Initiation à la virologie Chapitre IV : Diagnostic viral

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1 Initiation à la virologi Chapitr IV : Diagnostic viral [www.virologi-uclouvain.b] Objctifs du modul Nous disposons d outils d laboratoir nous prmttant d détctr ls infctions virals t lurs ffts. Lorsqu on travaill dans l sctur médical, vétérinair ou agricol t qu on st confronté aux infctions virals, il st nécssair d avoir un vu général ds possibilités diagnostiqus xistants. Vous trouvrz ici ls princips du diagnostic viral ainsi qu un aprçu ds différnts tchniqus utilisés. Tabl ds matièrs 1. uts du diagnostic 2. pproch général 3. Caractéristiqus d un tst 4. Tchniqus diagnostiqus 5. Quiz t tsts 6. ibliographi la fin d c modul «Généralités sur ls virus», vous srz capabl d Expliqur l utilité ds tsts d laboratoir n virologi Comprndr ls notions d qualité général ds tsts (snsibilité, spécificité, tc.) Situr ls différnts typs d tsts dircts t indircts n virologi Comprndr l mod d fonctionnmnt général ds tsts rpris dans c chapitr Prérquis voir parcouru t compris ls partis I à III d c cours dans lurs aspcts généraux Qustions t réflxions Un tst répond à un qustion. Posz-vous d abord la qustion Ls qualités d un tst dépndnt fortmnt d la population tsté : tnz n compt dans l évaluation d un tchniqu Ls qualités d un tst vous disnt s il st adapté aux circonstancs Réalisation :

2 IV. Diagnostic viral 1. uts du diagnostic Lorsqu on n sait pas c qu on chrch, il st difficil d trouvr. L diagnostic établi par un laboratoir d virologi tnt d répondr à un crtain nombr d qustions. En fonction d la qustion posé t n fonction du virus concrné, l laboratoir appliqura ds tchniqus différnts. L diagnostic put poursuivr ls buts suivants : Confirmr un infction aiguë Démontrr un immunité par un infction ancinn ou un vaccination Détctr un infction prsistant avc ou sans symptôms Détctr la présnc d un xacrbation, par réactivation ou surinfction Caractérisr un virus Suivr l évolution d un infction viral avc ou sans traitmnt [ Pour lir ls xmpls : ] 1. uts du diagnostic 1

3 IV. Diagnostic viral 2. pproch général Dux typs d approch sont possibls. Soit la rchrch dirct du virus ou d élémnts d clui-ci, soit un approch indirct rchrchant ls signs d la réaction d l organism à la présnc du virus. En médcin humain ou vétérinair, ctt drnièr approch s résum la plupart du tmps à la rchrch d anticorps. En phytopathologi, si c typ d approch st moins utilisé vu l absnc d production d anticorps par la plant, il rst possibl d rchrchr la présnc d inclusions cllulairs caractéristiqus d infctions virals. 1. pproch indirct Chz ls animaux ou l homm, ls anticorps signnt un contact récnt ou ancin avc un antigèn donné. Ls anticorps rconnaissnt un antigèn donné t sont donc spécifiqus d un virus donné. Ctt rchrch d anticorps s fait généralmnt dans du sérum, d où l nom d tst sérologiqu. On put détctr un séropositivité, ou la présnc d anticorps. On put égalmnt déclr sur dux sérums succssifs l apparition d anticorps ou séroconvrsion. Ls anticorps sont ds immunoglobulins groupés n différnts classs, dont ls IgG t ls IgM. Ls IgM sont surtout présnts lors d la prmièr répons n phas aiguë t disparaissnt n qulqus mois. La présnc d IgM indiqu donc souvnt un infction récnt. Ls IgG apparaissnt à pu près au mêm momnt t prsistront à vi. On obsrv qu au cours d l évolution d la répons immunitair, il y a maturation d cs IgG qui au début ont un faibl avidité pour l antigèn, laqull augmntra au cours ds mois. L avidité ds IgG st un autr marquur prmttant d datr un infction. IV.2.1. Inclusions n rous à aubs provoqués par l virus d la bigarrur du poirau (microscopi élctroniqu) 2. pproch dirct Il s agit d la façon concptull la plus simpl. Un virus st présnt t nous rchrchons sa présnc soit n l visualisant d façon complèt par microscopi élctroniqu, soit n l cultivant t n obsrvant ss ffts dircts ou indircts sur ls clluls cultivés, l animal ou la plant inoculé. Par aillurs, nous pouvons détctr ds élémnts constitutifs du virus, comm ds antigèns xprimés dans ls particuls virals ou à la surfac d clluls infctés, ou un séqunc spécifiqu d acid nucléiqu. Ls tchniqus d détction d acids nucléiqus prnnnt actullmnt d plus n plus d importanc, surtout dpuis l dévloppmnt d tchniqus d amplification comm la PCR. près détction du génom d un virus on put caractérisr clui-ci par différnts tchniqus d hybridation t d séqunçag. 2. pproch général 2

