrés près sur la curbe, l ADN duble-brin est presque cmplètement dénaturé en ADN simple-brin et la flurescence disparaît alrs aussi presque cmplètement. La température à laquelle la mitié de l ADN est sus frme ADN simple-brin est la température de fusin T m. La température de fusin peut ainsi être utilisée en guise de cnfirmatin de la nature des amplicns. On utilise en pratique le plus suvent la première dérivée (mathématique) de la curbe de fusin, à l aide de laquelle la sigmïde est cnvertie en un pic dnt le smmet crrespnd à la température de fusin (vir figure). Figure : Tris curbes de fusin et leurs dérivés. 100

109 Détectin spécifique avec flurescence Cette détectin spécifique fait appel à de curtes séquences d ADN les «sndes» - qui snt cmplémentaires à une partie du fragment qui se truve entre les amrces et qui dit être détecté. Ceci implique que les sndes peuvent se lier de manière très spécifique (n dit «s hybrider») à un fragment d ADN particulier. Cmme la snde fait partie d un système ù la détectin est basée sur une hybridatin, la présence du fragment d ADN est mise en évidence de manière très spécifique. Il existe plusieurs variantes du principe de détectin à l aide de sndes, dnt la plus utilisée est celle décrite ci-après Sndes à hydrlyse : TaqMan Le système TaqMan fait appel à l activité exnucléasique 5-3 de la plymérase Taq pendant l élngatin des chaînes. Quand, pendant l élngatin, la plymérase Taq rencntre une séquence cmplémentaire déjà existante, celle-ci est hydrlysée et dnc disparaît, et ensuite la plymérase synthétise une nuvelle séquence cmplémentaire sur le brin mis à nu. Une snde Taqman est cnstituée de tris parties (vir figure): O O O la séquence de bases cmplémentaires, le plus suvent d une lngueur de 20 à 30 bases. un flurphre, une mlécule fixée à l extrêmité 5 de la séquence de la snde, qui fluresce si irradiée par une lumière de lngeur d nde adaptée. Des flurphres beaucup utilisés snt FAM (6-carbxyflurescéine), VIC (breveté, structure nn cmmuniquée), TET (tetrachlrflurescéine), HEX (hexachlrflurescéine) et JOE (6-carbxy-4,5 -dichlr-2,7 - diméthxyflurescéine). un quencheur, une mlécule fixée à l extrêmité 3 de la séquence de la snde, qui éteint la flurescence du flurphre lrsqu à prximité de celui-ci. Le quencher le plus utilisé est TAMRA (6-carbxytétraméthylrhdamine). Sur une snde intacte le flurphre et le quencheur se retruvent visins l un de l autre, dnc le quencher éteint la flurescence du flurphre et en pratique aucune flurescence n est émise. Un flurphre libre sans quencher à prximité n est pas éteint et fluresce lrsque irradié par la lumière. Parce que l extrêmité 3 de la snde est blquée par le quencher, la snde ne peut pas être utilisée cmme amrce et il n y a dnc pas de risque que la plymérase fasse une élngatin des chaînes à partir de la snde. 101

110 Figure : Structure d une snde TaqMan; R est le flurphre («Rapprteur»), Q est le quencheur. Pendant l analyse avec une snde TaqMan il se passe les évènements suivants: au début de l analyse la slutin cntient l ADN duble-brin, la plymérase Taq, les nuclétides, les amrces et la snde, lrsqu n chauffe l ADN duble-brin se dénature en ADN simple-brin, lrsqu n refridit les sndes vnt se lier en premier à la séquence cible. Les amrces ne se lient pas en premier à l ADN car la température de fusin de la snde est envirn de 10 C supérieure à celle des amrces. lrsqu n refridit encre les amrces se lient alrs à l ADN. A partir de cet instant, la plymérase Taq peut utiliser le cmplexe ADN-amrces cmme pint de départ pur la synthèse des chaînes cmplémentaires pendant l élngatin des chaînes, la plymérase rencntre les sndes. En vertu de l activité exnucléasique de la plymérase, la snde est hydrlysée, ce qui libère le quencher et le flurphre, lesquels se retruvent indépendants l un de l autre en slutin. La cnséquence est que la flurescence n est plus éteinte (il n y a plus de prximité quencher-flurphre) et le flurphre libre peut flurescer sus irradiatin de lumière. La flurescence de la slutin augmente. C est à cette étape que la flurescence est lue. à l étape suivante, la température est de nuveau augmentée pur dénaturer l ADN dublebrin et le cycle est répété. Figure : Dérulement de la PCR avec sndes TaqMan. 102

111 Nus remarquns dnc qu à chaque cycle la flurescence augmente; à partir d un cycle dnné, celleci sera mesurable et la curbe typique en frme de S d une réactin RT-PCR va se frmer. La détectin se base dnc sur la rupture de la snde avec suivi de l augmentatin du signal flurescent. Il est à nter que ceci est une réactin irréversible : la flurescence ne peut alrs qu augmenter, et ceci à l inverse de l utilisatin d un agent clrant intercalant de type SybrGreen. Une cnséquence de cela est que il n y a pas de curbe de fusin à établir en guise de cnfirmatin ; sinn la réactin est très spécifique : n ne détecte plus une augmentatin dépendant d une quantité ttale d ADN mais une augmentatin dépendant du fragment cherché Sndes FRET FRET signifie Flurescence Resnance Energy Transfer, dnc la transmissin d énergie de résnance via flurescence. Cntrairement aux sndes TaqMan n utilise ici 2 sndes: une première snde avec à sn extrêmité 3 un flurphre-dnneur (le plus suvent flurescéine) et une deuxième snde avec à sn extrêmité 5 un flurphre accepteur (Red-640 u Red-705). Quand le flurphre dnneur est sumis à un rayn lumineux (la lngueur d nde idéale est 493 nm), il fluresce à une lngueur d nde d émissin dnnée. Cmme le flurphre dnneur est vraiment en cntact direct avec le flurphre accepteur (distance 1 à 10 nm), l énergie du dnneur est transmise à l accepteur et suite à cela de la lumière à une lngeur d nde supérieure est émise (640 u 710 nm). Nus avns dnc ici un phénmène tel que il y a seulement émissin de flurescence par l accepteur quand dnneur et accepteur snt dans le visinnage immédiat l un de l autre. Pur adapter ce système à la détectin d une séquence d ADN déterminée, n cnçit les deux sndes de srte à ce qu elles sient liées l une à côté de l autre sur le fragment d ADN recherché, et ù le flurphre dnneur (l extrêmité 3 de la première snde) se truve à côté du flurphre accepteur (l extrêmité 5 de la deuxième snde). C est seulement dans cette cnfiguratin qu il peut y avir émissin de flurescence à une lngeur d nde élevée par l accepteur suite à l expsitin à un raynnement lumineux. 103

112 Pendant l analyse avec les sndes FRET se prduisent les faits suivants: au début de l analyse la slutin cntient l ADN duble-brin, la plymérase Taq, les nuclétides, les amrces et les deux sndes, puis n chauffe (à 95 C) et l ADN duble-brin devient ADN simple-brin, puis n refridit (jusqu à C) et les amrces et les deux sndes se lient, les deux sndes se retruvent l une à côté de l autre de srte que FRET devient pssible. Lrs de l irradiatin lumineuse les accepteurs vnt flurescer ; c est à cette étape que la flurescence est mesurée. ensuite la température est augmentée pur atteindre la température ptimale pur la plymérase Taq (72 C) et alrs la plymérase allnge les amrces entraînant la frmatin des chaînes cmplémentaires ; pendant l élngatin, la plymérase rencntre les sndes et les casse, impliquant que le dnneur et l accepteur snt élignés l un de l autre par libératin dans la slutin. La cnséquence est que plus aucune flurescence du dnneur est transférée à l accepteur. La flurescence de la slutin diminue à ce mment. à l étape suivante, la température est de nuveau augmentée à 95 C pur dénaturer l ADN duble-brin et le cycle est répété. 104

113 Remarquns qu ici 3 étapes de température divent être utilisées : pur puvir mesurer la flurescence de l accepteur il faut pérer avant que la plymérase exécute l élngatin et ceci est pssible via un abaissement de la température sus la température ptimale de la plymérase de telle srte que celle-ci est à peine active après la liaisn des amrces et des sndes. A chaque étape les sndes liées snt brisées par la plymérase de telle manière que la cncentratin des sndes dans la slutin de départ dit être assez élevée pur qu au dernier cycle il y en ait encre suffisamment de cpies pur puvir se lier à l amplicn. Il est pssible d établir une curbe de fusin avec les sndes FRET: à faible température il y a exclusivement du dsdna. A l augmentatin de la température le ssdna s accumule et les sndes FRET peuvent se lier à celui-ci et la flurescence peut alrs être mesurée. Cntrairement à la curbe de fusin btenue avec le SybrGreen, il y a ici une augmentatin et pas de diminutin de la flurescence lrsqu n augemente la température Balises mléculaires Les balises mléculaires snt parentes des sndes TaqMan, mais présentent quelques différences imprtantes. Une balise mléculaire est une snde qui cnsiste en 4 parties: une séquence de 15 à 30 bases qui est cmplémentaire à une partie du fragment d intérêt (le «lp») à chaque extrêmité de cette séquence n truve une séquence plus curte de 5 à 7 bases qui snt cmplémentaires l une avec l autre de srte qu elles puissent s hybrider ensemble à l extrêmité 5 n truve un flurphre à l extrêmité 3 n truve un quencheur En situatin nrmale (faible température et pas d ADN cmplémentaire présent) une balise mléculaire est repliée en structure «d épingle à cheveux» : les deux pièces cmplémentaires s hybrident ensemble et alrs le flurphre et le quencher snt en cntact l un avec l autre et il n y a pas d émissin de flurescence. Quand une balise mléculaire entre en cntact avec une séquence qui est cmplémentaire à celle de la séquence «lp», alrs la balise va s y lier avec préférence et un fragment duble-brin se frme (la stabilité d un «lp» lié est plus grande que la structure en épingle à cheveux). Ceci implique que les extrêmités de l épingle à cheveux snt déshybridées dnc le flurphre est éligné du quencheur ; dans cette cnfiguratin, le flurphre peut flurescer. 105

114 En pratique la lngueur du lp est le plus suvent chisie de srte à ce que les fragments dublebrins sient à peine plus stables que l épingle à cheveux. Ainsi n a la pssibilité d une grande spécificité : la présence d un quelcnque base nn cmplémentaire dans l ADN peut gêner la liaisn de la balise mléculaire. Lrsqu n utilise des balises mléculaires n mesure la flurescence pendant l étape ù la balise se lie à l ADN, car c est la seule phase pendant laquelle le flurphre et le quencher snt séparés. Après la mesure la température est augmentée et la plymérase exécute l élngatin des chaînes à partir des amrces. Quand une balise mléculaire est rencntrée, celle-ci est libérée (pas brisée!) et ainsi se retruve en slutin à nuveau, et dnc la structure en épingle à cheveux se refrme. Les balises mléculaires peuvent dnc être réutilisées à chaque cycle de PCR Amrces scrpin Les amrces scrpin résultent de la cmbinaisn d amrces et d une balise mléculaire. Tut cmme les balises mléculaires, les scrpins cnsistent en une structure en épingle à cheveux avec un flurphre et un quencheur. L extrêmité 3, à laquelle le quencheur est lié, est ici prlngée par une mlécule qui est cnnue cmme le «blqueur de PCR» («PCR-blcker») et qui est nn nuclétidique, bien qu ici il s agisse d une séquence d amrce cnfirmée. Le blqueur de PCR, entre l épingle à cheveux et l amrce, est là pur empêcher que la plymérase n uvre l épingle à cheveux pendant la liaisn sur l amrce, ce qui impliquerait la frmatin de prduits nn-spécifiques. Une analyse PCR avec les scrpins se dérule seln les étapes suivantes : les scrpins se truvent en slutin sus la frme d épingle à cheveux, lrs de la dénaturatin snt dénaturés tant l ADN-cible que l épingle à cheveux, lrs du refridissement l amrce du scrpin se lie sur l ADN simple-brin et l épingle à cheveux est de nuveau frmée, 106

115 la plymérase allnge les chaînes à partir de l amrce avec frmatin d ADN duble-brin, à l étape suivante de dénaturatin la trsade (scrpins + chaînes allngées) est de nuveau libérée et l épingle à cheveux est uverte, lrs du refridissement la séquence de la bucle de l épingle à cheveux se lie à la séquence cmplémentaire de la nuvelle trsade frmée (dnc une hybridatin interne), ce qui entraîne l élignement du quencher et du flurphre l un par rapprt l autre et dnc émissin de flurescence. Cette cnfiguratin est plus favrable sur le plan énergétique que la liaisn des chaînes allngées avec une trsade d ADN cmplémentaire. A cette étape, la flurescence est mesurée. Cmme cette étape est aussi celle à laquelle les amrces se lient, un scrpin cmplémentaire peut se lier à l extrêmité de la trsade allngée ayant une telle cnfiguratin et être allngé jusqu au blquer de PCR. De cette manière, il se prduit aussi via les scrpins un dédublement du nmbre de trsades par cycle de PCR. Etant dnné que l élngatin du scrpin fait disparaître sa fnctin d amrce, du scrpin est cnsmmé à chaque cycle de la PCR de manière irréversible. A chaque cycle, la flurescence augmente.en général, n limite la distance entre l amrce et la séquence-cible de la snde à mins de 200 bases Autres variantes Outre les applicatins expsées ci-dessus, il existe un certain nmbre d autres variantes. La particularité est que tus travaillent suivant le principe du quenching <-> flurescence liée à la séquence recherchée. 107

116 PCR cmbinée Il est pssible d utiliser des assciatins d amrces et de flurphres sit pur réaliser différentes réactins simultanément, sit pur utiliser l amplicn d une réactin cmme séquence de départ d une autre réactin. Dans la singleplex-pcr, il existe une dispsitin unique : il n y a qu une seule paire amrce/snde présente. Il s agit de la variante la plus simple et la plus répandue. Dans la duplex-pcr, deux pératins snt exécutées simultanément. Ceci est pssible grâce à l ajut de deux cuples d amrces et de deux sndes différentes. Ainsi, deux réactins peuvent avir lieu simultanément et indépendamment l une de l autre. Pur que les deux réactins puissent être distinguées l une de l autre dans la RT-PCR, les sndes snt cuplées à des flurphres émettant un raynnement à des lngueurs d ndes différentes (par exemple, FAM et HEX). En utilisant des filtres apprpriés, les culeurs de flurescence de chacun peuvent être distinguées, ce qui permet la réalisatin de deux réactins différentes dans le même puits. Muliplex-PCR : il s agit d une variante plus élabrée de la duplex-pcr, dans laquelle plus de deux jeux d amrces et de sndes snt utilisés. La distinctin des culeurs de flurescence émises ainsi que l ptimalisatin des cnditins de réactin snt plus cmpliquées. Nested PCR : Deux jeux d amrces snt ici utilisés. Le premier dnne lieu à la frmatin d un lng amplicn qui cmprend la séquence cible. Le secnd enture la séquence cible ; cmme ce dernier est aussi présent dans le lng amplicn frmé par le premier jeu, l amplicn de ce premier set est utilisé cmme matrice pur la secnde réactin. Une seule snde est utilisée seulement à prximité de la secnde amrce, alrs, le signal détecté sera spécifique au secnd segment. Ceci est suvent utilisé dans des cnditins difficiles pur amplifier le DNA parce que l amplificatin avec le premier amplicn cmme matrice se fera beaucup plus facilement. Figure Principe de la Nested PCR 108

117 Exécutin de la PCR Tutes les variantes de la PCR se fnt à partir d une slutin dans laquelle l ADN duble brin (u l ARN dans le cas de certaines applicatins spéciales) est présent avec une pureté suffisante Equipement L appareil de base pur l exécutin de la PCR est le thermcycleur. Il cnsiste essentiellement en une plaque chauffante dans laquelle une plaque de micrtitratin (96 u 384 puits) est placée. Cette plaque chauffante, généralement en aluminium, peut être très rapidement chauffée u refridie. Pur rendre pssible ce chauffage et ce refridissement rapide, cette plaque est installée sur un élément Peltier, ainsi la température peut être réglée au myen de l effet Peltier. Figure Un thermcycleur pur la RT-PCR. La partie inférieure est le thermcycleur pur la PCR classique, la partie supérieure cntient le détecteur pur la RT-PCR. 109

118 A côté de la plaque chauffante grâce à laquelle la température de la plaque de micrtitratin est régulée, la température du cuvercle qui recuvre la plaque dit aussi être augmentée pur éviter la cndensatin sur le haut des puits. Un thermcycleur pur la PCR classique est cmpsé d un blc chauffant, un cuvercle thermstatisé et l électrnique pur cntrôler la température du blc chauffant et prgrammer le cycle de température. Dans un thermcycleur pur RT-PCR, il y a en plus un blc détecteur qui permet de mesurer la flurescence dans un puits à une étape dnnée de chaque cycle de température. Un tel système de détectin est cmpsé d une surce d excitatin pur prduire la flurescence. Ce peut être une lampe au xénn mais aussi une LED qui émet un raynnement dans une gamme étrite de lngueurs d nde. Ce raynnement passe encre à travers un filtre afin de restreindre la gamme de lngueurs d nde pur l excitatin. de filtres pur délimiter la gamme de lngueurs d nde dans laquelle la mesure de flurescence purra être effectuée, d une caméra u phtdides pur mesurer l intensité de la flurescence. Figure Un détecteur pur RT-PCR (Bi-Rad). Les LED s émettent de la lumière dans une gamme de lngueur d nde dnnée, les phtdides mesurent l intensité de la flurescence. Il faut nter que les LED s cmme les phtdides nt leurs prpres filtres. 110

119 Dérulement de la PCR classique Le dérulement de la PCR classique cmprend les étapes suivantes : Etape 1 : diluer l ADN jusqu à une cncentratin standard. Une cncentratin trp élevée en ADN peut inhiber la réactin. Etape 2 : préparer un mix cntenant tus les cmpsants de base pur la réactin : nuclétides, Taq-plymérase, ins, Un tel mix est cmmercialisé en prêt-à-l empli. Etape 3 : répartir le mix dans des tubes suivant la quantité de paire d amrces qui sera utilisée. Ceci est imprtant quand différentes séquences snt recherchées lrs d une analyse : chaque séquence recherchée a sa prpre paire d amrces. Etape 4 : ajuter à chaque mix la paire d amrces pur la séquence cible, Etape 5 : pipetter les mélanges mix + amrces et les répartir sur une plaque de micrtitratin (96 u 384 puits) suivant un schéma prédéfini, Etape 6 : ajuter dans les puits l ADN de l échantilln et les cntrôles (cntrôles psitifs, cntrôles négatifs, blanc, etc.), Etape 7 : cuvrir la plaque avec un film plastique u des capuchns afin d éviter l évapratin durant l analyse, Etape 8 : Mettre la plaque dans le thermcycleur, fermer le cuvercle, prgrammer le cycle de températures et démarrer l analyse, Etape 9 : Retirer la plaque du thermcycleur et effectuer les analyses nécessaires pur déterminer le résultat de la réactin (par exemple, électrphrèse sur gel sur le prduit de la PCR avec clratin afin de déterminer la présence d une bande caractéristique crrespndant à la lngueur attendue de l amplicn). Un prgramme de température cnsiste principalement en la répétitin d un cycle de températures (généralement 40 à 50 répétitins). Ce cycle cmprte différents paliers de température, ayant chacun une durée déterminée. 111

120 Figure Schéma d un cycle de température d une PCR Dérulement de la Real-Time PCR Le dérulement de l analyse Real-Time PCR diffère du dérulement de la PCR classique dans deux principaux dmaines l ajut au mix de réactifs qui permettent la détectin de l amplicn recherché (SybrGreen u sndes), la présence d un mdule détecteur au-dessus du thermcycleur. Le dérulement de l analyse RT-PCR se distingue par l utilisatin du SybrGreen cmme système de détectin. La RT-PCR avec SybrGreen u snde cmme système de détectin cmprte les étapes suivantes : Etape 1 : Diluer l ADN jusqu à une cncentratin standard, Etape 2 : préparer un mix cntenant les cmpsants de base pur la réactin : nuclétides, Taq-plymérase, ins, SybrGreen si nécessaire, Etape 3 : répartir le mix dans des tubes suivant la quantité de paire d amrces qui sera utilisée, Etape 4 : ajuter à chaque mix la paire d amrces et snde si nécessaire pur la séquence cible, Etape 5 : pipetter les mélanges mix + amrces et les répartir sur une plaque de micrtitratin (96 u384 puits) suivant un schéma prédéfini, 112

121 Etape 6 : ajuter dans les puits l ADN de l échantilln et les cntrôles (cntrôles psitifs, cntrôles négatifs, blanc, etc.), Etape 7 : cuvrir la plaques avec un film plastique u des capuchns afin d éviter l évapratin durant l analyse, Etape 8 : Mettre la plaque dans le thermcycleur, fermer le cuvercle, prgrammer le cycle de températures et démarrer l analyse, Pendant l analyse, au curs de chaque cycle, la flurescence de chaque puits est mesurée ; sn évlutin est représentée graphiquement durant l analyse même. Etape 9 : quand SybrGreen est utilisé cmme système de détectin : après le dernier cycle de températures les curbes de dénaturatin peuvent être enregistrées. Ainsi la température de dénaturatin Tm du prduit est déterminée ; cette température de dénaturatin peut être utilisée pur rechercher la nature de l amplicn. Etape 10 : retirer la plaque du thermcycleur. Suvent l analyse est alrs cmplètement terminée et la plaque peut être détruite. Après chaque cycle, l intensité de la flurescence est présentée sur un graphique. De cette façn, le dérulement de la réactin peut être suivi dans chaque puits pendant l analyse Interprétatin de la RT-PCR Les résultats de la PCR classique snt seulement cnnus après que les analyses pst-pcr sient réalisées. Avec la RT-PCR, les résultats snt déjà cnnus après le dernier cycle de température. Avec la RT-PCR, le dérulement de la réactin (la flurescence mesurée) est présentée de manière graphique; lrs d une réactin nrmale, n btient une curbe sigmïde typique (vir plus haut). SERIES OF 10-FOLD DILUTIONS 113

122 La phase qui est utilisée pur l interprétatin et l évaluatin de la curbe est la phase expnentielle. Cmme cette zne devient une drite après la transfrmatin lgarithmique, en pratique n utilise le lgarithme de tutes les valeurs de flurescence. C est avec la drite résultante qu n fait la suite du travail PCR et OGM Histrique OGM signifie Organisme Génétiquement Mdifié (nl. GGO = Genetisch Gemdificeerd Organisme, angl. GMO = Genetically Mdified Organism). Ce terme exprime clairement de qui il s agit: des rganismes qui nt été mdifiés par des aménagements de leur matériel génétique. La manière classique de mdifier les prpriétés des rganismes est la sélectin: c est le fait de sélectinner des descendants sur base de prpriétés favrables et de les cultiver dans l espir que ces prpriétés sient héréditaires, afin qu elles se répandent dans la descendance. La manière classique est vraiment très lente et limitée: lente car n dit attendre que la descendance elle-même sit fécnde pur puvir cntinuer à travailler, et limitée car n peut seulement travailler avec des caractéristiques qui sit snt déjà présents sit snt spntanées et dnc nn cntrôlables. Ne seraitce pas tellement plus facile si n puvait chisir les mdificatins et les intrduire dans l rganisme suhaité? Vu que les principes fndamentaux snt pareils chez tus les rganismes (ADN, réplicatin, expressin, ) il s est avéré facilement envisageable de tester et bserver le résultat du transfert des gènes d un rganisme dans le génme d un autre rganisme. Et quand n a cmpris qu un tel transfert se passe aussi dans la nature (entre bactéries elles-mêmes et entre bactérie et cellule eucaryte), n a immédiatemment pu adapter un mécanisme pur puvir transmettre d autres mdificatins à des fins prpres. Ces mdificatins snt appliquées aujur d hui surtut sur des bactéries et des plantes. Ces dernières années, n a aussi cmmencé à faire des adaptatins à but cmmercial sur les animaux. Tut semble indiquer qu avec le temps il y aura de plus en plus d rganismes génétiquement mdifiés sur le marché Principe Le principe d un OGM est la mdificatin du matériel génétique pur changer une u plusieurs caractéristiques d une cellule u d un rganisme. Cmme pint de départ, n a besin de la séquence d un gène qui cde pur la mdificatin suhaitée, par exemple la tlérance à un herbicide. On peut isler ce gène dans un plasmide (le plus suvent le plasmide Ti de A. tumefaciens), lequel est alrs intrduit dans une bactérie pur être multiplié. Seln la suite de la prcédure chisie, n peut sit infecter la plante via la bactérie, sit isler le plasmide à partir de la bactérie (après multiplicatin) pur ensuite l administrer à une cellule végétale par une méthde alternative (micr-injectin, pistlet à gène avec lequel n tire dans la cellule des petites billes métalliques sur lesquelles est fixé le plasmide, ). Remarquns qu n utilise un plasmide défectueux qui ne prvque pas de galles. 114

123 A ce principe simple quelques mdificatins divent en fait être apprtées, pur puvir travailler avec dans la pratique: à part du gène des éléments de cntrôle (prmteur, terminateur) divent être présents. Sans ces éléments de cntrôle, le gène ne peut être exprimé. C est purqui n cuple, dans le plasmide, une séquence de prmteur en amnt du gène, ainsi qu une séquence de terminateur en aval. un prmteur très utilisé est le p35s du virus de la maladie de la msaïque du chu (nm du virus = CaMV); un terminateur curant est le tns du gène de la npaline (une des pines) de A. tumefaciens. la plupart des cellules manipulées ne dnnent aucun résultat. Pur puvir sélectinner les cellules traitées avec succès, n intrduit (préalablement) dans le plasmide un gène cdant pur la résistance à un antibittique u pur la prductin d un prduit qui permette de recherchér facilement les cellules transfrmées. On cultive par exemple les cellulles traitées sur un milieu nutritif qui cntient l antibitique cncerné, et seules les cellules exprimant le gène de résistance à l antibitique peuvent se dévelpper. Après cette première sélectin, une autre sélectin dit être effectuée sur l expressin de la mdificatin même. L intégratin nn dirigée de la mdificatin dans le génme signifie aussi que dans les différentes cellules exprimant le gène, le gène peut se truver à différents endrits dans le génme. Une lignée 115

124 cellulaire dnnée avec une place d intégratin (du plasmide) bien déterminée s appelle un event ( événement ). Une des premières applicatins dans l agriculture a été l intrductin du RundUp Ready Sja. En 1996, Mnsant a mis sur le marché ce sja génétiquement mdifié, dans lequel un gène cdait pur un enzyme (EPSPS) mins sensible à l herbicide ttal RundUp, résultant en un cultivar tlérant de cet herbicide ttal. Plus tard, d autres mdificatins (génétiques) nt été mises sur le marché par un certain nmbre de firmes (Mnsant, Pineer, Syngenta, Bayer Crp Sciences, ), et pas seulement pur le sja mais aussi pur le maïs, le clza, la tmate, la pmme de terre, la papaye, la betterave, le ctn, Sur un plan cmmercial, l attentin est surtut dnnée aux mdificatins des plantes d imprtance écnmique (sja, maïs, clza, pmme de terre ), pur la résistance cntre les herbicides ttaux (Rundup glyphsate, Basta glufsinate, ) pur la résistance cntre les insectes (cmme le chrysmèle du maïs) u les virus (Papaya ringspt virus), pur des prpriétés spécifiques (fermeté plus durable de la tmate, plus d amylpectine dans l amidn de pmme de terre, plus haute teneur en vitamine A dans le riz, ). Quand n a mdifié un nmbre de cultivars d une espèce dnnée pur différentes caractéristiques, par exemple une variété de maïs qui est tlérante pur un herbicide et une variété de maïs qui est résistante au chrysmèle du maïs, alrs n peut les criser pur btenir un cultivar qui cntient les deux mdificatins et dnc les deux caractéristiques. On parle alrs d un cultivar avec des stacked events ( événements empilés ): la cmbinaisn de deux u plusieurs mdificatins dans la même plante Mdificatins appliquées Actuellement, les mdificatins cmmerciales les plus imprtantes cncernent les tlérances aux herbicides et les résistances aux insectes. Remarque : les abréviatins des gènes snt écrites en italiques (pat), les prduits des gènes (prtéines, enzymes) snt indiqués en lettres majuscules (PAT) Tlérance aux herbicides Dans la cellule, les herbicides ttaux agissent par inactivatin d une u de plusieurs enzymes, ce qui pertube un métablisme déterminé. Pur installer une tlérance à un herbicide chez une plante qui naturellement n est pas tlérante, il existe deux apprches pssibles : intrduire un gène cdant pur une enzyme qui va rendre inffensive la matière active, u intrduire un gène cdant pur une enzyme mdifiée sur laquelle la matière active n a plus d effet. 116

125 Résistance aux insectes La bactérie Bacillus thuringiensis (Bt) prduit une prtéine qui est txique pur les larves d un grand nmbre d insectes (le δ-endtxine, txine CRY). L intrductin du gène Cry assure la présence de cette prtéine CRY dans la plante ; de ce fait, les larves qui se nurrissent de cette plante cnsmment la txine et meurent. Le gène Cry pssède une variabilité étendue : il existe une multitude de variantes différentes qui cdifient chacune pur une txine mrtelle et spécifique à d autres grupes d insectes Applicatins : quelques OGM s cmmercialisés Sja (Glycine max) Identificatin Gène Prmteur Terminateur MON , RundUp Ready Sja cp4-epsps p35s tns MON89788 cp4-epsps / ctp2 p-fmv/tsf1 T-E9 A pat p35s t35s Le sja est l une des premières cultures pur lesquelles un OGM a été cmmercialisé (RundUp Ready Sja de Mnsant). Cmme annncé ci-dessus, cela cncerne une mdificatin du gène epsps qui ffre une meilleure tlérance à l herbicide ttal glyfsate. Cmme prmteur et terminateur, n a utilisé p35s et tns. Le MON89788 (Mnsant) est un sja tlérant au glyfsate de la deuxième génératin; ici n a utilisé un autre prmteur et terminateur pur un meilleur cntrôle de l expressin. Le sja libertylink (Sja A , Bayer Crp Science) cntient une mdificatin pur la tlérance à l herbicide ttal glufsinate qui est mis sur le merché sus les nms Liberty, Basta, Rely et Finale. Parce qu une résistance au glyfsate s est établie chez certaines mauvaises herbes, diminuant ainsi l efficience de l herbicide, une rtatin de cultures avec différents sja-ogm s cuplée à l utilisatin de différents herbicides ttaux, peut ralentir l apparitin de résistance. 117

126 Maïs (Zea mays) Le maïs est la plante dnt il y existe le plus d OGM s sur le marché. Les maïs-ogm s peuvent être répartis dans les grupes suivants : Uniquement les mdificatins de la tlérance aux herbicides Identificatin Gène Prmteur Terminateur T25 pat p35s t35s NK603 epsps / epsps Chaque gène epsps a sn prpre prmteur, dnt p35s tns (2x) GA21 mepsps (mdified epsps) p-ract1 (actine du riz) tns Uniquement les mdificatins de la résistance aux insectes Identificatin Gène Prmteur Terminateur MON810 Cry1Ab p35s tns MIR604 Cry3A / pmi pmtl / pubi tns (2x) MON863 Cry3Bb1 / nptii p35s (2x) tns pmi chez MIR604 et nptii chez MON863 snt des gènes de sélectin. Les différentes prtéines CRY snt actives cntre Diabrtica spp., Ostrinia nubilialis et Sesamia spp. (ravageurs des tiges de maïs). Mdificatin de la tlérance aux herbicides et de la tlérance aux insectes Identificatin Gène Prmteur Terminateur Bt11 Cry1Ab / pat p35s (2x) tns (2x) Bt176 DAS59122 (Herculex) Cry1Ab (2x) / bar 1507 Cry1F / pat Cry34Ab1 / Cry35Ab1 / pat Chaque gène a sn prpre prmteur dnt p35s chez bar Chaque gène a sn prpre prmteur dnt p35s chez pat Chaque gène a sn prpre prmteur dnt p35s chez pat t35s (3x) Chaque gène a sn prpre terminateur dnt t35s de CaMV chez pat Chaque gène a sn prpre terminateur dnt t35s de CaMV chez pat 118

127 Clza (Brassica napus) Identificatin Gène Prmteur Terminateur GT73 (canla) cp4-epsps / gxv247 p-cmvb (2x) t-e9 Tpas 19/2 pat / nptii p35s / pns t35s / tacts T45 pat p35s Riz (Oryza sativa) Identificatin Gène Prmteur Terminateur LLRICE62 bar p35s t35s À part de ces mdificatins il y a aussi des OGM de tmate (Slanum lycpersicum), pmme de terre (Slanum tubersum), ctn (Gssypium hirsutum), papaye (Carica papaya) etc Cadre légal Le cadre légal pur la mise sur le marché des OGM s dans l Unin eurpéenne est cnsigné dans deux arrêtés de 2003 et une Recmmendatin de la Cmmissin de L essence même des deux Arrêtés peut être résumée cmme suit: L bligatin pur le prducteur d infrmer le client lrsque des OGM s u des dérivés snt furnis et l bligatin de prévir la traçabilité à chaque mailln de la chaîne alimentaire, Les prduits dérivés des OGM s divent être étiquetés, même lrsqu ils ne cntiennent plus de traces d ADN u de prtéines qui prviennent des mdificatins génétiques, L étiquetage des prduits destinés aux aliments pur animaux est bligatire et s inspire des nrmes en vigueur pur l étiquetage des prduits alimentaires, Le seuil de tlérance pur la traçabilité et l étiquetage est de 0,9%. Dans l UE n distingue deux grupes d OGM : ceux avec autrisatin pur la fabricatin des prduits destinés aux aliments pur animaux u des prduits alimentaires, et ceux sans autrisatin. La règle générale est que chez les OGM s autrisés, la présence et la teneur divent être signalées sur l étiquette lrsque cette teneur dépasse 0,9%; des teneurs mins élevées snt cnsidérées cmme prvenant d une prductin antérieure lrs du prcessus de fabricatin et ne divent pas être déclarées sur l étiquette. La présence des OGM s nn autrisés n est pas tlérée; pur ces OGM s, la tlérance zér est en vigueur et lrs de la présence d un OGM nn autrisé, le prduit ne peut pas être mis sur le marché. 119

128 La liste des OGM s autrisés est tenu à jur par DG SANCO et peut être cnsultée sur En 2011, d'autres règlements nt été publiés : Le Règlement (UE) n 619/2011 de la Cmmissin du 24 juin 2011 vue de la détectin de matériel génétiquement mdifié faisant l bjet d une prcédure d autrisatin u dnt l autrisatin a expiré. Il s agit: d OGM autrisés dans un pays tiers pur lesquels une autrisatin est demandée à la Cmmissin Eurpéenne d OGM pur lesquels l'autrisatin a expiré et n'a pas encre été renuvelé La décisin d exécutin de la Cmmissin du 22 décembre 2011 sur des mesures d urgence cncernant la présence nn autrisée de riz génétiquement mdifié dans les prduits à base de riz prvenant de Chine et abrgeant la décisin 2008/289/CE, cncernant le cntrôle sur la présence u l'absence d OGM nn-gm autrisés en prvenance du riz (prduits) imprté de la Chine Analyse des OGM L analyse des OGM a deux bjectifs: la détectin de la présence d OGM dans un prduit, et lrs de la suspicin de présence ; identifier l OGM présent et en déterminer la teneur dans le prduit. Ce pint étant particulièrement imprtant pur cntrôler la limite de 0.9% définie dans la législatin. Lrs de l analyse, les pints suivants divent être abrdés avec attentin : la séquence du u des gènes intrduits qui déterminent la nature du prduit frmé, le prmteur et le terminateur pur l expressin du gène, l endrit d intégratin de l unité fnctinnelle génétique dans l ADN génmique de la plante ce qui détermine l event. L analyse cnsiste en les étapes suivants : le screening ù le taxn présent (sja, maïs, clza, ) et la présence de deux types de marqueurs est examinée de manière qualitative: le prmteur p35s et le terminateur tns qui snt généralement utilisés. Un résultat psitif pur un de deux élément indique une mdificatin génétique. On peut aussi détecter un u plusieurs gènes curant pur limiter les recherches suivantes. l identificatin : lrsque la présence d un OGM est suppsée sur base d un résultat de screening, l event présent dit être identifié. Lrs de l identificatin, les différentes event pssibles snt testé de manière qualitative. Cela se fait de manière très spécifique en PCR par le dmaine de transitin u la cnstructin est intégrée dans le génme. La présence d une séquence qui fait le passage entre ADN génmique de la plante et l ADN de la mdificatin (prmteur u terminateur) dit inclure l event sans ambiguité 120

129 quantificatin : une fis l event identifié, sa teneur dit être déterminée. Pur cela n utilise des standards avec une teneur cnnue qui snt analysés en même temps que l échantilln et sur base desquels n estime la teneur dans l échantilln. 121

130 3 MATRICES PARAMETRES 3.1 Intrductin L AFSCA cntrôle de nmbreux cmpsants présents dans la chaine alimentaire. Les résidus et cntaminants dans les prduits d rigine animale dnt le cntrôle est impsé par la Directive 96/23/CE du Cnseil du 29 avril 1996 en fnt partie. Cette Directive cntient les mesures de cntrôle vis-à-vis de certaines substances et leurs résidus dans les animaux vivants et les prduits dérivés, cmme la viande, le lait et le miel. Cette Directive détermine cmment un prgramme natinal de cntrôle dit être établi : quels résidus divent être annuellement dépistés, dans quelle matrice et avec quelle fréquence. Chaque année, les Etats Membres divent établir et sumettre leur plan natinal de cntrôle à l UE. La législatin eurpéenne est traduite dans le «Plan Natinal pur les Résidus et Cntaminants dans les animaux vivants et les prduits d rigine animale» Annexe I de la Directive divise les résidus en 2 grupes : Grupe A cntient les substances interdites et Grupe B les médicaments vétérinaires et les cntaminants Tableau 3.1.1: Annexe I de la Directive UE 96/23/CE Grupe A: Substances ayant un effet anablisant et Substances nn autrisées Stilbènes, dérivés de stilbènes et leurs sels et esters Agents antithyrïdiens Stérïdes Resrcylic acid lactnes,-y cmpris zeranl Beta-agnistes Substances incluses dans l annexe IV du règlement (CEE) 2377/90 du Cnseil du 26 juin 1990 Grupe B: Médicaments Vétérinaires (1) et Cntaminants Substances antibactériennes, y cmpris sulfamides, quinlnes Autres médicaments vétérinaires Anthelmintiques Anticccidiens, y cmpris nitrïmidazles Carbamates et pyréthrïdes Tranquillisants Anti-inflammatires nn stérïdiens (AINS) Autres substances exerçant une activité pharmaclgique Autres substances et cntaminants envirnnementaux Cmpsés rganchlrés, y cmpris les PCB s Cmpsés rganphsphrés Eléments chimiques Myctxines Clrants Autres 1 Y cmpris les substances nn-enregistrées qui purraient être utilisées à des fins vétérinaires. Dans ce chapitre plusieurs des grupes mentinnés ci-dessus sernt traités ainsi que les techniques d analyses les plus imprtantes. 122

131 Ultérieurement quelques autres cmpsants imprtants sernt traités cmme l acrylamide, les vitamines et la recherche des farines animales. 3.2 Cmpsant : structure, effet et txicité, techniques d analyse Stilbenes et dérivés Structure Ce grupe de substances snt des œstrgènes synthétiques. Ils pssèdent une activité similaire à l hrmne naturelle l œstradil, mais n nt pas, cntrairement aux hrmnes sexuelles, une structure stéride. Diéthylstilbestrl (DES) est le représentant le plus cnnu du grupe des stilbènes et ne diffère pas beaucup, d un pint de vue chimique, des œstrgènes naturels. Ceci se manifeste clairement lrs d un cntrôle apprfndi de la structure de diéthylstilbestrl. OH HO Figure 3.2.1: La cncrdance entre le diéthylstilbestrl (à gauche) et le 17ß-œstradil (à drite). L effet strgénique est surtut attribué au fait que les deux grupes hydrxyliques se truvent sur la même distance spatiale que l œstradil. Il existe un certain nmbre de cmpsants apparentés au diéthylstilbestrl, également avec un effet œstrgène (vir Figure 3.2.2). OH OH OH HO Diëthylstilbestrl HO Hexestrl HO Diénestrl Figure 3.2.2: analgues du DES: hexestrl en diénestrl 123

