1) CONDITIONS GENERALES DE CONSERVATION DES STRUCTURES ET DES FONCTIONS CELLULAIRES

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1 INTRODUCTION D'une manière générale, le prblème de la cnservatin des tissus est celui du blcage u tut au mins du ralentissement des fnctins cellulaires et de la cnservatin des structures physic-chimiques qui cnditinnent ces fnctins. Les faits naturels mntrent qu'un rganisme, sumis à l'actin du frid vit sn activité fnctinnelle diminuer puis s'arrêter. Si, pur une rganisatin bilgique simple, les basses températures peuvent suspendre les phénmènes chimiques de la vie pur un temps illimité, il n'en est pas de même pur les rganismes perfectinnés. De plus, pur un rganisme dnné, chacune des cellules qui le cnstituent pssède une résistance particulière et en tut cas supérieure à celle de l'rganisme cnsidéré dans sn ensemble. 1. Cnditins générales de cnservatin des structures et des fnctins cellulaires 2. Chc thermique 3. Limites de déshydratatin 4. Vitesse de refridissement et vitesse de réchauffement 5. Phénmènes intervenant à basse température 6. Cnservatin à basse température 7. Mesures thermiques 8. Les agents cryprtecteurs 1. Nature des cryprtecteurs 2. Fnctins des cryprtecteurs 3. Cryprtecteurs et vitesses de refridissement 9. Annexes 1) CONDITIONS GENERALES DE CONSERVATION DES STRUCTURES ET DES FONCTIONS CELLULAIRES La résistance au frid et en particulier à la cngélatin dépend de plusieurs facteurs. Tut d'abrd, un refridissement brusque peut exercer un effet nuisible sur certaines cellules. Il s'agit du CHOC THERMIQUE qui peut intervenir aussi bien au-dessus qu'au-dessus du pint de cngélatin. D'autre part la CRISTALLISATION DE L'EAU tant à l'extérieur qu'à l'intérieur des cellules est à l'rigine de LÉSIONS MÉCANIQUES imprtantes. Une autre cnséquence de cette cristallisatin est la mdificatin du milieu physique dans lequel se truve les cellules. La frmatin de glace entraîne en effet une AUGMENTATION DE LA CONCENTRATION SALINE du milieu jusqu'à une valeur particulière crrespndant au pint eutectique.

2 L'augmentatin de la cncentratin en électrlytes entraîne une DÉSHYDRATATION des cellules. On nte avec intérêt que les cellules qui résistent le mieux à la déshydratatin snt celles qui résistent le mieux aux basses températures. 2) CHOC THERMIQUE Un chc thermique peut se prduire à l'ccasin du refridissement brusque de certaines cellules même en l'absence de tute cristallisatin. La zne critique se situe entre + 15 C et 0 C mais n peut bserver également un chc thermique entre 0 et -80 C. Les lésins dues au chc thermique truvent leur rigine au niveau de la membrane cellulaire, du fait de: cntractins différentielles des cmpsants membranaires, fractures mécaniques, changements cnfrmatinnels de la tpgraphie membranaire. Les dmmages subis snt peu sensibles à la nature des CATIONS présents dans le milieu extracellulaire mais beaucup plus aux mdificatins de sa COMPOSITION ANIONIQUE. De l'anin le mins agressif au plus txique n nte l'in ACÉTATE, CHLORURE, NITRATE, IODURE, SULPHATE. Le chc thermique peut être atténué par : les agents cryprtecteurs, la présence de PHOSPHOLIPIDES spécifiques (Phsphatidyl Sérine), un refridissement lent, l'expsitin préalable à des cncentratins élevées en sels. 3) LIMITES DE DESHYDRATATION Chez les vertébrés, une déshydratatin même partielle à température nrmale u subnrmale est nuisible pur la plupart des cellules. Seln leur type et leur rigine, les cellules ne supprtent pas de perdre plus de 20 à 80 % de leur quantité d'eau riginelle. Pur chaque type cellulaire, il existe une limite de déshydratatin au-delà de laquelle se prduit une altératin irréversible des structures cellulaires. La crrélatin entre la résistance d'une cellule à la déshydratatin et sa résistance aux basses températures tient à la mdificatin de l'équilibre inique.