4 Diagnostic viral 3. Caractéristiqus d un tst Lorsqu nous nous posons un qustion n virologi, nous pouvons dmandr un tst qui nous donnra un répons. Commnt savoir qull confianc nous pouvons avoir dans ctt répons? Cci dépndra ds caractéristiqus du tst, mais égalmnt ds circonstancs dans lsqulls il st dmandé. Exmpl : J soupçonn un hépatit viral chz un prsonn t j dmand d dosr dans son sang la présnc d bilirubin (pigmnt ntraînant la jauniss). D un part un infction par un virus d l hépatit put survnir sans présnc d jauniss t d autr part il y a d autrs raisons qu ls hépatits virals d avoir un jauniss. C tst, bin qu m donnant un indication, a ds limits évidnts. 1. La snsibilité cliniqu d un tst C st la capacité d un tst à détctr un infction, un maladi ou un immunité lorsqu cll-ci st présnt. Exmpl : Si un tst a un snsibilité d 98% pour détctr l infction par l virus du SID (VIH ou HIV), cla signifi qu sur 100 prsonns infctés j vais n détctr 98 avc mon tst. D mêm, si la snsibilité cliniqu d un tst dstiné à la détction du virus d la mosaïqu du tabac st d 95%, cla signifi qu l tst st capabl d mttr la présnc du virus n évidnc 95 fois sur 100. Exmpl : tst très snsibl. La snsibilité cliniqu s évalu sur un population ayant l attribut rchrché (maladi, infction ou immunité) Présnc d Maladi/infction/immunité Tst + Tst - Total Snsibilité cliniqu = (198/ ) X 100 = 99% 2. La spécificité cliniqu d un tst C st la capacité d un tst à êtr réllmnt négatif quand un infction, un maladi ou un immunité st absnt. Exmpl : Si n transfusion sanguin, lors du dépistag du SID chz ds donnurs d sang on trouv 2 donnurs positifs sur 1000, parmi ds donnurs parfaitmnt négatifs, la spécificité cliniqu du tst st d 99,8%. Parmi ls négatifs j trouv 0,2% d résultats faussmnt positifs. Exmpl : tst très spécifiqu. La spécificité cliniqu s évalu sur un population n ayant pas l attribut rchrché (maladi, infction ou immunité) Tst + Tst - Total Présnc d Maladi/infction/immunité Spécificité cliniqu = (998/ ) X 100 = 99,8% 3. La snsibilité analytiqu d un tst Cci rprésnt la quantité minimal d matièr à analysr qu l tst parvint à détctr. Exmpl : un tst pour la détction d l hépatit parvint à détctr d façon rproductibl au moins virus par ml d sang. Il s agit d la snsibilité analytiqu d c tst. On décrira parfois la snsibilité analytiqu comm l «suil d snsibilité». 3. Caractéristiqus d un tst 3