132 Effet et txicité pur l être humain et/u l animal Le diéthylstilbestrl était utilisé cmme additif alimentaire u cmme implant sus-cutané dans l reille des bvins pur stimuler la crissance. Il s avairait tutefis cancérigène. Les filles DES (dnt les mères avaient eu du DES sus prescriptin, à titre préventif cntre une fausse cuche) curaient un plus grand risque de prblèmes de fertilité et étaient susceptibles de dévelpper des types de cancer très spécifiques au niveau du vagin u au museau de tanche. De ce fait, l utilisatin du DES est interdite partut Techniques d analyse Le DES est lentement métablisé dans le fie et excrété dans l urine et les fèces. Des méthdes nt aussi été dévelppées pur le tissu musculaire, suvent matrice unique d intrductin. Les techniques utilisées snt le GC-MS (et/u GC-MS n et GC-MS/MS) et le LC-MS (et/u LC-MS n et LC-MS/MS) Agents antithyrïdiens Intrductin Avec l industrialisatin de l élevage du bétail n essaie d augmenter la prductivité : prduire plus de viande/pids à un prix cûtant égal u plus faible. Les agents antithyrïdiens u les inhibiteurs thyrïdiens snt un des myens utilisés d une façn illégale Effet et txicité pur l être humain et/u l animal Les effets des agents antithyrïdiens chez les bvins snt à attribuer au fait qu ils nt un effet suppressif sur le fnctinnement nrmal de la glande thyrïde. Ainsi, il y a prductin réduite des hrmnes thyrïdiennes, la thyrxine (T 4 ) et le trijdthyrnine (T 3 ). Par cnséquence, il y a une augmentatin du remplissage de l estmac-tube digestif et une plus grande rétentin d eau dans les tissus. Cela abutit à une augmentatin spectaculaire du pids en peu de temps. La viande, en prvenance des animaux traités avec des agents antithyrïdiens, est dans la plupart des cas, très humide et très dégulinante, fréquemment plus pâle que la nrmale et d une qualité inferieure. De ce fait, l utilisatin des agents antithyrïdiens peut être cnsidérée cmme une frme manifeste de fraude : n vend au cnsmmateur, de l eau au prix de la viande. Et d ailleurs, il y a de frtes indicatins que la présence des agents antithyrïdiens et leurs métablites peuvent avir un effet nuisible sur la santé publique. Certaines substances snt cancergènes u tératgènes 1. 1 tératgène: prpriété d'une substance afin de prvquer des anmalies du fetus pendant la grssesse si la mère est en cntact avec la substance, u inhaler qu'elle ccupe. 124

133 L utilisatin des agents antithyrïdiens est dès lrs aussi prhibée dans l UE et beaucup d autres pays. Par l instauratin d une prhibitin, un cntrôle efficace pur le dépistage de l administratin de telles substances dit être mis en place Structure et les grupes les plus imprtants Les agents antithyrïdiens, imprtant pur l engraissage des bvins, peuvent être divisés en résumé dans deux grupes : Un premier grupe est frmé par les agents antithyrïdiens naturels, une cllectin de prduits naturels à effet antithyrïdien; Un deuxième grupe cntient les agents antithyrïdiens xénbitiques. Les agents antithyrïdiens naturels se retruvent surtut dans le matériel d rigine végétale plante sus frme de précurseur, précité des glucsinlates. Sur le schéma suivant, le catablisme général des glucsinlates est présenté. Sus l influence d un enzyme, la thiglucsidase u myrsinase, snt islés de la mlécule mère. R C S-glucse N-OSO 2 O- thiglucsidase R C S- N- + glucse + sulfate R N = C = S isthicyanate "R" R S C N SCN - ph= 5-9 ph = 3-4 R C N + S nitrile "R" xazlidine-2-thin CN - Figure 3.2.3: Schéma général de l hydrlyse enzymatique des glucsinlates ( R dépendant de la structure du grupe R) Le reste de la mlécule se réfrme vers un isthicyanate u un nitrile, en fnctin du ph. En fnctin de la structure du R-grupe, l isthicyanate est transfrmé en thicyanate et ensuite éventuellement encre en in de thicyanate u en xazlidine-2-thine. 125

134 La frmule dévelppée de l xazlidne-2-thine le plus imprtant, le dérivé 5-vinyle, est repris dans Figure Ici n retruve la séquence N-C-S, ce qui est typique pur une substance à effet antithyrïdien. Le 5-vinyle-1,3-xazlidine-2-thine a reçut à sa décuverte le nm vulgaire de «gitrine», ceci par sn puvir de générer un gitre chez l être humain et l animal. Le glucsinlate d ù la gitrine est frmée s appelle la «prgitrine». Le clza peut cntenir jusqu à 1% de glucsinlates. Figure 3.2.4: frmule dévelppée de 5-vinyl-1,3-xazlidine-2-thine On retruve la séquence N-C-S aussi dans la plupart des agents antithyrïdiens xénbitiques. Ceux-ci cntiennent les dérivés de thiuracil et mercaptimidazle: Analgues du thiuracil (entre autres, le méthylthiuracil et le prpylthiuracil); Analgues du mercaptimidazle (le tapazle et le mercaptbenzimidazle). Lrs d utilisatin illicite, c était surtut le méthylthiuracil (MTU) qui était utilisé. MTU a cnnu une utilisatin très imprtante durant les années 70. C H 3 N N S H C H 3 N N S H N H N S H O H Méthylthiuracil Tapazle Mercaptbenzimidazle Figure 3.2.5: frmules dévelppées de différents agents antithyrïdiens : méthylthiuracil, tapazle, mercaptbenzimidazle A côté de ces deux grupes-ci d agents antithyrïdiens, il y a encre quelques ins inrganiques, cmme le Li +, ClO4 - et SCN - qui nt une activité antithyrïdienne. 126

135 Analytique Le dépistage des agents antithyrïdiens se fait principalement de deux façns : indirect (screening) : en apercevant les symptômes d une hypthyrése; direct (cnfirmatin) : en décelant les résidus des agents antithyrïdiens. Les symptômes de l hypthyrése peuvent être aperçus par les myens suivants : macrscpiquement : par exemple, carcasse aqueuse et surtut présence d une glande thyrïde agrandie analyse gravimétrique : en pesant la glande thyrïde des bvins (> 60 g : suspect) micrscpique : changements dans l image histlgique de la glande thyrïde; clinique-bilgique : abaissement de la cncentratin des hrmnes thyrïdiennes. Les deux premières méthdes se situent plus dans le dmaine de la médecine vétérinaire, la trisième méthde et la démnstratin des résidus des agents antithyrïdiens se situent dans le dmaine chimique. Nrmalement, une glande thyrïde de bvin pèse envirn 20 grammes. Parfis, des gitres, typique pur un animal traité avec des agents antithyrïdiens, nt été bservés pesant 200 g et dans un cas exceptinnel, pesant 1200 g. Néanmins, la pssibilité existe que des animaux traités, avec par exemple le MTU, ne manifestent pas un accrissement de la glande thyrïde. Figure 3.2.6: glande thyrïde Figure 3.2.7: un gitre chez l être humain Suvent, des discrdances claires snt bservées entre la recherche chimique et les méthdes basées sur les symptômes de l hypthyrése. L argument le plus imprtant qui peut être cité cntre l empli des symptômes de l hypthyrése cmme myen de détectin des agents antithyrïdiens, est le fait que les symptômes peuvent être prvqués par différents facteurs incntrôlables tels que certaines maladies, l efficience d idide et la présence des agents antithyrïdiens naturels. Ces méthdes (=méthdes de screening) ne servent qu à sélectinner les échantillns pur une analyse chimique décisive (méthde de cnfirmatin). 127

136 Techniques d analyse pur les agents antithyrïdiens xénbitiques Autrefis la technique de la chrmatgraphie sur cuche mince était appliquée pur le dépistage des agents antithyrïdiens. Pur une détectin sensible n devait dérivatiser, ainsi tutes les substances btenaient une clratin identique. Aujurd hui, dans les Etats Membres de L UE, la déterminatin par spectrmétrie de masse est impérative seln la Décisin 2002/657/UE. Initialement, la GC-MS (u GC-MS n ) était utilisée, mais à présent les agents antithyrïdiens snt presque uniquement détectés par LC-MS u LC-MS n Matrices Par des expériences animales il s avère que les cncentratins de MTU dans la glande thyrïde snt envirn 20 à 100 fis plus élevées que la nrmale dans la viande. Dans le rein aussi les cncentratins snt plus élevées que dans des échantillns de viande. Il est évident que la glande thyrïde est la matrice idéale pur le dépistage. Tutefis, si la glande thyrïde n est pas dispnible, n effectue de préférence le dépistage sur le diaphragme. Ce muscle peut facilement être excisé et identifié, il n a pas de valeur écnmique et, en prprtin aux autres muscles, cntient une cncentratin élevée d agents antithyrïdiens. Chez des animaux vivants, l urine est la matrice la plus apte Stérïdes: substances à effet andrgène, estrgène u gestagène Intrductin L'utilisatin des préparatins hrmnales a été intrduite, dans les années cinquante pur l élevage du bétail. Il s'agit ici des substances à effet andrgène, œstrgène u gestagène, suvent désignées sus la dénminatin anablisants. L'utilisatin des anablisants abutit à une augmentatin de pids plus rapide de l'animal et une cnversin amélirée de la nurriture par une rétentin d'azte accrue au curs du traitement. La ntin que certaines de ces substances peut prduire un danger pur la santé publique, a pur cela incité les législateurs au sein de l'ue à interdire ttalement l'utilisatin de ces substances dans l élevage de bétail et d analyser les résidus dans les animaux de bucherie. Vu le bénéfice retiré de l'usage des anablisants dans l élévage de bétail, il est encre saisi de temps en temps des préparatins hrmnales dnt l'utilisatin nest pas tujurs simple à détecter. L'utilisatin des méthdes spécifiques et universelles pur le cntrôle de l'utilisatin illégale d'anablisants suppse une recherche de résidu ciblée dans le matériel animal. Une cnnaissance des substances, leurs métablites, les teneurs d excrétin et de résidus en fnctin des mdes de traitement et la matrice est indispensable. 128

137 Structure et classificatin Classificatin Le terme anablicum" cmprend un très large éventail de cmpnsants qui peuvent être assimilés, seln leur activité bilgique dans la prductin animale, aux hrmnes sexuelles. Les anablisants peuvent être classés sur base de différents critères (tableau 3.2.1). La plupart des anablisants nt une structure de stérïde. Les stérïdes peuvent être classés à l'aide du nmbre d'atmes de carbne et le site de prductin principal. Les estrgènes, andrgènes et gestagènes pssèdent respectivement 18, 19 et 21 atmes de carbne. Seln leur activité hrmnale aussi, les hrmnes anablisantes peuvent être réparties en estrgènes, andrgènes et gestagènes. Tableau 3.2.1: Classificatin d un nmbre d anablisants estrgènes andrgènes gestagènes stérïdes naturels (activité par vie rale faible) estrne teststérne prgestérne 17ß-estradil hydrxyprgestérne estril anablisants synthétiques (en général actif par vie rale) stérïdiens nnstérïdiens ethinylestradil nrteststerne medrxyprgesterne mestranl methylteststerne melengestrl trenblne megestrl bldenne chlrmadinne methylbldenne chlrteststerne stanzll fluxymesterne diethylstilbesterl dienestrl hexestrl zeranl En utre, en plus d'une classificatin des stérïdes anablisants utilisés par la structure chimique (stérïdiens u nn stérïdiens) d'un éventuel classement par la surce (endgène u exgène). Cmme tels les stérïdes anablisants peuvent être divisés en: stérïdes endgènes: les hrmnes sexuelles qui snt prduites naturellement dans le crps snt présents. Ces stérïdes snt principalement inactivés par le fie et ne snt dnc pas très actifs par vie rale. hrmnes stérïdes synthétiques: stérïdes exgènes u cmpsés chimiques dnt certains xénbitiques agissent en mimant les effets des stérïdes endgènes (aussi appelée stérïdes anablisants exgènes u xénbitiques). 129

138 Les stérïdes anablisants xénbitiques snt les plus actifs par vie rale. Les esters des hrmnes naturelles, l'œstradil, la teststérne et la prgestérne, peuvent être cnsidérés cmme une classe intermédiaire. Le terme endgène u exgène devrait tujurs être cnsidéré en fnctin des espèces et du sexe de l'animal. Ainsi, le 19-nrteststérne est endgène dans le prc mâle, le cheval et le bvin gestant Oestrgènes Ceux-ci peuvent être subdivisés en estrgènes endgènes, semi-synthétiques et synthétiques. Oestrgènes endgènes estrne; estradil; estril. O OH OH OH HO HO HO Estrne Estradil Estril Figure 3.2.8: Frmules de l estrne, estradil et estril Parmi ces cmpsés, seulement la frme 17-bêta est active. En plus du grupe de dérivés d'hrmnes naturelles, il existe deux grupes principaux d estrgènes nn-stérïdiens: les stilbènes (vir ci-dessus) et zéranl et autres dérivés (vir ci-dessus) Andrgènes La structure de base des andrgènes est le squelette andrstane avec 19 atmes de carbne et un grupe 17-hydrxyl, un grupe 3-cétne et une duble liaisn entre C4 et C5. Les andrgènes peuvent également être divisés en endgènes, semi-synthétiques et synthétiques Andrgènes endgènes Au sens strict les andrgènes endgènes cmprennent la teststérne et ses métablites (cmme andrstérne et andrsténlne). La figure mntre le teststérne et un de ses métablites, l andrstérne. 130

139 OH O 0 H0 H Teststérne Andrstérne e Figure 3.2.9: Teststérne et un de ses métablites Andrgènes semi-synthétiques Dans ces dérivés, le grupe 17-OH est estérifié avec un acide rganique. Ainsi n crée des préparatins "retard", avec actin prlngée par la libératin lente de la substance à partir du site d'injectin. Une fis dans la circulatin sanguine, l'ester est hydrlysé et ainsi la teststérne libre (le stéride endgène) se frme. Le plus curant est l'ester prpinate. L'extensin de la durée est presque prprtinnelle à la lngueur de la chaîne de carbne dans l'acide. Dans les sites d'injectin, n a déjà truvé plusieurs esters de teststérne Andrgènes xénbitiques Il existe plusieurs andrgènes xénbitiques dérivés de la teststérne. Plusieurs grupes snt discutés ci-dessus: Un grupe imprtant cmprend la 19-nrteststérne u la nandrlne et ses esters. La nrteststérne est l'un des plus imprtants stérïdes anablisants. Elle a également tenu une place particulière dans les andrgènes, cmpte tenu de sa présence naturelle dans le verrat (cchn mâle) et l'étaln. Des cncentratins faibles snt même cmmunes chez les bvins femelles à la fin de la gestatin. Un autre grupe d andrgènes snt les derivés d alkyle, cmme la 17α méthyl-teststérne. Parce que le grupe alkyle se truve sur la psitin C17, le grupe 17-OH est prtégé cntre les enzymes hépatiques de srte que l'administratin perrale est pssible. Le grupe suivant a une duble liaisn supplémentaire sur la psitin 1, 2: bldénne et méthylbldenne (u methandienn). La trenblne peut être dérivée de la teststérne par deux liaisns dubles supplémentaires: sur la psitin 9,10 et 12,13 ( tren est également dérivé de triène: tris dubles liaisns). Un autre anablisant imprtant qui est classé chez les andrgènes est le stanzll. La structure du stanzll est très différente des andrgènes précédents par la présence d'un anneau pyrazl. 131

140 Gestagènes La structure de base des gestagènes est le squelette pregnane. Cmme avec les estrgènes et les andrgènes, n peut également faire la distinctin entre les gestagènes endgènes, les gestagènes semi-synthétiques et les gestagènes synthétiques Gestagènes endgènes La prgestérne est aussi appelée l hrmne du "crpus luteum". La frme de l'excrétin de la prgestérne dans l'urine est le pregnanedil. Un autre gestagène naturel est 17α-hydrxyprgestérne. CH 3 C=0 CH 3 C=0 OH Prgestérne Hydrxyprgestérne Figure : Frmules structurelles de prgestérne et de 17α-hydrxyprgestérne Gestagènes semi-synthétiques Les esters de l hydrxyprgestérne peuvent être classés dans cette catégrie. En particulier les esters acétate et caprate du 17-hydrxyprgestérne snt imprtants (acetxyprgestérne et caprxyprgestérne). Par hydrlyse, ils dnnent la 17-hydrxyprgestérne. Les esters en tant que tels, peut être truvés dans la graisse rénale Gestagènes synthétiques La figure suivante présente quelques uns des principaux gestagènes synthétiques: médrxyprgestérne (acétate), chlrmadinne (acétate), mégestrl (acétate) et mélengestrl (acétate). Elles peuvent être dérivées de la (hydrxy) prgestérne par substitutin d'un grupe méthyle sur la 6-psitin et une duble liaisn supplémentaire sur la psitin 6,7. Le mélengestrl (acétate) a un grupe CH2 supplémentaire sur le C16 et pur le chlrmadinne, le grupe méthyle C6 est remplacé par un chlre. En particulier, les esters d'acétate snt cnnus pur s'accumuler dans la graisse rénale. 132

141 Répnse de crissance La première enquête sur l'utilisatin de stérïdes anablisants en tant que prmteur de crissance chez les animaux remnte à 1939, ntamment en matière d estradilbenzate chez les vlailles (Zandek et Marx, 1939). Après la synthèse du DES (Ddds et al, 1938), ce prduit, relativement peu cûteux, actif par vie rale a d'abrd été testé chez les vlailles. Les expériences avec des andrgènes nt cmmencé envirn 10 ans plus tard (Andrews et al, 1949). L'impact écnmique des stérïdes anablisants est cnsidérable: dans l'utilisatin américaine de stérïdes anablisants chez les bvins il y a des marges de prfit indiqué d'envirn 17 $ par animal. Sur le marché de détail, la marge bénéficiaire devrait encre augmenter ( États-Unis, la pratique juridique, Hancck, 1990). Les substances anablisantes accélèrent la crissance glbale des tissus et augmentent aussi la cnversin des aliments dans les prtéines musculaires (augmentatin de la cnversin des aliments). Outre ce gain de pids accru, il se prduit généralement une améliratin de la qualité des carcasses. La répnse est très différente en fnctin de la préparatin, l'espèce et le sexe de l'animal. En utre, l'utilisatin de stérïdes anablisants affecte aussi la qualité de la viande elle-même Zéranl et dérivés Structure Le zéranl est un prduit à effet estrgénique mais avec une structure ttalement différente de l estradil et des stérïdes. Le zéranl a des prpriétés de stimulatin de crissance. Il faut dire que la frme "active" est la frme 7-α, tandis que pur les substances à structure stérïde la frme β est la frme "active". Le zéranl peut être frmé in viv 2 par la myctxine zéaralénne. La zéaralénne peut être truvée entre autres dans le maïs infecté. Il a des prpriétés estrgéniques et peut être prduit en grandes quantités par des cultures de certaines misissures (par exemple Fusarium rseum ; 3-15 g de prduit par kg de culture de misissure). Le zéranl a une activité estrgénique plus grande que le zéaralénne. L'utilisatin de zéranl est interdite dans l'ue. En déterminant le zéranl et/u le taléranl (le métablite principal de zéranl) dans p.ex. l'urine des animaux, il est imprtant de vérifier si n ne peut pas l attribuer à la présence des myctxines. Le tableau ci-dessus mntre clairement que, dans le cas de myctxine, le zéaralénne, le β- zearalenl et/u le α-zearalenl sernt également présents, ce qui n'est pas le cas lrs de l'utilisatin de zéranl cmme anablisant. 2 dans l rganisme vivant 133

142 OH O CH 3 HO O zearalenne O OH O CH 3 OH O CH 3 HO β-zearalenl OH O O O H OH HO α-zearalenl FUSARIUM FUNGUS CH 3 OH O CH 3 OH H HO β-zearalanl ( taleranl) O H OH HO O α-zearalanl (zeranl) OH H OH O CH 3 HO O zearalanne ZERANOL IMPLANT O Figure : Zéranl et les dérivés prvenant d un traitement et les substances apparentées prduites par la misissure Fusarium Techniques d analyses GC-MS/MS u GC-MS n et LC-MS/MS u LC-MS n ß-agnistes Intrductin Les exigences des cnsmmateurs pur la viande snt de plus en plus strictes. Ils demandent une viande tendre et maigre à un prix raisnnable. La qualité des animaux d'abattage est parfis vue cmme un vlume musculaire qui dit être le plus grand pssible au mment de l abattage. Pur ces raisns, n se sert parfis de substances nn autrisées /nn recnnues u de l empli abusif des médicaments. Les ß-agnistes, par exemple le clenbutérl le plus cnnu d entre eux, snt 134

143 dnc arrivés dans l engraissement en tant que prmteur de crissance: à l rigine utilisé cmme un brnchdilatateur (utilisé en médicine humaine pur des prblèmes respiratires et l asthme) et ensuite, cmme redistributeur, basé sur leurs effets secndaires d une meilleure utilisatin des nutriments. Il y a mins de graisse et le tissu graisseux est même activement dégradé, tandis qu il y a plus de tissu musculaire. Ce qui induit une cnversin alimentaire amélirée Effets et la txicité pur les humains et/u animaux Le clenbutérl et d'autres ß-agnistes appartiennent au grupe des ß2-sélectifs agnistes u bêtamimétiques. L'effet est exercé par la stimulatin de récepteurs spécifiques. Ces récepteurs snt nrmalement stimulés par l adrénaline et la nradrénaline (qui snt synthétisés et répandus par les glandes surrénales après stimulatin par le système nerveux sympathique) (Figure ). Après la liaisn des ß-agnistes sur ces récepteurs, situés sur la membrane cellulaire, de nmbreuses réactins nt lieu. Après stimulatin des récepteurs, l'amp cyclique est prduit dans la cellule, celui-ci fnctinne cmme messager secndaire et apprte, par influence du métablisme dans la cellule, certains effets. H H OH H HO HO C C N CH 3 H OH H Adrénaline HO CH C NH 2 H H HO Nradrénaline Figure : frmules dévelppées de l adrénaline et de la nradrénaline Les récepteurs peuvent être divisés en α- et β-récepteurs, ce dernier grupe peut encre être subdivisé en β1- et β2-récepteurs. Tut cmme pur la présence de récepteurs dans le système nerveux central, n peut faire la classificatin suivante des récepteurs dans les divers tissus (Tableau 3.2.2): Tableau Lcalisatin et effet de α-, β1- et β2-récepteurs Récepteur Effet après stimulatin du récepteur Α β1 β2 cnstrictin des vaisseaux sanguins, en particulier dans les znes cutanées et intestinales augmentatin du rythme cardiaque, augmentatin du débit systlique et la vitesse de cnductin cardiaque, raccurcissement de la péride réfractaire cardiaque, augmentatin de la glycgénlyse et la liplyse relaxatin des muscles brnches, relaxatin du muscle utérus Les ß-agnistes snt des substances apparentées (crps) à l adrénaline et la nradrénaline, ù, par des mdificatins chimiques, la fnctin ß2 est renfrcée par rapprt aux fnctins α et ß1. La 135

144 fnctin ß1 reste présente chez la plupart des cmpsés. En particulier à des dses plus élevées u à une applicatin plus fréquente, des effets secndaires peuvent se prduire. Ceci cncerne en général des effets sur le cœur (vir Tableau 3.2.2). En utre, l effet est prlngé par un métablisme mdifié, mins rapide. Cntrairement aux stérïdes anablisants, il y a des effets txiques aigus des résidus de bêtaagnistes qui snt décrits. En France et en Espagne un certain nmbre de persnnes snt tmbées malades après avir mangé du fie d'animaux traités avec le clenbutérl. En Espagne, il s agissait en 1990 de 125 persnnes dans 43 familles lcalisées dans 4 prvinces. Aussi les "dealers" du clenbutérl devenaient la victime mrtelle de leurs prpre préparatins (Irlande). Le clenbutérl est parfis également appelé "Angel Dust" (pudre d'ange). En Chine, plus de 300 persnnes nt été hspitalisées après avir cnsmmé de la viande de prc prvenant d'animaux traités avec le clenbutérl (septembre 2006). Les symptômes snt des tremblements prnncés des mains et des pieds, des palpitatins cardiaques, nausées, maux de têtes et vertiges Structure et grupes principaux Les ß-agnistes nt une structure de base cmmune: la phényléthylamine. Ils appartiennent au grupe des aryléthanlamines. CH 2 CH 2 NH 2 -Phényléthylamine Aryléthanlamine CH CH 2 NH R OH Figure : structure de base du phényléthylamine et de l aryléthanlamine Méthdes d analyse Pur l'analyse des ß-agnistes de nmbreuses méthdes snt décrites. Elles snt principalement basées sur des méthdes immunlgiques et chimiques (HPTLC, HPLC, GC-MS et LC-MS). Il y a aussi des méthdes générales qui n examinent pas le résidu, mais l'effet des ß-agnistes. Étant dnné la grande variété des ß-agnistes, l'utilisatin des méthdes de dépistage snt recmmandées. Elles snt basées sur des méthdes immunchimiques (avec un anticrps nnspécifique) u p.e. des paramètres physilgiques Méthde de dépistage Au RIKILT-DLO n a décuvert que les cncentratins de créatinine et de lactate dans l urine des veaux est indicative de l'utilisatin des ß-agnistes. Ces cncentratins peuvent être mesurées par des analyses enzymatiques. Des dizaines d'analyses d'échantillns par heure snt pssibles en utilisant un aut-analyser. Il est également pssible de dévelpper une méthde applicable "sur place" à la ferme, basée sur ce type d analyse. 136

145 Méthdes immunchimiques Pur les ß-agnistes des méthdes immunchimiques (ELISAs) peuvent être utilisées. Les anticrps aux ß-agnistes snt surtut spécifiques aux grupes et mins aux prduits. De ce fait de multiples ß- agnistes peuvent être recerchés simultanément. Plusieurs kits cmmerciaux snt dispnibles Méthdes chimiques Purificatin Pur les techniques d'extractin et de purificatin plusieurs techniques snt décrites. En raisn de la présence de grupes à la fis acides et basiques dans des phénls relativement plaires et les résrcinls il faut, en cas d'extractin liquide-liquide, utiliser des slvants plaires, ce qui cnduit à la c-extractin de nmbreux cmpsés interférents de la matrice. Pur les multiméthdes le chix du ph est imprtant (uniquement en milieu acide tus les ß-agnistes snt chargés psitivement. L extractin paire d ins a également été décrite et la SPE a fréquemment été utilisée (C4, C8 et C18 mélangé avec l échangeur des catins). La chrmatgraphie d'immun-affinité a également été utilisée, tandis que, plus récemment, l'utilisatin des MIPs est apparue très intéressant pur une bnne purificatin. Méthdes HPLC Pur la déterminatin du clenbutérl dans l'urine, les tissus, le furrage et les préparatins, un certain nmbre de méthdes HPLC nt été décrites. Dans la plupart des cas il s agit de chrmatgraphie par paire d ins en phase inversée avec détectin électrchimique u détectin dide-array. Une dérivatisatin sélective pstclnne a aussi été appliquée sus la frme d une réactin Brattn Marshall (diaztatin et frmatin d'un clrant diaz).seuls les cmpsés du grupe des anillines peuvent être recherchés avec cette réactin. Maintenant les méthdes HPLC ne peuvent être utilisées que cmme techniques de dépistage u cmme techniques pur la purificatin des extraits de matériel bilgique. Pur l examen de cnfirmatin il faut utiliser des analyses GC-MS u LC-MS. Méthdes de spectrmétrie de masse Dans les États membres de l'ue, la spectrmétrie de masse est exigée par la décisin 2002/657/CE pur la cnfirmatin de la présence de ces substances, cmme pur d'autres substances interdites (cmpsés de l annexe A). Pur la recherche en GC-MS, les bêta-agnistes divent, à cause de leurs frte plarité, être derivatisés, en cmpsés plus vlatils. En fnctin du réactif utilisé, les grupes hydrxy et amin snt cnvertis en dérivés mins plaires. La silylatin de l'hydrxyle à une O-TMS u un O-éther de butyle tertiaire dimethylsilyl (O-TBDMS) est largement utilisée. En utre, une acylatin des deux grupes hydrxyle et amine est pssible (TFA, PFPA u HFB). Une cmbinaisn de silylatin et acylatin a également été utilisée (des dérivés O-TMS/N-TFA snt frmés). 137

146 La frmatin de dérivés cycliques de l'acide brique est un fait intéressant (Lelux et al., 1989). La fragmentatin de la chaîne latérale est en partie empêchée et des fragments de masse plus élevée snt btenus. En plus de l améliratin de la vlatilité, la dérivatisatin jue un rôle imprtant dans la fragmentatin. L'intégratin de différents grupes mdifie la mlécule de srte que lrs de la fragmentatin au spectrmètre de masse (en particulier dans le cas d inisatin plus dure par impact d'électrns) certains fragments snt mieux stabilisés et btiennent une plus grande intensité dans le spectre de masse. Cela ffre la pssibilité d'influencer la fragmentatin de telle srte qu avec des spectrmètres de masse avec uniquement IE, des ins fils plus spécifiques (avec des valeurs de masse plus élevées) sient détectés à une limite de détectin assez basse. H 2 N Cl Cl Figure : des dérivés cycliques de l'acide brique de clenbutérl Dans les dérivés O-éther de TMS,par exemple le clenbutérl (btenu par spectrmétrie par impact d électrns) est btenu. Le spectre de masse du clenbutérl mntre une masse dminante (m/e 86) en brisant la chaîne latérale. L'autre fragment (m/e 262) et les autres fragments à masse plus élevée, n apparaissent qu en faible intensité. En figure , le spectre de masse du TMS dérivé du clenbutérl, dans un système de intrap, est affiché en mde EI. O B N C 4 H 9 C(CH 3 ) 3 100% 86 SMP - BKG CLENBUTEROL MSTFA/TMSI EI Figure : Spectre de masse de clenbutérl-o-tms (en EI) Aujurd'hui surtut la LC-MS est utilisée (LC- MS n et aussi LC-MS/MS), de srte qu il n y a plus de prblèmes de dérivatisatin. Dans les méthdes de spectrmétrie de masse, les analgues deutérés des bêta-agnistes snt utilisés cmme étaln interne, ce qui est très favrable à la quantificatin. 138

147 Matrices De nmbreuses matrices pur l'analyse des bêta-agnistes snt décrites. On peut analyser aussi bien l urine que les matières fécales d animaux vivants. Lrs d échantillnage à la ferme, n dit également avir la pssibilité d analyser l'eau, des aliments et des mélanges à base d herbes. Pur les animaux abattus, les reins et le fie snt plus intéressants que la viande, car les niveaux de résidus snt plus élevés et restent plus lngtemps. Pur démntrer l usage des beta-agnistes lngtemps après l'arrêt du traitement, des pils (de préférence fncés) et la rétine snt spécialement indiqués Les cmpsés Annexe IV Les cmpsés énumérés dans l'annexe IV du Règlement (CEE) nr. 2377/90 du Cnseil snt des substances pharmaclgiquement actives pur lesquelles les niveaux maximaux admissibles ne peuvent pas être établis. Le danger de l'utilisatin de ces substances est cnnu, mais il est impssible de déterminer le risque d un traitement (par exemple, cancérigène) et une LMR ne peut pas être enregistrée. Ces substances ne snt pas autrisées dans l'ue. Par l'abrgatin du règlement (CEE) N 2454/ /90, ces substances snt inclus dans la tableau 2 "Substances interdites" du Règlement (UE) n 37/2010 du 22 de la cmmissin du décembre 2009 «relatif aux substances pharmaclgiquement actives et à leur classificatin en ce qui cncerne les limites maximales de résidus dans les aliments d rigine animale» Chlramphénicl Structure Figure : Frmule structurelle de chlramphénicl Fnctins Chlramphénicl inhibe la synthèse prtéique au niveau des ribsmes. Il s'agit d'un antibitique bactéristatique, actif cntre les rganismes Gram+ et Gram-. Il est insluble dans l'eau et très sluble dans les graisses. A l'rigine le chlramphénicl a été dérivé de la bactérie Streptmyces venzuelae. Il a été le premier antibitique qui a été préparé à grande échelle. 139

148 Le chlramphénicl est métablisé en glucurnate de chlramphénicl dans le fie. La plupart du chlramphénicl administré est excrété par les reins sus frme du métablite inactif, glucurnate de chlramphénicl Utilisatin et txicité Chez les êtres humains le chlramphénicl peut endmmager irréversiblement la melle sseuse, et peut causer l aplasie hématpïétique (anémie aplastique). Pur cette raisn l usage du chlramphénicl est devenu interdit dans l Unin Eurpéenne. Dans les pays à faibles salaires c est encre utilisé parce que le chlramphénicl est bn marché Technique d analyse ELISA pur le screening et GC-MS(/MS) u GC-MS n et LC-MS/MS u LC-MS n pur les cnfirmatins Dapsne Structure La dapsne est un antibitique dnt le mécanisme d'actin est très cmparable à l actin des sulfnamides (vir ci-dessus). Figure : Frmule structurelle de dapsne Technique d analyse LC-MS(/MS) et LC-MS n Nitrimidazles Structure Les nitrimidazles snt surtut utilisés pur traiter les infectins à parasites prtzaires. Ces substances nt dnc suvent été utilisées pur la préventin et le traitement de la «maladie de la tête nire» (histmnse) chez les dindes et autres vlailles, pur la préventin de la trichmnase chez d'autres iseaux et pur le traitement de la trichmnase chez les bvins. Ces cmpsés synthétiques snt également imprtants dans le traitement des infectins bactériennes anaérbies. 140

149 Leur structure de base est un anneau imidazle avec un grupe nitr (NO2). Les nitrimidazles les plus curants nt été le dimétridazle, le rnidazle, le métrnidazle et l iprnidazle. dimetridazle rnidazle Figure : Frmule structurelle du dimetridazle et durnidazle Technique d analyse ELISA, LC-MS/MS u LC-MS n et GC-MS/MS et GC-MS n. Outre le dimétridazle, le métrnidazle et les métablites hydrxylés HMMNI et MNZOH snt aussi à déterminer La txicité humaine et / u animale Surtut leurs métablites qui pssèdent une structure nitrs snt ptentiellement cancérgènes et mutagènes. L'utilisatin de nitrimidazles est interdite dans les animaux destinés à la cnsmmatin Nitrfuranes Structure L'effet des nitrfuranes est basé sur l'inhibitin de certaines enzymes micrbiennes impliquées dans le métablisme des glucides. Les nitrfuranes snt rapidement métablisés in viv et leurs métablites se lient facilement avec les prtéines tissulaires. Exemples de nitrfuranes et leurs métablites: furazlidn avec le métablite le 3-amin-2-xazlidinn (AOZ) furaltadne avec le métablite le 3-amin-5-2-mrphlinmethyl-xazlidinn (AMOZ) nitrfurazne avec le métablite semicarbazide (SEM) nitrfurantïne avec le métablite le 1-aminhydantin (AHD) O 2 N O CH N N O Figure : Frmule structuelle du furazlidn O 141

150 Effets et txicité Les nitrfuranes nt été largement utilisés pur traiter les infectins gastr-intestinales telles que des infectins à E. cli chez les vlailles et les infectins à Salmnella chez les prcs et les veaux. Dans l'ue, n en a interdit l'utilisatin pur les animaux destinés à la cnsmmatin en juin Cela fait suite aux préccupatins crissantes cncernant la cancérgénicité et la mutagénicité éventuelle des nitrfuranes Technique d analyse ELISA et LC-MS/MS u LC-MS n Critères La décisin 2002/657/CE de l'ue fixe les mdalités et les méthdes d'analyse qu il faut utiliser pur les échantillns de tests fficiels, prélevés cmme défini dans la directive 96/23/CE. La qualité et la cmparabilité des analyses de différents labratires devraient être assurées. Il est dnc nécessaire que les méthdes appliquées sient validées sur la base de prcédures cmmunes et de critères de perfrmance. Ces critères de perfrmance ainsi que les critères pur l'interprétatin des résultats d'analyse snt définis dans la décisin 2002/657/CE. 142

151 3.3 Antibitiques Intrductin Dans l'élevage mderne n utilise une grande variété d'antibitiques. Le but de l'administratin légale d antibitiques aux animaux est de lutter cntre la maladie u pur empêcher la prpagatin de maladies là ù l agriculture est intensive. A cté de l'utilisatin légale des prduits vétérinaires, certains prduits snt également utilisés illégalement cmme prmteur de crissance. L'utilisatin inapprpriée u le nn-respect des délais d'attente peuvent cnduire à la présence de résidus dans les aliments d'rigine animale. Ces résidus peuvent être nuisibles pur l hmme et prvquer des réactins allergiques. Afin d'éviter de retruver des cncentratins ncives dans la chaîne alimentaire, l'unin Eurpéenne a fixé des limites maximales de résidus (LMR). Certains antibitiques (par exemple, le chlramphénicl) snt même txiques et leur utilisatin a également été interdite par l'unin Eurpéenne (vir ci-dessus). Antibitiques et médicaments chimithérapeutiques: Le cncept classique des antibitiques cncerne des substances antibitiques dérivées de la matière vivante et servant à cmbattre des agents pathgènes (principalement des bactéries dans l'rganisme), cntrairement aux prduits chimithérapeutiques qui snt préparés par l hmme de manière synthétique. Un exemple de cette dernière catégrie est le grupe des sulfamides (décuvert en 1935). Aujurd'hui, cette distinctin n'est plus strictement appliquée et n parle des antibitiques pur tutes les substances qui peuvent être administrées aux humains pur cmbattre les infectins bactériennes. Il existe deux grupes imprtants d'antibitiques: les bactéricides, qui tuent les bactéries et les bactéristatiques u les inhibiteurs de bactéries, qui empêchent la crissance des germes. Les ß- lactams, les flurquinlnes et la majrité des aminsides snt bactéricides, la pénicilline, par exemple, affaiblit la pari cellulaire. La bactérie explse en raisn de sa prpre pressin smtique. Les tétracyclines, le chlramphénicl, les macrlides et les sulfamides snt bactéristatiques: ils ne tuent pas les bactéries mais empêchent leur crissance Sulfamides et Triméthprime Structure Les sulfamides nt des structures analgues à l'acide p-aminbenzïque (PABA) (Figure 3.3.1) dnt la structure de base est le benzènesulfnamide (Figure 3.3.2). Le terme sulfamides est suvent abrégé en sulfa s. Figure 3.3.1: Frmule structuelle de l'acide p-aminbenzïque (PABA) 143

152 Figure 3.3.2: structure de base de sulfamide Prpriétés Triméthprime Le triméthprime, un diaminpyrimidin est bactéristatique et inhibe la synthèse de l'acide flique. La cible enzymatique est différente de celle des sulfamides. Le triméthprime est actif cntre les bactéries Gram + et Gram-, mais pas cntre les anaérbies. Sulfamides assciés au triméthprime Actuellement, les sulfamides snt suvent assciés au triméthprime en raisn d'effets synergiques. Ces cmbinaisns, suvent dans un rapprt de 5/1, deviennent bactéricides Utilisatin Les sulfamides snt surtut utilisés dans le traitement par vie rale des cccidises (vlaille, ruminants) u des infectins urinaires et digestives chez les carnivres. Les sulfnamides les plus curamment utilisés en médecine vétérinaire snt la sulphamethazine (sulfadimidine), sulfadiméthxine, sulfapyridine, sulfamerazine et sulfadiazine. En médecine vétérinaire les sulfamides ne snt pas seulement utilisés à des fins thérapeutiques. Depuis 1950, ils nt également été utilisés pur prévenir les infectins causées par des bactéries u des prtzaires. En plus, n peut utiliser les sulfamides cmme additifs de crissance Technique d analyse Five plate test (STAR), le Premi test, ELISA, CHARM II, HPLC-DAD, HPLC-flu, LC-MS/MS et LC- MSn (LMR: Σ 100 g / kg) ß-lactamines Structure Les bêta-lactamines, pssèdent un nyau bêta-lactame qui leur cnfère une activité antibactérienne. Ce nyau est cmpsé de tris atmes de carbne et d un atme d'azte. 144

153 Les ß-lactamines snt répartis dans différentes catégries cmme les pénicillines, céphalsprines, mnbactams et carbapénèmes. Les ß-lactamines les plus curamment utilisés snt dans les grupes des pénicillines et des céphalsprines. Les deux classes nt des chaînes latérales implantées respectivement sur l acide 6-aminpénicilane u sur le nyau de l acide 7- amincephalsprane. La structure de base des pénicillines est décrite à la Figure La structure de base des céphalsprines est décrite à la Figure Figure 3.3.3: structure de base des pénicillines Figure 3.3.4: structure de base des céphalsprines Prpriétés Penicillines Les pénicillines snt les antibitiques les plus anciens et le grupe le plus cnnu. La benzylpénicilline a été la première de la famille des pénicillines. Tutes les autres pénicillines en snt des dérivés. En médecine vétérinaire, n utilise deux types de pénicillines: les benzylpenicillines dnt le spectre est principalement limité aux germes GRAM + (antibitiques tiques à spectre étrit, p.e. Benzylpénicilline et benzylpénicilline prcaïne), et les aminpénicillines qui travaillent aussi cntre les germes Gram- ( antibitiques à large spectre, p.e. amxicilline et l'ampicilline). Les pénicillines principales snt la pénicilline G (benzylpénicilline), la pénicilline V (phenxymethyl- penicilline), l'amxicilline, nafcilline, xacilline, fluclxalline, methicilline, clxacilline et diclxacilline. 145