3 L'augmentatin de la cncentratin en sels bservée au curs de la cristallisatin de l'eau exerce les effets les plus nuisibles sur la cellule. Elle prvque la précipitatin des prtéines et les cmplexes lipprtéines qui frment la membrane snt altérés. De plus, la cristallisatin des sels tampns peut entraîner des variatins imprtantes du ph et par suite une dénaturatin irréversible des prtéines. L'augmentatin de la cncentratin de certaines mlécules u ins peut prvquer une txicité cellulaire. La cngélatin peut également mdifier de façn réversible u irréversible l'état cllïdal de la cellule. On peut en effet assister à la séparatin du système cllïdal cellulaire en deux phases, les particules rganiques se séparant de leurs mlécules d'eau de liaisn pur se slidifier u se vitrifier. La thérie de la vitrificatin du milieu cellulaire qui est en accrd avec de nmbreux faits expérimentaux ne peut cependant s'accmmder des vitesses de refridissement et de réchauffement qui snt utilisées dans la pratique curante.

4 4) VITESSE DE REFROIDISSEMENT ET VITESSE DE RECHAUFFEMENT En matière de cngélatin de cellules et de tissus de mammifères il n'y a pas de règle abslue. La meilleure vitesse et le meilleur mde de refridissement dépendent de facteurs quelquefis cntradictires et dnt beaucup restent encre mal cnnus. C'est suvent par l'expérience que l'n arrive à déterminer les meilleures cnditins de refridissement, en précisant la vitesse à laquelle ce refridissement dit être effectué, les paliers thermiques éventuels, les agents cryprtecteurs à utiliser, etc... Ainsi purra-t-n éviter le chc thermique, l'actin nuisible des frtes cncentratins salines, l'altératin de l'état cilidal de la structure cellulaire. On peut cependant faire quelques remarques générales cncernant les vitesses de refridissement et les lésins cellulaires qui leur snt liées. A la dimensin des vitesses de refridissement utilisées en pratique curante, la NUCLÉATION puis la CRISTALLISATION débutent invariablement dans le cmpartiment extracellulaire. Il s'en suit que l'équilibre smtique de la cellule est perturbé et celle-ci se déshydrate partiellement. L'augmentatin de la cncentratin des électrlytes qui en résulte peut cnduire à des lésins irréversibles. Une fis que la frmatin de glace est cmmencée, l a VITESSE DE VARIATION DE LA TEMPÉRATURE intervient de façn majeure sur la viabilité cellulaire au curs du refridissement : elle détermine le temps ù les cellules restent au-dessus du pint eutectique et de ce fait, détermine la durée d'expsitin aux hypercncentratins salines ; elle détermine l'allure de la cngélatin intracellulaire ; elle détermine la taille et la frme des cristaux de glace. Au curs d'un refridissement lent, les cristaux de glace extracellulaires augmentent de taille et les cellules se cntractent tut en étant au cntact de slutins salines très cncentrées. La phase liquide se cngèle ensuite à la température eutectique. Au curs d'un refridissement rapide, l'eau se cngèle à l'intérieur des cellules sus frme de cristaux petits et imparfaits qui snt relativement instables. Au curs d'un réchauffement trp lent ils se transfrmernt en cristaux de plus grande taille et plus stables qui purrnt être alrs néfastes pur les cellules. L'augmentatin de la cncentratin saline qui résulte de la cngélatin de l'eau prvque une cntractin des cellules qui peuvent atteindre un vlume minimum au delà duquel la membrane deviendra perméable aux ins.

5 La SURVIE DES CELLULES est dnc une fnctin de la vitesse de refridissement. Elle passe par une VALEUR MAXIMUM pur diminuer ensuite lrsque la vitesse augmente. La VITESSE OPTIMALE dit être juste assez basse pur permettre à une cellule de se déshydrater suffisamment et éviter ainsi une cngélatin intracellulaire prématurée. Des vitesses trp faibles expsent les cellules à une cncentratin excessive des slutés pendant une trp lngue durée. De plus, cette vitesse ptimale de refridissement crrespnd à un VOLUME CRITIQUE de la cellule qui dépend : de la PERMÉABILITÉ à l'eau de la membrane cellulaire, de la SURFACE de cette membrane, du rapprt SURFACE/VOLUME de la cellule cnsidérée. On peut dire en résumé que l'explicatin la plus simple de l'existence d'une vitesse de refridissement ptimale est que la survie des cellules est déterminée par deux facteurs ppsés qui dépendent de la vitesse. Le facteur dminant, respnsable de la mrt cellulaire est la frmatin de glace intracellulaire et sn augmentatin de taille au curs du réchauffement. L'hypercncentratin saline qui en résulte exerce des effets néfastes sur les cellules pur des vitesses lentes, lrsque l'eau intra cellulaire - dnt le ptentiel chimique est élevé - quitte la cellule pur se cngeler dans le milieu extra cellulaire. La SURVIE MAXIMALE est bservée dans une certaine zne de vitesses dite ZONE DE TRANSITION dans laquelle les effets cmbinés des deux types de mécanismes snt atténués. On aura nté que vitesse de refridissement et vitesse de réchauffement étaient liées. D'une façn générale un RÉCHAUFFEMENT RAPIDE est plus bénéfique qu'un prcessus lent. Si la vitesse de réchauffement a peu d'effet sur les cellules refridies lentement, elle a une grande influence sur les cellules refridies rapidement. Ces bservatins tendent à mntrer que les lésins dues à la frmatin de glace nt lieu, au mins partiellement, au curs du réchauffement et nn au curs de la frmatin initiale de la glace lrs du refridissement.