5 IV. Diagnostic viral > 3. Caractéristiqus d un tst 4. La spécificité analytiqu d un tst La spécificité analytiqu d un tst indiqu sa capacité à n détctr qu un produit à analysr bin précis à l xclusion d tout autr. Exmpl : un tst très spécifiqu n détct qu l virus d la varicll. Un tst un pu moins spécifiqu détct tous ls virus d la mêm famill, à savoir ls Hrpsvirida. 5. La valur prédictiv positiv d un tst ou la valur prédictiv d un tst positif (VPP) La VPP indiqu ls chancs qu un tst, lorsqu il st positif, soit réllmnt positif t non faussmnt positif. La VPP dépnd ds autrs caractéristiqus du tst, particulièrmnt d la spécificité, mais ncor baucoup plus d la probabilité pré-tst du diagnostic. Lorsqu un maladi ou infction st rar t donc sa probabilité pré-tst faibl, un résultat positif sra baucoup plus souvnt faussmnt positif qu si ctt infction était fréqunt dans l group étudié. Exmpl : Lorsqu on tst ls immunoglobulins d class M contr la rubéol, c tst st indicatif d un infction récnt. Utilisé chz ds patints présntant ds symptôms il confirmra la plupart du tmps l diagnostic ; utilisé comm dépistag chz ds prsonns n ayant aucun symptôm, comm ls fmms ncints, ls tsts positifs sront généralmnt faussmnt positifs. Exmpl : valur prédictiv positiv élvé si l attribut st très fréqunt (prévalnc d ±16,6%) avc un tst qui a un snsibilité d 99% t un spécificité d 99,8%. La VPP s calcul sur ls résultats positifs. Tst + ttribut présnt ttribut présnt VPP = (198/ ) x 100 = 99% Total Exmpl : valur prédictiv faibl si l attribut st très rar (prévalnc d ± 0,1%) avc l mêm tst ttribut présnt ttribut présnt Total Tst VPP = (99/99+200) x 100 = 33% 6. La valur prédictiv négativ d un tst ou la valur prédictiv d un tst négatif (VPN) La VPN indiqu ls chancs qu un tst, lorsqu il st négatif, soit réllmnt négatif t non faussmnt négatif. D mêm qu dans l cas d la VPP, la VPN st fortmnt dépndant d la probabilité pré-tst du diagnostic. Exmpl : En transfusion il y a un systèm d auto-xclusion ds donnurs, basé sur un intrrogatoir écrit. L but st d diminur la probabilité pré-tst d tombr sur un prsonn infcté par un virus d hépatit ou par clui du SID. D ctt façon on amélior la VPN ds tsts qui sront par après xécutés sur ls dons: lorsqu on aura un tst négatif, on augmnt la probabilité qu il corrspond réllmnt à l absnc d infction. 3. Caractéristiqus d un tst 4

6 IV. Diagnostic viral > 3. Caractéristiqus d un tst 7. Définition mathématiqu Divisons la population tsté n fonction d la présnc d un maladi/infction/immunité t d la présnc d un résultat positif ou négatif d tst. s Pour accédr à l xrcic : IV.3.1. Calcul d la snsibilité t d la spécificité ds valurs prédictivs d un tst Nous voyons qu la snsibilité cliniqu s évalu dans un population ayant l attribut tsté (maladi/infction/immunité) t qu la spécificité cliniqu s évalu dans un population n ayant pas ct attribut. Par contr la VPP t la VPN vont dépndr d la proportion d malads t d bin portants dans la population tsté, puisqu ils s calculnt sur ls colonns vrticals. 3. Caractéristiqus d un tst 5

7 IV. Diagnostic viral 4. Tchniqus diagnostiqus Ls différnts approchs possibls dans l diagnostic viral, dirct t indirct, sront miux compriss par qulqus xmpls pratiqus détaillés. Nous décrivons ici qulqus tchniqus d détction d anticorps, d détction t d caractérisation ds virus (sous-typs, résistanc aux médicamnts antiviraux). 1. Détction d anticorps Lorsqu un animal ou un homm ntr n contact avc un antigèn étrangr, il réagit par un réaction immunologiqu spécifiqu. L H H(avy) L(ight) Ctt réaction comprnd dux volts : un réaction humoral avc la production d anticorps qui rconnaissnt l antigèn t un réaction cllulair avc augmntation d un population cllulair cytotoxiqu spécifiqu. Ctt réaction survint aussi lors du contact avc un virus par infction ou vaccination. Variabl Constant ss ss ss ss La production d anticorps spécifiqus put êtr détcté avc ds tchniqus rlativmnt simpls. Cs tsts sont ffctués généralmnt sur du sérum d où l nom d tsts sérologiqus. IV Structur d un molécul d immunoglobulin Ls anticorps sont ds protéins, nommés immunoglobulins ou gamma-globulins, divisés n différnts classs : ls immunoglobulins G, M,, E. C sont surtout ls IgG (monomèrs) t ls IgM (pntamèrs) qui sront rchrchés dans l diagnostic ds maladis virals. Immunoglobulins L H H(avy) L(ight) IgG monomèr ss ss ss ss IgM pntamèr Ig dimèr IV Structur d un molécul d immunoglobulin 4. Tchniqus diagnostiqus 6

8 IV. Diagnostic viral > 4. Tchniqus diagnostiqus Séropositivité : Présnc d'anticorps IgG incubation Infction Survnu ds anticorps Maladi Séroconvrsion : apparition d'anticorps sur dux sérums succssifs 2 IgG Infction incubation 1 Détction ds anticorps 1 2 Echantillons d sérum Maladi ugmntation d titr ou taux d'anticorps ntr ls dux sérums 2 1 IgG Infction incubation ugmntation ds anticorps 1 2 Echantillons d sérum Maladi Rchrch d'igm IgM Infction incubation +/- 3 mois Survnu ds anticorps Maladi 4. Tchniqus diagnostiqus 7