154 Céphalsprines Les céphalsprines pssèdent un cycle dihydrthiazine attaché au nyau bêta-lactame, qui augmente leur résistance aux bêta-lactamases. Leur mécanisme d'actin est semblable à celui des pénicillines. Traditinnellement, les céphalsprines snt classées par "génératins", de la première à la quatrième, ce qui crrespndent à une chrnlgie de mise sur le marché et, dans une certaine mesure, à leur spectre d'activité. Les céphalsprines de première génératin snt essentiellement actives sur les GRAM+ mais aussi sur les staphylcques et les streptcques. Des exemples de céphalsprines de première génératin snt : la céphacétrile, céphalexine, céphalnium et la céphazline. Les céphalsprines du deuxième génératin (p.e. céphalr), nt un spectre d'activité prche de celui de la première génératin. Elles nt une activité plus marquée vis-à-vis les germes GRAM-. Les céphalsprines de trisième génératin (p.e. ceftifur et céfapérazne) nt une activité mins marquée vis-à-vis des staphylcques que celles de la première et la deuxième génératin. Mais elles snt plus actives sur les germes GRAM- que les céphalsprines de la première et de deuxième génératin. Les céphalsprines de la quatrième génératin (p.e. cefquinme) nt un spectre vraiment élargi, avec une activité sur les GRAM+ cmparable à celles de la première génératin, alrs que leur activité cntre les GRAM- est plus marquée que celles de la trisième génératin. Les céphalsprines les plus imprtantes snt le ceftifur, cefquinme, céphapirine, céphazlin, céfacétrile, céphaperazne et céfalexine. Ils snt principalement excrétés sus frme de médicament parentéral dans l'urine Utilisatin Les pénicillines nt une très faible txicité, même à des pslgies largement supérieures aux dses recmmandées. Des réactins crisées d'hypersensibilité cmme des chcs et des œdèmes, peuvent tutefis être bservées. On peut asscier la pénicilline à l acide clavulanique. Ce cmpsé pssède aussi un nyau β- lactame, mais au cntraire des antibitiques il n est pas inactivé par la β-lactamase, une enzyme dévelppée par certains bactéries résistantes, mais frme un cmplexa stable avec les pénicillines, ce qui empêche l enzyme de dégrader la pénicilline. Les pénicillines et les céphalsprines snt principalement utilisées cntre le mastitis (mammites) chez les bvins, les vins et les caprins. Les prduits utilisés snt ntamment l'xacilline, diclxacilline, céfacétrile, céfalnium, céfazline, céfalexine et la céphapirine Technique d analyse Essais bilgiques, les essais de récepteurs, de l'immun-essais, HPLC-UV, HPLC-DAD, HPLCdétectin par flurescence, LC-MS n, LC-MS/MS. 146

155 3.3.4 Flurquinlnes Structure Les quinlnes et les flurquinlnes snt un grupe relativement nuveau de cmpsés synthétiques antibactérien. Elles snt dérivées de l acide naldixine. Les quinlnes de première génératin appartiennent au grupe de l acide naldixine et de l acide xlinique. La majrité des quinlnes cliniquement utilisés snt parmi les quinlnes de la deuxième génératin: les flurquinlnes (par exemples: ciprflxacine, iprflxacine, saraflcxacin, fluméquine et enrflxacine). Celles-ci snt flurés sur le cycle central. Figure : Frmule structurelle d acide naldixine et d acide ciprflxacine Utilisatin La flumequine est utilisée dans le traitement des infectins digestives et urinaire chez les animaux de rente. Des dérivés les plus récemment dévelppés snt l'enrflxacine, la marbflxacine, la danflxacine, la diflxacine, l'ibaflxacine et l'rbiflxacine. Après administratin rale de ces substances aux animaux de rente, il est pssible que des facteurs de résistance de la flre intestinale de ces animaux sient transférés à la flre intestinale de l'hmme. Ainsi, l'utilisatin d'enrflxacine chez les vlailles purrait cnduire à l'élabratin de Campylbacter résistantes aux flurquinlnes, un agent pathgène pur l'hmme Technique d analyse Biassays, ELISA, HPLC-FLD, LC-MS n, LC-MS/MS Macrlides Structure Les macrlides snt un grand grupe d'antibitiques, qui se caractérisent par la présence d'un macrcycle lactnique, dans laquelle un u plusieurs amin- et sucres dexyglucses (généralement cladinse et dessamine) snt implantés. 147

156 Figure 3.3.6: structure chimique de l erythrmycine (le macrcycle lactnique est le cycle dans la partie supérieure) Techniques d analyse Bi-assays, Receptr-assays, immun-assays, LC-MSn, LC-MS/MS Flrfénicl et Substances apparentées Structure Le thiamfenicl est l analgue sulfnyle-méthyle du chlramphénicl, tandis que le flrfenicl est un analgue synthétique flurisé du thiamfenicl. Ci-dessus la structure du thiamfenicl. Figure 3.3.7: structure chimique du thiamphénicl 148

157 Caractéristiques Chlramphénicl est prduit par l Actinmyces Venezuela, qui se truve dans le sl. Chlramphénicl a été synthétisée pur la première fis en Le chlramphénicl, le flrfénicl et le thiamfenicl inhibent la synthèse des prtéines au niveau des ribsmes. Ce snt des antibitiques bactéristatiques et snt actifs cntre la plupart des rganismes à gram négatif et à gram psitif. Ils snt très lipslubles. L éliminatin de chlramphénicl se faite par l'intermédiaire de métablisatin dans le fie. Le flrfénicl est éliminé via les reins. Parfis n retruve le chlramphénicl dans l'ensilage de l'alimentatin et de la paille Tétracyclines Structure Les tétracyclines snt cnstituées d'un squelette de naftacène, dans lequel un certain nmbre de grupes plaires snt implantés. La chlrtétracycline, l xytétracycline et la tétracycline snt des cmpsés naturels qui peuvent être islés de certains Streptmyces spp. La dxycycline est un dérivé semi-synthétique Caractéristiques Les antibitiques de la famille des tétracycline snt un grupe d'antibitiques bactéristatiques basé sur la tétracycline. Les tétracyclines les plus imprtantes utilisées en médecine vétérinaire snt la tétracycline, la chlrtétracycline, l xytétracycline et la dxycycline. Figure : structure chimique de la Tétracycline Techniques d analyse Bi-assay, Receptr-assay, ELISA, HPLC-UV, HPLC-DAD, HPLC-FLD, LC-MSn, LC-MS/MS (dans le MRL les tétracyclines et leur 4-epimères snt inclus. Dxycycline n a pas de 4-épimère) Lincsamides Structure Ce grupe cmprend la lincmycine et la clindamycin. La lincmycine est prduite par la bactérie Streptmyces linclnensis. 149

158 Caractéristiques Les lincsamides snt actives cntre les rganismes à gram psitif, les anaërbies et les mycplasmes. Leur structure et leur mécanisme d'actin snt similaires à celle des macrlides. L éliminatin se faite par l'intermédiaire de métablisatin dans le fie. Chez les prcs, 20% est éliminé sus frme de médicament parentérale. Chez les pulets, 80% is retruvé sus frme de médicament parentérale dans les matières fécales Usage La lincmycine est suvent utilisée en cnjnctin avec la spectinmycine et ajutée à l eau ptable chez les prcs et les pulets. Au niveau des effets txiques, les lincsamides peuvent causer une diarrhée grave avec éventuellement une issue fatale chez l hmme et les herbivres. Chez les carnivres, les lincsamides snt bien tlérées. Elles snt, tutefis, à éviter chez le lapin, le cbaye et le hamster Aminglycsides Structure Les aminglycsides u les aminsides snt des cmpsés catiniques plycycliques qui cntiennent un amincyclitl sur lequel des sucres-amin snt liés par des liaisns glycsidiques (Figure ). Ils snt très plair et peu lipslubles. Figure 3.3.9: structure chimique de la némycine Caractéristiques Les aminglycsides snt des antibitiques à large spectre, qui snt prduits par Streptmyces et Micrmnspra. Parmi les aminglycsides les plus imprtants à usage vétérinaire: némycine, gentamicine, kanamycine et apramycine. Ils snt actifs cntre les rganismes aerbies à gram négatif et aussi cntre quelques rganismes à gram psitif. 150

159 Les aminglycsides nt une activité bactéricide par leur capacité à inhiber la synthèse prtéique bactérienne. Les aminglycsides snt rapidement absrbés après injectin mais ne snt presque pas absrbés après administratin rale et rectale. Ils restent actifs dans le système digestif. Ils snt excrétés dans les fèces. Frtes cncentratins snt truvées dans l'urine et les reins. Les aminglycsides snt particulièrement liés par des liaisns iniques aux prteines tissulaires et a des macrmlécules, mais la liaisn avec les prteines du plasma est minime. Ils snt généralement retruvés en faibles cncentratins et et sus frme nn liée dans les tissus. Ils s'accumulent en particulier dans les reins et dans d'autres rganes tels que le fie Techniques d analyse Bi-assays, Receptr-assays, immun-assays, LC-MSn, LC-MS/MS Plypeptides Structure La bacitracine est un mélange de decapeptides cycliques liés, prduite par Bacillus subtilis var Tracy Caractéristiques La bacitracine empêche la frmatin de la cuche peptidglycane de la pari cellulaire bactérienne. La bacitracine est active cntre les rganismes aerbies et anaerbies à gram psitif mais ne fnctinne pas cntre les bactéries à gram négatif. Les plus imprtants représentants des plypeptides snt l avparcine, la bacitracine, l efrmycine, la bambermycine (flavmycin, flavphsplipl) et la virginimyacine Usage Glycpeptides Structure Les glycpeptides se cmpsent d'un peptide glycsylé cyclique u plycyclique. Le glycpeptide plus imprtant est la vancmycine. 151

160 Caractéristiques Les glycpeptides empêchent la frmatin de la cuche peptidglycane de la pari cellulaire bactérienne. Ce snt des antibitiques à spectre étrit qui snt actifs cntre des micr-rganismes à gram psitif Usage En raisn de leur txicité, leur utilisatin est très limitée. La vancmycine est suvent le dernier recurs dans la lutte cntre la Staphylcccus aureus (MRSA), une imprtante cause d infectins bactérienne en hôpitaux Nitrfurans et Nitr-imidazles Vir plus haut Origine des résidus antibitiques dans la chaîne alimentaire Les raisns les plus évidentes de la présence d imprtante cncentratin en résidus d'antibitiques dans la chaîne alimentaire snt les abus et le nn respect des temps d'attente. Le temps d'attente est le délai entre l'administratin de l'antibitique à l'animal et la réclte de ses prduits (lait, œufs, viandes, miel, etc..). Lrsque le temps d'attente est trp curt, des résidus d'antibitiques snt succeptibles de se retruver dans les prduits d rigine animale, et dnc dans la chaîne alimentaire. Ces résidus peuvent dépasser les limites autrisées u tut simplement ne pas être autrisé (cmme par exemple le chlramphénicl). La raisn d un temps d'attente trp curt peut être entre autre la cnséquence d un suivi inexacte des registres de traitement u de l impssibilité d'identifier les animaux traités. Un mauvais usage des antibitiques peut avir differentes rigines; un dépassement de la dse prescrite pur des prduits enregistrés u l administratin a une espèce animale pur lesquelles l'antibitique n'a pas été enregistré cnduit à des manquements. Tutefis, il peut s agir également de l'utilisatin illicite des prduits nn enregistrés. Certains antibitiques snt également utilisés abusivement cmme prmteur de crissance. Les antibitiques snt administrés aux animaux par injectin (intraveneuse, intramusculaire u suscutanée), par le furrage u par l'eau, directement appliquer sur la peau u par perfusin intramammaire et intrauteriène. Tus ces mdes d administratin peuvent mener à des résidus dans les prduits d'rigine animale. Les injectins sus-cutanées et intramusculaires augmentent la prbabilité de résidus au niveau des sites d injectin, mais elles peuvent également dnner lieu à de cncentratins élevées de résidus dans le plasma. Les administratins intramammaires, par exemple pur le traitement de la mastite avec des ß-lactams, peuvent entrainer la présence des résidus dans le lait. 152

161 Suvent des résidus d antibitiques snt aussi truvés dans des si-disant animaux "nn traités". Cela peut avir différents causes : "le recyclage des matières fécales" se prduit lrsque les résidus d'antibitiques excrétés dans les excréments d'animaux traités cntaminent le furrage des animaux nn traitées u le sl. Cela peut mener à la présence de résidus d'antibitiques chez les animaux "nn traités". De même lrsque les veaux snt nurris avec du lait prvenant de vaches traitées, cela peut mener à des résidus d antibitiques dans les viandes. en utre, des antibitiques indésirables peuvent être administrés aux animaux par la cntaminatin des aliments. Lrsque, par exemple, après la préparatin des aliments médicamenteux la ligne de prductin n'est pas suffisant nettyée, cela peut entrainer la cntaminatin des lts d aliments Les effets ncifs des résidus d'antibitiques Résistance Les résidus d'antibitiques représentent une menace ptentielle pur la santé publique. L'augmentatin la résistance bactérienne est le risque principal en ce qui cncerne les antibitiques. La résistance est la défense que les bactéries (également des fngus et des virus) dévelppent cntre les myens utilisés pur les cmbattre. Un micr-rganisme peut être naturellemen insensible (= résistant) à certains antibitiques. Un autre type de résistance est la résistance acquise. Des mutatins du matériel génétique se manifestent et des bactéries peuvent survivre à l'antibitique. Ce qui va permettre précisément à ces bactéries de se reprduire. Si cela se prduit fréquemment les bactéries résistantes vnt dminer les bactéries nn résistantes. Les suches résistantes aux antibitiques appelées «fdbrne» pathgènes cmme Salmnella spp., E. cli et Campylbacter spp. nt été islées des animaux de ferme. Ces bactéries résistantes peuvent causer des infectins humaines qui snt difficiles à traiter L'évaluatin des risques et la fixatin de LMR L évaluatin des risques Afin de garantir la sécurité des résidus antimicrbiens présent dans les denrées alimentaires, n a fixé des LMR. LMR est la limite maximale de résidus. C'est la nrme qui détermine la quantité maximale de résidus d'un médicament vétérinaire, autrisé par les autrités publiques dans les denrées alimentaires. Une LMR est exprimée en mg/kg u µg/kg. Une LMR est utilisée pur garantir la sécurité des denrées alimentaires pur l'hmme. Au sein de l'eurpe, les LMR snt harmnisées pur éviter des bstructins des relatins cmmerciales internatinales. Les LMR pur les substances actives dans les médicaments vétérinaires snt déterminées de manière cmmune pur tus les pays eurpéens par le CVMP (Cmitee fr Veterenary Medical Prducts) de l EMEA (Eurpean Agency fr the evaluatin f Medical Prducts) à Lndres. Cette Agence est l'rganisme qui crdnne la fixatin de LMR. 153

162 L'évaluatin des risques est utilisée pur les résidus de médicaments vétérinaires dans l'unin eurpéenne est semblable à celle utilisée par le grupement de WHO / FAO. L analyse de risque est réalisée par le JECFA (Expert Cmmitee n Fd Additives) pur les résidus de médicaments vétérinaires et est exécutée en cnfrmité avec le Cdex Alimentarius Fixatin de l LMR Les LMR snt fixées sur base de l ADI (Acceptable Daily Intake = cnsmmatin qutidienne acceptable) u de la dse jurnalière admissible. C'est une estimatin de la quantité de résidus, basée sur le pids crprel, qui peut être prise sur une base qutidienne tut au lng de la vie, sans risque imprtant pur la santé du cnsmmateur (basé sur un pids standard de 60 kg). La base de calcul de l ADI est le NOEL (N-Observed Effect Level). Ceci est estimé sur base d études txiclgiques in vitr et in viv et sur différentes espèces animales. La dse est dérivée des quantités qui peuvent être administrées pur les espèces les plus sensibles sans qu aucun effet négatif sit détecté (exprimée en milligrammes par kilgramme de pids crprel par jur). Le NOEL est généralement divisé par 100 afin de parvenir à l ADI. On suppse que les persnnes purraient être dix fis plus sensibles que les animaux, et que la sensibilité purrait varier dix fis d hmme à hmme. Pur déduire des LMR de l ADI, n suppse qu une persnne myenne cnsmme sur une base qutidienne, 500 grammes de viande, 1,5 litres de lait et 100 g d'eufs u de prduits d'œufs. Les LMR nt été fixées par le Règlement 37/2010 CE (tableau 1: Substances autrisées, tableau 2: Substances interdites) Détectin des substances à effet bactéristatique dans les prduits d'rigine animale Classement des méthdes d'analyse Les méthdes d'analyse peuvent être classées dans différentes classes sur la base du principe utilisé Méthdes micrbilgiques Les méthdes micrbilgiques pur la déterminatin des résidus antimicrbiens snt des tests de screening rapides. Aux États-Unis n utilise en particulier le Kidney Inhibitin Swab (KIS-test), Swab Test On Premises (STOP) et le Calf Antibitic and Sulfa Test (CAST). En Eurpe, nmbreux tests utilisés snt sus frme de tube : La Premi test (r-bipharm), Explrer (Zeu-Immuntec), de Delvtest, de COPANtest. Parmi les tests fréquemment utilisés sus frme de plaque : les tests des 4-plaques au niveau eurpéen (u une variante de celle-ci), le Screening Test fr Antibitic Residus (STAR) et le Nuws Antibitic test (NAT). 154

163 Receptr test Le principe d'un test de récepteur est la liaisn des mlécules d antibitiques avec un récepteur à spectre large. SNAP (IDEXX), Bèta-star et TetraStar (Negen), charme-rosa, Tetrasensr et kits de Twinsensr (UNISENSOR), Bisensr, CHARM II essais et le Penzym snt des exemples Méthdes Immunchimiques Ceux-ci peuvent être divisés en deux grupes: immunassay et chrmatgraphie d immunaffinité. La méthde ELISA (Enzyme Linked Immun Srbent) est un exemple d'immunassay Méthdes physicchimique Ces méthdes snt basées sur la séparatin par chrmatgraphie de résidus suivi de la quantificatin spectrscpique cmme l UV, la flurescence et la spectrmétrie de masse. L'utilisatin de LC-MS/MS u LC-MSn est de plus en plus répandue. Les méthdes physic-chimiques snt généralement très spécifiques et quantitatives mais prennent beaucup de temps si l'identité du résidu n'est pas cnnue. Par cnséquent, ces méthdes snt fréquemment utilisées cmme méthde de cnfirmatin et pas cmme méthde de dépistage. 155

164 3.4 Acrylamide Structure et/u les grupes principaux L acrylamide prduit cmmercialement est utilisé cmme matière première pur la prductin de plyacrylamides. Les plyacrylamides snt très absrbants et frment un gel dux. Les plyacrylamides nt de nmbreuses applicatins : ils peuvent être utilisés dans les usines de traitement des eaux usées, d'eaux usées industrielles et pur la purificatin de l'eau ptable ; dans les prduits csmétiques, prduits de tilette, dans la fabricatin de lentilles de cntact suples et dans la chirurgie plastique faciale. Figure 3.4.1: Structure chimique de l acrylamide La présence d acrylamide dans les aliments a été décuverte récemment En avril 2002, un grupe de scientifiques à partir des dnnées de l'université de Stckhlm a mntré que l'acrylamide se frme lrs de la préparatin des denrées alimentaires et que l'essentiel se truve dans différents aliments. Les recherches de labratires dans les autres pays d'eurpe et d'amérique cnfirment ces résultats. L'acrylamide se prduit naturellement lrs de la préparatin des aliments à des températures élevées, telles que la cuissn au fur, rôtir u pêler. L'acrylamide fait prbablement déjà partie de ntre alimentatin depuis que l'hmme a cmmencé à réchauffer sa nurriture. L'acrylamide se frme à des températures supérieures à 120 c par réactin entre l'acide aminé asparagine et les sucres cmme le fructse et le glucse. Les teneurs les plus élevées se truvent dans les chips, frites et pain d'épice. Le café, le pain, les céréales, les biscuits et biscttes cntribuent également à l'absrptin de l'acrylamide. Les niveaux les plus élevés snt truvent dans les aliments riches en glucides chauffés de manière prlngée. Depuis la mise en évidence de l acrylamide dans les aliments, les industriels nt mené des recherches afin de réduire les niveaux d acrylamide. Cela a abuti à la publicatin d «bîte à utils» furni par la CIAA (Assciatin eurpéenne pur l'industrie alimentaire) Ainsi, l utilisatin de pmmme de terre à faible teneur en sucre réducteur dans la préparatin des frites permet de réduire le niveau d acrylamide. Il existe d autres façns de réduire la présence d'acrylamide cmme : - ajuster le temps et la température de chauffage lrs du prcessus ; - minimiser u éviter cmplètement si pssible la présence de sucres réducteurs ; améliratin du prcessus de cntrôle et éviter les valeurs extrêmes de température. L'utilisatin de l enzyme asparaginase semble être une vie prmetteuse pur réduire le niveau d acrylamide. 156

165 3.4.2 Techniques d analyse L analyse peut être réalisée par LC-MS/MS u GC-MSn. Les échantillns snt extraits avec de l'eau après hmgénéisatin. L'Acrylamide marqués au deutérium est dispnible cmme étaln interne. Après centrifugatin, une petite quantité d'extrait est purifié sur cartuche SPE. L extrait purifié est injecté sur un système de CL-SM/SM Txicité pur l'être humain et/u l animal L'acrylamide est à la fis géntxique et cancérigène chez les animaux de labratire et seln les experts, prbablement aussi chez les humains. Le Cmité scientifique sur l'alimentatin (UE) applique la psitin générale pur les substances cancérgènes géntxiques, et en particulier qu'une expsitin dit être aussi faible que raisnnablement pssible (ALARA = as lw as reasnable achievable) parce que pur ces substances, il n a pas été mis en évidence de seuil ù l interactin avec l ADN cmmence. 157

166 3.5 DIOXINES Intrductin Les dixines, les cmpsés de type dixine et les biphényles plychlrés de type dixine (dixine-like u dl-pcb) nt prvqués des incidents alimentaires. Ces incidents snt parfis décuverts suite à la cnstatatin d effets sur les animaux. En 1976, lrs de l explsin d une usine chimique à Seves, près de Milan, un nuage txique s est échappé dispersant 170 grammes de dixine. Il n'y a pas eu de victimes directes, mais différentes études de chrte nt mntrées un risque accru de cancer. Depuis lrs, la dixine est quelque chse de bien cnnu, et Seves est même le nm d un chapitre imprtant de la législatin envirnnementale eurpéenne. Il était déjà décuvert tôt que par l'incinératin des déchets à grande échelle les dixines nt été frmés et émis. Ces dixines cntaminent alrs le lait, œufs, et les graisses des animaux dans les explitatins prches des lieux d incinératin. De cette manière, la cnscientisatin par rapprt à ces matières est devenue plus imprtante et par exemple les installatin d incinératin de déchets nt été adaptées pur diminuer les cntaminatin. Néanmins, l incinératin des déchets est une des plus grandes surces de dixine et est en partie à l rigine de la cntaminatin des œufs de pule élevée en parcurt libre à l extérieure. Au Brésil, en 1998, l utilisatin de calcium dans l industrie de la pulpe de citrn a amené le plus haut niveau de dixine dans le lait des vaches nurrie avec cet aliment. Il a fallu attendre plusieurs années pur que les pellets de pulpe de citrn puissent à nuveau être exprtées vers l Eurpe. En 1999, a eu lieu le plus grand incident en Eurpe lrsque 200 litres d huile cntenant des PCB s, dl- PCB s et des dibenzfuranes plychlrés nt été utilisées pur la prductin d aliments pur vlailles et prcs. Il en a résulté une cntaminatin étendue des aliments prduits en Belgique. Le prblème a été aggravé par le fait que l incident a été décuvert tardivement mais aussi par la manière dnt la cntaminatin s est étendue et par les difficulté à remnter à la surce de cette cntaminatin. Cette même année, un scientifique autrichien décuvrait que certaines argiles kalinitiques utilisée pur les mélanges cntenaient de hautes teneurs en dixine et que cela induisait un niveau imprtnat en dixine chez les prcs. En 2004, le même type d argile a prvqué un incident aux Pays-Bas lrsqu il a été utilisé par des sélectinneurs de pmmes de terre et que les déchets étaient utilisés pur nurrir des vaches laitières. En 2003, l utilisatin de déchets de bis emplyés pur sécher des sus-prduits de bulangerie nt prvqué un nuvel incident en Allemagne et aux Pays Bas ù ils étaient utilisé cmme aliment pur animaux. Un incident cmparable cncerne la cntaminatin de chline chlride, un ingrédient utilisé en alimentatin animale, par l utilisatin de cpeaux de bis traités avec du pentachlrphénl. En 2006, l'utilisatin de l'acide chlrhydrique cntaminé dans la fabricatin de la gélatine était à l rigine d'un incident à grande échelle ù la graisse cntaminée a été prtée dans la chaîne alimentaire cmme animal feed. L'acide chlrhydrique aurait été prduite avec des filtres défectueux, ce qui en fait était cntaminé par des dixines. Les principaux prblèmes snt la cntaminatin généralisée des œufs de pules en libre parcurs et des anguilles capturées dans les rivières plluées. En répnse à ces incidents l Unin Eurpéenne 158

167 (UE) a dévelppé une plitique frte pur les dixines et les dl-pcb s, y cmpris les tlérance et les limites d actin pur l alimentatin animale et les denrées alimentaires. paître & picter Sl déversement, cntaminatin incinératin Plante (C) Eau: Pissn Animal huille & farine de pissn 90-95% Alimentatin Aliments des animaux (C)= Cntaminatin de matière végétale... par exemple par adhésin avec des particules de sl u, autre cntaminatin externe (par exemple à l`exterieur ( la cire) d`une pmme). Figure : La distributin des dixines et analgues Structure et/u grupe principaux La structure de base des dixines est cmpsée de 2 anneaux benzéniques (dibenz) cuplés entre eux par deux par 2 atmes d xygène (dix). Sur cette structure de base, un nmbre d atme de chlre (Cl) est implanté de manière variable. Tant le nmbre d atme de chlre que leur psitin peut varier. De cette manière, il y a 75 variantes pssibles de la mlécule de dibenzdixine, dnt envirn 17 snt cnsidérées cmme txique. La plus txique des dixine est le 2,3,7,8 tetrachlrdibenz-pdixine (2,3,7,8-TCDD) u «dixine de Seves» et le grupe des 17 dixines txiques a été décrit cmme le grupe 2,3,7,8-dibenzdixine. Figure : structure chimique du 2,3,7,8- TCDD 159

168 Les cncentratins en dixines snt exprimées en TEQ (equivalent txique) pur lequel un scre de txicité est calculé qui est la smme des indices de txicité des cngénères cncernés, avec la «dixine Seves» cmme référence : TEQ = ci. TEFi avec ci : la cncentratin d un cngénère i TEFi : un facteur d équivalence txique (spécifique) pur le cngénère cncerné i (TEF i < 1) Outre les dixines même, il y a également les cmpsés de type dixine tels que les dibenzfuranes plychlrés, pur lesquels le lien entre les cycles de benzène se fait par un atme d xygène à la place de deux. Figure : structure chimique du 2,3,7,8- TCDF Téchniques d analyse La méthde CALUX -biassay (Chemically Activated LUciferase expressin) est actuellement la méthde de screening la plus curante pur les dixines, pur les cmpsés de type dixine et les dl- PCB s. Cette méthde est capable de déceler des échantillns avec une teneur en dixine plus élevée que la nrmale et il a cmme avantage sa rapidité de réalisatin (3 jurs uvrables) et sa grande capacité d analyse. Avec CALUX, les dixines peuvent être détectées dans les échantillns mais il n est pas pssible de faire une quantificatin exacte. CALUX dnne une répnse générale parce que la technique n est pas en mesure d identifier individuellement les cmpsés dans l échantilln. En utre la répnse des différents cmpsés n est pas tujurs directement prprtinnelle à la valeur de TEF et il se peut dnc qu un cmpsé avec une faible valeur de TFE dnne une très grande répnse avec la méthde CALUX (cela vaut en particulier pur les échantillns avec une teneur élevée en mn-rth-pcb s cmme par exemple les anguilles sauvages). C est purqui, lrsque la méthde CALUX détecte des échantillns suspects ceux-ci divent tujurs être cnfirmés de manière quantitative en Spectrmétrie de Masse Haute Réslutin (GC-HRMS), méthde capable d'identifier et de quantifier de façn unique les différents cmpsés. En cnditin nrmale, lrsque les dixines et les cmpsés de type dixine viennent au cntact de cellules, elles se lient avec un récepteur cellulaire très spécifique à savir le récepteur aryl hydrcarbne (ArylhydrcarbnReceptr f AhR). Il en décule une activatin de l expressin génique AhR-dépendante qui peut prvquer des effets txiques. La première étape dans ce prcessus est la liaisn de la dixine et des autres cmpsés de type dixine à la AhR, après qui, une translcatin du cmplexe AhR intervient au niveau du nyau cellulaire. Dans le nyau cellulaire, le cmplexe AhR se lie a une séquence d ADN bien déterminée qui a été appelée le Dixin Respnsive Element (DRE). Cela induit une perturbatin dans le fnctinnement nrmal du gène 160

169 prvquant des erreurs de transcriptin et de traductin, erreurs qui peuvent prvquer des effets txiques. La méthde CALUX-biassay jue sur ce mécanisme naturel et utilise des cellule génétiquement mdifiées (suris, rats) qui cntiennent un gène reprteur qui cde pur la luciferase. (Un gène rapprteur est un gène dnt l expressin qualitative/quantitative peut être détecté, par exemple par la prductin d une substance spécifique, dans ce cas, la luciferase). Avec CALUX, le gène luciférase est activé puisque le cmplexe AhR va se lier sur le DRE. La quantité de luciférase qui est ainsi prduite est une mesure de la cncentratin en cmpsés de type dixine. Par l ajut de luciferine aux cellules, la quantité de luciferase prduite peut être mesurée par la quantité de lumière émise ( luciferine +luciferase = prduit de la réactin + lumière) Figure : mécanisme de la méthde CALUX Txicité pur l hmme et / u l animal Les dixines et les cmpsés de types dixines s accumulent dans les graisses et snt essentiellement transmises à l hmme via les graisses (et huiles) animales. L éliminatin se fait principalement via la vésicule biliaire. Les femmes peuvent déjà cntaminer leur bébé à un stade précce par l allaitement au sein. Les dixines se lient à un récepteur dans la cellule par lequel des gènes déterminés snt activés ce qui dnne lieu à la frmatin de plypeptides spécifiques qui snt respnsables de l effet txique, effet qui n est aigu qu à de très hautes cncentratins (mécanisme de txicité, vir plus haut). Le type d expsitin (aigu vs chrnique) et le niveau d expsitin déterminent dans une large mesure l effet txique des expsitins aux dixines. Les dixines peuvent interférer avec les hrmnes et les récepteurs cellulaires. C est purqui elles peuvent avir un effet sur la crissance, la reprductin, le 161

170 dévelppement et également sur le système immunitaire et sur les fnctins neurlgiques. A hautes cncentratins, les dixines peuvent causer la chlracnée (une affectin de la peau), le cancer, des trubles du fie, de l estmac et de l intestin. 162

171 3.6 Métaux lurds et arsenic Grupes principaux Principaux : Pb, Cd, Hg, As Sl déversement, cntaminatin incinératin assimilatin Nutritin L`eau: Pissn Animal furrage et herbe Plante principalement dans le rein et le fie Figure : Vies de cntaminatin pssible pur les métaux lurds. Le schéma ne prétend pas à l exhaustivité mais indique seulement les surces de cntaminatin les plus générales (Hg peut par exemple également être absrbé via les vies respiratires) Techniques d analyse AAS, ICP-OES, ICP-MS, AMA Txicité pur l hmme et/u l animal Plmb Le plmb entre dans la chaîne alimentaire via des particules cntenant du plmb qui se dépsent sur les végétaux. Les végétaux n absrbent quasiment pas de plmb à partir du sl. Si le bétail est nurri avec des végétaux cntaminés au plmb, n peut dnc aussi retruver du plmb dans la viande, le 163

172 lait et les prduits laitiers. Les tripes cntiennent relativement plus de plmb que la chair musculaire, car le plmb s accumule surtut dans le fie. La teneur en plmb du pissn et des fruits de mer est peu élevée à très peu élevée. Les denrées alimentaires végétales et surtut les légumes feuillus et les fruits cnstituent la principale surce de plmb dans ntre alimentatin. La cncentratin en plmb des bissns alclisées, et en particulier du vin, peut être très élevée. La cause en est, en partie, l utilisatin de capsules cntenant du plmb pur la fermeture des buteilles. La cnservatin des liqueurs et des apéritifs dans de belles carafes en cristal peut aussi augmenter la quantité de plmb dans la bissn. Le cristal cntient en effet de grandes quantités d xyde de plmb susceptible de migrer dans la bissn. Seule une petite partie du plmb ingéré est assimilée de manière effective par l rganisme. La majeure partie du plmb ingéré s accumule dans le squelette. Le reste abutit dans le sang. Même si l effet ncif de cncentratins trp élevées en plmb peut être bservé dans presque tus les tissus, certains rganes et tissus snt particulièrement sensibles au plmb, cmme le sang et les rganes hématpïétiques (la melle sseuse), le système nerveux (le cerveau et le système nerveux périphérique), les muscles et les reins Cadmium Le cadmium est présent dans presque tus les aliments et prvient de manière plus u mins égale des prduits végétaux et des prduits animaux. La viande, les céréales, les fruits, le lait et les prduits laitiers cntiennent relativement peu de cadmium. Les légumes, et surtut les légumes feuillus absrbent par cntre assez facilement le cadmium du sl. Les céréales, et en particulier le riz, cntribuent de manière plus imprtante à l absrptin de cadmium via l alimentatin. Tutefis, lrs de la transfrmatin des céréales, la cncentratin en cadmium diminue frtement. Les fruits de mer et le pissn cntiennent relativement beaucup de cadmium. On peut également rajuter que les fumeurs ingèrent une quantité cnsidérable de cadmium. Seule une petite partie (5 à 6 %) du cadmium présent dans l alimentatin est résrbée. Le cadmium ingéré s accumule facilement dans le crps, principalement dans le crtex du rein et en mindre mesure dans le fie L arsenic L arsenic cnstitue un élément naturel de la crûte terrestre. L arsenic est txique dans tutes ses liaisns, tutefis les liaisns d arsenic inrganiques snt beaucup plus txiques que les liaisns d arsenic rganiques. Les surces d arsenic snt l eau de surce (il y a dans certains pays beaucup d arsenic dans le sl), le pissn, les fruits de mer. La cncentratin en arsenic dans l alimentatin est d un rdre de grandeur tel qu elle ne présente aucun danger pur la santé publique. Via d autres surces autres que les aliments, une persnne peut cependant subir une intxicatin à l arsenic (suicide, explitatin minière, pesticides). L arsenic inrganique perturbe les prcessus bichimiques (As 3+ se lie à l acide lipïque en pyruvate déshydrgénase et As 5+ perturbe la phsphrylatin xydative). 164

173 Le mercure Dans la nature, le mercure se présente sus frme élémentaire et dans diverses liaisns inrganiques et rganiques et cmplexes. Les frmes inrganiques du mercure snt mins txiques que les frmes rganiques, mais les frmes inrganiques peuvent être transfrmées en frmes rganiques par les bactéries. Le méthyle de mercure est la frme rganique la plus txique. Le mercure a tris valences : Hg 0, Hg 1+ et Hg 2+. Parmi les espèces txiques, n cmpte les frmes inrganiques : le mercure métallique (Hg 0 ), le mercure mnvalent (mercureux, Hg + ), le mercure bivalent (mercurique, Hg 2+ ), et les frmes rganiques : entre autres le mercure d'éthyle et le méthyle de mercure Absrptin La façn dnt le mercure est stcké dans le crps dépend de la frme et de la manière dnt le mercure rentre en cntact avec le crps. Les tableaux et dnnent un aperçu des vies d'expsitin principales et de la cinétique de txicité des liaisns du mercure dans le crps humain. Le mercure métallique est généralement mal absrbé par ingestin, mais les vapeurs inhalées dans les pumns snt à 80 % absrbées et très txiques. 10 à 30 % du mercure inrganique est absrbé via le tube digestif. L'imprtance de l'ingestin et de la txicité du mercure inrganique dépend frtement de sa slubilité dans l eau. Les liaisns Hg 2+ snt plus facilement assimilables que les liaisns Hg + (Eurpean Fd Safety Authrity (EFSA), 2008). Tableau Surces des liaisns txiques du mercure pur l hmme (ATSDR, 1999) liaisns Mercure élémentaire (Hg 0 ) Mercure mercurique (Hg 2+ ) Méthyle mercure (CH 3 Hg + ) Surces d expsitin pur l hmme «plmbage des dents», expsitin lrs de tâches spécifiques (lab, électrnique), cmbustibles fssiles, usines d incinératin. Oxydatin du mercure élémentaire, déméthylatin du méthyle de mercure, empisnement accidentel u vulu avec HgCl 2 Les pissns, les animaux marins, les crustacés, les animaux et la vlaille nurris avec de la farine de pissn L'absrptin du méthyle de mercure et de ses sels via le système digestif est plus rapide que l absrptin du mercure inrganique et s'élève à plus de 80 %. La présence de ligands rganiques dans la nurriture cmme les phytates, les prtéines, les aminacides u les lig-éléments cmme le sélénium peuvent influencer l'absrptin, mais d'autres facteurs cmme le temps que la nurriture passe dans l'intestin et la physilgie nt un plus grand effet sur la dispnibilité bilgique du mercure. 165

174 Tableau Absrptin des frmes txiques de mercure dans le crps humain (ATSDR, 1999) Absrptin par inhalatin Absrptin par ingestin Absrptin cutanée Mercure élémentaire (Hg 0 ) Hg 0-80 % absrbé quasi immédiatement Absrptin quasi nulle, les vapeurs de Hg 0 snt transfrmées dans l intestin en HgS et évacuées La vitesse myenne d absrptin cutanée = 0,024 ng/cm ² pur chaque 1 mg/m ³ dans l'air Mercure mercurique (Hg 2+ ) Aérsl d HgCl 2 Prprtinnelle à la slubilité dans l eau des sels de mercure mercurique; assimilatin chez les nuveaux-nés plus imprtantes que chez les adultes. 2 à 3 % de la dse appliquée est absrbée immédiatement Méthyle mercure (CH 3 Hg + ) Vapeur de mercure 100 % d absrptin Méthyle de mercure dans le pissn 95 % d absrptin 3 à 5 % de la dse appliquée est absrbée après 5 heures Distributin et dépôt dans les tissus Les vapeurs de mercure métallique snt quasi immédiatement diffusées à travers le crps. Le mercure métallique traverse la barrière hémat-encéphalique et le placenta de telle manière que 5 % de la quantité présente dans le sang de la mère se retruve dans le lait maternel. Les faibles quantités de mercure métallique absrbées dans l'intestin snt xydées en Hg 2+ et ne présentent presque plus de risque de diffusin dans le crps (EFSA, 2008). Le mercure métallique peut causer des dmmages graves au cerveau, au système nerveux, au fie et aux reins. Le mercure inrganique peut difficilement traverser la barrière hémat-encéphalique et le placenta. Dans le cerveau, n retruve très peu de mercure inrganique. Sn absrptin se fait en majrité par les reins et en mindre mesure dans le fie et les s. Chez les femmes enceintes, seulement de petites quantités de mercure inrganique arrivent chez le futur bébé. Dans le fœtus et chez le nuveau-né, la barrière hémat-encéphalique n'est pas frmée entièrement, raisn pur laquelle, la cncentratin en mercure mercurique dans sn cerveau est plus élevée que dans celui des adultes. Chez les nuveau-nés, le mercure mercurique n'est pas cncentré dans les reins, mais il est disséminé dans les autres tissus. Le mercure de méthyle peut traverser la barrière hémat-encéphalique, le placenta, les glandes mammaires et les fllicules pileux.16 % de la teneur ttale en mercure dans le lait maternel se retruve sus frme de mercure de méthyle. Dans les cheveux, 90 % du mercure se retruve sus frme de mercure de méthyle (ATSDR, 1999). Le mercure de méthyle absrbé diffuse vers les tissus, mais la plus grsse partie est stckée dans les reins. Dans le sang, le mercure de méthyle est stcké en majrité dans les glbules ruges ù il est lié à l'hémglbine. Une plus petite partie est liée aux prtéines du plasma. Le mercure dans le sang est synnyme d une expsitin récente au mercure de méthyle et au mercure inrganique. Le mercure de méthyle se retruve dans le sang du fœtus de par le sang de la mère. 166