6 5) PHENOMENES INTERVENANT A BASSE TEMPERATURE Nmbreuses snt les preuves des changements biphysiques et bichimiques qui peuvent se prduire dans des cellules vivantes à des températures inférieures à 0 C. De nmbreuses espèces de bactéries et de levures survivent et se multiplient à -8 C malgré la cngélatin du milieu envirnnant. On sait que les aliments (viande, pissns, légumes, fruits) en dehrs de tute activité micrbienne, perdent une partie de leur gût pendant la cnservatin à - 25 C, traduisant ainsi l'activité enzymatique à basse température. On peut en cnclure que si la température de cnservatin n'est pas suffisamment basse les cellules cntinuernt de vieillir et le temps de leur survie sera limité par le maintien du métablisme qui se truvera plus u mins ralenti. A des températures cmprises entre 0 et -40 C qui snt imprpres à cnservatin de certaines cellules, il se prduit des phénmènes de diffusin qui entraînent une mdificatin de l'équilibre inique du milieu. A plus basse température ces slutins d'électrlytes snt slidifiées sus frme d'eutectiques. On assiste également à des mdificatins de l'état cristallin de la glace (crissance cristalline u recristallisatin) puvant entraîner des lésins mécaniques imprtantes des structures bilgiques. 6) CONSERVATION A BASSE TEMPERATURE Dans le dmaine des sciences bilgiques la température de -70 C était cnsidérée cmme la limite inférieure au-dessus de laquelle aucun prcessus vivant ne puvait persister. Pur envisager valablement une cnservatin à lng vire très lng terme, il faut admettre que des températures inférieures de cnservatin divent être retenues. La plupart des bservateurs ntent que des cellules cngelées en présence de cryprtecteur (Diméthylsulfxyde u Glycérl) ne subissent aucune altératin si la température de cnservatin est inférieure à -130 C. Il est en effet difficile de cncevir qu'à cette température qui crrespnd à la vitrificatin de l'eau, des mécanismes destructeurs puissent encre se prduire. La cnservatin de certaines cellules particulièrement fragiles purra nécessiter l'utilisatin de températures très basses telle que celle de l'azote LIQUIDE ( C). On ntera pur la "petite histire" que BECQUEREL avait calculé en 1950 qu'une graine dnt la durée de vie serait d'un an entre 20 et 10 C purrait encre germer, si

7 elle était cnservée à la température de -270 C, au but de TRILLIONS 300 MILLIARDS D'ANNÉES!! Plus tard, ASHWOOD-SMITH et GRANT, en 1977, nt pu cnclure que la cnservatin indéfinie à -196 C était une impssibilité thérique car des cellules cnservées à cette température pendant ans accumuleraient, du fait des radiatins inisantes, autant de dmmages que si elles avaient subi une seule irradiatin à 600 rads! 7) MESURES THERMIQUES Puisque les vitesses de refridissement et de réchauffement peuvent avir de prfnds effets sur la survie des cellules et des tissus, il est imprtant qu'elles sient mesurées quantitativement. La meilleure infrmatin cnsiste en un tracé des curbes cmplètes de refridissement et de réchauffement qui permettent de déterminer : le refridissement avant cngélatin, la place et l'imprtance de la surfusin (*), le début de la cristallisatin et la lngueur du plateau de changement de phase, la vitesse de variatin de température après le changement de phase. L'ensemble de ce tracé cnstitue l'histoire THERMIQUE du système cnsidéré et peut être ramené à une mesure unique pur en simplifier la manipulatin. La meilleure mesure de la vitesse de refridissement est le temps nécessaire pur que la température passe d'envirn -5 C (à laquelle la plus grande part du changement de phase est engagée) au dessus de -50 C. Dans cette zne, la température tend à devenir une fnctin sensiblement linéaire du temps de telle srte qu'un nmbre myen unique pur une vitesse de refridissement u de réchauffement aura une significatin. * SURFUSION : Au curs de la cinétique de cngélatin, la surfusin cnstitue une étape imprtante et délicate de l'histire thermique. Le refridissement d'une slutin au-dessus de sn pint de cngélatin peut en effet cnditinner la nucléatin de la glace et par suite le mde de cristallisatin. 8) LES AGENTS CRYOPROTECTEURS Les principales causes de la mrt cellulaire étant: la frmatin de glace intracellulaire, le cntact avec une hypercncentratin saline,