9 IV. Diagnostic viral > 4. Tchniqus diagnostiqus IgG IgM incubation Infction Maladi IV pparition d anticorps après infction t lur détction L tst sérologiqu détctra : La présnc d anticorps ou séropositivité : cci sign l contact avc l virus mais n prmt pas d datr l momnt d l infction. Pour crtains virus qui prsistnt dans l organism cla indiqu égalmnt l état d portur (xmpl : l virus du SID ou VIH/HIV) L apparition d anticorps ntr dux sérums succssifs prélvés généralmnt à un intrvall d 10 à 21 jours. On parl d séroconvrsion. Cci indiqu qu un prmir contact a u liu autour du momnt du prmir prélèvmnt. Un augmntation d la concntration d anticorps ntr dux sérums. Ctt concntration s xprim n titr ou n unités tst utilisé. Un augmntation indiqu qu il y a u un stimulation du systèm immunitair : cll-ci put êtr du à un infction récnt ou à un réactivation viral symptomatiqu ou non. La présnc d anticorps d la class M (IgM), qui sont présnt pndant ls prmirs mois après un contact. La présnc d anticorps IgG d faibl avidité. L avidité ds anticorps augmnt au cours ds mois succédant à un infction aiguë. Un faibl avidité indiqu donc un infction récnt. 4. Tchniqus diagnostiqus 8

10 IV. Diagnostic viral > 4. Tchniqus diagnostiqus Qulqus xmpls d tsts sérologiqus Ls tsts d agglutination Ils font appl à ds particuls microscopiqus (latx, gélatin ou globuls rougs) rcouvrts d un antigèn viral avc ss épitops, qui sront mélangés à un dilution d sérum. Ls anticorps sont capabls d lir dux épitops t établiront donc ds ponts ntrs ls particuls qui sront visibls comm un agglutination microscopiqu ou macroscopiqu. Un problèm pouvant survnir avc c gnr d tst st l fft «prozon» : lorsqu il y a un très grand quantité d anticorps, il y a déséquilibr ntr la quantité d anticorps t d antigèns t la réaction n s produit pas. Lorsqu, dans c cas, on dilu l sérum la réaction dvint positiv. Résultat positif Résultat négatif Efft prozon IV Tst d agglutination pparition d anticorps après infction t lur détction Définir l taux d anticorps par titration vc l tst d agglutination l princip d la titration st aisémnt compris. Il s agit d établir un séri d dilutions d sérums t d ffctur la réaction d détction avc chaqu dilution. La plus haut dilution offrant ncor un réaction positiv donnra l titr. Lorsqu à un dilution d 1/32 on détct ncor ls anticorps, mais plus à 1/64, on dit qu l titr d anticorps dans c sérum st d 32. Lorsqu ls particuls utilisés pour l tst d agglutination sont ds globuls rougs (avc lurs proprs protéins d surfac fortmnt glycosylés comm antigèns), on parl d hémagglutination. C tst st souvnt utilisé, non pas pour la détction d anticorps, mais pour la détction d particuls virals s liant aux acids sialiqus (comm l virus d la gripp). 0.5 ml d diluant dans chaqu tub IV Titration d un sérum pour la rchrch d anticorps 4. Tchniqus diagnostiqus 9