175 Tableau Distributin des frmes txiques du mercure dans le crps humains (ATSDR, 1999) Répartitin dans le crps Mercure élémentaire (Hg 0 ) Lipsluble, d ù diffusin rapide dans le crps Mercure mercurique (Hg 2+ ) Accumulatin dans les reins, la prprtin nn éliminée via les urines dépend de la dse Méthyle de mercure (CH 3 Hg + ) Lipsluble, d ù diffusin imprtante à travers le crps, dnt 1-10 % dans le sang et 90 % dans les glbules ruges. Lrs d expsitins fréquentes, le mercure peut s accumuler dans le crps. Les rganes tuchés dépendent du type de liaisn (Tableau 3.6.4). Tableau Organes cibles en fnctins des liaisns mercuriques (ATSDR, 1999) Liaisns Mercure (Hg 0 ) Mercure (Hg 2+ ) élémentaire mercurique Méthyle de mercure (CH 3 Hg + ) Organes cible Cerveau et reins Reins cerveau, aussi bien chez l adulte que le fœtus Métablisme Le mercure et les liaisns mercuriques snt métablisés via un cycle d xydréductin. Le mercure métallique peut, dans le sang et dans les tissus, être xidé par la catalase et le perxyde d hydrgène et peut être transfrmé sus la frme inisée Hg 2+ la plus dangereuse (Tableau 3.6.5). Aussi lngtemps que l xydatin n est pas cmplète, le mercure dissut peut traverser la barrière cérébrale et placentaire. Si l'xydatin a lieu dans le cerveau u le placenta, le retur dans les vaisseaux sanguins est quasi impssible et le mercure s accumule alrs dans le cerveau u le fœtus. Dans les reins, le mercure inrganique se lie aux liaisns thils et aux prtéines structurelles. Ainsi le méthyle mercure- cystéine est structurellement analgue à méthinine. Sumises à une expsitin prlngée au mercure, la capacité de ces prtéines peut être dépassée et ainsi le mercure peut causer des dmmages aux reins. Tableau Mécanisme de txicité des frmes txiques du mercure (ATSDR, 1999) Liaisns Mercure (Hg 0 ) Mercure (Hg 2+ ) élémentaire mercurique Méthyle de mercure (CH 3 Hg + ) Mécanisme de txicité Oxydatin en Hg 2+ Hg 2+ liée aux liaisns thils (ex. cystéine) et aux prtéines structurelles Déméthylatin en Hg 2+ et txicité intrinsèque du méthyle de mercure. 167

176 Le mercure Hg 2+ peut être méthylé dans les tissus du crps ù il est transfrmé en méthyle mercure par les bactéries de l'intestin. Le mercure rganique qui est absrbé, est transfrmé en Hg 2+ par la scissin de la liaisn C-Hg et ensuite métablisés par le cycle d xydréductin. Ceci arrive dans l'intestin à l aide des bactéries intestinales, mais également dans les glbules ruges et les tissus. La déméthylatin est une étape très lente. Les liaisns aryles du mercure (par ex. phénylmercure) se frment plus rapidement que les liaisns à chaines curtes (par ex. le méthyle mercure). Les bactéries intestinales semblent avir une résistance au mercure rganique via une enzyme (une lyase) qui catalyse la déméthylatin de méthyle de mercure en Hg 2+. Le Hg 2+ peut aussi être réduit jusqu au mercure élémentaire. Le sélénium peut influencer l'accumulatin du méthyle de mercure dans le crps, mais le mécanisme n'a pas encre été pruvé. Mécanismes pssibles snt: la frmatin des cmplexes sélénium-methylmercure, la libératin de methylmercure des cmpsés de sufre dans le sang induite par le sélénium et des mécanismes spécifiques dans un tissu qui influent l absrptin du méthylmercure Excrétin La vie d'excrétin la plus imprtante du mercure inrganique se fait via l'urine et les fèces. 80 % du mercure inrganique absrbé ralement est excrété via les fèces. Le temps de demi-vie du Hg 2+ absrbé est d envirn 40 jurs (Clarksn et al., 1988). Le mercure inrganique peut aussi être réduit en mercure élémentaire qui sera exhalé u migrera dans le lait maternel. L'excrétin du mercure de méthyle se fait principalement dans les fèces via l'excrétin de bile. Dans le fie, le mercure de méthyle est transfrmé en cmplexe mercure de méthyle-glutathin et excrété dans l intestin via la bile. La part la plus imprtante du mercure de méthyle est ensuite excrétée via les fèces, une petite partie est déméthylée en mercure inrganique dnt 10 % est réabsrbé. D'autre part, la lente déméthylatin du mercure de méthyle en Hg 2+ se fait grâce aux macrphages des tissus et des bactéries intestinales. La déméthylatin a aussi lieu dans le fie du fœtus. Le mercure de méthyle est écarté d'une manière naturelle du crps à une vitesse de 1 % par jur. Après 1,5 à 2 mis, la mitié du mercure de méthyle présent a disparu du crps. L'allaitement abutit à une éliminatin plus rapide du mercure du sang. Le tableau résume les vies d'excrétin les plus imprtantes des liaisns mercuriques. 168

177 Tableau Excrétin des frmes txiques du mercure (ATSDR, 1999) Liaisns Mercure (Hg 0 ) élémentaire Mercure mercurique (Hg 2+ ) Méthyle de mercure (CH 3 Hg + ) Excrétin hrs du crps humain Hg 0 via la respiratin, la sueur, la salive; cmme Hg 2+ via les fèces et les urines Dans les fèces et les urines, aussi via sueur, salive, bile, respiratin, lait maternel. Cmme Hg 0 via la respiratin, la sueur, la salive; cmme Hg 2+ via les fèces et les urines Effet txique du mercure sur le crps humain Le mercure est très txique pur la plupart des frmes de vie, mais la txicité dépend de la frme chimique. Le mercure élémentaire est relativement inerte et nn aisément absrbé via le canal gastr-intestinal, mais ses vapeurs snt txiques. Les sels de mercure snt très txiques, mais à cause des micr-rganismes, les prduits de méthylatin (mercure de méthyle et le mercure de diméthyle) sn encre plus txiques Effet txique du mercure élémentaire Chez l hmme, le système nerveux apparaît le plus sensible à l'expsitin au mercure élémentaire. Les symptômes de neurtxicité par le mercure élémentaire snt des tremblements, nervsité, irritabilité, timidité exagérée, insmnie, amnésie et prblèmes cgnitifs. A hautes dses, les reins snt endmmagés et des prblèmes pulmnaires peuvent apparaîtrent. Des réactins aut-immunes snt également assciées au mercure élémentaire Effets txiques du mercure inrganique Le rein semble être l'rgane cible après ingestin des sels de mercure inrganiques. Il est aussi pruvé que l'expsitin au mercure inrganique prvque une répnse aut-immune. Le mercuremercurique est classé par «l'internatinal Agency fr Research n Cancer» (IARC) dans le grupe 3 (= substance nn cancérigène pur l hmme) Effet txique du mercure de méthyle À peu près tutes les études txiclgiques dispnibles au sujet du mercure rganique se limitent au mercure de méthyle. L'rgane cible du mercure de méthyle est le cerveau, aussi bien chez les adultes que dans chez le fœtus. L'effet le plus imprtant suite à une lngue durée d expsitin et à une cncentratin en mercure de méthyle élevée est la neurtxicité. Les effets sur le dévelppement du système nerveux nt été perçus chez les enfants qui nt été expsés dans leur phase prénatale au mercure de méthyle. Les études sur animaux cnfirment ces cnstatatins. 169

178 Neurtxicité Les effets neurtxiques nt pu être déterminés dans deux incidents ù des persnnes nt été expsées à des dses de mercure de méthyle très élevées : au Japn (Minamata Bay et Niigata, ) et en Irak (1956 et ). De ces incidents, snt ressrtis que les premiers symptômes de txicité apparaissent seulement quelques mis après l'expsitin et les effets les plus graves snt apparus dans le cerveau et le système nerveux du fœtus. Les persnnes qui, au Japn, nt été empisnnées par du mercure de méthyle issu de pissns nt mntré entre autre des perceptins des sentiments errnées causées par des stimuli internes, l'ataxie (dysfnctinnement dans la synchrnisatin des muscles), des tremblements, la défaillance de l'uïe et des difficultés à marcher. En Irak, ù les gens nt été empisnnés par du pain cnfectinné à partir de grains traités avec un fngicide au mercure de méthyle, n a cnstaté le plus curamment des trubles de perceptins des sentiments ; pur les persnnes les plus cntaminées, de l'ataxie, une visin flue, des bégayements, aveuglement, surdité et mrt. Aussi bien au Japn qu'en Irak, les effets snt apparus chez les enfants qui nt été expsés gravement dans l'utérus. Des études épidémilgiques nt été btenues sur des effets neurtxiques lrs de lngues durées d expsitin chrnique à une faible dse de mercure de méthyle. Les études nt eu lieu dans les pays ù beaucup de pissns et d animaux marins snt cnsmmés, à savir la Nuvelle-Zélande, les iles Faeröer et les Seychelles. Le mécanisme exact par lequel le mercure de méthyle cause les effets neurtxiques n est pas encre cnnu. Le mercure de méthyle prvque des changements pssibles dans le dévelppement nrmal du cerveau des enfants et, lrs des cncentratins hautes, il peut causer des changements neurlgiques chez les adultes. L'expsitin prénatale interfère avec la crissance et la migratin des neurnes et peut causer des dmmages irréversibles au système nerveux central. Lrs de l'expsitin à des dses extrêmement élevées dans l'uterus, des handicaps graves nt été cnstatés cmme le retard mental, l'épilepsie, l aveuglement et la surdité. Carcingécité Certaines études nt mntré une assciatin entre le mercure de méthyle et le cancer, mais les preuves pur la carcingécité du mercure de méthyle snt cntradictires. Aucune assciatin n'a été truvée entre le mercure et le cancer dans les études épidémilgiques, mais deux études nt démntré une assciatin entre le mercure et la leucémie aigüe. Dans les essais sur animaux, des dmmages aux reins nt été causés par une dse de mercure élevée, mais sans effet tumral. Le mercure apparaît in vitr capable de nuire aux chrmsmes et à l ADN, entre autres, sur levures et bactéries, cellules de pissns et de mammifères et aussi dans des lymphcytes de cerveaux humains. In viv, les résultats des tests ne snt pas tutefis cnvaincants. Le mercure de méthyle est classé pur cette raisn, pur l'hmme, en grupe 2B seln «l'internatinal Agency fr Research n Cancer» cmme pssible cancérigène (IARC, 1993). La txicité dépend de la dse. 170

179 Effets txiques sur le système cardi-vasculaire Il y a des preuves des effets négatifs du mercure de méthyle sur le système cardi-vasculaire adulte et en dévelppement (prblèmes de tensin, variatins du rythme cardiaque, maladies cardiaques). Certaines recherches nt mntré des effets négatifs à des expsitins à des teneurs en mercure de méthyle plus basses que le niveau avec lequel la neurtxicité a été déterminé. En 1995, les chercheurs finlandais nt truvé une crrélatin entre la cnsmmatin de pissn cntaminés au mercure de méthyle et le risque d infarctus aigu du mycarde ; ceci est pssible du fait que le mercure peut prmuvir la perxydatin des graisses. Effets txiques sur les reins Le mercure rganique et inrganique snt cnnus pur leurs effets txiques sur les reins. Les gens expsés au mercure rganique suffrent de plyurie (urines abndantes) et albuminurie (présence de prtéines dans l'urine). L autpsie des gens empisnné au alkyles de mercure à dévilé des néphrites (inflammatin des reins). Effets txiques sur le système immunitaire Le système immunitaire apparaît être sensible au mercure. Les scientifiques nt étudié les effets du mercure de méthyle sur le système immunitaire de suris et nt bservé des changements au niveau du thymus et dans l activité naturelle des cellules tueuses (killer-cels) en présence de mercure de méthyle. Sur les gens, les tests n nt pas été effectués, mais il y a des cas bien cnnus d'expsitin au mercure élémentaire prvquant des mdificatins au niveau des lymphcytes CD4+ Effets txiques sur la régulatin de la tensin Une tensin diastlique et systlique accrue a été déterminée chez les enfants de 7 ans dnt le fœtus avait été expsé au mercure de méthyle Risque d empisnnement Expsitin humaine par la nurriture Bien que l'inhalatin de mercure gazeux de l'air, de cnsmmatin d eau ptable cntaminée au mercure, de la présence de mercure dans certaines médicatins puissent cntribuer à l'expsitin humaine au mercure, l'ingestin via la nurriture est la surce la plus imprtante d expsitin nn accidentelle au mercure. Le pissn et les prduits d aquaculture snt la surce la plus imprtante d ingestin de mercure par l'hmme. La cncentratin myenne de mercure dans le pissn en Eurpe est estimée de 62 jusqu'à 97 µg/kg seln une étude de Le mercure de méthyle est présent à cncurrence de 70 à 100 % de la teneur de mercure ttale dans le pissn Recmmandatins cncernant le mercure dans l alimentatin À peu près tus les pissns cntiennent des traces de mercure de méthyle, mais les plus grands pissns qui nt vécu lngtemps, nt les cncentratins les plus élevées en mercure de méthyle 171

180 parce qu'ils nt eu plus de temps pur accumuler ce mercure dans leur crps. Il est recmmandé pur cette raisn d être mdéré avec la nurriture des pissns prédateurs cmme l'espadn, le requin, le maquereau- ri, le tile et le thn (cncentratins typiques de 500 à 1000 µg/kg). Ceci est surtut valable pur les femmes enceintes u vulant l être, pur les enfants et pur les femmes qui allaitent. Les enfants et les nuveau-nés snt les plus sensibles aux effets du mercure. Il n est pas décnseillé de manger du pissn mais il faut des pissns en faible teneur en mercure. Les pissns et les prduits d aquaculture avec des teneurs basses en mercure de méthyle snt entre autres la crevette, le thn mis en cnserve, le saumn, le clin, le pissn chat, le hareng et les sardines (cncentratin < 100 µg/kg). Cnsmmer deux prtins de thn par semaine n'est pas un prblème surtut si les sujets snt jeunes. La cncentratin en mercure maximale truvée dans le saumn d élevage est envirn cinq fis plus basse que la nrme pur le mercure dans le pissn (0,5 mg/kg pur les salmnidés). Il est dnc pssible de cnsmmer deux fis par semaine du pissn et même recmmandé par les diététiciens, sans risque accru pur la santé. 172

181 3.7 Cccidistatica Généralités La cccidise est une maladie infectieuse et cntagieuse des animaux, elle est causée par des frmes de vie eucarytes unicellulaires parasitaires (prtzaires). Ces prtzaires snt appelés cccidies et plus spécifiquement Eimeria. Actuellement, il y a plus de 600 espèces cnnues de cccidies, mais certaines espèces seulement infectent les vlailles. Les cccidies le plus pathgènes snt E. tenella, E. necatrix, E. Maxima, E. acervulina, E.mitis, E.praecx et E. Brunetti. Outre les vlailles, les dindes et les lapins, des cccidies peuvent aussi infecter d autres animaux cmme les prcs et des vins, ces animaux étant cependant mins sensibles. Le cycle de vie d un Eimeria dans un animal cmmence par l ingestin d cystes sprulées qui cntiennent chacun 4 sprcystes avec 2 sprzaires. A la température crprelle les sprzaires quittent leur sprcyste, deviennent actifs et pénètrent rapidement les cellules épithéliales de la pari intestinale de l hôte. Le cycle de vie d un Eimeria à l intérieur des cellules épithéliales cntinue par 3 u 4 génératins de multiplicatin asexuelle (schizgnie u mergnie), suivie par une multiplicatin sexuelle appelée gametgnie. Finalement il y a l émergence des cystes, qui snt excrétés dans le fumier. Dans des cnditins favrables ces cystes se dévelppent en 24 heures en cystes sprulés, qui à leur tur peuvent être avalés par des animaux, et le cycle recmmence. La cccidise dans sa frme aiguë est mrtelle et dans sa frme subaiguë cause la perte de pids suite à la diminutin de la cnversin alimentaire et réduit la prductin d œufs de vlaille. Figure : Le cycle de vie d un Eimeria 173

182 3.7.2 Structure et/u grupes principaux Les cmpsés chimiques utilisés cmme cccidistatiques n nt pas de dénminateur cmmun général et peuvent exercer leur effet sur les cccidies à divers stades du cycle de vie du parasite. Ils snt généralement appelés des cccidistatiques, bien qu n puisse faire une distinctin entre un effet anticccidial (inactivatin des cccidies) et un effet cccidistatique (inhibitin du dévelppement de cccidies). Les cccidistatiques snt généralement administrés via des aliments médicamenteux, bien qu il puissent l être également par des ajuts dans l eau des abreuvirs. Certaines mlécules pssèdent également, utre leur actin cccidistatique, une activité antibitique u antibactérienne. L utilisatin du cmpsé thérapeutique cmme antibitique u cccidistatique dépend de la cncentratin administrée. En général les cccidistatiques peuvent être divisés en deux grupes, les cccidistatiques nninphres u chimiques et les cccidistatiques inphres. Les cccidistatiques inphres snt des substances qui cntiennent un grupe plyéther et qui snt prduites par fermentatin par un certain nmbre d espèces Streptmyces et Actinmadura. Ce snt des mlécules slubles dans la graisse et qui peuvent transprter des ins à travers la bicuche lipidique de la membrane cellulaire et ainsi perturber le système vital de gradient d ins des micrrganismes. Il existe deux mécanismes par lesquels les inphres peuvent régler le transprt des ins à travers des structures hydrphbes: une frmatin de cmplexes entre ins et inphre u la frmatin d un canal inique. Via la frmatin du cmplexe il y a un rati spécifique in-inphre (généralement 1-1). L inphre s enrule autur de l in de telle façn que l in est attrapé dans l intérieur plaire de l inphre, alrs que l extérieur reste principalement hydrphbe et est sluble dans les milieux nn plaires. L in est retenu dans l inphre par les atmes d xygène via des interactins in-dipôle. En fait, l inphre agit cmme slvant pur l in. Des inphres qui agissent par la frmatin d un canal inique frment un canal plaire dans la membrane cellulaire aplaire permettant aux petits ins de se muvir à travers la membrane cellulaire. L activité bilgique des inphres est due à leur capacité de perturbatin du flux inique cellulaire. Nrmalement, la cncentratin de K+ à l intérieur de la cellule est plus élevée que la cncentratin de Na+, tandis que dans le milieu extracellulaire c est le cntraire. Ce déséquilibre est nécessaire pur le fnctinnement nrmal de la cellule et est maintenu par une prtéine spécifique de transprt qui pmpe les ins sdium de la cellule en échange d ins ptassium (le sdium-ptassium adénsine trifsfatase). Les inphres perturbent ce «déséquilibre» inique, car ils permettent aux ins de buger à travers la cellule, avec, cmme cnséquence, des lésins cellulaires et apptses éventuelles. Les cccidistatiques inphres cmprennent : semduramycin (sdium), lasalcid (sdium), mnensin (sdium), salinmycine (sdium), narasine et maduramicine (ammnium). Les cccidistatiques nn-inphres n nt pas de prpriétés chimiques cmmunes et snt : halfuginne, nicarbazine, rbenidine (chlrhydrate), diclazuril et décquinate. 174

183 Actuellement, il y a 11 cccidistatiques autrisés cmme additif alimentaire chez les pulets, les dindes et les lapins. Chaque prduit est légalement autrisé en vertu d un nm de marque pur une utilisatin dans une espèce cible spécifique et à une cncentratin spécifique. Chaque licence inclut également une péride d attente bligatire, c est à dire le temps minimum qui dit s éculer entre la dernière administratin du cccidistatique à l animal et sn abattage. Cette péride d attente u temps de retrait vise à éviter la prévalence des résidus des cccidistatiques dans les aliments d rigine animale et par cnséquent un risque éventuel pur les cnsmmateurs. Le règlement (CE) nr.1831/2003 prévit la pssibilité de changer la licence d autrisatin d un additif sur demande du preneur de licence et après avis de l Autrité Eurpéenne de Sécurité des Aliments (EFSA) Halfuginne Le brmhydrate d halfuginne est un cmpsé nn inphrique dérivé d un alcalïde naturelle de la plante Dichra febrifuga Lur. L ismère «trans-halfuginne» est le principe actif, tandis que l ismère «cis» est présent cmme impureté Rbenidine Le chlrhydrate de rbenidine est un cccidistatique synthétique et nn inphrique qui est autrisé à une cncentratin de 30 à 36 mg/kg pur les aliments pur animaux chez les vlailles et à une cncentratin de 50 à 66 mg/kg pur l alimentatin des lapins (marque Cycstat ) Nicarbazine La nicarbazine est un cmplexe de synthèse nn inphrique cmpsé d une quantité équimlaire de 4,4 -dinitrcarbanilide (DNC) et de 2-hydrxy-4,6-diméthylpyrimidine (HDP), autrisé cmme additif cccidistatique dans l alimentatin animale chez les pulets d engraissement, éventuellement sus frme de prduit cmbiné au narasin (marque Maxiban ) Diclazuril Le diclazuril est un cmpsé synthétique nn-inphrique dnt l utilisatin en tant qu agent cccidistatique est autrisée à une cncentratin maximale de 1 mg/kg d aliment cmplet pur animaux chez les pulets et les dindes d engraissement (16 et 12 semaines au maximum, respectivement), mais aussi chez les lapins et pintades (marque Clinacx ) Décquinate Le décquinate est un cmpsé synthétique nn-inphrique déjà décrit en Sn utilisatin est relativement limitée, car il y avait des supçns de résistance des cccidies au prduit si la même entreprise l utilisait durant une péride assez lngue. Le décquinate est autrisé en tant qu additif alimentaire chez les pulets d engraissement à une dse minimale-maximale de 20 à 40 mg/kg d aliment cmplet (marque Deccx ) 175

184 Semduramycine La semduramycine-sdium est un agent plyéther inphre qui est prduit par fermentatin par Actinmadura rserufa et purifié chimiquement. Elle est autrisée cmme cccidistatique pur les pulets d engraissement à une dse maximale de 25 mg/kg d aliment cmplet (marque Aviax ) Lasalcide Lasalcide-sdium est un inphre plyétherique naturel qui est prduit par fermentatin de Streptmyces lasaliensis subsp lasaliensis. Il est islé du milieu de fermentatin par une acidificatin et ensuite purifié. Le principe actif principal du prduit purifié est lasalcide A, qui représente 90% du prduit final. Le slde de 10% dans le prduit final est cmpsé des hmlgues B, C, D et E, mlécules pur lesquelles un grupe méthyle est remplacé par un grupe éthyle en différentes psitins de la mlécule. L usage de lasalcide-sdium cmme cccidistatique est autrisé pur les pulets d engraissement et les pules pndeuses (jusqu à 16 semaines), et pur les dindes à 12 semaines (marque Avatec ). Le niveau maximal de l ingrédient actif dans l alimentatin est de 125 mg/kg Mnensin Le mnensin est un inphre plyétherique naturel qui est prduit par la fermentatin de Streptmyces cinnamnensis. Il est cmpsé de plusieurs analgues A, B, C et D dnt le mnensin A est l élément le plus imprtant (98%). Dans la pratique le mnensin est utilisé sus la frme de sel de sdium. Le mnensin-sdium est autrisé cmme additif cccidistatique pur les aliments de pulets d engraissement aux cncentratins de 100 à 125 mg/kg d aliment cmplet. Il est aussi autrisé pur des pules pndeuses (âge maximum de 16 semaines) dans une gamme de cncentratin de 100 à 120 mg/kg. Pur les dindns jusqu à l âge de 16 semaines le mnensin est autrisé dans une gamme de 60 à 100 mg/kg (marques Cxidin et Elancban ) Salinmycine Le salinmycine est un inphre plyéther naturel qui est islé de Streptmyces albus, et qui a un effet antimicrbien ainsi qu un effet anticccidial. Il est principalement utilisé sus frme de sel de sdium. Salinmycine sdium est autrisé cmme cccidistatique pur les pulets d engraissement dans une cncentratin minimale maximale de mg/kg d aliment (marque Salinmax ). Sus la marque Sacx le salinmycine sdium est autrisé à une cncentratin de 50 mg/kg pur les pules pndeuses et les pulets d engraissement et pur les lapins d engraissement à une cncentratin de mg/kg. 176

185 Narasin La narasine est un plyéther inphre prduite par Streptmyces aurefaciens qui a un effet anticccidial ainsi qu un effet antimicrbien. Le cmpsant principal de la narasine est le narasin A (96%), mais il cntient aussi les variantes structurelles B, D et I. La Narasine est autrisée cmme cccidistatique pur utilisatin chez les pulets d engraissement dans une cncentratin minimale-maximale de mg/kg (marque Mnteban ). Cmme déjà mentinné ci-dessus la narasine est également permise pur utilisatin en cmbinaisn avec nicarbazine Maduramicine Ce prduit inphre est btenu cmme le sel d ammnium d un acide mn carbxylique plyétherique prduit par Actinmadura yumaensis. La maduramicine a un effet anticccidial ainsi qu un effet antimicrbien. La maduramicine ammnium qui est utilisée cmme additif alimentaire est cmpsée pur 90% du sel d ammnium d un plyéther mn carbxylique avec une grupe -OCH3 à la psitin C5 de l anneau A (maduramicine-alfa) et pur 10% d un cmpsé structurellement similaire avec un grupe -- OH à cette psitin (maduramicine-beta). La maduramicine-alpha a une affinité surtut pur les catins mnvalents. La maduramicine-ammnium est autrisée cmme cccidistatique pur les pulets et les dindes d engraissement (jusqu à l âge maximale de 16 semaines), à une cncentratin maximale de 5 mg/kg (marque Cygr ) Amprlium L amprlium n est pas un antibitique, mais un analgue de la thiamine (= vitamine B1). Il est en cmpétitin avec le transprt actif de la vitamine thiamine par les cccidies qui nt besin de cette vitamine pur leur crissance dans les intestins des vlailles. L amprlium a suvent été utilisé en cmbinaisn avec éthpabate u avec éthpabate en cmbinaisn avec sulfaquinxaline. La dse habituelle est de 125 mg/kg amprlium + 8 mg/kg éthpabate Les différents techniques d analyse La technique d analyse utilisée pur les différents cccidistatiques dépend de l bjectif de l analyse. Glbalement, deux types d analyse peuvent être distinguées, à savir le cntrôle des dsages des cccidistatiques utilisés dans l alimentatin animale et la détectin des résidus de cccidistatiques dans les denrées alimentaires et les aliments pur animaux. Cmme décrit ci-dessus, il existe actuellement 11 cccidistatiques autrisés cmme additif alimentaire pur une utilisatin chez les pulets, les dindes, la pintade et les lapins au myen de différentes licences. Chaque licence décrit l utilisatin d un cccidistatique pur des animaux spécifiques et à une cncentratin bien déterminée, c est à dire avec des valeurs autrisées minimales en maximales. L rdre de grandeur des cncentratins est en mg/kg et dnc le cntrôle de 177

186 la dse cible pur les animaux snt faisables avec des méthdes d analyse traditinnelles cmme l HPLC et la micrbilgie. En générale un seul cccidistatique est déterminé quantitativement par analyse. Pur l analyse HPLC les cnditins snt ptimisées afin qu elles sient idéales pur chaque cccidistatique. Pur les cccidistatiques chimiques n peut utiliser une détectin UV, tandis que pur les inphres une dérivatisatin est nécessaire pur les rendre détectables par flurescence. Pur les cccidistatiques qui nt aussi un effet antimicrbien l analyse peut être effectuée par une méthde micrbilgique. Il s agit d une méthde ù une quantité du cccidistatique est ajuté à un milieu de culture liquide inculé avec des bactéries. Ainsi la crissance des bactéries présentes sera inhibée. Le degré d inhibitin de la crissance est une mesure de la cncentratin du cccidistatique et est mesurée à l aide d un spectrphtmètre. On parle dans ce cntexte de turbidimétrie car il y a réellement une turbidité du milieu qui est mesurée. Une augmentatin de la turbidité de milieu de culture est en relatin avec une augmentatin de la crissance bactérienne et dnc avec une cncentratin plus basse du cccidistatique. La quantificatin de la cncentratin d un cccidistatique dans un aliment est réalisée par cmparaisn entre la turbidité d un milieu de culture ensemencé dans lequel n a ajuté différentes cncentratins du standard (curbe de calibratin) et la turbidité d un milieu de culture ensemencé dans lequel n a ajuté l extrait de l aliment qui dit être analysé. Puisqu n ne mesure qu une inhibitin de la crissance, une identificatin du cccidistatique n est pas pssible. On peut seulement quantifier en suppsant que l inhibitin mesurée est causée par le cccidistatique qu n veut analyser. A côté de l utilisatin réglementée des cccidistatiques pur certains animaux cibles, il y a aussi des animaux pur lesquelles l utilisatin des cccidistatiques est interdite. Pur cntrôler l absence de cccidistatiques dans les aliments pur ces animaux il nus faut une analyse à des niveaux de résidus (µg/kg). Basé sur des études de txicité chez des animaux nn cibles n a fixé des limites maximales pur les différents cccidistatiques dans des aliments pur ces animaux. Pur cntrôler les résidus de cccidistatiques indésirables dans les aliments n utilise la LC-MS et l UPLC cmme technique d analyse. En plus du cntrôle dans des aliments il y a aussi des limites maximales en cccidistatiques dans la viande, les œufs, le fie et les reins (p.e. les Maximum Residue Limits u MRLs) parce que les résidus de cccidistatiques dans des aliments peuvent être transférés dans des denrées alimentaires. Les cntrôles des MRLs dans les denrées alimentaires snt réalisés par LC-MS Les MRLs pur les différents cccidistatiques snt entre autre décrits dans la Directive 2009/08/CE (aliments) et le Règlement (CE) n 124/ Txicité pur l hmme et/u l animal Aperçu de la situatin Les explitants du secteur de l'alimentatin animale puvant prduire une grande variété d'aliments au sein d'un même établissement, différents types de prduits divent parfis être fabriqués successivement sur une seule chaîne de prductin. Il peut ainsi arriver que des traces inévitables d'un prduit subsistent dans la chaîne de prductin et qu'elles sient encre présentes au début de la prductin d'un autre prduit destiné à l'alimentatin animale. 178

187 Cette prpagatin d'un lt de prductin à l'autre se nmme «transfert» u «cntaminatin crisée» et peut par exemple se prduire lrsque des cccidistatiques snt utilisés en tant qu'additifs autrisés dans l'alimentatin animale. Elle peut cnduire à la cntaminatin d'aliments pur animaux prduits en aval, en prvquant la présence de traces techniquement inévitables de ces substances dans des «aliments pur animaux nn cibles», c'est-à dire des aliments pur lesquels l'utilisatin de cccidistatiques n'est pas autrisée, tels que les aliments destinés à des espèces u catégries animales nn visées par l'autrisatin de l'additif. Cette cntaminatin crisée inévitable peut se prduire à tutes les étapes de la prductin et du traitement des aliments pur animaux, mais également pendant l'entrepsage et le transprt. Sus réserve d'applicatin des bnnes pratiques de fabricatin, les valeurs maximales du transfert inévitable de cccidistatiques vers les aliments pur animaux nn cibles divent être établies seln le principe «ALARA» (As Lw As Reasnably Achievable, c'est-à-dire au niveau le plus bas puvant raisnnablement être atteint) Halfuginne Sur la base d études limitées sur la tlérance réalisées par l industrie chez différentes espèces animales nn cibles, il a été cnclu qu une ingestin accidentelle d aliments pur animaux destinés aux pulets u aux dindes, cntenant de l halfuginne à la dse maximale autrisée de 3 mg/kg d aliments pur animaux, purrait présenter un risque pur la santé de plusieurs espèces animales nn cibles, ntamment pur les lapins, les ies, les perdrix et les cailles, qui purraient réagir par un refus de s alimenter et un ralentissement de la prise de pids. Cette dse purrait également être une cause de mrtalité chez les perdrix Rbenidine Les prducteurs des cccidistatiques nt fait des études de tlérance chez des pules pndeuses, des prcs et des ruminants. Ces études nt mntré que la cnsmmatin accidentelle des aliments pur animaux cntenant des dses maximales autrisées de 36 et 66 mg/kg d aliment n a aucun risque de santé pur ces espèces Nicarbazine Sur la base d une série limitée d études de tlérance réalisées chez différentes espèces animales nn cibles, n a cnclu qu il est imprbable qu une ingestin accidentelle d aliments pur animaux cntenant de la nicarbazine à la dse maximale autrisée chez les pulets (50 mg/kg d aliments pur animaux) entraîne des effets indésirables chez des espèces animales nn cibles Diclazuril Un certain nmbre d études de tlérance effectuées par l industrie sur des espèces animales nn cibles nt pruvé l absence de txicité du diclazuril chez les canards, les cailles, les pintades, les prcs et les ruminants expsés au taux maximal autrisé dans l alimentatin animale pur les espèces animales cibles (1 mg/kg d aliment pur les animaux). 179

188 Décquinate Différents études de tlérance nt été effectuées chez des animaux nn cibles, mais n nt pas mntré d effets txiques chez les prcs, les ruminants, les chevaux et les lapins qui nt été expsés au maximum de la teneur admise pur les animaux cible (40 mg/kg). Les chiens apparaissent être les animaux nn cibles les plus sensibles avec une tlérance d ingestin maximale de 15 mg/kg de pids crprel par jur Semduramycine La semduramycine prduit une txicité typique des cmpsés inphres chez le chien, ntamment des lésins du muscle squelettique; de plus, la semduramicine induit des mdificatins rétiniennes chez le chien qui n nt pas encre été étudiées chez d autres espèces Lasalcid Des signes d'intxicatin chez l'animal, cmprenant des signes neurlgiques (dépressin, ataxie, parésie, paralysie, tremblements musculaires) et des effets cardiaques (effets intrpes et tachycardie), nt été rapprtés chez différentes espèces nn cibles après une expsitin accidentelle, et des symptômes neurtxiques sans lésins histpathlgiques nt été décrits au curs d études expérimentales menées chez le chien. Ces signes de txicité crrespndent au mde d'actin des cccidistatiques inphres plyéthers, et cncrdent avec les symptômes bservés dans les espèces cibles à des pslgies dépassant la dse autrisée. Les espèces particulièrement sensibles snt les chiens, les veaux, les lapins et les chevaux. Par cnséquence n a cnclu que l ingestin accidentelle de la dse maximale autrisée de lasalcide dans les aliments destinés aux vlailles (125 mg/kg d'aliments) puvait entraîner des intxicatins chez les espèces nn cibles Mnensin Les caractéristiques inphres de la mlécule snt respnsables pur l intxicatin par le mnensin. Chez les animaux nn cibles, differents effets cmme des prblèmes cardiaques (y cmpris l hypertensin), des dégâts aux fibres musculaires striées et aux nerfs nt déjà été bservés. D autres signes d intxicatin snt l anrexie, la diarrhée, la dépressin, la relaxatin musculaire et le retard de crissance. Les chevaux snt les animaux les plus sensibles pur lesquels une seule dse de 2 mg/kg de mnensin est fatale. Les chiens, les canards et les petits ruminants snt aussi très sensibles aux inphres plyetheriques Salinmycine Des signes d'intxicatin chez l'animal, cmprenant des effets cardivasculaires (augmentatin de la pressin artérielle et dégénérescence mycardique), anrexie, faiblesse, ataxie, paralysie, nt été rapprtés chez différentes espèces nn cibles. Ces signes crrespndent au mde d actin des 180

189 inphres et surviennent également chez les espèces animales cibles à des cncentratins dépassant la dse maximale autrisée. Les espèces particulièrement sensibles à la salinmycine snt les dindes, les veaux pré ruminants et les bœufs, les chevaux, les chats et les chiens, alrs que les prcs snt mins sensibles Narasine Différent signes de txicité nt été cnstaté chez différents animaux cibles tels que l anrexie, l œdème pulmnaire, la nécrse des cellules du fie et des dégâts aux fibres musculaires. Ces symptômes snt causés par l actin inphrique de la narasine. Les animaux nn cibles les plus sensibles snt les chiens, les chevaux et prbablement aussi les dindes et les lapins Maduramicine Des différences de sensibilité à la maduramicine entre les espèces et une faible marge de sécurité entre le niveau maximal autrisé et la dse txique minimale chez les espèces animales nn cibles nt été mises en évidence. Des signes d intxicatin nt été signalés chez les lapins, les bvins et les vins au niveau maximal autrisé pur les pulets d engraissement et les dindes (5 mg/kg). Les syndrmes txiques incluent des cardimypathies assciées à une insuffisance cardiaque cngestive et des lésins du muscle squelettique mdérées à sévères, ce qui crrespnd au mde d actin des agents plyéthers inphres. Chez les dindes, une réductin du gain de pids crprel a été cnstatée au-dessus de 10 mg/kg d aliments et des effets létaux nt été bservés chez les prcs à 37,5 mg/kg d aliments. 181

190 3.8 Myctxines Nature et rigine Les myctxines snt des métablites secndaires prduits par des misissures. Par ppsitin aux métablites primaires, les métablites secndaires ne snt pas nécessaire à la crissance de l rganisme. Leur rôle bilgique est très différent, ils peuvent agir cmme insecticide, antibitique, antifngique, antiprtzaire De ce fait, l rganisme émetteur acquiert un avantage cmpétitif face aux autres misissure et bactéries Les risques assciés aux myctxines La préccupatin relative aux risques chimiques et bilgiques dans la chaîne alimentaire n est pas neuve. Une grande diversité de substances ptentiellement txiques peuvent se retruver dans les prduits alimentaires à différents mments de la prductin. Il est évident qu une chaîne alimentaire sûre est fndamental pur tute sciété mderne et il serait faux de déclarer que la présence de myctxines dans ntre alimentatin ne revêt aucune imprtance. Les myctxines les plus cnnues et les plus curantes, en particulier celles qui représentent une menace ptentielle pur la santé, snt régulièrement mises en évidence dans les denrées alimentaires. L ingestin de myctxines peut prvenir de la cnsmmatin de denrées alimentaires végétales mais aussi animales. Pur ces raisns, n truvera dans les chapitres suivants un résumé des recherches de résidus dans les animaux d élevage. Les résidus retruvés snt-ils dangereux pur l hmme suite à leur cnsmmatin? En général, les questins liées au bien être animal snt de mindre imprtance. M.P. (1994) le frmule cmme suit : le plus suvent, n prte peu d attentin aux maladies prvquées par les myctxines aux animaux d élevage. Les symptômes snt en effet assez vagues et il est difficile de pser un diagnstic. Les pertes d animaux snt rares, mais il peut y avir des trubles de la prductin et une diminutin de la rentabilité. Il faut cependant tenir cmpte que les animaux d élevage snt nurris à partir de grain et il n est pas imaginable que les myctxines se retruvent dans la chaine alimentaire humaine depuis les grains via les animaux. 182

191 Plante (1) Champ Frmatin des myctxines (Misissures) Cntaminatin (humaine) (2) Entrepôt Alimentatin Infectin par (1)et/u (2) Lait Viande Animal -Aflatxines (les plus cnnues) frmées par Aspergillus flavus -autres:ochratxine, DON(dexynivalenl), Fumnisine e.a. Figure : Vies d'expsitin aux myctxines Myctxicse Il n est pas évident de cnsidérer une myctxine cmme cause pssible de myctxicse. Un lien clair entre une myctxine et une maladie n a été que rarement mis en évidence et ce pur les raisns suivantes : Les myctxines snt suvent présentes en très faible quantité et peuvent ne pas être détectées si les analyses ne snt pas sensibles assez, u si la myctxine n a pas encre été identifiée. Lrs d une détectin de myctxine, la surce de cntaminatin a suvent déjà disparu et n est dnc plus dispnible pur l analyse. À part quelques cas particuliers pur lesquels ils snt bien décrits, les symptômes cliniques snt vagues et chrniques. Dans le cas de nuvelles mlécules, les effets bilgiques et médicaux pur les hmmes et les animaux snt le plus suvent incnnus. Les vétérinaires snt suvent peu familiers avec les symptômes car l apparitin des myctxines est spradique, étendue gégraphiquement et liée aux saisns. Le principe txiclgique qui lie la dse d un txique à la répnse de l rganisme est difficilement applicable vu la nature chrnique des myctxicses Suvent, plusieurs myctxines snt présentes simultanément. L effet synergétique induit par la présence de plusieurs myctxines est encre incnnu. 183