8 Il s'agira dnc, au curs du refridissement, de maintenir une quantité suffisante d'eau à l'état liquide à la fis dans les cmpartiments intra et extra cellulaires et qui devra ne pas cristalliser pur rester slvant des électrlytes. La NUCLÉATION et par suite, la CRISTALLISATION peuvent être prévenues en rendant les nyaux de cndensatin inactifs par un "EMPOISONNEMENT" CHIMIQUE. Les substances utilisées à cette fin se fixent sur les mlécules d'eau par des liaisns hydrgènes. Ces AGENTS CRYOPROTECTEURS snt de différentes nature mais leurs fnctins snt analgues. 8.1) Nature des cryprtecteurs Quelle que sit leur structure mléculaire, les cryprtecteurs snt très slubles dans l'eau. Leur aptitude à frmer des liaisns hydrgènes avec les mlécules d'eau leur permet de la maintenir à l'état liquide à des températures inférieures aux pints de cngélatin cmmençante des slutins. La secnde prpriété essentielle de ces prduits est de présenter une faible txicité vis-à-vis des cellules qu'ils divent "prtéger". La TOXICITÉ est une ntin difficile à définir car les cnditins extérieures à la nature même du prduit peuvent entrer en jeu. Elle dépend en effet : de la cncentratin du cryprtecteur, de la tnicité du milieu, du mde de cntact des cellules avec le prduit. On parlera préférentiellement de TOXICITÉ INTRINSÈQUE d'un agent cryprtecteur pur rendre cmpte de ses interactins biphysiques et bichimiques avec les structures cellulaires. Les autres cnditins pur lesquelles un additif particulier prtègera les cellules d'un système bilgique dnné variernt et dépendrnt de facteurs tels que le POIDS MOLÉCULAIRE et la PERMÉABILITÉ de la membrane cellulaire à ce prduit. Les agents qui pénètrent dans les cellules nt un faible pids mléculaire (inférieur u égal à 400). Les agents nn pénétrants dnt le pids mléculaire est de l'rdre de plusieurs milliers, prtègent les cellules par des mécanismes encre mal élucidés. Le mde d'addition et d'élimination des cryprtecteurs est en si un chapitre imprtant de la crycnservatin.

9 8.2) Fnctins des cryprtecteurs D'une façn générale, les cryprtecteurs mdifient les caractéristiques eutectiques des slutins de telle srte que la quantité de glace frmée et par vie de cnséquence la cncentratin saline de la phase liquide snt diminuées. En abaissant le pint de cngélatin de la slutin extracellulaire ils ralentissent la cinétique de srtie d'eau intracellulaire et évitent ainsi à la cellule d'atteindre sn vlume minimal critique. En atténuant la cntractin cellulaire, les cryprtecteurs évitent les hypercncentratins salines et les précipitatins, On cnstate en effet, qu'en présence de 1 % de DMSO, une slutin saline istnique (9 g/l) atteindra la cncentratin de 50 g/l de NaCI à la température de - 5 C. En présence de 5 % de DMSO, cette cncentratin serait btenue à -20 C, tandis qu'elle ne serait atteinte qu'à -50 C si la cncentratin de cryprtecteur était prtée à 10 %. A cette température les dénaturatins prtéiques snt manifestement mins imprtantes. 8.3) Cryprtecteurs et vitesses de refridissement Les lésins cellulaires dues au refridissement snt attribuées à deux facteurs ppsés qui dépendent de la vitesse: l'hypercncentratin saline pur les vitesses trp basses; la frmatin de glace intracellulaire pur les vitesses trp élevées. La survie maximale est bservée dans une zne de transitin dans laquelle les effets de ces deux types de mécanismes snt atténués. D'une façn générale, n cnstate que les cryprtecteurs prtègent les cellules à des vitesses de refridissement pur lesquels les dmmages liés aux "EFFETS DE SOLUTION" (basses vitesses) snt suppsés être prédminants. On cnstate en effet, qu'en augmentant la cncentratin d'un agent cryprtecteur (GLYCÉROL u DMSO) dans une suspensin de cellules refridies à des vitesses différentes, la VITESSE OPTIMALE est déplacée vers les basses vitesses, tandis que l'amplitude du taux de survie est augmentée. On cnstate que la partie relative à la cngélatin intracellulaire (vitesses élevées) n'est pas affectée par la présence de cryprtecteur. Revenant à la ntin de ZONE DE TRANSITION définie précédemment, n peut dire que les agents cryprtecteurs présents au curs de la cngélatin la déplacent vers les basses vitesses en abaissant le seuil des lésins dues aux effets cmbinés des sels et de la glace intracellulaire.

10 9) APPENDICES RESUMES ET FIGURES D'ILLUSTRATION : 1. Cnservatin des tissus et activité bilgique 2. Cnditins générales de cnservatin : effets de la cngélatin lésins mécaniques prpres augmentatin de la cncentratin des électrlytes déshydratatin 3. Vitesses de refridissement 4. Effets de la vitesse de refridissement sur la cristallisatin intra et extra cellulaire 5. Cngélatin intracellulaire 6. Lésins cellulaires prvquées par la cngélatin 7. Nature des lésins dues à la cngélatin 8. Influence de la vitesse de refridissement sur le taux de cngélatin intra cellulaire 9. Taux de survie de différentes cellules en fnctin de la vitesse de refridissement 10. Vitesse de réchauffement 11. Phénmènes intervenant à basse température 12. Histire thermique 13. Agents cryprtecteurs (I) 14. Agents cryprtecteurs (II) 15. Fnctins des cryprtecteurs 16. Cryprtecteur et vlume critique 17. Effet de la cncentratin initiale de DMSO sur la cncentratin saline pendant la cngélatin 18. Effet de la cncentratin de cryprtecteur sur le taux de survie 19. Effet des cryprtecteurs sur le taux de survie et le déplacement de la "Zne de Transitin" des lésins cellulaires 20. Figure 1, 2, 3 a Variatin de l'smlarité du milieu en fnctin du temps 21. Figure 1, 2, 3 b Cnséquence sur la variatin du vlume cellulaire en fnctin du temps * A. Ehrsam - Lyn - France

11 Figure n 1 : Cnservatin des tissus et activité bilgique Objectif : Ralentissement et/u blcage des fnctins Cnservatin des structures Résultats: Variables seln le degré de cmplexité des tissus à cnserver Figure n 2 : Cnditins générales de cnservatin Effets de la cngélatin : Chc thermique : effet sur les membranes Cntractin Différentielle des cmpsants membranaires Fractures Mécaniques Changements cnfrmatinnels de la tpgraphie membranaire Cristallisatin de l'eau : mdificatins physiques et bichimiques Lésins Mécaniques prpres Augmentatins de la cncentratin des électrlytes (EUTECTIQUE) Déshydratatin et cntractin Augmentatin de la cncentratin des électrlytes : Variatins smtiques Précipitatin des eutectiques Déshydratatin Cnséquences : les plus néfastes Variatin de PH : dénaturatin des prtéines "Salting ut" : précipitatin des prtéines altératins enzymatiques Txicité due à la cncentratin de certaines mlécules (urée) Altératin fnctinnelle due à la cncentratin de certains ins (Ca++; PO4...) Lésins mécaniques prpres : Dues à la cristallisatin de l'eau Cristaux de frmes et de taille différentes seln le mde de refridissement Phénmène de recristallisatin Déshydratatin : A température nrmale : effet nuisible Taux de déshydratatin variable seln les cellules Au-delà de la "limite" : dénaturatin irréversible A basse température : crrélatin avec la viabilité Relatin avec la vitesse de refridissement Ntin de vlume minimum et de vitesse critique Variable seln les cellules Prblème des tissus cmplexes

12 Figure n 3 : Vitesses de refridissement En matière de cngélatin de tissus : Pas de règle abslue Vitesse ptimale : Déterminée expérimentalement en fnctin de : - Nature et cmplexité du tissu étudié - Nature du milieu de cnservatin - Nature et cncentratin de l'agent cryprtecteur utilisé - Pssibilités techniques à dispsitin Figure n 4 : Effets de la vitesse de refridissement sur la cristallisatin intra et extra cellulaire -2 C -5 C -10 C 1 : refridissement lent 2 : rapide 3 : très rapide