192 Les critères suivants nt été prpsés pur l identificatin d une myctxicse : La maladie dit être causée par un prduit alimentaire Aucun rganisme pathgène ne dit être islé de l aliment La maladie ne peut pas être cntagieuse u transmissible Après arrêt de la cnsmmatin de la nurriture cntaminée, n dit vir une nette améliratin de l état du sujet La myctxine dit être identifiée dans la nurriture de l animal et dit être détectée en quantité suffisante pur induire un effet txique Les myctxines islées divent être recnnues cmme induisant les symptômes bservés Si la nurriture cntaminée est dnnée à des animaux sains, ils divent alrs mntrer les même symptômes L analyse pst mrtem peut seulement indiquer une irritatin de la grge u une inflammatin des tissus Cnditins de prductin des myctxines Il y a beaucup de facteurs qui influencent la prductin des myctxines, cmme l activité en eau, la température, le temps, les cncentratins en xygène et dixyde de carbne, la cmpsitin du substrat, la présence abndante de misissures, la présence de suches txiques, la quantité de spres, les interactins micrbilgiques et la présence d insectes. Bien que la purriture, la crissance des misissures et la frmatin des myctxines résultent d une interactin cmplexe entre ces différents facteurs, la cmpréhensin de chaque facteur est essentielle pur cmprendre le prcessus dans sn entièreté et puvir ainsi faciliter le prnstic et prévenir l apparitin des myctxines L activité en eau Dans les climats tempérés, les misissures qui clnisent les grains peuvent être classées en tris catégries suivant la quantité d eau dnt elles nt besin : les champignns de cultures, les champignns de cnservatin et les misissures qui apparaissent lrs de purritures avancées. Lacey & Magan (1991) nt mntré que le dmaine a w de prductin des myctxines est généralement plus limité que le dmaine dans lequel les misissures peuvent se dévelpper. (cfr. Figure 3.8.2) 184

193 Figure : Relatin entre crissance des misissures et prductin des txines Température La température est aussi un facteur imprtant qui influence la prductin de myctxines. Cmme pur l activité en eau, les misissures nt des températures minimale, ptimale et maximale de crissance. La température a une grande influence sur les besins en eau, en effet, le teneur minimale est différente suivant la température et suivant également le type de substrat. L activité en eau nécessaire est la plus basse à l ptimum de température et la plus haute aux températures minimale et maximale de crissance. Nrhlt et al. (1979) n mntré ce mdèle dans le cas de la prductin de l chratxine par P. cyclpium, P. viridicatum et A. chraceus Substrat Les différences de crissances des misissures et de prductin de txines dépend des caractéristiques physic-chimiques du substrat. Les paramètres physiques snt la quantité d eau dispnible, la résistance mécanique suite à l entassement qui détermine la quantité résiduel d air et dnc la quantité d air dispnible ainsi que la cnductivité thermique qui influence la migratin des températures dans la matrice. Les prpriétés chimiques snt les teneurs en matières grasses et prtéiques, en lig-éléments, en acides aminés et acide gras Teneur en xygène et en dixyde de carbne La plupart des misissures qui causent la purriture des grains nt besin d xygène. Une cncentratin basse en O 2 (<1%) et/u une augmentatin de la cncentratin en CO 2 résultent dans la plupart des cas dans la frmatin de misissure et dans la prductin de txine Interactins micrbiennes La présence d autres micr-rganismes, misissures u bactéries, peut mdifier la crissance des misissures et la prductin de txines. 185

194 Dégâts mécaniques et insectes La relatin entre les misissures de cnservatin et les insectes est imprévisible. Certains insectes dispersent les misissures, d autres peuvent en diminuer la crissance. Les mites peuvent ainsi avec leurs crps répandre des spres de misissures des grains infectés vers des grains sains Temps Madhyasta et al. (1990) nt étudié la crissance et la frmatin de txines par A. alutaceus et P. verrucsum après 7, 15 et 30 jurs d incubatin. Ils nt bservé peu de prductin de txines avant le jur 5. Une crissance perceptible et une prductin de txine nt été démntrées après le septième jur. Les auteurs nt cnclu à une évlutin lgarithmique. Dans tus les substrats (blé, maïs, clza, cacahuète) à part les graines de sja, la prductin de txine cntinue à augmenter jusqu au jur 30 après lequel plus aucune mesure n a été réalisée. Étant dnné que les myctxines snt répartis de façn très irrégulière au sein d un lt, le législateur eurpéen a déterminé dans le règlement 401/2006 le mde de prélèvement des échantillns de denrées alimentaires pur la recherche des myctxines. Des prpsitins nt été mis en place pur l'échantillnnage d aliments pur animaux Ochratxine A (OA) Structure de l chratxine A Figure : structure chimique de l chratxine A Les Ochratxines snt un grupe de plusieurs mlécules chimiquement apparentées qui snt islées de certaines espèces d Aspergillus et de Penicellium.. On retruve entre autre les chratxines A, B et C, les esters méthyliques et éthyliques de ces structures ainsi que les chratxines α et β. La plus curante et la plus txique parmi ces mlécules est l chratxine A L chratxine A (MW = 403.8) est un cmpsé cristallin inclre, sluble dans les slvants rganiques plaires et dans les slutins aqueuses de bicarbnates diluées, légèrement sluble dans l eau et ayant un pint de fusin de 90 C quand il est cristallisé dans le benzène et de 169 C pur les cristaux btenus dans le xylène. 186

195 Une réactin chimique imprtante de l chratxine A est l estérificatin du grupe carbxyle. Le méthyl ester frmé avec du BF3-méthanl est utilisé en chrmatgraphie liquide pur la cnfirmatin de l identificatin de la mlécule Risques assciés à l chratxine A L apparitin de l OA dans les tissus animaux après ingestin de la mlécule dépend d un certain nmbre de facteurs cmme le temps d alimentatin, la dse, la façn dnt l OA est ingérée, le degré de liaisn du sérum, le temps de demi-vie et la durée d une alimentatin sans chratxine avant l abattage. Une cmparaisn entre elles des teneurs en Ochratxine A truvées dans la littérature est suvent prblématique car les méthdes d analyse ne snt pas tujurs spécifiées et leurs critères de perfrmances snt incnnus. C est purqui il est suhaitable que les études sient réalisées dans un système de qualité analytique avec des méthdes validées Effets sur les hmmes Bi marqueurs pur l expsitin OA a un temps de demi-vie d envirn 35 jurs dans le crps humain. La cncentratin dans le sang représente un marqueur adéquat de l expsitin récente (cfr. Tableau). Cette apprche pur la déterminatin de la quantité d OA ingérée chaque jur peut être cmparée avec celle calculée sur base de la cncentratin en OA des aliments Technique d analyse Extractin L extractin est le plus suvent réalisée avec un mélange d eau et de slvants rganiques, dépendant du type de matrice. Une méthde IUPAC/AOAC pur la déterminatin de l OA dans l rge utilise un mélange de CHCl 3 et H 3 PO 4 ; pur le café vert, seul CHCl 3 est utilisé. Pur la déterminatin dans le blé, n utilise différents milieux d extractin en ce cmpris le mélange tluène/hcl/mgcl 2, CHCl 3 /ethanl/acide acétique et dichlrméthane/h 3 PO 4. Les slvants chlrés snt de mins en mins utilisés à cause de leur effet néfaste sur l envirnnement. Burdaspal a prpsé le methylbrmyde tert-butylether cmme slvant d extractin pur l OA dans les aliments pur bébé. D autres mélanges nn chlrés qui snt utilisés pur le blé snt : méthanl/eau, acétnitrile/eau. Seulement deux méthdes pur la déterminatin de l OA dans l rge et le café trréfié snt validées. L extractin de l rge est réalisée avec un mélange acétnitrile/eau, et l extrait est dilué avec du PBS pur purificatin par IAC. Lrs d un test d aptitude sur la déterminatin d OA dans le café trréfié, un mélange de méthanl avec une slutin aqueuse à 3% de bicarbnate de sdium (50:50) a été emplyé principalement pur l extractin. Zimmerli et Dick nt décrit une méthde de déterminatin de l OA dans le vin ruge en utilisant une extractin au chlrfrme. 187

196 Purificatin La technique IAC (immun affinity clumn) est le state f the art pur la purificatin de l OA. L extrait parcurt la clnne et l chratxine est liée par des anticrps. L analyte est ensuite élué par une slutin adéquate (par exemple l acétnitrile). La réactin immunlgique est spécifique à l OA. L analyte est élué de la clnne après une étape de rinçage Séparatin et détectin Après la purificatin sur IAC, la détectin se fait le plus suvent par HPLC-FLD. La déterminatin est pssible à des niveaux du µg/kg. Généralement n utilise l HPLC en phase inverse avec des clnnes greffées en C18 et une slutin tampn acide (acide acétique). Des rendements de 70 à 100% snt rapprtés. Les critères de prestatins pur la déterminatin de l OA snt décrits dans le règlement 401/ Dexynivalenl (DON) Intrductin Apparitin et imprtance de la dexynivalenl (DON) dans les aliments pur animaux On truve le plus suvent les txines de Fusarium dans le blé, le maïs et l rge. L avine, le seigle et le triticale peuvent aussi cntenir ces txines, mais en général ils snt résistants u échappent à des cntaminatins significatives Prductin de DON par les misissures Dexynivalenl est une myctxine appartenant à la famille des trichthécènes qui apparaissent à grande échelle dans les céréales. DON est la mlécule trichthécènes la plus suvent retruvée au Canada et aux Etats-Unis. On retruve en plus faible quantité la nivalenl, les txines T-2 et HT-2 tandis que le diacetxyscirpenl (DAS) est très peu présent. 188

197 La zearalenn (ZEA) et les trichthécènes snt les myctxines les plus imprtantes d un pint de vue écnmique pur le Canada et le nrd des Etats-Unis. Dans d autres pays, ce snt l chratxine et l aflatxine qui nt un impact écnmique plus grand que les txines de Fusarium Structure du DON CH 3 O O O O H CH 2 CH 3 O H OH Figure : Dexynivalenl 4-Dexynivalenl (DON; vmitxin, dehydrnivalenl, RD-txine) est l appellatin pur le 12,13- epxy-3,4,15-trihydrxytrichtec-9-et-8-ne (MW: 296,32) (cfr. Figure 3.8.5). Dn se présente sus frme de cristal blanc avec un pint de fusin de C. C est un prduit ptiquement actif, sluble dans l éthanl, le méthanl, l acétate d éthyle, l eau et le chlrfrme. C est un cmpsant stable, aussi bien durant le stckage et le bryage que durant la préparatin et la cuissn de la nurriture. La mlécule n est pas dégradée à haute température Méthde d analyse Extractin L extractin du DON est réalisée par agitatin dans une slutin aqueuse d acétnitrile, de l eau u de l eau avec du plyéthyleneglycl. Le temps d extractin dit être suffisant (2h) cmme présenté dans la méthde pur les furrages Purificatin La purificatin est réalisée avec des clnnes d immunaffinité u des clnnes SPE Séparatin et détectin L analyse peut être réalisée aussi bien en RP-HPLC-UV qu en GC après dérivatisatin. En HPLC-UV, il faut travailler dans les UV bas (218 nm) Le règlement 401/2006 présente les critères de prestatins pur l analyse du DON. 3 malheureusement, l auteur de cette étude ne dnne pas de ces bservatins pur l Eurpe. 189

198 3.8.7 Fumnisines Structure des fumnisines On retruve les fumnisines la plupart du temps dans le maïs suillé et dans les prduits à base de maïs. On les retruve un peu mins suvent dans d autres denrées alimentaires cmme le srgh, le riz, la bière et les haricts. Les fumnisines les plus curantes snt les fumnisines B1 et B2. Les méthdes d analyse snt dnc dévelppées essentiellement pur ces deux mlécules. En général, les méthdes dirigées vers les fumnisines B1 et B2 semblent valables pur la fumnisine B3. Il n existe pas de méthde d analyse spécifique pur la fumnisine B4 et il y a très peu d infrmatin sur sn apparitin naturelle. Les fumnisines snt un grupe de matières apparentées structurellement. La fumnisine B1 est le diester de l acide 1,2,3-tricarbxy-prpane et du 2S-amin-12S,16R-diméthyl-3S, 5R,10R,14S,15R pentahydrxyeicsane ù les grupes hydrxyde du C14 et du C15 snt estérifiés. La fumnisine B2 est l analgue déxygéné en C10 de la B1. La stéréchimie cmplète des fumnisines B3 et B4 est incnnue, mais la terminaisn amin de la fumnisine B3 a la même cnfiguratin que celle de la fumnisine B1. 190

199 Les misissures prduisant les fumnisines. Les fumnisines snt prduites par des misissures du genre Fusarium. La seule espèce qui prduit des quantités significatives de fumnisines est le Fusarium verticilliides (Sacc.) Nirenberg (F. mnilifrme (Sheldn)=) et l espèce apparentée F. prliferatum (Matsushima) Nirenberg qui dmine en fin de péride de crissance. Au mins dix autres espèces de Fusarium prduisent aussi cette txine. F. verticilliides et F. prliferatum appartiennent aux misissures les plus cmmunes sur le maïs et snt retruvés aussi bien sur les épis endmmagés que sur les épis intacts. Ces espèces causent la purriture fusarienne du maïs, une maladie imprtante dans les régins chaudes. Il existe également une relatin étrite entre les dégâts des insectes et la purriture fusarienne avec d autres espèces de Fusarium cmme F. graminearum. Le stress thermique peut aussi juer un rôle, spécialement pur les cultivars cultivés en dehrs de leurs régins d rigines. F. verticilliides et F. prliferatum crissent dans une gamme étendue de température, mais c est uniquement à des valeurs de l activité en eau assez élevées (> 0.9) qu il peuvent prduire dans le maïs, avant la réclte u la phase du séchage, des fumnisines. Sauf dans des circnstances extrêmes, les cncentratins de fumnisines n augmentent pas durant le stckage Les hmmes Chez l hmme, plusieurs apparitins nt été déterminées avec des cancers de l œsphage, des cancers du fie et un cas cnfirmé de myctxicse aiguë en Inde Techniques analytiques Screening La chrmatgraphie sur cuche mince et les techniques immunchimiques cmme l ELISA snt les méthdes de screening les plus curantes. Il existe différents kits ELISA dispnibles dans le cmmerce Méthdes quantitatives Les méthdes dispnibles pur la quantificatin cmprennent suvent une extractin, une purificatin avant une quantificatin de l analyte Extractin et purificatin La purificatin n est suvent pas nécessaire pur les immunessais, elle est au cntraire indispensable pur les méthdes chrmatgraphiques. Les slutins utilisées pur l extractin snt entre autre : méthanl/eau (3:1) et acétnitrile/eau (1:1). Pur la purificatin, n utilise le plus suvent des clnnes d immunaffinité. 191

200 Séparatin et détectin Vu leur caractère plaire, la technique la plus curante pur l analyse des fumnisines est la chrmatgraphie liquide en phase inverse avec une détectin par flurescence. Le plus suvent, n réalise une dérivatisatin préclnne avec le -phtaldialdéhyde / mercaptéthanl (OPA) malgré sa faible stabilité quand la détectin par flurescence suit. Des méthdes GC nt également été dévelppées. Le réglement 401/2006 présente les critères de prestatins pur l analyse des fumnisines Trichthécènes Structure Les trichthécenes snt essentiellement prduits sur les champs (Misissures Fusarium) dans les prductins céréalières. Les plus imprtants snt les T-2, HT-2 (Type A) et les DON (type B). Les txines T-2 et HT-2 snt des Trichthécènes de type A qui s apparentent aux épxysesquiterpénïdes. La recherche a démntré que les txines T-2 et HT-2 snt présentes dans les prductins tels que le frment, le maïs, l avine, l rge, le riz, les haricts et les fèves de sja. Les txines T-2 et HT-2 snt issues du Fusarium sprtrichiides, F. pae, F. equiseti et F. acuminatum. Le principal prducteur est le Fusarium sprtrichiides, une misissure saprphyte qui 192

201 se dévelppe entre -2 et 35 C et prlifère par activité (au-dessus de 0.88). Par cnséquent, les txines T-2 et HT-2 ne se retruvent nrmalement pas dans les grains lrs de la réclte, mais par suite de dégâts causés par l eau lrsque le grain reste lngtemps sur le champ durant u après la réclte, en particulier, par temps frid ù les céréales cnservées snt humides. La txine T-2 est le nm trivial du 4-15-diacétxy-3 -dihydrxy-8 -[3-méthylbutyryl-xy]-12,13- épxytrichtec-9-ène, qui est illustrée à la figure 1. Cnfrmément à la frmule brute C24H34O9, la masse mléculaire relative est de 466,5 g/ml. La txine HT-2 est le nm trivial du 15-acétxy-3-4 -dihydrxy-8 -[3-méthylbutyryl-xy]-12,13- épxytrichtec-9-ène, qui est illustrée à la figure 1. Cnfrmément à la frmule brute C22H32O8, la masse mléculaire relative est de 424,5 g/ml. Les structures des txines T-2 et HT-2 se différencient seulement par un grupe fnctinnel sur le carbne C-4-psitif, car la txine T-2 se métablise facilement en txine HT-2. C est purqui, ces deux myctxines snt évaluées ensembles. La txine T-2 se présente sus la frme cristalline d aiguilles blanches, avec un pint de fusin de C et un puvir rtatire de [ ] 26 D = +15 (c= 2,58 dans l éthanl) L hmme Un cntact accidentel de la txine T-2 avec la peau ccasinne de sérieuses irritatins et de l apathie Méthde d analyse Screening Pur le screening, des kits d immun-essais snt dispnibles pur la T-2 et la HT-2 dans le frment. L extractin est généralement réalisée dans l acétimètre/eau, le méthanl u le chlrfrme/éthanl. Il peut y avir détectin à partir de 200 µg/kg Méthde quantitative Il y a différentes méthdes existantes pur l analyse des txines T-2 et HT-2. La technique d HPLC avec détectin UV n est pas applicable étant dnné que le grupe cétne sur le carbne C8 psitif est absent. Cependant, il semble que dans la pratique cela serait bien pssible d effectuer l analyse par HPLC-UV. Pur l extractin dans les graines des aliments et furrage, il est habituellement fait usage d acétnitrile/eau u méthanl/eau. L extractin est alrs réalisée avec un ultra-turrax u un agitateur hrizntal. Pur la purificatin, de curtes clnnes IAC snt dispnibles depuis peu. L analyse peut se faire aussi bien par HPLC-FLD que par GC. Pur l HPLC-FLD, il peu être fait usage du 1-anthrynitril et du 4-diméthylaminpyridine. Pur la GC, n utilise le plus suvent la triméthylsilylatin u la fluracylatin pur augmenter la rapidité et la sensibilité. Dans le décret CE/401/2006 snt repris les indices de prestatin pur l analyse des txines T-2 et HT

202 3.8.9 Zéaralénne Intrductin La zéaralénne est prduit durant la cnservatin du maïs (misissures fusarium) et a un fnctinnement estrgène. C est une myctxine nn stérïdienne prduite par plusieurs misissures Fusarium spp. Il est cnnu qu'elle est impliquée dans plusieurs myctxicses du bétail, en particulier chez les prcs. La zéaralénne est stable à chaud et est truvée partut dans le mnde dans des céréales cmme le maïs, l'rge, l'avine, le blé, le riz et le srgh ainsi que dans le pain Ingestin chez l hmme Dans le Myen-Orient la surce la plus imprtante était le maïs (31%) et le frment (52%) ; le riz dans l Extrême-Orient (62%) ; Le maïs (55 %) et le riz (31%) en Afrique ; le maïs (27%), le riz (30%) et le frment (30%) en Amérique Latine ; et le frment (67%) en Eurpe. La cncentratin en zéaralénne dans les fruits, les légumes et les nix n est pas significative. L ingestin myenne qutidienne en zéaralénne est estimée à 1,5 µg/jur en Eurpe et 3,5µg/jur dans le Myen-Orient. Sur base des résultats des différentes études une PMTDI de 0,5 µg/kg/jur a été établie. 194

203 Méthde d analyse Extractin Les slvants utilisés pur l extractin snt nrmalement des mélanges de slvants liquides rganiques dnt l acétate d éthyle, le méthanl, l acétnitrile et le chlrphrme Purificatin Généralement n utilise une clnne IAC Séparatin et détectin La plupart du temps n utilise la technique RP-HPLC-FLD. Dans le règlement 401/2006 les critères de prestatin snt établis pur la zéaralénne. 195

204 Aflatxines Structure Méthdes d analyse Extractin L extractin des aflatxines se fait, en général, par des slvants classiques tels que l acétne, le chlrfrme, le méthanl et leurs mélanges. La pratique mntre que de petites quantités d eau augmentent, de manière significative, le rendement d extractin Purificatin La purificatin se réalise par slid-phase extractin (SPE) avec des cartuches C 18 et des clnnes flrisil u d immun-affinité (IAC) Séparatin et détectin Les méthdes de chrmatgraphie liquide les plus utilisées snt les RP-HPLC avec dérivatisatin pst clnne. La dérivatisatin peut être réalisée avec Br 2 u I 2 (pur les aflatxines B et G). La lngueur d nde d excitatin est à 435 nm, celle d émissin à 365 nm. La clnne de séparatin cnsiste en la classique C-18. Il y a cntinuellement de nuvelles techniques dispnibles en LC/MS. Récemment il y a aussi d équipements UHPLC sur le marché avec lesquels des aflatxines peuvent 196

205 être mesurées sans derivatisatin. Afin de puvir mesurer ainsi sensiblement les aflatxines B1 et G1 qui snt faiblement flurescents, une cellule de flw extra large est utilisée. Le décret 401/2006 fixe les critères de perfrmance pur l analyse des aflatxines Prpriétés Des quatre aflatxines (B 1, B 2, G 1 et G 2 ), c est l aflatxine B 1 qui est la plus imprtante et la plus txique, aussi bien pur l hmme que pur l animal, et elle est un puissant carcingène. Elle est classée, par l IARC, dans le grupe 1 et est clairement géntxique. Le métablite de l aflatxine B 1 se retruve dans le lait cmme aflatxine M 1. Dans les régins gégraphiques à frte prévalence de prteurs de l antigène du sérum de l hépatite B, il y a une frte chance de dévelppement du cancer du fie. Les aflatxines snt principalement prduites par les misissures Aspergillus : A. parasiticus et A. flavus. A. parasiticus se retruve principalement dans le sl tandis qu A. flavus se retruve principalement dans les plantes (feuilles, fleurs). Les aflatxines snt prduites aussi bien avant qu après la missn seln des cnditins de température, de pluies et de dispnibilité de nutriments bien définies. Avant n pensait que la pllutin primaire des plantes agricles en Eurpe était peu prbable, mais, récemment, n a retruvé des aflatxines dans du maïs prduit en Italie. Il est apparu que la principale surce d aflatxines dans les aliments des animaux prvient des déchets de cc, arachides et turnesl ainsi que du gluten de maïs. Les aflatxines snt dnc principalement présentes dans les myens nutritifs imprtés. 197

206 L aflatxine M Structure L aflatxine M1 et métablisée in viv, chez le bétail, à partir de l aflatxine B1 absrbée dans l alimentatin. Elle est excrétée par le lait ; chez la vache laitière 0.5 à 4 % de l aflatxine B1 ingérée se retuve dans le lait sus frme d aflatxine M1. Vu sa présence dans le lait, elle fait curir un grand risque aux enfants et nurissns, grands cnsmmateurs de prduits laitiers. L aflatxine M1 est particulièrement résistante aux traitements de transfrmatin du lait, à savir, le chaud, le frid, la lyphilisatin. Vu l affinité de l aflatxine M1 pur les caséines, n la retruve presque en ttalité dans les frmages, le lait écrémé, les ygurts, frmage blanc mais très peu dans le beurre Txicité Les aflatxines figurent parmi les cancérigènes les plus puissants. Les aflatxines M1 nt les mêmes prpriétés txiclgiques que les aflatxines B1 mais avec un puvir carcingène mindre. Une intxicatin aigüe est suvent mrtelle avec des symptômes de dépressin, anrexie, diarhée, anémie, ictère ; les liaisns hépatiques évluent en carcinme Technique d analyse Screening ELISA Cnfirmatin par clean-up sur clnnes d immunaffinité et dsage en HPLC-FLUO Ergt de seigle Intrductin Ergt de seigle est un nm cllectif pur les alcalïdes (ergtamine, ergstine ) qui snt surtut prduits dans le seigle (Claviceps purpurea). Ces cmpsés ccasinnent des fractures, de la diarrhée et nt un effet hallucingène. Vir aussi les techniques d analyse : Micrscpie. Depuis peu, il y a aussi des techniques HPLC dispnibles. Le terme ergt de seigle fait référence à des ergts fncés frmés par différentes srtes de misissures du genre Claviceps. Claviceps purpurea est le plus fréquent et n le truve surtut sur le seigle, le triticale et le frment mais aussi sur d autres céréales et herbes. La quantité d alcalïdes frmée est très variable. La législatin actuelle est basée sur le pids des ergts. Il faut cependant faire remarquer que la txicité est déterminée tant par la teneur que par la cmpsitin des alcalïdes. 198

207 Le terme alcalïdes de l ergt de seigle fait référence à un grupe varié de maximum 40 txines cnsistant en clavines, acides lysergiques et ergpeptines. Ces txines snt prduites par des misissures de la famille des Clavicipitacées à laquelle appartiennent, entre autre, Claviceps purpurea, C. paspaspali et C. fusifrmis qui snt prédminants sur le seigle, le frment et l rge mais qui peuvent se présenter aussi sur le riz, le maïs, le srgh et l avine. Claviceps purpurea cntamine les plantes pendant la flraisn. Il y a, en principe, de nmbreuses pacées qui peuvent lui servir d hôte. Les cntaminatins se prduisent plus dans le seigle et le triticale qui nt des fleurs uvertes. Cependant, différentes herbes qui cnstituent un réservir naturel pur les misissures peuvent être cntaminées. Les ergts snt résistants et restent intacts pendant l hiver et pendant la mntée du frment. Dans des cnditins favrables, ils dévelppent des périthèces qui peuvent prduire des ascspres qui à leur tur peuvent cntaminer les plantes en fleur. Après la cntaminatin, il est prduit un mycélium blanc-jaune qui prduit un miellat qui cntient des cnidies infectieuses. Le miellat attire les insectes qui dispersent les cnidies, ce qui prvque une infectin secndaire. La grandeur des ergts va de quelques mm à plus de 4 cm seln la plante hôte et le pids varie de quelques grammes à 25 g par 100 ergts. La culeur des ergts va du blanc (C. tripsaci) au brun (C. glabra) au jaune (C. hirtella) et au brun-vilet (C. purpurea). En utre, la teneur ttale en alcalïdes dans les ergts varie cnsidérablement entre 0,01 et 0,21 %. Ces différences snt dépendantes de la suche, de la régin gégraphique et de la plante hôte. En Allemagne, n a cnstaté, ces 10 dernières années une augmentatin des infectins par C. purpurea. Il en résulte que 40 à 50 % des échantillns examinés snt infectés. En plus, il peut aussi y avir des ergts des herbes qui infectent entre les missns. Les intxicatins ccasinnées par C. purpurea snt cnnues depuis des siècles. Dans la littérature myenâgeuse, ces intxicatins prtent les nms de «feu de St Antine» et «feu sacré» avec des symptômes de gangrène, de duleur intense et des symptômes neurtxiques. La dernière grande épidémie de gangrène s est prduite en Ethipie en chez 140 persnnes qui mntraient des signes d intxicatin et avec une grande mrtalité (34 %). Sur base de ces effets bilgiques, les alcalïdes de l ergt de seigle snt utilisés depuis le début du 19 ème siècle à des fins médicales. Ainsi l ergtamine agit cmme antagniste des alpha-adénrécepteurs et prvque un accrissement de la circulatin sanguine ; de même pur la brmcriptine cmme antagniste des dpamin-récepteurs. L ergmétrine est utilisée lrs des accuchements alrs que sn mécanisme d actin n est pas cnnu Méthdes d analyse L'extractin est fait à l'usage d'acétnitrile / d'ammnium carbnate 200 mg/l. Une slutin alcaline est utilisée pur rendre les alcalïdes dans la cnfiguratin apprpriée. L'extractin est réalisée avec un ultra-turrax u un agiteur hrizntale. Pur la purificatin, des clnnes SPE - dévelppées spécifiquement pur cette analyse - snt utilisées. La lngueur d'nde d'excitatin s'élève à 330 nm, la lngueur d'nde d'émissin à 415 nm. L'analyse est réalisée avec l'hplc-fld. On n a plus besin de derivatisatin pur séparer les 6 principaux alcalïdes et leurs ismères stéré. 199

208 La patuline Structure La patuline est un métablite issu d espèces fngiques de type Penicillium, Aspergillus et Bysschlamys. Penicillium expansum en est l espèce la plus fréquente. Seul Penicillium peut cntaminer les Pmacae (pmmes, pires et cings). Ce champignn est un parasite des blessures : chcs du fruit avec altératin de l épiderme, piqûres d insectes ; il est suvent identifié sur des fruits présentant des symptômes de purriture externe. Ce champignn tlérant aux températures, aux cnditins hygrmétriques, indifférent à la lumière est présent partut, dans les vergers, les statins fruitières et les ateliers de transfrmatin. Frmule mléculaire Pmme atteinte par Penicillium expansum La présence de patuline n'est pas décelable au gût u à l drat. Seule l'analyse peut la mettre en évidence. Les jus cntaminés n'nt ni gût particulier, ni mdificatin d'aspect. C'est un txique à faible dse sur les animaux à sang chaud et l'hmme. Les alcls frts n'en cntiennent plus. La transfrmatin d'alcls à faible degré d'alcl en vinaigres détruit également la patuline, mais celle-ci ci n'est pas détruite par la pasteurisatin. Elle est cependant présente dans les prduits cidricles nn fermentés u faiblement fermentés. Cette mlécule de faible pids mléculaire est difficilement dégradable et thermstable en milieu aqueux. La patuline, cmme d'autres myctxines est capable de subsister des années dans les denrées, même après l'éliminatin des misissures par un fngicide u par traitement mécanique Txicité A partir d'une certaine dse (faible), les symptômes se manifestent par des lésins cngestives au niveau des pumns, des reins et de la rate ; mais accessirement, la patuline prvque une dégénérescence des neurnes du crtex cerébral, d'ù peuvent résulter divers symptômes nerveux (dnt paralysie...). Classificatin IARC : Grupe 3 (nn classifiable cmme carcingène pur les humains). 200

209 Technique d analyse extractin à l acetate d éthyle clean-up SPE injectin et quantificatin en HPLC-UV cnfirmatin pssible en GC-MS 201

210 3.9 Les allergènes Les allergènes alimentaires Généralités Une allergie est en fait une réactin exagérée de ntre crps à des substances (appelées antigènes) étrangères à l'rganisme, que ntre système immunitaire cnsidère à trt - n ne sait trp purqui - cmme ennemies, alrs qu'intrinsèquement, elles ne snt pas dangereuses, cntrairement à certains micrbes u virus. Pur des raisns peu claires, le système immunitaire des persnnes allergiques à une substance précise cnsidère la substance allergisante cmme un ennemi. Dans ce cas, les antigènes snt appelés allergènes. N'imprte quel allergène susceptible d'entrer dans ntre crps peut prvquer une allergie. Pur résumer la situatin, il existe deux grandes espèces d'allergies: les allergies alimentaires et les allergies respiratires. Dans les deux cas, le mécanisme au curs duquel l'allergie apparaît est le même. Le premier cntact avec la substance allergène ne prvque aucune réactin dans l'rganisme: c'est ce que l'n nmme la phase de sensibilisatin, mais le deuxième cntact de la persnne allergique avec l'allergène suscite la réactin allergique. Les allergies respiratires apparaissent suite au cntact du système immunitaire de l'appareil respiratire avec un allergène, tel que acariens, pllens, misissures, pils d'animaux, etc. Une allergie respiratire prvque principalement des difficultés respiratires: rhinites, sinusites, laryngites, asthme, etc. Les allergies alimentaires apparaissent suite à l'ingestin d'allergènes qui entrent en cntact avec le système immunitaire de l'appareil digestif. Les symptômes des allergies alimentaires snt plus variés: éruptins cutanées, edèmes (gnflement), urticaire, asthme, chc anaphylactique (degré le plus grave des réactins allergiques), trubles digestifs, rhinites. Les allergies alimentaires peuvent se prduire chez 2 à 3% de la ppulatin belge et prbablement 8 % des enfants, le taux étant quelque peu plus élevé chez les enfants. Actuellement, n cmpte plus de 160 allergènes alimentaires. Les allergènes les plus cnnus se truvent dans les arachides, les eufs, le pissn et les crustacés, les céréales cntenant du gluten (frment, rge, avine et seigle), le sja, le lait et les prduits laitiers, les nix et leurs dérivés, les graines de sésame, les denrées alimentaires cntenant des sulfites (cnservateurs utilisés dans certains aliments). Les réactins allergiques les plus graves snt prvquées par la cnsmmatin d'arachides (chc anaphylactique puvant être mrtel si traité trp tard). Les allergies alimentaires snt dès lrs en première instance en relatin directe avec des éléments habituels et nrmaux de ntre alimentatin auxquels une persnne est allergique (surce : Une allergie alimentaire survient en réactin à une prtéine qui peut être présente par exemple dans les arachides, le lait de vache, le pissn, etc. Il est dnc impssible d être allergique à un sucre u à un crps gras, même si l n peut très bien avir une intlérance au lactse, sucre naturellement présent dans le lait. Pur prvquer une allergie, une très petite quantité de l aliment est suffisante pur prvquer des symptômes. L unique slutin, pur un traitement curatif des allergies alimentaires, cnsiste à bannir la cnsmmatin des aliments allergènes. 202

211 Les symptômes d allergie peuvent être légers, par exemple des pictements sur les lèvres, u très graves et ptentiellement mrtels, cmme une difficulté à respirer, une perte de cnscience u de l arythmie cardiaque dans le cas d un chc anaphylactique Mécanisme de la réactin allergique Lrs d une allergie, le système immunitaire réagit envers une u quelques substances spécifiques et nn cntre tus les ingrédients de l aliment. L rganisme cnsidère ces substances cmme dangereuses et met en place un mécanisme pur les éliminer. Le système immunitaire, grâce à des anticrps (immunglbulines, Ig) cmmande la libératin de substances pr-inflammatires cmme l histamine et prvquent des effets sur le crps cmme des rugeurs, des démangeaisns, une rhinite, de l eczéma, de l asthme. Les symptômes d allergie apparaissent au mment du deuxième cntact avec l aliment. Au premier cntact avec l aliment allergisant, le système immunitaire, se «sensibilise». Au secnd cntact, il sera prêt à réagir. L allergie se dévelppe dnc en deux étapes Les allergies crisées Ce snt des allergies à des substances présentant des similitudes chimiques. Par exemple, une persnne allergique au lait de vache risque frt d être aussi allergique au lait de chèvre, en raisn de la similarité de leurs caséines. Des tests cutanés permettent d identifié les allergies crisées. Ci dessus, un tableau présentant quelques allergies crisées Symptômes Les signes d allergies apparaissent habituellement dans les minutes suivant l absrptin de l aliment (et jusqu à deux heures). Leur nature et leur intensité varient d une persnne à l autre. Ils peuvent inclure l un u l autre des symptômes suivants, seuls u en assciatin. symptômes cutanés : des démangeaisns, des éruptins cutanées, des rugeurs, un gnflement des lèvres, du visage et des membres (urticaire, eczéma, angi-œdème). Figure Urticaire Figure Angi-edème 203

212 symptômes respiratires : une respiratin sifflante, une sensatin de gnflement de la grge, une difficulté à respirer, une sensatin d étuffement (asthme) ; le nez qui pique, qui cule, tensin dans les sinus, rugeurs aux yeux, rhinite). symptômes digestifs : des crampes abdminales, de la diarrhée, des cliques, des nausées et des vmissements. symptômes cardivasculaires : une pâleur, un puls faible, des éturdissements, une perte de cnscience La réactin et le chc anaphylactiques La réactin anaphylactique est une réactin subite et généralisée tuchant tut l rganisme. Traitée nn rapidement, elle entrainera un chc anaphylactique se traduisant par une chute de la tensin artérielle, un perte de cnscience, vir le décès en quelques minutes. Dès les premiers signes de réactin grave et de détresse repiratire, il est vital d administrer de l épinéphrine (adrénaline) Les allergies aux arachides, aux nix, aux pissns et aux fruits de mer snt les plus suvent impliquées dans les réactins anaphylactiques dues aux allergènes alimentaires.. Pur qu il sit questin de réactin anaphylactique, les symptômes divent être très prnncés. Habituellement, plus d un système est atteint (cutané, respiratire, digestif, cardivasculaire). Pur qu il sit questin d un chc anaphylactique, il dit y avir chute de la pressin sanguine. Celle-ci peut entraîner une perte de cnscience, de l arythmie cardiaque et même la mrt Persnnes à risque Pur un enfant dnt l un des parents suffre d une frme d allergie, le risque qu il ait une allergie alimentaire augmente de 20 % à 40 %. Il grimpe de 60 % à 80 % lrsque les deux parents snt allergiques Persnnes à risque de réactin anaphylactique Les persnnes qui nt déjà fait une réactin anaphylactique. Les persnnes qui, en plus d avir une u des allergies alimentaires, snt aussi atteintes d asthme Techniques utilisées Spectrmétrie de masse PCR (plymearse chain reactin) 204

213 Elisa (sandwich et/u cmpétitive Avantages Incnvénients Spectrmétrie de masse Peu de faux psitifs ; Spécificité Sensibilité ; cuteux PCR Spécificité ; Sensibilité DNA et nn l allergène ELISA Rapide, facile, sensibilité Faux psitifs et faux négatifs pssibles L histamine Les intxicatins histaminiques fnt parties des txi-infectins alimentaires les plus répandues liée à la cnsmmatin des prduits de la pêche Frmatin de l histamine A la mrt du pissn, certaines bactéries prduisent une enzyme respnsable de la tranfrmatin d un acide aminé (l histidine présente en grandes quantités) en une amine bigène : l histamine. Figure : frmatin de l histamine L histidine peut se présenter sus frme libre mais aussi sus frme liée dans les pigments cmme l hémglbine et la myglbine. Les bactérires respnsables de la transrmatin de l histidine en histamine se dévelppent entre 7-10 C dans les uïes et viscères des pissns Espèces de pissns cncernées Les 3 principales familles de pissns riches en histidine snt : les scmbridés : thn, maquereau les clupéidés : sardine, hareng, les engraulidés : anchis, 205

214 Symptômes L intxicatin histaminique est suvent cnfndue avec une réactin allergique : n parle de pseudallergie alimentaire ; les symptômes snt les mêmes que ceux d une allergie mais les mécanismes impliqués ne snt pas immunitaires. Les symptômes durent quelques heures mais peuvent se prlnger plusieurs jurs dans les cas graves. La réactin à l histamine est différente d un individu à l autre suivant sa sensibilité. La réactin peut se prduire après quelques minutes u quelque heures suivant l ingestin du pissn cntaminé et seln une gradatin : symptômes initiaux : rugeurs au visage et à la nuque, œdème au visage, démangeaisns, pictements de la peau, sensatins de brûlure dans la grge et la buche. symptômes de secnde phase : maux de tête, éturdissements, palpitatins cardiaques. symptômes secndaires : de types gastr-intestinal cmme nausées, vmisements, diarrhées Cmment éviter sa frmatin? Saigner et rincer le pissn (le sang cntient de l histidine libre) Eviscérer (les bactéries snt présentes dans les viscères), réfrigérer u cngeler rapidement. Ne pas rmpre la chaîne du frid. Respecter de bnnes cnditins d hygiène. Remarques : L histamine est résistante à la cuissn, à la mise en cnserve, à la cngélatin. Le salage et le fumage n inhibent pas tujurs le dévelppement des bactéries respnsables de la transfrmatin de l histidine en histamine. Une fis l enzyme libérée (histidine décarbxylase), la réfrigératin ne diminue pas sn activité d ù ne pas rmpre la chaîne du frid Méthdes de dsage Méthdes de références : HPLC-flu avec dérivatisatin pré-clnne Méthdes alternatives : CCM, CPG, HPLC par ins pairés avec détectin DAD Méthdes immunenzymatiques : par kits Elisa avec dérivatisatin préalable. 206

215 3.10 Matériaux au cntact des denrées alimentaires Intrductin L industrie alimentaire est la première cnsmmatrice d emballages et représente 66% du chiffre d affaire de ce secteur. Elle est également la plus cnfrntée aux exigences réglementaires et ce, à tus les stades de prductin. A côté de l emballage, il existe une variété d bjets u cntenants susceptibles d entrer en cntact avec les denrées alimentaires. Le risque de transferts réciprques entre ces bjets u matériaux et les denrées alimentaires ne dit pas être négligé. L aptitude au cntact alimentaire d un bjet signifie que le matériau dnt il est cnstitué répnd aux exigences réglementaires garantissant qu il n y a pas de risque susceptible de présenter un danger pur la santé humaine lrs de la cnsmmatin d aliments u bissns au cntact de cet bjet. Cette aptitude est régie par le Règlement CE 1935/2004 et cncerne les matériaux et bjets tels : les emballages et cnditinnements, les récipients et ustensiles de cuisine, les machines et les matériaux utilisés dans la prductin, le stckage u le transprt de denrées alimentaires, les tétines et les sucettes. Le règlement vise les aliments et bissns qu ils sient à l état de prduits finis u de prduits intermédiaires, destinés à l alimentatin humaine. A côté du règlement cadre, il existe divers règlements u directives spécifiques décrivant les critères d inertie pur certains matériaux (Matières plastiques, céramiques, pellicule de cellulse régénérée) et les mdalités de cntrôle de la cnfrmité. La réglementatin spécifique défini les critères d inertie en fnctin de la nature des matériaux. Ce principe d inertie est exprimé en terme de limite de migratin glbale et limite de migratin spécifique (SML). La migratin glbale crrespnd à la smme des migratins des cmpsés qui cnstituent le matériau u l bjet. La limite de migratin spécifique est quant à elle définie pur le cmpsé individuel. La réglementatin eurpéenne fnctinne avec des listes psitives, à savir, des listes de substances autrisées dans la fabricatin des matériaux délivrée par la DG-Sanc. La législatin américaine fnctinne avec des listes négatives, tutes les substances nn reprises dans les listes snt autrisées. Certaines directives snt transpsées en drit natinal belge par matériau u type de matériau. Pur assurer un niveau élevé de prtectin de la santé et de la vie des persnnes, la législatin alimentaire se fnde sur l analyse des risques. L unin eurpéenne demande à chaque état membre d établir un plan natinal de cntrôle cntenant les infrmatins générales sur la structure et l rganisatin des systèmes de cntrôles fficiels. 207

216 Migratins spécifiques Généralités La migratin spécifique est le passage de substance entre deux milieux en cntact ntamment u curs de l interactin cntenant-cntenu. La migratin est surtut étudiée dans le cas d'un cntact liquide-slide. Ex. : emballage des liquides alimentaires (cntact pari du récipient - liquide cntenu). Par extensin le terme " migratin " désigne la masse de ce qui migre et peut s exprimer en mg/kg de cntenu u en mg/dm² de surface en cntact. Les migratins spécifiques peuvent être évaluées sit dans les denrées alimentaires, sit au départ des matériaux Migratin dans les denrées alimentaires Dans les denrées alimentaires, les analyses de migratin snt cmplexes car l effet de matrice est nn négligeable et la préparatin des échantillns nécessite divers clean-up et/u étapes de cncentratin Migratin dans les simulants Les paramètres de l essai de migratin snt : le cuple Temps/Température le simulant La durée de l essai de migratin varie de 30 minutes à 10 jurs et la température de 5 C à 175 C. Simulants Définitin : un milieu d essai qui imite une denrée alimentaire et qui, par sn cmprtement, reprduit la migratin à partir des matériaux destinés à entrer en cntact avec des denrées alimentaires Tableau : classe de simulants d aliments pur les essais de migratin spécifique (Règlement n UE 10/2011 de la Cmmissin du 14 janvier 2011). Ethanl à10% (v/v) Acide acétique (3% p/v) Acide citrique (5 g/l) Ethanl à 20% (v/v) Ethanl à 50% (v/v) Simulant d aliment Huile végétale présentant une répartitin particulière d acide gras. Abréviatin Simulant A Simulant B Simulant C Simulant D1 Simulant D2 208

217 Sélectin des simulants Les simulants A,B et C snt affectés aux denrées alimentaires à caractère hydrphile qui peuvent extraire des substances hydrphiles. Le simulant B est utilisé pur les denrées alimentaires dnt le ph est inférieur à 4,5. Le simulant C est utilisé pur les denrées alimentaires alcliques ayant une teneur en alcl de 20 % maximum et les denrées alimentaires cntenant une quantité significative d ingrédients rganiques qui les rendent d avantage lipphiles. Les simulants D1 et D2 snt affectés aux denrées alimentaires à caractère lipphile qui peuvent extraire des substances lipphiles. Le simulant D1 est utilisé pur les denrées alimentaires alcliques ayant une teneur en alcl supérieure à 20 % et pur l huile dans les émulsins aqueuses. Le simulant D2 est utilisé pur les denrées alimentaires cntenant des matières grasses libres en surface. Les tests snt effectués en utilisant les simulants d aliments cnsidérés cmme les plus stricts et prévisibles dans la pratique. Cnditins d essais : durée température Le cuple durée / température dit crrespndre aux cnditins de cntact prévisible les plus strictes pur le matériau u l bjet et à tute infrmatin relative à la température maximale d utilisatin indiquée sur l étiquette. Tableau : cnditins d essais cuple durée/température-directive CE n 10/2011 Cnditins de cntact dans les pires cnditins d empli prévisibles Durée de cntact t 5 mn Cnditins d essais Durée de l essai 5 min 5 mn < t 30 mn 30mn 30 mn < t 1 h 1h 1h < t 2h 2h < t 6h 6h < t 24h 1 j < t 3 j 3 j 3 j < t 30 j 10 j T > 30 jurs Température de cntact T 5 C 5 C 5 C < T 20 C 20 C 20 C < T 40 C 40 C 40 C < T 70 C 70 C 2h 6h 24h Cnditins spécifiques pur un essai accéléré (Règlement CE n 10/2011 pp/84). Température de l essai 70 C < T 100 C 100 C u température de reflux 100 C < T 121 C 121 C (1) 121 C < T 130 C 130 C (1) 130 C < T 150 C 150 C (1) T > 150 C 175 C (1) (1) : cette température n est utilisée que pur le simulant D2 pur les simulants A, B et C, l essai est remplacé par un essai à > 100 C. 209

218 Analyses Aluminium Trisième élément présent à la surface de la terre, il est le métal le plus utilisé dans l industrie ntamment dans : Transprts Bâtiment autmbile Ustensiles de cuisine Emballages alimentaires (stckage, préparatin). Le prjet des lignes directrices du Cnseil de l Eurpe retient une limite de migratin spécifique (SML) actuelle de 3,5 mg/l. L analyse est réalisée par ICP-OES avec un atmiseur cyclnique afin d atteindre une LOQ suffisante Encres : Isprpylthixanthne L isprpylthixanthne est un cnstituant (pht-initiateurs permettant le durcissement par plymérisatin) de l encre d impressin des emballages Tetra Pak et peut sus certaines cnditins migrer de l extérieur de l emballage vers le cntenu de l emballage. Figure : frmule dévelppée de l isprpylthixanthne La méthde de détectin la plus curamment utilisée après extractin est une séparatin par HPLC cuplée à un spectrmètre de masse Semicarbazide (SEM) Le semicarbazide présent dans les denrées alimentaires truve sn rigine dans : la dégradatin de l azdiacarbnamide durant le prcess de chauffage, cmme métablite relativement stable des nitrfuranes utilisés en tant qu antibitiques. L azdiacarbnamide est un agent «gnflant» utilisé dans les jints en plymères de cuvercles de certains cnditinnements afin d en assurer l étanchéité. 210

219 Pur l analyse chrmatgraphique de ce cmpsé, une étape de dérivatisatin (2-NBA 2- nitrbenzaldéhyde.) est rendue nécessaire par la structure de la mlécule. Figure : dérivatisatin du semicarbazide Différentes études nt mntré la présence de SEM à des cncentratins puvant atteindre 25 µg/kg dans des sauces préparées, des cnserves stérilisées et des aliments pur bébés. Le semicarbazide (SEM) appartient à une famille de substances chimiques (les hydrazines) dnt l inncuité pur la santé humaine et animale est largement mise en dute. La Directive 2004/1 en interdit sn usage depuis Sn usage est interdit depuis 2005 (Directive 2004/1/CE). La LC-MS cnstitue la méthde d analyse de chix pur le cntrôle de la migratin du semicarbazide Frmaldéhyde La mélamine u frmaldéhyde de mélamine est un plymère faisant partie des résines aminées. Les prpriétés de résistance à la chaleur ntamment fnt que ce plymère est largement utilisé pur des bjets destinés à entrer en cntact avec des denrées alimentaires. Cependant, le prcessus de plycndensatin entre la mélamine et le frmaldéhyde n étant pas cmplet, les mnmères libres peuvent migrer vers les denrées alimentaires. Les limites de migratins spécifiques de 15 mg/kg (Directive n CE/72/2002) pur ces mnmères snt déterminées par chrmatgraphie en phase gazeuse.. La chrmatgraphie liquide avec pst-dérivatisatin pur le frmaldéhyde est une des techniques d analyse. En effet, afin de rendre pssible l analyse de ce cmpsé par HPLC, le frmaldéhyde est dérivatisé en présence d une slutin 2,4-dinitrphenylhydrazine (DNPH). 211

220 Figure : schéma de pst-dérivatisatin du frmaldéhyde ,4-diamindiphenylmethane (DDM, MDA, DADP,DADPM) Figure : mlécule de DDM Le 4,4-diaminphenylmethane, l analine et le 2,4 tluènediamine fnt partie du grupe des amines armatiques primaires et peuvent être utilisé pur dnner une culeur nire à certains ustensiles de cuisine en nyln, elles servent aussi de durcisseur pur les résines épxydes. La limite de migratin spécifique de la smme des amines armatiques ne peut dépasser 10 µg/kg. La migratin spécifique de la mlécule des plymères est évaluée par HPLC-UV u par GC-MS Huile de sja epxydée (ESBO) : L ESBO (C57H106O10) est : un stabilisateur de matériaux en PVC. utilisé dans les jints en PVC dans le cuvercle des bcaux en verres. Seln le Règlement CE n 372/2007 les limites de migratin snt : prduits destinés aux bébés et aux petits enfants ainsi que des prduits à base de céréales: LMS =30 mg/kg fd tus les autres prduits : LMS = 60 mg/kg fd u 10 mg/dm 2 212

221 L ESBO n est à priri pas txique en tant qu additif intervenant dans le prcessus de fabricatin de plastiques à usage alimentaire. Aux températures élevées utilisées (160 C-220 C ) pur la fabricatin des articles en PVC u pur cuire les vernis des bîtes de cnserve, les prduits de cnversin d huile de sja epxidée (ESBO) dnnent lieu à des prduits nn identifiés. Dans les films alimentaires PVC et les jints PVC des cuvercles des pts en verre, prbablement mins de 10% de prduits de cnversin snt frmés Par cntre, dans les vernis des bîtes de cnserve, ils dépassent suvent les 20%. Dès lrs, certains cnditinnements purraient cnduire à ingérer jusqu à plusieurs milligrammes de ces prduits. L autrisatin d utilisatin de l ESBO cmme additif pur plastiques et vernis a été établie sans que la txicité des prduits de réactin n ait été testée. La méthde d analyse de la migratin spécifique de l ESBO est effectuée, après une étape de dérivatisatin par chrmatgraphie gazeuse. La méthde GC-FID est précnisée dans de nmbreuses publicatins. Mais une cnfirmatin pur des analyses sur des matériaux qui nt subi un chauffage durant le prcessus de fabricatin exige l utilisatin d un GC-MS. Figure : Chrmatgramme de l ESBO n ayant pas subi de chauffage. Figure : Chrmatgramme de l ESBO ayant subi un chauffage en présence d HCl. 213

222 Phtalates Les phtalates snt curamment utilisés cmme additifs dans une série de plastiques et autres matières de cnditinnements u bjets destinés à entrer en cntact avec les denrées alimentaires. Ils rendent les plastiques cmme le PVC suples et flexibles. Ils ne frment pas de liens chimiques avec les plastiques auxquels ils snt ajutés. De ce fait les phtalates peuvent migrer vers l envirnnement alimentaire. Les phtalates migrent principalement vers les aliments riches en graisses tels le frmage u la viande. Il existe une inquiétude générale sur les phtalates en raisn de leur usage généralisé et de leurs effets éventuels sur la santé. Les cinq phtalates les plus répandus snt : DEHP :Diethyhexylphthalate DBP : Dibutylphthalate DINP :Di-isnylphthalate DIDP :Di-isdecylphthalate BBP : Benzylbutylphthalate Bisphenl A Depuis plusieurs années, les perturbateurs endcriniens tels les alkylphenls, le bisphénl-a (BPA) et le bisphénl-b (BPB) retiennent l attentin du mnde scientifique pur leurs pssibles effets négatifs sur la santé humaine. De récents rapprts indiquent que les risques liés au bisphenl-a pur la santé humaine peuvent résulter d une expsitin inférieure à la limite de 0.05 mg/kg de pids crprel définie par les autrités sanitaires eurpéennes et à 0,025 mg/kg par les autrités sanitaires canadiennes. Le plycarbnate est un plastique clair, transparent, therm-rigide et largement utilisé dans la prductin de matériaux u bjets destinés à entrer en cntact avec les denrées alimentaires. Il est prduit au départ de la réactin de plymérisatin du bisphénl-a (mnmère primaire) avec le carbnyl chlride en présence d hydrxyde de sdium. Le bisphenl-a entre également dans la cmpsitin de résines épxy et cmme additif de certains plastiques. Lrs des prcessus de fabricatin, la réactin de plymérisatin n étant pas cmplète, le bisphénl résiduel peut être libéré. Par cntact, le bisphenl peut migrer du matériau vers les denrées alimentaires et une limite de migratin spécifique a été définie. La directive eurpéenne 2002/72 a réduit la limite de migratin spécifique du bisphenl-a à 0,6 mg/kg dans les aliments u les simulants alimentaires. Le règlement UE n 321/2011 de la Cmmissin du 1 er avril 2011 mdifie le règlement UE 10/2011 en ce qui cncerne la restrictin de l utilisatin du Bisphénl A dans les biberns en plastique pur nurrissn en insérant dans sn texte l interdictin frmelle de l empli du bisphenl A dans la fabricatin des biberns. 214

223 Mercaptbenzthiazle (MBT) Le mercaptbenzthiazle est largement répandu dans des articles en cautchuc cmme agent de vulcanisatin nn-vlatil et entre ntamment dans la cmpsitin de certaines tétines de biberns. Le MBT prvque des agressins cutanées telle que des irritatins de la peau. Le cntrôle de cnfrmité de la limite de migratin spécifique de 25 mg/kg est réalisé par HPLC-UV. Figure : chrmatgramme du 2-mercaptbenzthiazle (HPLC-UV). 215

224 3.11 Vitamines Intrductin Les êtres humains et les animaux snt dépendants d envirn 40 différents nutriments pur garantir le bn fnctinnement de tus leurs prcessus physilgiques. L absence u l insuffisance d une seule de ces substances prvquera des symptômes de déficience puvant être fatals à plus lng terme. Ces nutriments essentiels se subdivisent en 6 grupes : hydrates de carbne, graisses, prtéines, minéraux, vitamines et lig-éléments. Ils snt ensuite divisés en macrnutriments (hydrates de carbne, graisses et prtéines) et micrnutriments (minéraux, vitamines et lig-éléments). Les vitamines snt des substances nutritives essentielles qui, cntrairement à d autres nutriments (hydrates de carbne, graisses, prtéines) ne furnissent pas d énergie u de matériaux de base mais qui snt tutefis nécessaires pur un bn dérulement du métablisme. Ce snt des micrnutriments, des substances nutritives dnt seule une faible quantité (quelques mg u µg) dit être qutidiennement ingérée par le biais de l alimentatin car elles ne snt peu u pas suffisamment synthétisées par l rganisme. Pur chaque vitamine, il existe un apprt jurnalier recmmandé (AJR). La quantité réellement nécessaire par individu est déterminée par différents facteurs : l âge, le sexe, les facteurs envirnnementaux, l état de santé, les facteurs de stress, etc. Avec l arrivée de l élevage intensif dans le secteur de l agriculture, la nurriture naturelle a été remplacée u cmplétée par des aliments pur animaux industriels. Afin de purvir aux besins naturels en vitamines et accrître la prductin animale, des vitamines nt été ajutées aux aliments pur animaux industriels. Un apprt accru en vitamines amélire la résistance, la fécndité et la prductivité du cheptel. Le nm vitamine est dérivé du mt latin vita (vie) et amine (un cmpsé azté rganique). Ce nm a été utilisé pur la première fis par Casimir Funk en Entre-temps, il est apparu que seule une vitamine u quelques vitamines snt réellement un amine, tandis que tutes les autres appartiennent à d autres grupes chimiques. Elles snt cependant tutes des cmpsés rganiques, cntrairement aux lig-éléments cmme le zinc et le fer. A l heure actuelle, 13 vitamines snt cnnues, chaque vitamine représentant un grupe de cmpsés rganiques similaires avec la même activité. Lrsqu n a dnné un nm aux vitamines, n est initialement parti du principe d une dénminatin simple à l aide d une lettre, cmme vitamine A, B, C, etc. Les vitamines nt ensuite été subdivisées sur base de leur structure et de leur effet fnctinnel, des sus-grupes snt de ce fait apparus cmme vitamine B1, B2, B3, etc. La plupart des vitamines snt des cmpsés sensibles et se dégradent rapidement lrsqu ils snt expsés à l air et/u à la lumière. Les vitamines snt des régulateurs des prcessus de synthèse et de dégradatin et cnstituent les fndements des cenzymes, hrmnes et autres substances. Elles juent un rôle dans la crissance, le rétablissement et le bn fnctinnement du crps. On distingue deux grupes de vitamines, à savir les vitamines lipslubles et les vitamines hydrslubles. La plupart des vitamines hydrslubles snt transfrmées in viv en cenzymes qui, en cllabratin avec les enzymes métabliques, réalisent leurs fnctins bichimiques. Certaines vitamines peuvent également être directement actives en certains pints du métablisme. Les prvitamines ne parviennent à leur frme définitive que dans le crps. Quelques vitamines snt fabriquées dans le crps (la vitamine K par les bactéries intestinales et la vitamine D dans la peau, sus l influence de la lumière du sleil). 216

225 Vitamines, carence et excès Hypvitaminse Les vitamines remplissent tutes srtes de fnctins clés dans le métablisme. Lrsqu une u plusieurs vitamines ne snt pas dispnibles u le snt en insuffisance, certains prcessus métabliques snt perturbés et cela entraîne différentes carences. Bien que les vitamines remplissent le même rôle dans tute frme de vie, les rganismes supérieurs (cmme l hmme) nt perdu leur capacité à créer eux-mêmes tutes les vitamines. Le nmbre de vitamines dnt un individu a précisément besin est déterminé par différents facteurs. La grssesse, les activités physiques intenses, certaines maladies et certains médicaments augmentent les besins en certaines vitamines. C est purqui il est très difficile de dnner un besin en vitamines qutidien général. Le besin qutidien minimal en vitamines pur éviter des maladies de carence a tutefis été déterminé. En cas de carence en une vitamine, des maladies peuvent se manifester. Une administratin pprtune de la vitamine manquante y remédie la plupart du temps. Les maladies qui apparaissent en raisn d une carence ttale en une vitamine s appellent avitaminses, en cas d une simple carence en une vitamine, n les appelle hypvitaminses. Les avitaminses les plus cnnues cmme le béribéri, le scrbut et le rachitisme se manifestent lrs de carences graves en vitamine B1, C et D (principalement dans les pays en vie de dévelppement). De faibles carences en vitamines peuvent prvquer des trubles plus atténués et ne snt suvent pas clairement bservables. Ce n est qu à un stade ultérieur u dans des circnstances de stress que la maladie apparaît véritablement. Une carence en vitamines peut entre autres être ccasinnée par une alimentatin déséquilibrée : Étant dnné que la vitamine B12 ne se rencntre que dans les prduits d rigine animale, le végétarisme u végétalisme entraîne suvent une carence en vitamine B12. Les allergies u intlérances ccasinnent fréquemment un déséquilibre du régime alimentaire et peuvent détérirer l absrptin de vitamines et minéraux. Les persnnes allergiques aux fruits peuvent ainsi, par exemple, avir une carence en vitamine C. Il est cnnu que les patients atteints de maladie cœliaque (intlérance au gluten) suffrent de tutes srtes de carences en vitamines et minéraux. La pari intestinale enflammée peut difficilement assimiler tutes srtes de nutriments présents dans la nurriture. Le traitement cnsiste en un régime sans gluten qui ne cntient suvent pas tutes les vitamines et minéraux ce qui peut à nuveau entraîner des carences et des trubles. Les patients atteints de maladie cœliaque encurent par exemple un risque accru d stéprse Hypervitaminse D autre part, un excédent en vitamines peut s accumuler dans le crps et cela peut être ncif pur l rganisme. Un excès en vitamines hydrslubles est rare car celles-ci snt évacuées par l'urine. Les vitamines lipslubles au cntraire snt plus difficiles à éliminer et un excès en vitamines, u hypervitaminse, se rencntre dnc presque exclusivement avec des vitamines lipslubles (surtut la vitamine D). 217

226 Tut être humain est unique, c est purqui il est imprtant de tenir cmpte des besins individuels en vitamines et minéraux. Les tablettes multivitaminées curantes snt en règle générale les plus sûres pur quelqu un qui ne cnnaît pas ses prpres besins Types de vitamines Les 13 vitamines snt subdivisées en 2 grupes, à savir les vitamines lipslubles et les vitamines hydrslubles. Les vitamines A, D, E et K (myen mnémtechnique : KADE) fnt partie des vitamines lipslubles. On les rencntre principalement dans les denrées alimentaires riches en graisse. Les vitamines B et C slubles dans l eau se rencntrent dans tutes srtes de denrées alimentaires. Les vitamines slubles dans l eau, principalement les vitamines B, nt surtut une fnctin de cfacteur dans de nmbreuses réactins enzymatiques dans le métablisme des hydrates de carbne, des prtéines et des graisses. De ce fait, elles snt entre autres imprtantes pur la libératin d énergie de l alimentatin et pur la frmatin d éléments structuraux pur les tissus rganiques. Les vitamines lipslubles nt un grand nmbre de fnctins variées, allant d'un rôle dans la visin (vitamine A) à la régulatin de l'équilibre du calcium (vitamine D). La plupart des vitamines snt cnstituées de plusieurs cmpsés (apparentés) qui nt en cmmun une activité bilgique déterminée et qui snt désignés par un nm générique Vitamines lipslubles Les vitamines lipslubles snt : les vitamines A, D, E et K. Ces vitamines se retruvent principalement dans la graisse des denrées alimentaires et peuvent être stckées dans les tissus graisseux et le fie. Dans des circnstances défavrables, ces stcks snt sllicités Vitamine A La vitamine A est une vitamine lipsluble, également appelée all-trans-rétinl tinl u simplement rétinl. Les dérivés synthétiques rétinyl acétate et rétinyl palmitate snt ajutés aux aliments pur animaux et aux denrées alimentaires pur en augmenter la teneur en vitamine A. Figure : Frmule de la structure de la vitamine A Appellatin chimique : Vitamine A, rétinl u all-trans-rétinl Frmule mléculaire : C 20 20H 30 O Masse mléculaire : 286,46 g/ml. 218

227 Le rétinl peut se frmer dans l intestin grêle suite à une scissin xydative de bêta-cartène (carténïde). C est purqui le bêta-cartène est également appelé prvitamine A. Figure : Frmule de la structure du bêta-cartène Appellatin chimique : bêta-cartène u prvitamine A Frmule mléculaire : C 40 H 56 Masse mléculaire : 536,9 g/ml. Fnctin La vitamine A : a un effet prtecteur par rapprt à l épithélium est essentielle à la frmatin de capillaires sanguins et cntribue de ce fait à l apprvisinnement en alimentatin de tus les rganes prévient et traite les prblèmes de peau ainsi que le vieillissement cutané amélire la vue et prévient l héméralpie amélire la capacité de guérisn du crps stimule la crissance d s, de cheveux, de dents, d une peau et de gencives frts aide en cas de glande tyrïde fnctinnant trp rapidement. Le bêta-cartène, précurseur de la vitamine A, est un antixydant (rend les radicaux libres inffensifs) et a en utre des prpriétés anti-cancérigènes (à cnditin que l n ne fume pas). Hypvitaminse Les symptômes en cas d une carence en vitamine A snt l héméralpie, des maux de tête persistants, une résistance diminuée aux infectins (surtut des vies respiratires), des prblèmes de peau, des cheveux secs et cassants et des pierres aux reins. Aucun effet spécifique n est cnnu pur une carence en bêta-cartène. Une carence en vitamine A se manifeste en premier lieu là ù la plupart des cellules snt dégradées et cntinuellement remplacées (cmme dans la peau). En cas de fabricatin insuffisante et de dysfnctinnement des capillaires, les prduits de dégradatin servant de nurriture aux bactéries envahissantes s amncellent. Des lésins graves, suvent mrtelles apparaissent alrs. L héméralpie peut survenir suite à un truble de la rétine. Chez les animaux, une carence en vitamine A peut entraîner une perte d appétit, des trubles de la crissance, une perte de pids et finalement la mrt. En utre, des prblèmes peuvent également surgir au niveau de la peau, des yeux, du système nerveux, des vies urinaires et de la reprductin. 219

228 Hypervitaminse Un excédent en vitamine A cmme le rétinl est txique, surtut pur les femmes enceintes (danger pur le fœtus). Les symptômes snt entre autres un manque d appétit, une diminutin de l acuité visuelle, des maux de tête, des nausées, des vertiges, des duleurs musculaires, des anmalies culaires, des pertes de cheveux et/u des rugeurs et desquamatins de la peau. Le bêta-cartène n est pas cnsidéré cmme txique. Il est préférable pur les fumeurs de ne pas cnsmmer de trp frtes dses de vitamine A u de bêta-cartène étant dnné que cela augmente la prbabilité de dévelpper un cancer des pumns. Dsage et surces naturelles La quantité jurnalière recmmandée en vitamine A est de 0,8 mg (=800 micrgrammes). Les persnnes ayant des besins spécifiques (après une maladie, en cas d infectin u de diabète) nt besin d une plus grande quantité. La dse jurnalière maximale sûre est de 3 mg (= 3000 micrgrammes). D imprtantes surces de vitamines A snt surtut des prduits animaux dnt le fie, l huile de pissn, l huile de fie de mrue, le lait, le beurre, la margarine, le frmage et le jaune d œuf. La quantité té jurnalière nécessaire recmmandée en bêta-cartène est de 2 à 6 mg et plus durant la grssesse. La dse jurnalière maximale sûre est de 25 mg. D imprtantes surces de bêta-cartèncarttes, les patates duces, les fruits jaunes u range et les herbes armatiques snt des prduits végétaux, dnt les légumes verts, les vertes Vitamine D La vitamine D est une vitamine lipsluble. Il existe deux frmes de vitamine D, à savir les vitamines D3 et D2. Figure Frmule de la vitamine D3 Figure Frmule de la vitamine D2 220

229 Appellatin chimique : Vitamine D3 u chlécalciférl Frmule mléculaire : C 27 H 44 O Masse mléculaire : 384,2 g/ml Appellatin chimique : Vitamine D2 u ergcalciférl Frmule mléculaire : C 28 H 44 O Masse mléculaire : 396,6 g/ml. La vitamine D2 ne diffère de la vitamine D3 que par une duble cmbinaisn avec un grupe méthyle (indiqué en ruge). La vitamine D3 se frme dans l'rganisme à partir de chlestérl sus l influence d ultravilets. La vitamine D2 se frme également à partir du chlestérl mais emprunte un autre parcurs et est d rdre végétal. Les vitamines D2 et D3 nt le même fnctinnement bilgique. C est purqui la vitamine D2 est également suvent utilisée cmme cmplément alimentaire. Fnctin La vitamine D est nécessaire au dévelppement du squelette, surtut pur le métablisme du phsphate et du calcium. L effet de la vitamine D dépend de la présence du cmplexe acide pantthénique. La vitamine D : prtège cntre l stéprse peut aider dans le traitement du psriasis renfrce le système immunitaire peut aider à prévenir du cancer est nécessaire pur de bnnes dents et de bns s garantit un bn fnctinnement des muscles. Hypvitaminse Les symptômes en cas de carence en vitamine D snt le rachitisme (maladie anglaise), stémalacie, des duleurs dans les s, l hyptnie, des crampes musculaires et l stéprse. La vitamine D stimule l assimilatin de calcium et la cnstitutin des s. Lrsque la vitamine D vient à manquer, ces prcessus ralentissent ce qui résulte en rachitisme (maladie anglaise, une malfrmatin du squelette) chez les enfants et un ramllissement des s (stémalacie) chez les adultes. Chez les enfants, le rachitisme perturbe le dévelppement des s et ceux-ci snt alrs défrmés en raisn d une fixatin insuffisante du calcium et du phsphre ; les adultes ne minéralisent pas suffisamment la matrice sseuse récemment frmée ce qui rend les s cassants. Chez les animaux, une carence en vitamine D peut prvquer le rachitisme, l stémalacie, une perte d appétit, des trubles de la crissance et une perte de pids. Cela peut en utre causer une irritabilité accrue, des prblèmes au niveau des s et de la reprductin. 221

230 Hypervitaminse Une prise trp imprtante de vitamine D durant une lngue péride peut endmmager le cœur, les reins et les vaisseaux sanguins. Cela peut également ccasinner des nausées, des vmissements, des maux de tête, des smnlences, des états dépressifs, la cnstipatin et d autres symptômes. Les effets préjudiciables suite à un excédent en vitamine D snt très rares. Dsage et surces naturelles La quantité jurnalière recmmandée en vitamine D est de 0,005 mg (= 5 micrgrammes). La dse jurnalière maximale sûre est de 0,05 mg (= 50 micrgrammes). Une alimentatin saine furnit en principe suffisamment de vitamine D pur les persnnes au teint clair et qui vnt suffisamment à l extérieur. Tus les autres grupes nt besin de vitamines D supplémentaires. D imprtantes surces de vitamines D snt les prduits animaux cmme pissn (l huile de), l huile de fie de mrue, le fie, les œufs et les prduits laitiers. Actin bichimique spécifique La frmatin de vitamine D3 à partir du chlestérl présent dans la peau se fait sus l influence d ultravilets. Le chlestérl est transfrmé en 7-déhydrchlestérl par expulsin de l hydrgène en psitin 7 et 8, cette réactin est catalysée par la réductase 7-déhydrchlestérl. La vitamine D3 (chlécalciférl) est frmée à partir de ce 7-déhydrchlestérl sus l influence d ultravilets. Figure Créatin de chlécalciférl La vitamine D2 se frme également à partir du chlestérl mais emprunte un autre parcurs dans les champignns, levures et plantes. Le chlestérl est transfrmé en ergstérl végétal, cet ergstérl est transfrmé en ergcalciférl sus l influence d ultravilets (vitamine D2). En si, la vitamine D est inactive, elle est activée par des prcessus métabliques ultérieurs, tut d abrd l hydrxylatin en psitin 25 dans le fie et ensuite l hydrxylatin en psitin 1 dans les reins. L hrmne qui apparaît maintenant s appelle 1,25-dihydrxychlécalciférl u 1,25(OH)2D et est active dans le métablisme du calcium et du phsphate et dans la crissance et la différenciatin de différents types de cellules. 222

231 Figure Prductin de 1,25-dihydrxychlécalciférl Cette hrmne stimule l absrptin intestinale de calcium et phsphate et le transprt des ins de calcium et de phsphate. Elle est essentielle au dévelppement, à la crissance, à la préservatin et à la guérisn des s. On rencntre des hrmnes mais également du 1,25-dihydrxychlécalciférl en faibles cncentratins dans le sang, ceci expliquant purqui nus n'avns besin que de peu de vitamine D (5 µg) dans ntre alimentatin qutidienne Vitamine E La vitamine E u alpha-tcphérl est une vitamine lipsluble. Elle est suvent ajutée aux denrées alimentaires et aliments pur animaux sus la frme d acétate d alpha-tcphérl. Figure Frmule de la structure de la vitamine E Appellatin chimique : Vitamine E u alpha-tcphérl Frmule mléculaire : C 29 29H 50 O 2 Masse mléculaire : 430,7 g/ml. Fnctin Le tcphérl a un effet préventif sur le vieillissement et les maladies nutritinnelles en raisn de ses prpriétés frtement antixydantes. A partir de 40 ans, la résistance naturelle aux radicaux libres diminue prgressivement et de plus en plus de persnnes prennent de la vitamine E en supplément. Elle est également nécessaire à la frmatin des glbules ruges ainsi qu à la cnstitutin, à la guérisn et au maintien des tissus musculaires et autres tissus. Elle prtège également de multiples acides gras nn saturés qui cnstituent un matériau essentiel pur le crps. 223

232 La vitamine E : est un antixydant (prtectin des membranes cellulaires) prtège cntre les neurpathies augmente la résistance prtège cntre les maladies cardi-vasculaires réduit les symptômes prémenstruels traite les prblèmes cutanés et la calvitie aide à prévenir des fausses cuches a naturellement un effet d expulsin de l humidité prévient de l épaississement des tissus cicatriciels Hypvitaminse Des graves symptômes suite à une carence en vitamine E snt très rares chez l hmme et ne se rencntrent presque que suite à un grave désrdre de la prise de nutriments. D'éventuels symptômes d'une carence en vitamine E snt l anémie et des dmmages au cerveau (encéphalmalacie u ramllissement cérébral). Chez les enfants, une carence peut entraîner l anémie, des œdèmes, des prblèmes du système digestif et des trubles de la crissance. Chez les animaux, une carence en vitamine E prvque des maladies s'attaquant au système cardivasculaire, au système reprducteur et au système nerveux central, de même qu'aux tissus graisseux, au fie, aux reins et aux glbules ruges. Hypervitaminse La vitamine E s accumule dans le fie et le pancréas mais jusqu à présent, n ne lui cnnait aucun effet txique. Dsage et surces naturelles La dse jurnalière recmmandée en vitamine E est de 10 mg. Les dsages qutidiens en cas de trubles de la santé snt de 250 à 280 mg mais dans certains cas, un dsage plus frt peut être recmmandé. La dse jurnalière maximale sûre est de 350 mg. D imprtantes surces en vitamine E snt les huiles végétales, les graines de sja, les brclis, épinards, nix, prduits à base de farine cmplète, le pissn, la viande, les œufs et les prduits laitiers Vitamine K Il existe tris frmes de vitamine K, à savir K1, K2 et K3. Tutes les frmes nt la même structure de base. Les vitamines K1 et K2 snt des vitamines lipslubles naturelles, la frme K3 synthétique est lipslubles et dans une mesure limitée aussi hydrslubles. 224

233 Figure Frmule de la structure de la vitamine K1 Appellatin chimique : Vitamine K1 u phyllquinne Frmule mléculaire : C 31 31H 46 O 2 Masse mléculaire : 450,7 g/ml. Figure Frmule de la vitamine K2 Figure Frmule de la vitamine K3 Appellatin chimique : Vitamine K2 u ménaquinne Appellatin chimique : Vitamine K3 u ménadine. Fnctin La vitamine K est indispensable à la frmatin des différents cmpsants de cagulatin et dnc également à la cagulatin lrs de blessures. Jusqu à envirn 3 mis après la naissance d un bébé, il est nécessaire d ajuter cette vitamine à l alimentatin car il n y a alrs pas encre de bactéries intestinales en suffisance dans l intestin. De ns jurs, la vitamine K est incrprée à l alimentatin des bébés u bien n fait une injectin de vitamine K aux nuveau-nés nés afin d éviter tute hémrragie cérébrale. Hypvitaminse Une carence en vitamine K ralentit la cagulatin du sang et peut entraîner des hémrragies. Une carence en vitamine K est rare et se rencntre principalement chez les nuveau-nés, les persnnes avec un grave truble de l assimilatin et les patients ayant pris des antibitiques pendant un lng laps de temps. Les antibitiques peuvent ntamment détruire les bactéries intestinales qui prduisent la vitamine K. Les nuveau-nés nés nt tujurs une carence en vitamine K car cette vitamine ne passe pas au travers du placenta. Chez les animaux, une carence en vitamine K résulte également en hémrragies et ralentit la cagulatin du sang. 225

234 Hypervitaminse Aucun effet ncif n est cnnu. Dans la pratique, un excédent en vitamine K ne se rencntre pas. Dsage et surces naturelles La dse jurnalière recmmandée en vitamine K est de 0,08 mg (= 80 micrgrammes). La dse maximale sûre est de 50 x DJR, dnc 4 mg (= 4000 micrgrammes). La vitamine K1 est naturellement présente dans les aliments végétaux (légumes verts). Dans les intestins, elle est prduite par des bactéries intestinales, cmme la vitamine K2. La vitamine K synthétique est appelée vitamine K3, ntre crps la transfrme en vitamine K active. D imprtantes surces de vitamine K naturelle snt entre autres : le chu-fleur, le brcli, le chu frisé, les épinards, les pis, les prduits à base de farine cmplète, l huile de clza, le lait, les prduits laitiers, les œufs et les viandes maigres. Actin bichimique spécifique La vitamine K est indispensable à la frmatin de thrmbine u thrmbingène et à d autres cmpsants de la cagulatin dans le fie. Lrsque la vitamine K fait défaut u qu un inhibiteur cmpétitif est présent cmme la warfarine (raticide), la thrmbine se frme alrs de manière anrmale, ne fnctinnant qu à 1% vire 2% de l activité nrmale. La vitamine K fnctinne cmme un cfacteur dans les prcessus pst-translatinnels pur la frmatin de thrmbine en transfrmant l acide glutamique (glu) en gamma-carbxyglutamate (gla). La vitamine K est tujurs réutilisée durant cette vie de réactin. Cela explique purqui nus n avns besin que de faibles quantités de cette vitamine (80 micrgrammes) dans ntre alimentatin qutidienne Vitamines hydrslubles Les vitamines hydrslubles snt : les vitamines B1, B2, B3, B5, B6, B11 et B12, C et la vitamine H. Ces vitamines snt présentes dans l humidité cntenue dans ns denrées alimentaires. Le crps ne sait pas bien emmagasiner ces vitamines hydrslubles (à l exceptin de la vitamine B12), tut excédent est évacué par l urine u la transpiratin. Ces vitamines du cmplexe B se chargent ensemble du métablisme dans le crps et snt tutes des précurseurs de cenzymes. En présence d une carence en une vitamine B déterminée, s en suit généralement une carence en d autres vitamines B. La prise d une vitamine B déterminée entraîne de surcrît une augmentatin des besins en autres vitamines B Vitamine B1 (Thiamine) La vitamine B1 est une vitamine sluble dans l eau et fait partie du cmplexe de la vitamine B. Il s agit d une vitamine sufrée et elle est également appelée thiamine. Elle est surtut ajutée aux denrées alimentaires et aux aliments pur animaux cmme la thiamine hydrchlride. 226

235 Figure Frmule de la structure de la vitamine B1 Appellatin chimique : Vitamine B1 u thiamine Frmule mléculaire : C 12H 17 N 4 OS Masse mléculaire : 265,3 g/ml. Fnctin La vitamine B1 est indispensable à l apprvisinnement énergétique du crps car elle règle surtut la dégradatin des hydrates de carbne dégageant de l énergie. La vitamine B1 est également nécessaire au bn fnctinnement du cœur et du système nerveux et jue un rôle dans le métablisme des acides aminés. La vitamine B1 : prtège des cnséquences de la cnsmmatin d alcl peut aider dans le traitement des trubles neurlgiques peut aider dans le traitement de l anémie peut amélirer la flexibilité intellectuelle peut cntribuer à réguler le diabète s'il a un lien avec une carence en vitamine B1 cntribue au traitement des infectins à herpès cntribue à transfrmer les hydrates de carbne en énergie dans les muscles. Hypvitaminse Les symptômes en cas de carence en vitamine B1 snt la fatigue, l hyptnie, la perte d appétit, l irritabilité, un état dépressif, une mauvaise mémire, une sensatin de pictements dans les rteils et la plante du pied, des trubles de la digestin et des nausées. Lrsque la vitamine B1 fait défaut et en présence d un excès en hydrates de carbne (sucres), apparaît alrs le béribéri. Une carence relative se rencntre très suvent. Chez les animaux, une carence en vitamine B1 cause perte d appétit, diminutin de la crissance, affaiblissement, réduit la température crprelle et prvque d innmbrables prblèmes cutanés, nerveux, cardi-vasculaires, du système digestif et reprducteur. 227