13 Figure n 5 : Cngélatin intracellulaire La cellule perd de l'eau lrs d'un refridissement lent Mais L'eau intracellulaire se cngèle avant d'avir pu quitter la cellule lrs d'un refridissement rapide. Pratiquement La cngélatin intra cellulaire est néfaste, mins par le biais de la cngélatin que par celui de la décngélatin au curs de laquelle peuvent se prduire des phénmènes de recristallisatin. Figure n 6 : Lésins cellulaires prvquées par la cngélatin nt un caractère bimdal. Mécanismes agissant à vitesses lentes : "Effets de slutin" dus à la cngélatin du mélange eau-électrlyte. Mécanismes agissant à vitesses élevées : Frmatin de glace à l'intérieur des cellules. Survie maximale dans une certaine zne de vitesses (zne de transitin) pur lesquelles les effets cmbinés des deux types de mécanismes snt atténués.

14 Figure n 7 : Nature des lésins dues à la cngélatin Figure n 8 : Influence de la vitesse de refridissement sur le taux de cngélatin intra cellulaire Figure n 9 : Taux de survie de différentes cellules en fnctin de la vitesse de refridissement

15 Figure n 10 : Vitesse de réchauffement Figure n 11 : Phénmènes intervenant à basse température Étritement liée à la vitesse de refridissement Si peu d'effet sur les cellules refridies lentement Grande influence sur la survie des cellules refridies rapidement Lésins dues à la frmatin de glace En majeure partie au curs du réchauffement D'une façn générale : réchauffement rapide Changements biphysiques et bichimiques Échanges iniques (DIFFUSION) Persistance de l'activité ENZYMATIQUE VIEILLISSEMENT maintenu entre 0 et -70 C Mdificatin de l'état cristallin de la glace Recristallisatin Lésins mécaniques Influence de la température de cnservatin -130 C : Température de vitrificatin de l'eau -196 C : Température de l'azte Liquide Figure n 12 : Histire thermique

16 Figure n 13 : Agents cryprtecteurs (I) Imprtance relative de la perméabilité de la membrane (1) et de la diffusin du cryprtecteur (2) (1) Dépend du vlume et de la surface cellulaires (2) Dépend de la perméabilité, de la nature du cryprtecteur, de la température. Imprtance du mde d'additin et d'éliminatin du C.P. Effets smtiques Vlume critique (cntractin smtique) Température et durée Figure n 14 : Agents cryprtecteurs (II) De différente nature mais prpriété cmmune : Frmatin de liaisns hydrgènes avec les mlécules d'eau Grande slubilité et faible txicité Diffusibles u nn seln leur pids mléculaire Agents pénétrants (PM <= 400) Méthanl CH 3 OH (32) 1-2 Isprpanedil C 3 H 6 (0H) 2 (76) Ethanl C 2 H 5 OH (46) Glycérl C 3 H 5 (OH) 3 (92) Ethylène glycl C 2 H 4 (0H) 2 (62) Diméthyl sulfxide (CH 3 )SO (78) Agents nn pénétrants (PM > ) Plyvinyl pyrrlidne (40 000) Hydrxy Ethyl Amidn (97 000)

17 Figure n 15 : Fnctins des cryprtecteurs Réduire le chc smtique lrs de la cristallisatin Réduire les risques de cristallisatin intracellulaire Augmentatin de la viscsité Réductin de la prbabilité de Germinatin Mdifier la structure de la glace Réductin des traumatismes mécaniques Éviter les hypercncentratins salines Quel que sit leur mde de prtectin : La prtectin est prprtinnelle à leur cncentratin Figure n 16 : Cryprtecteur et vlume critique

18 Figure n 17 : Effet de la cncentratin initiale de DMSO sur la cncentratin saline pendant la cngélatin Figure n 18 : Effet de la cncentratin de cryprtecteur sur le taux de survie Figure n 19 : Effet des cryprtecteurs sur le taux de survie et le déplacement de la "Zne de Transitin" des lésins cellulaires

19 Figure 20: Figure 1, 2, 3 a : Variatin de l'smlarité du milieu en fnctin du temps Figure 1, 2, 3 b : Cnséquence sur la variatin du vlume cellulaire en fnctin du temps