236 Hypervitaminse La thiamine n est pas txique mais il est recmmandé de ne pas en prendre plus de 400 mg par jur. Dsage et surces naturelles La dse jurnalière recmmandée pur cette vitamine est de 1,1-1,4 mg. La dse jurnalière maximale sûre est de 400 mg. La cnsmmatin d alcl, drgue, café, nictine et sucre requiert des quantités supérieures de B1, jusqu à mg par jur. Les denrées alimentaires riches en vitamine B1 snt les levures, la viande (de prc), les pis, les haricts, les pmmes de terre, le pain, les prduits céréaliers, le lait et les prduits laitiers ainsi que les arachides. Actin bichimique spécifique La vitamine B1 se rencntre dans le crps cmme une cenzyme appelée thiamine diphsphate u thiamine pyrphsphate. Cette cenzyme est une mlécule de thiamine à laquelle nt été ajutés deux grupes de phsphate au lieu d hydrgène. Cette cenzyme jue un rôle imprtant dans le cycle de l acide citrique, de cette manière, elle règle surtut la dégradatin des hydrates de carbne permettant le dégagement d'énergie. Figure Frmatin de la thiamine diphsphate Vitamine B2 (Ribflavine) Tut cmme la vitamine B1, la vitamine B2 est une vitamine sluble dans l eau, également appelée ribflavine. Elle appartient en utre au cmplexe de la vitamine B. Étant dnné que la ribflavine se dissut difficilement dans l eau, n utilise suvent la ribflavine 5-phsphate sdique dans les denrées alimentaires et les aliments pur animaux. 228

237 Figure Frmule de la structure de la vitamine B2 Appellatin chimique : Vitamine B2 u ribflavine Frmule mléculaire : C 17H 20 O 6 N 4 Masse mléculaire : 376,4 g/ml. Fnctin La vitamine B2 est indispensable à l apprvisinnement énergétique du crps, principalement pur la libératin d énergie à partir des hydrates de carbne, des prtéines et des graisses apprtés au crps par le biais de l alimentatin. Il s agit dnc d une vitamine imprtante pur le métablisme et elle jue un rôle dans le maintien du système nerveux. Elle est en utre imprtante pur une peau saine et des cheveux en bnne santé. La vitamine B2 : cntribue au métablisme des graisses, prtéines et hydrates de carbne stimule l acuité visuelle favrise le bn fnctinnement du mécanisme de prcréatin stimule les prestatins athlétiques ffre une prtectin cntre l anémie. Hypvitaminse Les symptômes en cas de carence en vitamine B2 snt des gerçures de la peau et des muqueuses, rugeur de la langue, eczéma sur la peau et les parties génitales, sensatin de brûlure sur la peau, fatigue, parfis difficultés lrs de l hématpïèse. En cas de carence en vitamine B2, apparaît également une détériratin partielle de la respiratin tissulaire et suite à cela, une stagnatin de la crissance, des malfrmatins de l abdmen, des malfrmatins aux lèvres, une crissance trdue des ngles des digts et des maladies de l estmac. Chez les animaux, une carence en vitamine B2 cause des trubles de la crissance, une perte d appétit, une faible température crprelle, des prblèmes de peau, aux yeux, au niveau du système nerveux, du système digestif et du système reprducteur. 229

238 Hypervitaminse La ribflavine n est txique qu à très frte dse. Des symptômes que l n rencntre rarement snt des démangeaisns et une sensatin de brûlure sur la peau. Dsage et surces naturelles La dse jurnalière recmmandée pur la ribflavine est de 1,1-1,61,6 mg. Une plus frte dse est nécessaire en cas de stress, de grssesse, d allaitement au sein, de prise de la pilule et de frte cnsmmatin d alcl. La dse jurnalière maximale sûre est de 400 mg. Le fie, les reins, les œufs, le frmage, la levure, le lait, les germes, le brcli, les champignns, le pissn, les fruits, le pain, les prduits à base de farine cmplète et les viandes snt riches en vitamines B2. Actin bichimique spécifique Les vitamines B2 snt actives lrs de la dégradatin des hydrates de carbne, des prtéines et des graisses. Dans le crps, n rencntre la ribflavine dans les cenzymes flavine adénine dinuclétide (FAD) et flavine mnnuclétide (FMN). La FAD est active en tant que ptentiel redx, cela signifie pur ainsi dire que de l énergie peut y être stckée. Elle est entre autres active dans le cycle de l acide citrique Vitamine B3 (Niacine) La vitamine B3 est sluble dans l eau, elle fait partie du cmplexe de vitamine B et existe sus deux frmes, à savir l'acide nictinique et la nictinamide. namide. La vitamine B3 est également appelée niacine u vitamine PP (Pellagra Preventing factr). Figure Frmule de la structure de la vitamine B3 (acide nictinique) Appellatin chimique : Vitamine B3, acide nictinique u niacine Frmule mléculaire : C 6 6H 5 NO 2 Masse mléculaire : 123,1 g/ml. 230

239 Figure Frmule de la structure de la vitamine B3 (Nictinamide) Nm chimique : Vitamine B3, acide nictinique u niacine Frmule mléculaire : C 6 H 6 N 2 O Masse mléculaire : 122,1 g/ml. Fnctin La vitamine B3 cntribue à l apprvisinnement en énergie des cellules par la dégradatin des acides gras, des hydrates de carbne et des acides aminés et stimule le fnctinnement du système nerveux. La nictinamide est le grupe actif de nictinamide adénine dinuclétide (NAD) et nictinamide adénine dinuclétide phsphate (NADP). L acide nictinique est transfrmé dans le crps en nictinamide. NAD et NADP juent un rôle imprtant dans divers prcessus de dégradatin et dans la libératin d énergie et de matériaux essentiels. La vitamine B3 : prévient et traite la schizphrénie favrise la respiratin cellulaire puise l énergie du sucre, de la graisse et des prtéines garde la peau prpre, les nerfs et la langue sains et favrise une bnne digestin peut diminuer le niveau de chlestérl et ainsi ffrir une prtectin cntre les affectins cardiaques est cnsidérée cmme un antixydant peut prévenir les migraines diminue la pressin artérielle. Hypvitaminse Une carence est rare mais d éventuels symptômes en cas de carence en vitamine B3 snt la dermatite, rugeur de la langue, insmnie, diarrhée, démence et pellagre (était très fréquent en Amérique du Sud il y a sixante ans). Chez les animaux, une carence en vitamine B3 diminue la crissance et l appétit, prvque des dermatites, des prblèmes au niveau du système nerveux et du système digestif, aux s et cause l anémie. 231

240 Hypervitaminse Des symptômes en cas de frtes dses snt entre autres des prblèmes de peau et de membranes, des états dépressifs, un dysfnctinnement du fie et des maux de tête. Dsage et surces naturelles La dse jurnalière recmmandée pur cette vitamine est fixée à 15 vire 18 mg. Des dsages de 20 à 100 mg par jur peuvent avir un effet favrable. La dse maximale sûre pur cette vitamine est différente pur les deux frmes. Pur l acide nictinique, elle est de 120 mg et pur la nictinamide, elle est de 300 mg par jur. D imprtantes surces de vitamine B3 snt entre autres les prduits à base de farine cmplète et les prduits céréaliers, le riz cmplet, le lait, le frmage, les viandes, le pissn et les nix de caju. Actin bichimique spécifique Dans le crps, n rencntre la niacine dans une cenzyme appelée nictinéamine adénine dinuclétide (NAD). Cette cenzyme est active en tant que ptentiel redx, cela signifie que l n peut pur ainsi dire y stcker de l énergie et l y puiser. Étant dnné que la NAD est tujurs recyclée par «chargement» (dans le catablisme) et à nuveau utilisée (lrs de l anablisme), seules de faibles quantités de cette vitamine snt nécessaires dans ntre alimentatin qutidienne. La cenzyme est entre autres active dans le cycle de l acide citrique et dans la glyclyse Vitamine B5 (Acide pantthénique) Cmme tutes le vitamines du cmplexe de vitamine B, la vitamine B5 est sluble dans l eau et est également appelée acide pantthénique. Au niveau cmmercial, elle est suvent ajutée cmme pantthénate de calcium. Figure Frmule de la structure de la vitamine B5 Appellatin chimique : Vitamine B5 u acide pantthénique Frmule mléculaire : C 9 9H 16 O 5 N Masse mléculaire : 218,2 g/ml. Fnctin La vitamine B5 est indispensable à l apprvisinnement énergétique du crps, surtut du fait du dégagement d énergie à partir d acides gras. Cette vitamine jue également un rôle imprtant lrs de la dégradatin des prtéines et hydrates de carbne. Dans le crps, l acide pantthénique fait partie 232

241 de la cenzyme A (CA). Cette cenzyme décmpse les prtéines de ntre alimentatin en acides aminés. Par la suite, elle recmpse des prtéines humaines à partir de ces éléments. La cenzyme A est également active dans la transfrmatin d hydrates de carbne en énergie crprelle, entre autres au début du cycle de l acide citrique. Elle est également imprtante lrs de la frmatin et de la régulatin d un certain nmbre d hrmnes. La vitamine B5 : favrise la guérisn de blessures aide le crps lrs de la prductin d énergie réduit le stress régule la résistance prévient la fatigue réduit le chlestérl et ffre ainsi une prtectin cntre les affectins cardiaques aide à prévenir et traiter l arthrite peut éviter la calvitie et la blancheur des cheveux est essentielle à la prductin de certaines hrmnes. Hypvitaminse Une carence se rencntre rarement mais des symptômes éventuels en cas de carence en vitamine B5 snt des vmissements, cnvulsins, de la fatigue, des insmnies, une diminutin de la résistance aux infectins et des maux de ventre. Une carence en vitamine B5 est plus fréquente chez les animaux et peut causer une diminutin de la crissance et de l'appétit, une perte de pils, l'irritabilité, des muvements perturbés, l'anémie, des prblèmes au niveau du système digestif et du système reprducteur. Hypervitaminse On ne cnnait aucun effet ncif à la vitamine B5. Certaines persnnes nt des maux d estmac en cas de prise de dses supérieures à 10g. Dsage et surces naturelles La dse jurnalière recmmandée (DJR) pur cette vitamine est de 6 mg. Pur une applicatin médicale, il est préférable de prendre la vitamine dans une préparatin de cmplexe de vitamine B à raisn de maximum 300 mg par jur. Un dsage nrmal devant cntribuer à prévenir les maladies est d'envirn 100 mg par jur. La dse jurnalière maximale sûre est fixée à 1000 mg. On rencntre entre autres la vitamine B5 dans les substances alimentaires suivantes : levure, prduits à base de farine cmplète, mélasse, brcli, épinard, pivrn vert, champignns, viandes, fie, riz cmplet, œufs et nix. 233

242 Vitamine B6 (Pyridxine) Cmme tutes les vitamines du cmplexe de vitamine B, la vitamine B6 est sluble dans l eau et est également appelée pyridxine. Au niveau cmmercial, n la retruve presque exclusivement sus frme d hydrchlride de pyridxine. Figure Frmule de la structure de la vitamine B6 Nm chimique : Vitamine B6 u pyridxine Frmule mléculaire : C 8 8H 11 NO 3 Masse mléculaire : 169,18 g/ml. Fnctin La vitamine B6 jue un rôle imprtant dans le métablisme et la résistance de l rganisme. Elle régule le fnctinnement de certaines hrmnes dans le crps. C'est une substance indispensable au niveau de la défense immunitaire et de la crissance. Avec la vitamine B11 (acide flique) et la vitamine B12, la pyridxine assure l assimilatin de fer par le crps, elle est également impliquée dans la frmatin de glbules ruges. Ces tris vitamines garantissent également le bn fnctinnement du système nerveux et snt impliquées dans le métablisme de l acide aminé. Dans le crps, cette vitamine est transfrmée en cenzyme PLP (pyridxal-5-phsphate). Cette cenzyme est imprtante pur plus de 100 enzymes et jue un rôle dans presque tutes les réactins bichimiques (métablisme du glycgène, acide gras et acide aminé). La vitamine B6 : augmente la résistance aide à réguler le diabète garantit la prise de prtéines et graisses sulage les nausées cntribue à prévenir les trubles cutanés et nerveux traite les symptômes mes prémenstruels (PMS) et la ménpause réduit les tensins musculaires agit cmme myen diurétique naturel aide à prtéger cntre le cancer. 234

243 Hypvitaminse Les symptômes en cas de carence en vitamine B6 snt l anémie, la névrse et les prblèmes de peau. Chez les animaux, une carence en vitamine B6 prvque une diminutin de l appétit, un ralentissement de la crissance, des prblèmes cutanés, une vue trublée, l anémie, la névrse, une diminutin de la reprductin et l ascite. Hypervitaminse Une cnsmmatin prlngée de dses élevées peut entraîner de graves anmalies au niveau du système nerveux. Une phtsensibilité u une détériratin des prcessus cgnitifs de mémrisatin et raisnnement peuvent en utre apparaître. Dsage et surces naturelles La dse jurnalière recmmandée pur cette vitamine est de 1,6 à 2 mg. Ne pas utiliser cette vitamine en frte cncentratin ( mg) de manière prlngée. La dse jurnalière maximale sûre est de 200 mg. Des substances alimentaires riches en vitamine B6 snt les pireaux, le chu blanc, le brcli, les pmmes de terre, les bananes, les prduits à base de farine cmplète, le lait, les œufs, les légumineuses, les nix, le pissn et la viande Vitamine B11 (Acide flique) Cmme tutes le vitamines du cmplexe de vitamine B, la vitamine B11 est sluble dans l eau et est également appelée acide flique. Figure Frmule de la structure de la vitamine B11 Appellatin chimique : Vitamine B11, B9 u acide flique Frmule mléculaire : C 19H 19 N 7 O 6 Masse mléculaire : 441,4 g/ml. 235

244 Fnctin L acide flique stimule la frmatin de suc gastrique et est imprtant pur un bn fnctinnement du fie. Cette vitamine est impliquée dans le métablisme des prtéines et graisses, elle est nécessaire à la frmatin des glbules ruges et cntribue au métablisme cérébral. L'acide flique est également nécessaire au métablisme de l'adn et de l'arn. Cette vitamine est indispensable lrs des prcessus de divisin cellulaire du crps, c est purqui il est recmmandé aux femmes enceintes u suhaitant l être de cnsmmer un supplément d acide flique. Dans le crps, l acide flique peut se transfrmer en une cenzyme appelée tétrahydrflate (THF). Durant le métablisme, l acide flique agit en étrite cllabratin avec la vitamine B12 (et B6). La vitamine B11 : amélire la lactatin peut aider à prtéger cntre le cancer amélire la peau est un antiduleur naturel amélire l appétit prcure aux bébés et aux enfants une certaine résistance cntre les infectins est nécessaire lrs de la prductin d ADN et d ARN (les mlécules de l hérédité) cntribue à prévenir du Spina bifida. Hypvitaminse Les symptômes en cas de carence en vitamine B11 snt une sensatin de faiblesse, apathie, fatigue, perte d appétit, smnlence, irritabilité, démence et Spina bifida (fœtus). Chez les animaux, une carence en vitamine B11 résulte en un ralentissement de la crissance, une perte d appétit, la dermatite, une dépigmentatin, la perte de pils, une paralysie, l anémie, la diarrhée et des prblèmes de fécndité. Hypervitaminse Aucun effet indésirable n est cnnu pur l absrptin à partir de l alimentatin. La frme synthétique est txique en grandes quantités et peut prvquer de graves prblèmes neurlgiques ainsi que la smnlence et peut entraver l assimilatin de zinc dans le crps. Dsage et surces naturelles La dse jurnalière recmmandée pur cette vitamine est de 0,2 à 0,36 mg. Les grands buveurs, les femmes enceintes, les persnnes âgées et les persnnes qui suivent un régime pauvre en graisses risquent une carence. La dse jurnalière maximale sûre d acide flique est de 1 mg. 236

245 D imprtantes surces de vitamine B11 snt entre autres les légumes verts, les chux de Bruxelles, le brcli, les œufs, les lentilles, le riz, le pain, les germes de blé, le fie, les rgnns, les bananes, les ranges et les pêches Vitamine B12 (Cbalamine) La vitamine B12 est la seule vitamine sluble dans l eau qui est stckée dans le crps. La vitamine B12 fait partie du cmplexe de vitamine B et est également appelée cbalamine. La cyancbalamine est la frme synthétique stable ajutée aux denrées alimentaires et aliments pur animaux. Figure Frmule de la structure de la vitamine B12 Appellatin chimique : Vitamine B12 u cbalamine Frmule mléculaire : C 63H 88 CN 14 O 14 P Masse mléculaire : 1355,4 g/ml. Fnctin Avec la vitamine B6 (pyridxine) et la vitamine B11 (acide flique), la cbalamine assure l assimilatin de fer par le crps, elle est également impliquée dans la frmatin de glbules ruges. Une carence de ces vitamines peut entraîner l anémie. Ces tris vitamines garantissent également le bn fnctinnement du système nerveux et snt impliquées dans le métablisme de l acide aminé. 237

246 La vitamine B12 : est nécessaire au maintien du système nerveux amélire la mémire et la cncentratin est nécessaire pur puvir utiliser les graisses, hydrates de carbne et prtéines dnne plus d énergie favrise une crissance saine chez les enfants peut ffrir une prtectin cntre le cancer prtège cntre les allergènes et éléments txiques Hypvitaminse Les symptômes en cas de carence en vitamine B12 snt l anémie pernicieuse, des trubles menstruels, déclin mental et tremblements. Chez les animaux, une carence en vitamine B12 peut entraîner une diminutin de crissance, une réductin de la cnsmmatin alimentaire, la dermatite, l irritabilité, des muvements désrdnnés, l anémie, une perte d appétit, la diarrhée, une diminutin de la reprductin, etc. Hypervitaminse La vitamine B12 n est pas cnsidérée cmme txique. Dsage et surces naturelles La quantité jurnalière recmmandée en vitamine B12 est de 0,001 mg (= 1 micrgramme). Des dsages de 5-50 micrgrammes snt généralement suffisants. La dse jurnalière maximale sûre est de 200 mg. Les substances alimentaires riches en vitamine B12 snt exclusivement des prduits animaux : œufs, frmage, frmage blanc, lait, pissn et viande. Actin bichimique spécifique La vitamine B12 peut se transfrmer dans le crps en cenzyme B12 qui est essentielle pur 2 enzymes. Tut d abrd, pur une enzyme impliquée dans le métablisme des acides gras, ntamment la méthylmalnyl-ca mutase. Cette enzyme cntribue à la dégradatin des acides gras avec un nmbre impair d atmes de carbne. Deuxièmement, la cenzyme B12 est nécessaire lrs de la bisynthèse de l acide aminé méthinine et aussi pur l enzyme hmcystéine méthyltransférase. Cette enzyme ajute un grupe méthyle à l hmcystéine, ce qui prduit la méthinine. 238

247 Vitamine C (Acide L-ascrbique) La vitamine C est une vitamine sluble dans l eau également appelée acide ascrbique. Figure Frmule de la vitamine C Figure Frmule de l acide déhydrascrbique Appellatin chimique : Vitamine C u acide L-ascrbique Frmule mléculaire : C 6 H 8 O 6 Masse mléculaire : 176,1 g/ml. Fnctin La vitamine C est l une des vitamines les plus imprtantes pur le système immunitaire, elle favrise l activité des glbules blancs et garantit une meilleure résistance aux infectins et maladies. C est en utre un puissant antixydant (rend les radicaux libres inffensifs). La vitamine C est axée sur la régénératin et garantit l évacuatin des prduits de dégradatin. La vitamine C est rapidement attaquée par l xygène (en cas de chaleur) et est l une des vitamines les plus sensibles. Une carence en vitamine C est partiellement la cause de la fatigue de printemps. La vitamine C : est un antixydant accélère la guérisn de blessures maintient les s, dents et vaisseaux sanguins en bnne santé agit cmme un antihistaminique naturel cntribue à l assimilatin du fer peut aider à lutter cntre la stérilité chez l hmme réduit la durée des refridissements et autres virus. 239

248 Hypvitaminse Les symptômes en cas d une carence en vitamine C snt le scrbut, une sensatin de faiblesse, une perturbatin de la guérisn des blessures, l irritabilité, le saignement des gencives, des ecchymses et des bleus, le déchaussement des dents, des duleurs articulaires, manque d appétit et trubles cardiaques. La plupart des animaux prduisent eux-mêmes la vitamine C. Une carence est très rare et prvque parfis le scrbut chez les jeunes animaux et les animaux stressés. Hypervitaminse Un excès en vitamine C peut causer des pierres aux reins et la gutte. En cas de frtes dses, certaines persnnes suffrent de diarrhée et de crampes à l estmac, bien que cette vitamine ne sit pas estimée ncive, même à très frtes dses. De très frtes dses de vitamine C fnt augmenter la teneur en chlestérl dans le sang, ce qui accrît la prbabilité de maladies cardiaques. Dsage et surces naturelles La dse jurnalière recmmandée en vitamine C est de 70 mg. Les fumeurs nt besin de plus de vitamine C, il en va de même en cas de stress, de l'usage d'antibitiques, d'infectins, de frte cnsmmatin d'alcl u de blessure. La dse jurnalière maximale sûre est fixée à 1000 mg. L acide L-ascrbique se rencntre beaucup dans les agrumes, les légumes verts, les tmates, les asperges, les aubergines, les pireaux, les radis, les pmmes de terre, le lait et le fie Vitamine H (Bitine) Bien que la bitine sit appelée vitamine H, cette substance appartient à la famille B et est également appelée vitamine B8. La bitine est une vitamine sluble dans l eau et fait partie du cmplexe de vitamine B. Figure Frmule de la structure de la vitamine H Appellatin chimique : Vitamine H, B8 u d-bitine Frmule mléculaire : C 10H 16 N 2 O 3 S Masse mléculaire : 244,3 g/ml. 240

249 Fnctin La bitine jue un rôle imprtant dans la synthèse et la dégradatin des hydrates de carbne et des prtéines. Dans le crps, elle peut se transfrmer en bicytine, une cenzyme. La bicytine cntribue à dégager de l énergie à partir de l alimentatin ainsi qu à la frmatin d anticrps. Elle est en utre imprtante pur la frmatin d acides gras et est respnsable d une bnne cnditin de la peau et des cheveux. La vitamine H : empêche les cheveux de grisnner sulage diverses frmes de duleurs musculaires aide à lutter cntre l eczéma, la dermatite et les autres prblèmes de peau aide à lutter cntre la calvitie. Hypvitaminse Une carence est rare, tutefis les symptômes en cas de carence en vitamine H snt les suivants : eczéma, fatigue, inflammatin de la langue, duleur musculaire, anémie, dépressin et altératin du métablisme des graisses. Une carence en vitamine H se rencntre parfis chez les bébés sus frme de dermatite (peau irritée, squameuse). Dans les intestins des adultes, la bitine est généralement prduite en quantités suffisantes par les bactéries intestinales. Chez les animaux, une carence en vitamine H entraîne une diminutin de la crissance et de l appétit, prvque dermatite, dépigmentatin et assmbrissement de la peau, perte de pils, paralysie et diminutin de la reprductin. Hypervitaminse On ne lui cnnait aucun effet ncif. Dsage et surces naturelles La dse jurnalière recmmandée est fixée à 0,03-0,15 mg (= micrgrammes). La dse jurnalière maximale sûre est de 300 mg. D imprtantes surces de bitine snt entre autres les œufs, le lait, les fruits, les nix, le sja, la levure de bière, le riz sauvage, la viande et le pissn. 241

250 Techniques d analyse des vitamines Les matrices qui snt essentiellement analysées quant à la sectin vitamines snt les aliments pur animaux (aliments pur animaux cmplets, aliments cmplémentaires pur animaux et prémélanges), les cmpléments alimentaires, l alimentatin pur bébés et les bissns. En général, une prcédure d analyse se cmpse des étapes suivantes : extractin, purificatin (si nécessaire) et quantificatin via HPLC u turbidimétrie. La méthde chisie pur l extractin dépend du résultat exigé, de la matrice, de la frme naturelle u synthétique des vitamines, des cmpsés interférents, de la résistance à la chaleur et aux valeurs ph extrêmes Chrmatgraphie liquide à haute perfrmance (HPLC) Les vitamines lipslubles A, D et E snt déterminées à l aide d une phase inverse HPLC après l extractin par hydrlyse alcaline (sapnificatin) et purificatin sur une clnne. Les vitamines A, E, D, C et K3 snt déterminées quantitativement à l aide d une HPLC et d un détecteur UV. Les vitamines B1, B2 et B6 snt en utre déterminées quantitativement à l aide d une HPLC et d un détecteur de flurescence Micrbilgie (Turbidimétrie) Les vitamines B3, B5, B11, B12 et H snt actuellement quantifiées à l aide de méthdes turbidimétriques. On utilise à cet effet une suche spécifique d un rganisme test dnt la crissance est définie par la présence d une vitamine déterminée. Une série étaln (avec des cncentratins cnnues en vitamine) et une série de l extrait d échantilln snt inculées avec l rganisme spécifique et incubées jusqu à ce que l rganisme ait crû suffisamment et que le milieu devienne truble. En mesurant la turbidité à l aide d un spectrphtmètre et en cmparant la curbe de l échantilln avec la curbe étaln, n btient un résultat quantitatif. Cette méthde est suffisamment sensible pur bserver les teneurs en vitamines B que l n rencntre naturellement et elle mesure généralement l activité vitaminique ttale, cntrairement à certaines méthdes HPLC Nuvelles évlutins A l avenir, les méthdes sernt adaptées aux différentes matrices et si nécessaire, une méthde spécifique sera dévelppée pur certaines matrices. A terme, les méthdes bilgiques sernt autant que pssible remplacées par des méthdes HPLC u par une méthde micrbilgique plus rapide sus frme de kits cmmerciaux dispnibles (avec plaques de micrtitratin). Des méthdes distinctes pur l analyse d 1 vitamine du cmplexe B sernt cmbinées en méthdes permettant d analyser simultanément plusieurs vitamines B. 242

251 Tableau : Tableau récapitulatif Vitamines essentielles pur l hmme Substance Synnymes Prpriétés Hypvitaminse Hypervitaminse Se retruve dans DJR Vitamine A Prvitamine A Vitamine D3 Vitamine D2 Vitamine E Vitamine K1 Vitamine K2 Vitamine K3 Vitamine B1 all-trans retinl Bêta-cartène Chlécalciférl Ergcalciférl Alphatcphérl Phyllquinne Ménaquinne Ménadine Thiamine Amélire la vue et la résistance, prévient l héméralpie et le vieillissement cutané, rôle dans le prcessus de renuvellement cellulaire, pur une peau, des dents, des gencives et des cheveux sains Antixydant, mêmes prpriétés que la vitamine A Stimule la résrptin et la fixatin du calcium, surtut dans les s et la dentitin. Prtège cntre l stéprse, renfrce le système immunitaire, les dents et les s Antixydant, prtège les membranes cellulaires, prtège cntre les neurpathies et les maladies cardi-vasculaires, réduit les symptômes prémenstruels, pur une peau saine et des cheveux sains Empêche les hémrragies, essentiel pur la prductin de thrmbine et la cnstitutin des s, ajuté à la nurriture pur bébés Cenzyme impliquée dans le métablisme cellulaire, traitement de l anémie, régulatin du diabète, dégradatin des hydrates de carbne Héméralpie, prblèmes de peau et de cheveux Idem vitamine A Rachitisme, duleur dans les s, hyptnie et crampes musculaires, stéprse Rarement: œdème anémie, Prblèmes de cagulatin / Fatigue, hyptnie, pas d appétit, irritabilité, état dépressif, mauvaise Les femmes enceintes divent faire attentin Nausées, vmissements, maux de tête, dépressin, maladies cardiaques et rénales / / Lait, beurre, frmage, margarine, œufs, fie, huile de fie de mrue, pissn, pmmes, légumes verts, carttes, maïs, abricts Variétés de chux, légumes vert fncé, carttes, ranges et fruits et légumes jaunes (huile de) pissn, huile de fie de mrue, levure, légumes verts, viande et prduits laitiers Huiles végétales, sja, haricts, nix, prduits à base de farine cmplète, œufs et margarine, légumes verts (K 1 ) Tmates, frment, œufs, fie, pissn, chu-fleur, brcli, chu frisé, épinards, pis, prduits à base de farine cmplète, huile de clza et viande maigre Viande, pain, levure, pis, haricts, pmmes de terre et prduits laitiers 0,8 mg 2-6 mg 0,005 mg 10 mg 0,045 mg 1,1-1,4 mg 243

252 Substance Synnymes Prpriétés Hypvitaminse Hypervitaminse Se retruve dans DJR Vitamine B2 Vitamine B3 Vitamine B5 Vitamine B6 Vitamine B11 Ribflavine Niacine, PP Acide pantthénique Pyridxine Acide flique (Vitamine B9 u M) et des acides gras pur l énergie, essentielle au fnctinnement des cellules nerveuses et du cœur Cenzyme impliquée dans le métablisme cellulaire (dégradatin des hydrates de carbne, des prtéines et des graisses), pur une peau saine et des cheveux sains, prtectin cntre l anémie Partie de la cenzyme A impliquée dans le cycle de l acide citrique, stimule la respiratin cellulaire et le fnctinnement du système nerveux, prductin d énergie, réduit le chlestérl, antixydant, diminue la pressin artérielle, prévient la migraine Partie de la cenzyme A, métablisme des graisses et sucres, guérisn des blessures, prductin d énergie, réductin du stress, régulatin de la résistance, préventin de la fatigue, diminutin du chlestérl, cntre l arthrite, la calvitie et les cheveux gris Impliquée dans le métablisme cellulaire (prtéines et hrmnes), assimilatin du fer, frmatin des glbules ruges, fnctinnement du système nerveux, métablisme acide aminé, augmente la résistance, régulatin du diabète, assimilatin des prtéines et graisses, cntre les symptômes prémenstruels et la ménpause Cenzyme impliquée dans le métablisme, frmatin de suc gastrique, fnctinnement du fie, assimilatin de prtéines et de graisses, mémire, béribéri nausées, Gerçure de la peau et muqueuses, langue ruge, eczéma, fatigue Dermatite, démence, pellagre diarrhée, insmnie, Vmissements, crampes, fatigue, insmnie, résistance diminuée, maux de ventre, anmalies cardivasculaires, anmalies nerveuses Anémie, névrse, prblèmes de peau Sensatin de faiblesse, apathie, fatigue, insmnie, irritabilité, démence, Spina Uniquement à très frte dse : démangeaisns et sensatin de brûlure En cas de frte dse : état dépressif, prblèmes de peau et maux de tête En cas de frte dse : diarrhée En cas de frte dse : détériratin nerveuse En cas de frte dse : insmnie, mauvaise Rgnns, jaune d œuf, frmage, levure, lait, germes, pain, légumes verts et viande Céréales cmplètes, riz brut, lait, frmage, viande, pissn et nix de caju, pain, légumes, levure Levure, prduits à base de farine cmplète, sirp, légumes verts, champignns, viande, viande rganique, riz sauvage, œufs et nix, légumineuses, prduits laitiers et fruits Légumes, pmmes de terre, bananes, frmage, sja, prduits à base de farine cmplète, lait, œufs, nix, pissn et viande Légumes verts, œufs, lentilles, riz, pain, germes de blé, fie, rgnns, bananes, 244 1,1-1,6 mg mg 6 mg 1,6-2 mg 0,2-0,36 mg

253 Substance Synnymes Prpriétés Hypvitaminse Hypervitaminse Se retruve dans DJR Vitamine B12 Vitamine C Vitamine H Cbalamine Acide ascrbique Bitine (Vitamine B8) frmatin de glbules ruges, métablisme cérébral et ADN/ARN et prcessus de divisin cellulaire (grssesse) Cenzyme, assimilatin du fer, synthèse de l ADN, frmatin de glbules ruges, fnctinnement du système nerveux, métablisme acide aminé, amélire la mémire et la cncentratin, assimilatin de graisses et d hydrates de carbne, stimule la crissance, prtège des allergènes Antixydant, guérisn des blessures, antihistaminique naturel, dents et gencives saines, s et rganes sexuels, fécndité chez l hmme, activité glbules blancs, cntre les refridissements et autres virus Cenzyme impliquée dans le métablisme, la prductin d énergie, la frmatin d anticrps, pur une peau saine, des cheveux et des ngles sains, sulage les duleurs musculaires, cntre l eczéma, la dermatite, la calvitie, le diabète bifida, anémie assimilatin du zinc Anémie, trubles menstruels, déclin mental, tremblements Scrbut, sensatin de faiblesse, irritabilité, saignement des gencives, ecchymses, duleurs articulaires, trubles cardiaques, perturbatin de la guérisn des blessures Peau squameuse chez les bébés, eczéma, fatigue, mauvais métablisme des graisses, duleur musculaire, anémie, dépressin / En cas de très frte dse : pierres aux reins, gutte, diarrhée, crampes à l estmac / ranges et pêches viande, lait, levure Uniquement les prduits animaux cmme les œufs, le frmage, le frmage blanc, le lait, le pissn et la viande. Fruits, légumes verts, pmmes de terre, lait et fie, pivrn et chux de Bruxelles Œufs, lait, fruits, nix, sja, levure de bière, riz nn décrtiqué, viande et pissn 0,001-0,002 mg 60 mg 0,03-0,15 mg DJR = dse jurnalière recmmandée mg = milligramme 245

254 Tableau : Dse jurnalière recmmandée par catégrie d âge DJR Vitamine a Enfants Adultes Senirs Bébé (0-5 m) Bébé (6-11 m) Enfant en bas âge (1-4 a) Enfants (5-12 a) Ads (13-18 a) Hmme (19-50 a) Femme (19-50 a) Femme (enceinte) A (µg) 450 b Femme (allaitant) a 70 a + D (µg) d 2,5-5,0 d 2,5-5 d 2,5 d 2,5 d 7,5-10 d 7,5 d d 12,5-15 d E (mg) 2,6 e 3,3 5 6,5-9,2 9,6-12,1 10,7-11,8 8, ,9 7,9-9,7 7,5-8,5 K (µg) B1 (mg) 0,2 0,2 0,3 0,5-0,8 1,1 1,1 1,1 1,4 1,7 1,1 1,1 B2 (mg) 0,4 0,4 0,5 0,7-1,0 1,1-1,5 1,5 1,1 1,4 1,7 1,1-1,5 1,1-1,5 B3 (mg) 2 b B5 (mg) B6 (mg) 0,12-0,20 c 0,2 c 0,4 0,7-1,1 1,5 1,5 1,5 1,9 1,9 1,5-1,8 1,5-1,8 B11 (µg) B12 (µg) 0,4 0,5 0,7 1,3-2,0 2,8 2,8 2,8 3,2 3,8 2,8 2,8 C (mg) H (µg) a Unités exprimées en milligramme (mg) u micrgramme (µg) b En suppsant un allaitement maternel exclusif c En cas d allaitement maternel exclusif 0,12 mg/jur; alimentatin au bibern (par rapprt à une teneur accrue en prtéines) 0,20 mg/jur d Vaut pur les persnnes à la peau claire allant au mins 15 minutes par jur à l extérieur avec en tut cas les mains et le visage décuverts. e Lrsque nn nurri au sein maternel 246

255 4 TECHNIQUES D ANALYSE 4.1 Chrmatgraphie en phase liquide Aspects généraux La chrmatgraphie est un prcédé de séparatin des cnstituants d un mélange. Elle est devenue une méthde analytique pur identifier et quantifier les cmpsés d une phase liquide u gazeuse hmgène. Le principe de base repse sur les équilibres de cncentratin des cmpsés présents, entre deux phases nn miscibles dnt l une, dite statinnaire, est emprisnnée dans une clnne u fixée sur un supprt et l autre, dite mbile, se déplace au cntact de la première. Chaque cnstituant adpte une vitesse de migratin qui lui est prpre en fnctin de sa slubilité dans la phase mbile et de sn affinité pur la phase statinnaire qui tend à la retenir pur, au final, btenir la séparatin des cnstituants du mélange initial. On peut classer les différents types de chrmatgraphies de plusieurs façns différentes seln que l n cnsidère la nature des phases utilisées u les mécanismes de séparatin des cmpsés Classificatin seln la nature des phases La phase mbile est un fluide, dnc sit un liquide, sit un gaz, sit encre un fluide supercritique. La phase statinnaire est sit un slide, sit un liquide (fixé sur un supprt slide). La cmbinaisn de ces pssibilités cnduit à plusieurs pssibilités : Chrmatgraphie liquide-slide (LSC) Chrmatgraphie liquide-liquide (LLC) Chrmatgraphie gaz-slide (GSC u GC) Chrmatgraphie gaz-liquide (GLC u GC) Chrmatgraphie supercritique (SFC). La SFC représente un cas intermédiaire entre LC et GC, les fluides supercritiques pssédant des prpriétés à la frntière entre celles de liquides et celles des gaz Classificatin seln le phénmène chrmatgraphique Cela dépend de la nature et de la structure de la phase statinnaire, n distinguera dnc : La chrmatgraphie d adsrptin lrsque la phase statinnaire est un slide (LSC, GSC) ; par extensin n peut y rattacher la chrmatgraphie d affinité quand les prpriétés d adsrptin de la phase statinnaire snt spécifiques d un u d une famille de cmpsés. La chrmatgraphie de partage (LLC, GLC) lrsque la phase statinnaire est un liquide nn miscible avec la phase mbile (mise en jeu de cefficients de partage). 247

256 La chrmatgraphie d échange d ins (IEC) ù la phase statinnaire prte des grupes fnctinnels acides u basiques, destinés à séparer des cmpsés inisés. La chrmatgraphie d exclusin ù la phase statinnaire preuse se cmprte cmme un tamis et sépare les cmpsés seln leur taille. Une autre appellatin est la chrmatgraphie de perméatin sur gel (GPC) Classificatin seln le prcédé utilisé Seln le cnditinnement de la phase statinnaire, n distinguera : La chrmatgraphie sur clnne. La chrmatgraphie sur papier La chrmatgraphie sur cuche mince Seln les mdalités de migratin de la phase mbile, n distinguera : La chrmatgraphie par dévelppement (les cnstituants de l échantilln restent sur la phase statinnaire ). La chrmatgraphie d élutin (les substances snt entraînées hrs de la phase statinnaire) Classificatin seln les phénmènes intervenants dans la séparatin Les paramètres physic-chimiques respnsables des principes de séparatin snt : La plarité et/u l hydrphbicité ; plarité de phase nrmale u inversée La charge électrique : échange d ins. La taille et la frme : exclusin u perméatin sur gel L existence de structures particulières qui permettent d établir des liaisns spécifiques : chrmatgraphie d affinité Phases statinnaires en HPLC La phase statinnaire (PS), au cntact de la phase mbile (PM) mais insluble dans celle-ci, est le secnd milieu avec lequel les cmpsés initialement dissus dans la phase mbile vnt également interagir. Il apparaît dans la clnne une assciatin particulière à tris cnstituants (PM/cmpsé/PS) pur chaque analyte dans l échantilln. 248

257 Le gel de silice C est la matière de base des phases actuelles. C est un slide amrphe et rigide ayant pur frmule SiO 2 (H 2 O)n (avec n très prche de 0). Ce matériau de base tut à fait différent de la silice naturelle (SIO 2 ) qui peut servir de matière première à sa synthèse, est préparé sus frme de micr sphères de diamètre sensiblement cnstant puvant varier de 2 à 5 µm. Le diamètre dit-être le même pur tutes les particules et assurer un remplissage cmpact des clnnes si l n veut éviter la créatin de chemins préférentiels. Ces micr sphères snt btenues par agglutinatin en présence d un liant rganique (urée/frml) de micr particules (appelées sl-gel) elles mêmes btenues par plymérisatin puis hydrlyse basique cntrôlée du tétraéthxysilane. Le traitement final est une pyrlyse cnduisant aux micr sphères de silice utilisées pur le garnissage des clnnes (cf Figure 4.1.1). Le gel de silice est un matériau très plaire crrespndant à un maillage tridimensinnel. Il n a pas la structure rdnnée de la silice cristalline, mais il reste bâti sur l agencement tétraédrique des quatre liaisns de l atme de silicium. C est un plymère inrganique réticulé cmprtant des grupements silanls, en nmbre variable, ayant résistés à la phase de cuissn. Figure Remarque : Les gels de silice snt stables dans une grande gamme de ph mais ne supprtent pas des ph trp extrêmes. Il existe des risques de disslutin à des ph trp acides u trp basiques. On se limite à une gamme de travail 2 < ph < 12. Un agrandissement d une micr sphère est schématisé dans la Figure et l n cnstate que ces sphères snt en réalité inhmgènes et irrégulières et qu il existe des lacunes appelées pres. Ces pres juent un rôle imprtant car snt des znes d adsrptin préférentielles. 249

258 Figure La surface des micr sphères de silice est cmpsée de grupement silanl Si-OH (cf Figure 4.1.3) qui snt respnsables des phénmènes d adsrptin car ils permettent la frmatin de liaisns hydrgène et snt respnsables de la plarité et de l acidité de la silice. Ces grupements silanl s ils snt trp nmbreux entraînent des adsrptins trp imprtantes et leur nmbre dit-être signeusement cntrôlé. Les figures dans le curs servent seulement pur infrmatin. Figure Les silice greffées Bien qu ayant une capacité d adsrptin élevée, le gel de silice est de mins en mins utilisé tel quel pur les analyses. Ses caractéristiques évluent au curs du temps entraînant un manque de reprductibilité des séparatins ; ainsi, pur beaucup d applicatins, il est partiellement réhydraté (3-8 % d eau) pur le désactiver. Pur diminuer cette plarité excessive, n fixe par liaisns cvalentes des mlécules rganiques sur les fnctins silanl. Le gel de silice mdifié devient ainsi assimilable à un liquide, la séparatin mettant en jeu des cefficients de partage et nn plus des cefficients d adsrptin. Ces phases greffées dnt la plarité peut être ajustée facilement snt à l rigine de la chrmatgraphie de partage en phase inversée. Cmme le schématise la figure ci-dessus distinguant les phénmènes d adsrptin et de partage, l adsrptin est un phénmène d interface à la différence de l absrptin ; par exemple, si l n greffe une mn cuche d hydrcarbure à la surface du gel de silice, les 250

259 mlécules qui présentent une partie lipphile et l autre hydrphile s rientent à l interface. L adsrptin est le phénmène qui cnsiste en l accumulatin d une substance à l interface entre deux phases (gaz-slide, gaz-liquide, liquide-slide, liquide-liquide, slide-liquide). En chrmatgraphie en phase inverse les grupements silanl très plaires snt dnc éliminés vu leur grande affinité avec les slutés plaires ainsi retardés. Pur résudre ce prblème, n utilise un prcédé nmmé «end-caping» retraitant la phase greffée à l aide d un silane prteur de grupements méthyle. La plarité du gel en est ainsi cnsidérablement réduite (cf Figure 4.1.4) : Figure La qualité d un gel de silice pur la chrmatgraphie dépend de plusieurs paramètres, à savir : la structure interne, la taille des grains, la prsité uverte (dimensins et répartitin des pres), la surface spécifique, la résistance à l écrasement et la plarité. Les gels curants en HPLC nt les caractéristiques suivantes : diamètre de 2 à 5 µm avec 5 grupes silanl par µm² ; surface spécifique variant de 4 à 350 m²/g s il s agit d une silice preuse u nn avec des pres de 10 nm. 251

260 Figure Chrmatgraphie de partage Cette chrmatgraphie a pur principe la différence de slubilité d un sluté entre deux liquides qui snt nn miscibles ; il s agit ici d un équilibre de partage. Autrefis, les phases statinnaires étaient cmpsées d un slide preux imbibé par un liquide. Bien que tujurs utilisée en chrmatgraphie gazeuse, cette technique est abandnnée en chrmatgraphie liquide. La cause en est le phénmène de lessivage par l éluant du liquide imbibant les slide preux. De ns jurs, ce snt des gels de silice sur lesquels n greffe une fnctin chimique par liaisn cvalente. Ce greffn va se cmprter cmme un liquide fixé sur la phase statinnaire slide. Deux types de chrmatgraphie de partage snt envisagés seln la plarité de la phase mbile et de la phase statinnaire Chrmatgraphie en phase nrmale La phase statinnaire est très plaire tandis que la phase mbile est peu plaire (slvants rganiques). Les cmpsés qui snt faiblement plaires nt dnc une plus grande affinité pur la phase mbile et snt ainsi élués rapidement. A l inverse, les cmpsés plaires ayant une plus grande affinité pur la phase statinnaire sernt élués lentement. Les slutés snt dnc élués en sens inverse de leur plarité. 252

261 Greffns utilisés en phase nrmale Les phases statinnaires de silice pure snt mins utilisées en raisn de quelques prpriétés défavrables : elles snt sensibles à l'humidité, l'eau dans ces clnnes dit être à tut prix évitée tendance au «tailing» ce qui peut prvquer une interprétatin errnée du pic tendance au «bleeding», phase statinnaire se détachant de la clnne l'élutin de gradient n'est pas pssible. En raisn de ces incnvénients, n privilégie des greffns cmprtant des fnctins plaires : Amine : NH 2 Nitrile : CN Dils : CH 2 -CHOH-CH 2 OH Chrmatgraphie en phase inverse La phase statinnaire est peu plaire u aplaire tandis que la phase mbile est généralement plaire (slvants aqueux et rganiques). Les cmpsés plaires nt dnc une plus grande affinité pur la phase mbile et snt ainsi élués rapidement. A l inverse, les cmpsés peu plaires ayant une plus grande affinité pur la phase statinnaire sernt élués lentement. Les slutés snt dnc élués dans le sens de leur plarité. Greffns utilisés en phase inverse Il s agit de greffns cmprtant des fnctins de nature aplaire : Diméthylsillyle : C2 Octylsillyle : C8 Octadécylsillyle : C18 Phénylsillyle : C6 cyclique Synthèse des silices greffées On distingue deux types de synthèse cnduisant à des surfaces mnmères u plymères greffées (cf schéma «frmatin d rgansilanes greffés à l interface du gel de silice) : Phases mnmériques (10-15 µm d épaisseur) : n fait réagir un mnchlrsilane de type ClSiMe 2 R (méthylchlrsilane) avec les silanls de surface. 253

262 Phases plymériques (25 µm) n utilise cette fis ci un di- u trichlrsilane (Cl 2-3SiMeR) en présence de vapeur d eau ce qui prvque une plymérisatin réticulée dans laquelle les grupes silanld initiaux sernt en partie reliés entre eux. On atteint ainsi 4 u 5 % de carbne après greffage sur les silanls accessibles, cela représente un greffage de 40 à 50 % de la surface ttale. Le grupement R représente la fnctin greffée : NH 2, CN, CH 2 CHOHCH, OH, CH 3 en phase nrmale et C 8 H 17, C 8 H 37, C 6 H 5 en phase inverse. Figure : Frmatin d rgansilanes greffés à l interface du gel de silice. Représentatin de quelques grupements mnmériques u plymériques rencntrés en surface du gel de silice. L enchaînement Si-O-Si-C est plus stable que Si-O-C. On atteint 4 u 5 % de carbne après greffage sur les silanls accessibles Mécanisme de partage liquide/liquide Les phases greffées ne snt pas de véritables liquides car la cuche mnmérique u plymérique est de très faible épaisseur et se cmpare à un film liquide. Le partage entre la phase fixe et mbile fait intervenir l adsrptin des slutés et du slvant rganique sur la cuche mnmléculaire du greffn. Pur rappel, la phase mbile en phase inversée met en jeu un slvant rganique (classiquement méthanl u acétnitrile) et de l eau. Le slvant rganique mins plaire présente une affinité pur la phase greffée qui est aplaire. Les slutés devant être séparés snt ptentiellement aplaires et présentent une affinité pur le greffn aplaire. Le slvant rganique M et les slutés S vnt dnc être adsrbés à la surface de la phase statinnaire. Il s établira ensuite un équilibre de partage entre les cmpsés adsrbés et les cmpsés restés libres dans la phase mbile. Madsrbé + Smbile = Mmbile + Sadsrbé (cf Figure 4.1.7) 254

263 Figure Il s établit une suite d équilibres successifs entre la cuche liquide d adsrptin et la phase mbile. Les cnstituants les plus plaires qui nt une plus grande affinité pur la phase mbile sernt élués plus rapidement que les cmpsés plus aplaires ayant une plus grande affinité pur la phase statinnaire Interactins hydrphbes En plus du phénmène d adsrptin à l interface, les slutés présentent en général un pôle hydrphile et un pôle hydrphbe ; l extrémité hydrphbe s rientera dnc vers la phase statinnaire (en phase inverse) et l extrémité hydrphile vers la phase mbile plaire (aqueuse). En réalité, le sluté de part la répulsin de sn pôle hydrphbe avec la phase mbile plaire sera bligé de pénétrer plus u mins prfndément la cuche d adsrptin ce qui augmentera sn temps de rétentin (cf schéma). La gémétrie de la partie hydrphbe jue également un rôle : plus la surface hydrphbe sera grande plus le cmpsé sera retenu dnc sn temps de rétentin sera élevé. Figure Influence de la teneur en slvant rganique dans la phase mbile Plus la tensin superficielle de l éluant sera frte et plus le temps de rétentin d un cmpsé sera lng. L eau étant un des slvants présentant la plus grande tensin superficielle, plus la teneur en eau de l éluant sera imprtante, plus les cmpsés sernt retenus dans la phase statinnaire. Dnc, pur diminuer le temps d analyse, n purra augmenter la prprtin en slvant rganique mais cela se fera suvent au détriment de la réslutin. 255

264 Influence de la teneur en slvant rganique dans la phase mbile La plarité des cmpsés jue également un grand rôle en chrmatgraphie. Il est dnc imprtant de savir classer les fnctins rganiques par rdre de plarité, ici crissant : Alkyle < flur < chlr < nitr < aldéhyde < acétyle < hydrxyle < cétne < amine < carbxyle < amide R < F < Cl < NO 2 < CHO < O-CO-CH 3 < CO-R < NH 2 < COOH < CO-NH 2 Pur les grupes alkyles, la plarité est fnctin de la lngueur de la chaine ; pur les cycles, c est la surface : Plus la lngueur u la surface sera imprtante, plus la plarité sera faible (interactin hydrphbe). Quand un cmpsé cmprte plusieurs fnctins, c est la fnctin la plus plaire qui est cnsidérée Thérie simplifiée de la chrmatgraphie de partage Le facteur de rétentin k Cnsidérns le sluté A en équilibre entre la phase mbile et la phase statinnaire : A(m) A(s) En mdifiant la plarité de la phase mbile, n agit directement sur le cefficient de distributin u de partage K = (Cs/C M ) régissant l équilibre ci-dessus ; Cs est la cncentratin du sluté dans la phase statinnaire et C M la cncentratin du sluté dans la phase mbile. Le cefficient de distributin K u cnstante de Nernst est le paramètre physic-chimique de base en chrmatgraphie qui quantifie le rapprt de cncentratin de chaque cmpsé entre les deux phases en présence ; K, pur un sluté, ne dépend que de la température, est indépendant du débit u de la lngueur de la clnne ; il rend cmpte de la capacité de la clnne à retenir chaque cmpsé. En chrmatgraphie, n utilise plutôt une grandeur prprtinnelle à K que l n désigne par k nmmé facteur de rétentin : k = K*V s /V M V s est le vlume de la phase statinnaire cntenu dans la clnne et V M est sn vlume mrt c est-àdire le vlume ccupé par le slvant lrs de l utilisatin de la clnne. La prsité d une clnne est définie par la relatin : p = V M /V s. 256

265 Figure De ces relatins, n cnclut que plus un cmpsé aura une affinité pur la phase statinnaire, plus K et k sernt élevés, plus le cmpsé sera retenu dnc plus grand sera sn temps de rétentin. Par extensin, plus un cmpsé aura une grande affinité pur la phase mbile, plus k et K sernt faibles, mins le cmpsé sera retenu dnc plus faible sera sn temps de rétentin En phase inverse, le slvant est plaire et aqueux : Les substances plaires et/u peu hydrphbes sernt éluées rapidement Les substances aplaires et/u très hydrphbes sernt éluées lentement. Ainsi, pur faire varier le temps de rétentin des cmpsés et ptimiser une séparatin, n purra juer sur la teneur en slvant rganique de l éluant. Classiquement n bserve suvent une crrélatin linéaire entre les lgarithmes des facteurs de rétentin et le lgarithme de la teneur en slvant rganique : lg(k) = a*lg(x) + b (équatin d Everett) L augmentatin de la teneur en slvant rganique (mins plaire que l eau) X permet suvent de diminuer les temps de rétentin et dnc raccurcir la durée de l analyse. Cependant les cmpsés sernt alrs mins bien séparés car les valeurs de k des cmpsés sernt prches. Il est aussi curant d bserver une inversin dans l rdre de srtie des cmpsés cmme le mntre le crisement de curbes (Figure ) pur deux cmpsés A et B. 257

266 Figure Le facteur de séparatin (u sélectivité) entre deux slutés On définit la sélectivité α d une séparatin par le rapprt k 2 /k 1 des facteurs de rétentin de deux cmpsés. Plus α sera élevé, meilleure sera la séparatin. Le facteur de séparatin α précise les psitins relatives de deux pics adjacents 1 et 2 (Figure ). Par définitin, il ne peut être < 1. Sachant que le temps de rétentin d un cmpsé t R est tel que t R = t M + t s, la valeur de k est dnc accessible à partir du chrmatgramme (t S = t R ). t M étant le temps de rétentin d un cmpsé nn retenu sur la clnne. t k = t ' R M t = R t t M M ' t R(2) α = u α = t ' R(1) k k 2 1 Figure

267 Le facteur de réslutin entre deux pics Afin d exprimer numériquement une plus u mins bnne séparatin entre deux cmpsés, n utilise le facteur de réslutin R calculé à partir du chrmatgramme ci-dessus. Figure t R = 2 w R(2) 1 t + w R(1) 2 ù : t R est le temps de rétentin des cmpsés respectifs, exprimé en secndes W est la largeur de pic à mi-hauteur de l'analyte crrespndant, exprimé en secndes. L expressin ci-dessus mntre l influence, sur la réslutin, de l efficacité, du facteur de capacité et de la sélectivité : ù : R = N α 1 k2 * * 4 α 1+ k N est le nmbre de plateaux thériques qui est une mesure de l'efficacité de la clnne; plus il y a de plateaux, meilleure est la séparatin (défini dans le paragraphe suivant) α est le facteur de sélectivité, qui dépend de la frce des slvants utilisés et de la température à laquelle a lieu la séparatin k est le facteur de capacité; décrit la vitesse de prgressin des slutés dans la clnne, également dépendant de la frce des slvants utilisés

268 La Figure ci-dessus mntre l aspect visuel d une variatin de R entre 2 pics adjacents. A partir de R = 1.5, n cnsidère que les pics snt réslus. Figure L efficacité N d une clnne On défini l efficacité N d une clnne par sn nmbre de plateaux Le nmbre de plateaux N peut se calculer à l'aide de la frmule suivante : = 5,54 T W N R 1 / 2 2 L efficacité d une clnne dépend de tris facteurs : de sa gémétrie : plus une clnne sera lngue et/u diamètre interne grs, plus elle sera efficace. du garnissage : plus les particules de silice de la phase statinnaire sernt fines, plus la clnne sera efficace. du débit de l éluant : il existe un débit ptimal pur laquelle l efficacité de la clnne est la plus grande (li de Van Deemter). A partir du nmbre de plateaux N et de la lngueur de la clnne analytique L, n calcule le HETP (appelé H en abrégé) (Hauteur équivalente d un plateau thérique). L H = N H est fnctin de 3 termes qui snt la cause d'un élargissement du pic : B H = A + + µ Cµ (l'équatin de Van Deemter) ù : A: Diffusin d Eddy la garniture de la clnne analytique (phase statinnaire) peut allnger le chemin parcuru des cmpsants et prvquer des éculements préférentiels, si bien que les pics deviennent plus larges que vulus B: Diffusin lngitudinale élargissement des pics du fait que les cmpsants dans la clnne analytique ne migrent pas seulement avec le sens d'éculement de la phase mbile 260

269 C: Transfert de masse dans la clnne analytique, il y a une résistance au transfert de masse du sluté entre les 2 phases. Cmme la phase mbile perturbe l'équilibre, il peut se prduire un élargissement du pic. En utilisant une plus faible granulmétrie de particules, l'équilibre est atteint plus rapidement et il y aura un mindre transfert de masse, dnc aussi mindre élargissement du pic µ: flw u vitesse d'éculement de la phase mbile Lrsqu'n met ces 3 termes dans un graphique, n peut déterminer le flux ptimal pur lequel le nmbre de plateaux N est le plus grand. Il est tutefis imprtant de savir qu'n ne dit pas tujurs travailler avec un flux ptimal. Parfis il est plus rapide de travailler avec un débit plus élevé, tut en cnservant une bnne séparatin du mélange. H µ Figuur Elargissement des pics Il est prvqué par : le vlume de l'échantilln : si n injecte un trp grand vlume d'échantilln, il ne peut pas se prduire une bnne séparatin dans la clnne et les pics sernt trp larges sur le chrmatgramme. un mauvais tubing entre l'extrémité de la clnne et l'entrée du détecteur. Lrsque le tubing entre la clnne et le détecteur est trp lng u a un trp grand diamètre, il y a un risque de 261

270 vir les pics qui nt été séparés dans la clnne à nuveau se réunir et dnc de détecter des pics plus larges. le vlume de détectin : On peut agrandir la cellule du détecteur dans le but d'augmenter la sensibilité. L'incnvénient est que cela risque de diminuer la réslutin, et dnc élargir les pics. le temps de répnse du détecteur : La vitesse à laquelle le détecteur mesure des pints de dnnées est parfis trp faible pur distinguer 2 pics l'un de l'autre avec le risque de ne cnsidérer qu un seul pic Chix de la méthde HPLC En plus de la chrmatgraphie classique en phase nrmale u inverse, d autres techniques snt parfis emplyées, à savir : Chrmatgraphie d appariement d ins (paired in chrmatgraphy) Cette technique a pur avantage d amélirer la séparatin de cmpsés iniques u très plaires ayant une trp faible affinité pur la phase statinnaire dans le cas ù celle-ci est aplaire. Pratiquement, n ajute à la phase mbile un cmpsé à la fis prteur d une chaîne carbnée (peu plaire) et d un grupement de charge ppsée à celle du cmpsé à séparer. On crée ainsi une paire d ins glbalement neutre, assez stable et qui sera retenue par la phase statinnaire. Il est même pssible de séparer des catins u anins minéraux sur une phase statinnaire inversée classique. analyse de cmpsés acides: utilisatin d'un cntre in avec une chaîne hydrphbe et une fnctin basique (ex: triethylamine). Phase mbile a ph 7-8 qui permet d'avir le cntre in et l acide inisé. analyse de cmpsés basiques: utilisatin d'un cntre in avec une chaîne hydrphbe et une fnctin acide (ex: hexanesulfnate). Phase mbile à ph 3-4 qui permet d'avir le cntre in et la base inisés. Figure Une exemple pratique est le dsage de l histamine sur une clnne C18 classique par appariement de la mlécule d histamine (cmpsé basique) à un cntre-in à fnctin acide (ctanesulfnate) évitant ainsi une étape de dérivatisatin, lngue, fastidieuse et délicate. 262

271 Chrmatgraphie par échanges d ins (inique) Pur la séparatin de: mélanges d'ins, y cmpris ins inrganiques Phase statinnaire: présente à sa surface des grupes fnctinnels iniques qui engagent des interactins avec des ins d'analyte de charge ppsée Phase mbile : slutin aqueuse cntenant le cntre-in, n utilise parfis aussi des tampns. La technique est détaillée dans le paragraphe : chrmatgraphie inique Chrmatgraphie d exclusin (de taille) Ce type de chrmatgraphie est encre appelé : tamisage mléculaire, gel-filtratin (phase mbile aqueuse) u perméatin sur gel (phase mbile rganique). Cette technique permet la séparatin des mlécules en fnctin de leur taille et de leur frme. On utilise pur ce faire des granules de gel preux. Les grsses mlécules (dnt le diamètre est supérieur à celui des pres) snt exclues et snt dnc éluées les premières. Les petites et myennes mlécules snt éluées plus tardivement, car elles snt incluses dans le gel, leur migratin est ainsi freinée. Dnc, les slutés snt éluées dans l rdre inverse des masses mléculaires cmme le mntre le schéma suivant : Figure : principe de perméatin sur gel 1 : Dépôt d'un mélange de deux mlécules (des grsses et des petites) sur une clnne remplie d'un gel. 2 : Les petites mlécules peuvent pénétrer dans les billes de gel car leur diamètre est inférieur à celui des pres du gel. Les grsses mlécules ne le peuvent pas en raisn de leur grande taille; elles snt dnc exclues du gel (d'ù le nm de chrmatgraphie d'exclusin). 3 : Les grsses mlécules nt dnc un trajet plus curt à parcurir pur arriver en bas de la clnne; elles snt dnc éluées les premières. 4 : Les petites mlécules snt éluées ensuite car elles nt une plus grande distance à parcurir pur arriver en bas de la clnne. 263

272 Résultat sur un chrmatgramme (Figure ): Figure Pur la séparatin de: cmpsants de masse mléculaire élevée u plymères cmme les épxydes, plystyrènes, silicnes, PVC u lipides (avec perméatin de gel), u peptides, prtéines, enzymes, acides nucléiques, lig u plysaccharides (avec filtratin de gel) Phase statinnaire: ne peut pas réagir avec la phase mbile, gels crss-linked avec des pres d'une taille spécifique. Filtratin sur gel (supprt hydrphile) ; perméatin sur gel (supprt hydrphbe) Phase mbile: ne peut pas réagir avec la phase statinnaire, pur la filtratin sur gel, utilisatin de slutins aqueuses ; pur la perméatin sur gel, utilisatin de slutins rganiques Cette méthde est suvent utilisée pur déterminer la masse mléculaire myenne des plymères, cmme analyse qualitative et quantitative de mlécules bilgiques et cmme méthde de séparatin de petites mlécules. La technique de perméatin sur gel est ntamment utilisée pur séparer les cmpsants de la matière grasse en acides gras, diglycérides, triglycérides et plymères de triglycérides afin de dser le % de triglycérides plymérisés dans la matière grasse. La phase statinnaire est un gel styrènedivinylbenzène ne et la phase mbile du THF pur Chrmatgraphie d interactin hydrphbe Cette technique permet d amélirer la séparatin de cmpsés birganiques tels que les prtéines slubles dans l eau. 1ère étape : On fixe la prtéine à séparer sur le supprt chrmatgraphique en présence d'une frte cncentratin en sel : 264

273 dans un milieu à haute frce inique, les mlécules d'eau de l'envelppe d'hydratatin des prtéines snt "mbilisées" pur hydrater les anins et les catins issus de la dissciatin du sel, c'est le phénmène de "salting -ut" ; il en résulte une mdificatin de l'rganisatin des mlécules d'eau autur des prtéines et ce changement d'envirnnement est thermdynamiquement favrable à l'établissement d'interactins hydrphbes entre les régins hydrphbes à la surface des prtéines et le grupement hydrphbe prté par la phase statinnaire. 2ème étape : Après rinçage du gel afin d'éliminer les prtéines nn adsrbées, l'élutin des prtéines fixées est btenue : en faisant passer un tampn de frce inique décrissante, les ins du sel étant ainsi prgressivement éliminés ; les acides aminés chargés u plaires à la surface des prtéines peuvent de nuveau établir des liaisns hydrgène avec la phase mbile, c'est-à-dire que la slubilité des prtéines dans la phase mbile redevient maximale et elles snt éluées. Il en résulte que les mlécules snt éluées dans l rdre décrissant de leur caractère hydrphile Figure Pur la séparatin de: prtéines et peptides sans dénaturatin. Phase statinnaire: clnnes reversed phase, avec petite quantité d'atmes de C, grupes curts fixés à la silice. Phase mbile: eau pure avec sel. 265

274 4.1.8 Aspects instrumentaux Figure : Schéma général d un HPLC Slvants Le chix du slvant est très imprtant en HPLC parce qu'une très grande quantité de liquide est pmpée par le système. Les slvants divent être très purs et il existe plusieurs qualités en fnctin de l'applicatin. Suvent, l'éluant est encre filtré une nuvelle fis avant utilisatin. Afin d'empêcher que d'éventuelles petites particules ne sient aspirées dans le système, un filtre est généralement psé à l'aspiratin. Un appareil HPLC peut être équipé d'un dégazeur. Il est cependant cnseillé d'encre dégazer l'éluant avant utilisatin, que l'appareil sit équipé u nn d'un dégazeur interne. On peut le faire en plaçant l'éluant dans un bain à ultrasns, faire barbter de l'hélium gazeux à travers la slutin u filtrer sus vide. Les bulles de gaz divent être évitées parce qu'elles snt surce de bruit de fnd au niveau du détecteur. Lrs du chix du slvant, il faut aussi tenir cmpte de l'absrbance de chaque slvant. La valeur d'uvcutff est indiquée sur la buteille de slvant et dit être la plus faible pssible afin de dnner le mins pssible de perturbatins supplémentaires. La valeur d'uv-cutff de l'acétnitrile et de l'eau est de 190 nm, alrs que celle du méthanl est de 210 nm, ce qui peut être prche de l'absrbance des cmpsants recherchés Pmpes La pmpe d'un appareil d'hplc se cmpse généralement d'une pmpe à pistn cmprenant une petite chambre cylindrique qui se remplit d'éluant lrsque le pistn se déplace vers l'arrière, et injecte le slvant vers la clnne lrsque le pistn se déplace vers l'avant. Le retur du liquide n'est pas pssible parce que l'entrée et la srtie de la pmpe snt fermées par une valve anti-retur. 266

275 Pur btenir un éculement stable, n fait usage d'une pmpe à duble pistns d un l un est de vlume duble du secnd (cf Figure ). Figure : le pmpe à pistn Lrsque le réservir de slvant est raccrdé au système, n va 'primer' avec la pmpe. C'est à dire pmper séparément dans chaque réservir, mais sans envyer le slvant par la clnne, seulement pur expulser le plus d'air pssible des cnduites. On peut aussi purger, en pmpant les liquides en prprtin de l'éluant par la cnduite et nn par la clnne. Primer permet de changer facilement la cmpsitin du slvant. Lrsque les cnduites nt été le mieux pssible vidées de leur air, l'éluant peut s'éculer dans la clnne. Généralement, 15 minutes suffisent pur atteindre un équilibre, à mins que l'n utilise des slutins tampns. Celles-ci divent suvent se stabiliser pendant plus de 30 minutes. Sur un chrmatgramme, il est nettement visible qu'une clnne n'est pas assez stabilisée lrsque les temps de rétentin vnt se déplacer entre les différentes injectins, u si la ligne de base se met à augmenter graduellement pendant une injectin. (ceci vaut uniquement pur l'élutin iscratique, étant dnné qu'avec l'élutin par gradient il est nécessaire qu'au début d'une injectin suivante, le système revienne en équilibre avec la cmpsitin initiale de l'éluant.) 267

276 Les pmpes divent répndre aux exigences suivantes : furnir des pressins élevées jusqu à 400 bars débit stable, nn pulsé et réglable de 0.1 à 10 ml/min avec un cntrôle meilleur que 0.5 % résistance à la crrsin quelque sit le slvant utilisé. Il existe deux mdes de fnctinnement : Le mde iscratique pur lequel la cmpsitin de la phase mbile est fixe. Le mde gradient de slvant ù l n fait varier la cmpsitin du slvant pendant l analyse en vue d ptimiser la séparatin et diminuer le temps d analyse. La variatin en gradient est prgrammable principalement sus 3 types de prfil : linéaire, cncave u cnvexe. Figure : le mde gradient d élutin Figure En pratique, l n prcède par tâtnnement pur btenir le résultat le plus satisfaisant. Les pmpes actuelles peuvent mélanger jusqu à quatres slvants différents, chacun d entre-eux puvant déjà être un mélange de slvants. Pur les éluants qui snt cmpsés de plusieurs slvants, il est préférable (en raisn des erreurs pssibles) de laisser la pmpe cmpser le slvant, plutôt que de mélanger si-même les slvants. La plupart des systèmes HPLC nt une chambre de mélange basse pressin. 268

277 Il n'y a qu'une pmpe qui pmpe tus les slvants. Dans une chambre à mélange haute pressin, il y a une pmpe prévue pur chaque slvant. Ce dernier système est cnsidérablement plus cûteux à l'achat. La Figure ci dessus dnne la cnfiguratin pur gradient basse (a) et haute pressin (b). Figure : cnfiguratin pur gradient basse (a) et haute pressin (b) Injecteur Pur l'injectin, n utilise un rbinet à six vies, puvant prendre une psitin de chargement et une psitin d'injectin. Figure : rbinet à six vies En psitin de chargement, la bucle (lp) est remplie avec le vlume d'échantilln vulu. Le lp est raccrdé à l'injecteur et au waste, tandis que de l'éluant s'écule par la clnne. Lrsque le lp est rempli, n turne le rbinet de telle façn que le lp rempli sit raccrdé à la pmpe de l'éluant et à l'entrée de la clnne analytique : c est l injectin. 269

278 La clnne C est la partie du système qui permet la séparatin des cmpsés. Il s agit d un cylindre calibré en acier inxydable et parfis en matériaux inerte (verre u plastique). Classiquement le diamètre varie de 0.5 à 5 mm et de lngueur 10 à 30 cm. La phase statinnaire est calée entre deux disques frittés. Le diamètre intérieur snt classiquement entre 4 et 10 mm. La granulmétrie de la phase statinnaire est cmprise entre 5 et 10 µm pur une efficacité de l rdre de plateaux/m. Il existe aussi des micr-clnnes de 3 à 7 cm de lng, de diamètre interne de 1 à 5 mm, et de 3 à 5 µm de granulmétrie. Leur efficacité est de l rdre de plateaux/m ; l intérêt d une telle clnne est la rapidité d analyse, l écnmie de slvant mais nécessite des pmpes plus puissantes permettant des débits rapides. Outre la clnne analytique qui fait la séparatin des cmpsants dans le mélange, n peut aussi utiliser des clnnes de prtectin (pré clnne très curte de 0.5 à 1 cm) remplies de la même phase que la phase statinnaire. Les clnnes de prtectin snt placées entre l'injecteur et la clnne analytique et divent enlever, en cas d'échantillns 'sales', le plus grs des impuretés de telle srte qu'elles n'arrivent pas au début de la clnne analytique. Dès qu'n vit se prduire un tailing dans les chrmatgrammes, n dit remplacer la clnne de prtectin. Cette pré clnne fixe les cmpsés dnt l affinité avec la phase statinnaire est trp élévé et qui ne migrent pas dans les cnditins utilisée. La pré clnne dit être changée péridiquement. Figure : clnne et pré clnne Filtratin de l échantilln : En HPLC, il est recmmandé de filtrer en amnt avant la mise en vial. A l aide d une seringue n filtre l échantilln à travers un disque de prsité 0.2 u 0.45 µm dnt la membrane est cmpatible avec le slvant utilisés. Le filtrat est réclté dans le vial d injectin ; l injecteur est ainsi prtégé des particules inslubles. 270

279 Figure : Filtratin de l échantilln Pur un fnctinnement ptimal plus lng de la clnne analytique, les pints suivants snt imprtants: si l'n utilise des tampns cmme slvant d'élutin, la clnne dit être bien rincée à l'eau pure après analyse afin de prévenir une cristallisatin du tampn lrsqu une clnne n'est pas utilisée, le mieux est de la cnserver fermée les clnnes ne peuvent pas être cnservées au sec u dans l'eau pure, mais bien dans de l'acétnitrile par exemple. veillez à ce que le slvant d'élutin ne sit pas trp acide u trp basique car cela purrait faire se décmpser la phase statinnaire dans la clnne évitez les grs écarts de pressin; laissez d'abrd baisser la pressin avant de débrancher une clnne, car un déplacement de pressin peut déplacer le packing, ce qui dnne naissance à des vlumes mrts qui prvquent une interprétatin errnée des chrmatgrammes ne laissez pas tmber les clnnes, car cela peut aussi prvquer l'apparitin de vlumes mrts veillez à ce que les clnnes sient tujurs mises dans le bn sens du flux Détecteurs Détectin par IR 10 % de tutes les détectins se fnt par détectin d'indice de Réfractin. L'usage est universel, mais cmme lrs de la mesure le slvant d'élutin est lui-même détecté, la cncentratin de l'analyte recherché dit être assez élevée. Ces détecteurs snt également sensibles à la température (attentin aux curants d'air et systèmes d'air cnditinné). 271

280 La limite de détectin (LOD, Limit Of Detectin) se situe autur de 1 µg, alrs qu'elle est beaucup plus basse pur d'autres systèmes de détectin. Ce détecteur est inutilisable en mde gradient sauf si les slvants utilisés nt des indices de refractin très prches. Les pics btenus peuvent être psitif u négatifs seln que l indice de refractin augmente u diminue. Avec la détectin par IR, il y a dans le détecteur une cellule qui est remplie d'un côté de slvant A (référence) et de l'autre côté de slvant B (le slvant d'élutin avec u sans l'analyte). Si B cntient uniquement le slvant d'élutin, il aura le même indice de réfractin que le slvant A. Si l'analyte est présent dans B, la lumière quittera la cellule sus un autre angle de réfractin et un pic sera détecté Détectin par UV La détectin par UV/VIS se fait dans envirn 2/3 des cas. Cntrairement à la détectin par IR, il n'y a ici qu'une petite détectin de secnd plan du slvant d'élutin. Chacun des cmpsants qui se truvent dans le slvant d'élutin absrbe ici la lumière UV/VIS, ce qui rend cette détectin beaucup plus sensible. Plus la cncentratin du cmpsant présent est élevée, plus il y a de lumière absrbée. La LOD est ici prche des 10 ng. Une cnditin imprtante pur puvir travailler par détectin par UV/VIS est qu'il y ait des chrmphres (par exemple duble liaisn) présents dans l'échantilln injecté. Différents détecteurs snt pssibles pur la détectin par UV : Détectin de lngueur d'ndes fixe et lngueur d'nde variable Dans la détectin de lngueur d'nde fixe, la LOD peut s'élever jusqu'à 1 ng. Pur la détectin de lngueur d'nde variable, la lngueur d'nde ptimale (dnnant la meilleure absrbance) pur chaque cmpsant est réglée en fnctin du temps de rétentin. Pur la détectin à lngueur d'nde fixe, n mesure tujurs à une même lngueur d'nde. Pur puvir btenir plusieurs lngueurs d'nde en détectin à lngueur d'nde variable, un mnchrmateur est intégré dans le détecteur, celui-ci peut émettre la lngueur d nde vulue à travers le flw cell. Figure : Détecteur UV/VIS avec un seul élement de détectin 272

281 Détecteur à dide array (DAD) Cette méthde de détectin est très intéressante en HPLC parce que bien que le nmbre de plateaux en HPLC sit beaucup plus faible qu'avec la GC, avec cette méthde, la pureté d'un pic peut être déterminée s'il y a 2 pics qui se chevauchent u si un pic en cuvre un autre. Cette méthde permet aussi de s assurer de l identité du cmpsé séparé et ainsi être cnsidérée cmme méthde de cnfirmatin. Le détecteur à dide array utilise une lampe au deutérium qui envie un large spectre d'uv/vis. Le faisceau lumineux plychrmatique traverse l échantilln puis est séparé en diverses lngueurs d ndes par un mnchrmateur avant d être dirigée sur une barrette de dides. Chaque dide reçit alrs une bande spectrale étrite. Les absrptins peuvent maintenant être mesurées à plusieurs lngueurs d'ndes différentes et dnner un spectre cntinu du cmpsé. Figure : Détecteur UV/VIS avec dide array Ci-dessus (Figure ), pur exemple, une détectin DAD dans le VIS ( nm) appliquée à la bixine et la nrbixine, clrants naturels interdits dans certaines denrées épices : 273

282 Chrmatgramme (480 nm) Nrbixine Bixine 274

283 Figure : Dessus : chrmatgramme, Centre : prfil DAD spécifique des deux mlécules et maxima spécifiques d absrbance, Dessus : Vue en 3 D Détectin par flurescence Cette détectin n'est utilisée que dans envirn 10 % des détectins et est plus sensible que la détectin par UV, la LOD est de pg. Le principe est que de la lumière d'une lngueur d'nde spécifique est prjetée sur l'analyte et absrbée ; le cmpsé ré-émet sus frme de lumière tut u une partie du raynnement absrbé. L'émissin u radiatin de l'analyte est mesurée à une lngueur d'ndes plus élevée. Cette méthde est utilisable de façn limitée, à mins que l'n ne dérivatise l'analyte par liaisn avec un grupe flurescent. Ce type de détecteur est utilisable en mde gradient. Cette détectin est beaucup utilisée pur la déterminatin de vitamines, myctxines, acides aminés, drgues et pur le cntrôle de la qualité de prduits pharmaceutiques Détectin électrchimique A cause de l'utilisatin d'électrdes, ces détecteurs se salissent très facilement. Dans ce détecteur, un ptentimètre mesure la différence entre une électrde de référence et une électrde de travail qui snt plngées d'abrd dans la phase mbile et ensuite dans l'échantilln dissus. Par une xydatin u une réductin, il y a un transfert d'électrns de l'analyte à l'électrde u inversement. En cas d'xydatin, l'électrde agit cmme une cathde, en cas de réductin cmme une ande. En fnctin du métal qui se truve sur l'électrde, n peut déterminer des grupes différents. Cette méthde est utilisée à raisn de 10 %, surtut dans la chrmatgraphie inique et elle a une sensibilité d'envirn 100 pg. 275

284 Techniques assciées (HPLC-MS) La spectrmétrie de masse (MS) est utilisée pur la déterminatin du pids mléculaire (frmule brute), l identificatin des structures par la fragmentatin de la mlécule en fragments typiques recnnaissables, et cmme système de détectin dans la chrmatgraphie. La spectrmétrie de masse est une méthde de détectin dnt le fnctinnement est basé sur le fait que les mlécules snt inisées et éventuellement fragmentées puis séparées sur base du rapprt de la masse sur la charge. Aucun spectrmètre de masse ne peut mesurer la masse d'un atme u d'une mlécule nn chargé(e). Les parties nn chargées divent d'abrd être inisées avant de puvir être repussées u attirées par les champs magnétiques générés dans le spectrmètre de masse. Un spectrmètre de masse détermine le rapprt de la masse à la charge d'un in, exprimé cmme m/z Dérivatisatin pré- et pst-clnne Cmme n l'a déjà signalé pur la détectin par flurescence, n peut faire réagir un analyte de l'échantilln avec un grupe flurescent. La dérivatisatin peut se faire avant que le mélange ne passe par la clnne analytique (pré-clnne) u après que le mélange sit passé par la clnne analytique (pst-clnne). La dérivatisatin pré-clnne implique que l'échantilln et le réactif de dérivatisatin sient mélangés dans la chambre de mélange. Avantages : n peut chisir si-même les cnditins de réactin, la dérivatisatin peut servir d'étape de purificatin, l'excédent de réactif de dérivatisatin peut être éliminé, Incnvénients : les résidus de la réactin de dérivatisatin peuvent prvquer des pics, la réactin dit être reprductible, la séparatin après cup peut être difficile. Dérivatisatin pst-clnne Avantages : n peut utiliser plusieurs détecteurs en même temps, mindre frmatin de résidus, plus besin d'une séparatin après cup Incnvénients : la réactin dit être rapide, une dispersin secndaire est pssible, la réactin dit se faire dans la phase mbile, le réactif de dérivatisatin peut dnner des signaux supplémentaires Applicatin pratique Exemple : la déterminatin des aflatxines B1, B2, G1 et G2 : Dans l'analyse HPLC classique pur les aflatxines, 4 types d'aflatxines (B1, B2, G1 et G2) snt extraits de l'échantilln (chlrfrme) et purifiés au myen d'une SPE (Slid Phase Extractin) en un extrait qui est injecté dans l HPLC. Le système HPLC travaille avec une dérivatisatin pst-clnne, ce qui signifie qu'il se prduit d'abrd une séparatin des 4 cmpsants sur une clnne HPLC nrmale, et qu ensuite (='pst') il y a une dérivatisatin des aflatxines à l'ide (dans une clnne de réactin APRES la clnne HPLC). 276

285 Cette dérivatisatin est nécessaire pur rendre 'visibles' par flurescence les 4 aflatxines. Pur ce mntage, n utilise 1 pmpe HPLC et une pmpe à réactif de dérivatisatin car la slutin idée dit être pmpée dans le système après le circuit de séparatin primaire. La Figure a été reprise de la nrme eurpéenne fficielle : Figure Une alternative à cette dispsitin est pssible avec ce qu'n appelle une cellule Kbra; cette cellule se truve après la cellule de séparatin et est un système électrlytique qui dnne une dérivatisatin au brme. Ici aussi c'est la flurescence qui dnne la mesure finale. L'avantage de la cellule Kbra est qu'n n'a pas besin d une secnde pmpe dans le circuit. A l'avenir, n fera également de plus en plus l'usage de clnnes dites d'immun-affinité afin de remplacer l'extractin classique au chlrfrme et la purificatin. L'avantage est ici que le chlrfrme, txique, disparaît de la prcédure, que celle-ci devient plus simple et que la limite de détectin peut être abaissée du fait qu'il devient plus facile de travailler sur de plus grandes quantités d'extrait par rapprt à la méthde classique. Exemple : dsage des avermectines dans les fies : Les avermectines snt extraites d un échantilln de fie à l aide d acétnitrile. La purificatin de l extrait (clean up) est réalisée par extractin en phase slide (SPE) en deux étapes successives sur cartuches alumine puis C18. L extrait purifié est évapré à envirn 65 C et ensuite dérivatisé (pré-clnne) par le TFAA (acide trifluracétique anhydre) et le MMI (méthylimidazle), en un dérivé hautement flurescent et analysé par HPLC-flurimétrie (excitatin : 361 nm et émissin : 465 nm). 277

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