11 IV. Diagnostic viral > 4. Tchniqus diagnostiqus ELIS ou EI (Enzym Linkd ImmunoSorbnt ssay ou Enzym Immunossay) Cs tsts font appl à un conjugué couplant un nzym à un anticorps d détction. Cs tsts prmttnt un automatisation complèt ds tsts t d ctt façon d tstr d nombrux sérums. L princip st donné dans la figur IV L ELIS prmt aussi un évaluation du taux d anticorps, mais au liu d fair appl à un titration, il fait appl à un courb standard pour comparr ls valurs obtnus. Dans c cas l résultat sra xprimé n unités. Cs unités sront intrnationals (UI) si la comparaison s fait avc un standard intrnational ou arbitrairs (U) s il n y a pas d standardisation. Il xist d nombruss variants du tst ELIS, comm ls tsts d captur t ls tsts compétitifs. L princip put égalmnt êtr modifié pour la détction d antigèns. Ls tsts sérologiqus décrits dans ctt sction sont donc aussi utilisés pour l idntification d virus phytopathogèns à partir d un xtrait végétal. insi, chaqu anné, ds cntains d millirs d ELIS sont réalisés pour détctr ls virus potntillmnt présnts dans ls pomms d trr dstinés à la plantation, pour minimisr ls risqus d prts d rndmnt liés à cs virus. ntigèns dans un puits d un plaqu n polystyrèn + Sérum Incubation Si ds anticorps sont présnts, ils s fixnt sur l'antigèn Lavag pour éliminr ls élémnts non fixés + Conjugué (anticorps antihumain couplé à un nzym) Incubation Lavag pour éliminr ls élémnts non fixés + Substrat pour l'nzym L substrat s color si l'nzym st présnt Lctur photométriqu IV Titration d un sérum pour la rchrch d anticorps 4. Tchniqus diagnostiqus 10

12 IV. Diagnostic viral > 4. Tchniqus diagnostiqus Wstrn blot Lorsqu on confirm un résultat obtnu n sérologi d routin, on utilis parfois un tst dit Wstrn blot (W), qui st un modification du princip ELIS énoncé plus haut. Dans l tst W, ls protéins d un lysat viral sont séparés n élctrophorès sur gl d polyacrylamid (PGE), nsuit transférés («blotting») vrs un fuill d nitrocllulos ou d nylon. Ctt fuill, découpé n lanièrs, prmttra d tstr ls sérums pour rchrchr ls anticorps contr ls différnts protéins avc un tchniqu dont l princip rssmbl à cll d l ELIS décrit plus haut. La réaction apparaît comm un band d dépôt à l ndroit où s trouv la protéin concrné. - + Lysat viral Protéins séparés SDS-PGE "blotting" Transfrt ds antigèns séparés sur nitrocllulos Protéins lourds Découpag n bands Protéins légèrs IV Préparation ds bands d Wstrn blot L substrat s color t s dépos à l'ndroit d l'antigèn conjugué anticorps antigèn IV Détction d anticorps par Wstrn blot 4. Tchniqus diagnostiqus 11

13 IV. Diagnostic viral > 4. Tchniqus diagnostiqus gp160 gp120 p66 p55 p51 gp41 p31 p24 p17 p15 () () + - IV Résultat d détction d anticorps 4. Tchniqus diagnostiqus 12

14 IV. Diagnostic viral > 4. Tchniqus diagnostiqus Rchrch ds anticorps IgM Dans ls tsts ELIS, l conjugué put spécifiqumnt êtr dirigé contr un class particulièr d immunoglobulins, ls IgG ou ls IgM. Ls tsts rchrchant ls IgM posnt un crtain nombr d problèms, t d façon général ils rstnt moins fiabls qu ls tsts IgG. Dans un tst, suivant l format donné dans la figur IV ds résultats faussmnt négatifs ou positifs puvnt survnir. Ds résultats faussmnt négatifs survinnnt lorsqu il y a baucoup d IgG accompagnant ls IgM. Ls IgG vont saturr ls sits d réaction t n prmttront pas aux IgM d s fixr. IgM ntigèns dans un puits d un plaqu n polystyrèn + Sérum Si ds IgM sont présnts, ils s fixnt sur l'antigèn Lavag pour éliminr ls élémnts non fixés + Conjugé (anticorps anti IgM couplé à un nzym) Lavag pour éliminr ls élémnts non fixés + Substrat pour l'nzym L substrat s color si l'nzym st présnt IV Tst immuno-nzymatiqu pour la rconnaissanc ds IgM 4. Tchniqus diagnostiqus 13

15 IV. Diagnostic viral > 4. Tchniqus diagnostiqus Intrférnc du factur rhumatoïd (FR) dans ls Elisa IgM Par aillurs, d nombrux facturs puvnt intrvnir pour crér ds résultats faussmnt positifs. L plus important st l factur rhumatoïd (FR) : il s agit d IgM réagissant d façon non spécifiqu avc ds IgG complxés ou liés à un antigèn. Lorsqu dans l tst ELIS ds IgG spécifiqus s sont liés à l antigèn t qu c complx st rconnu par l factur rhumatoïd présnt dans l sérum du patint, un réaction d rconnaissanc d IgM s fra lors d l ajout d conjugué, donnant faussmnt l imprssion qu ds IgM spécifiqus sont présnts. FR (IgM) IgG ntigèns dans un puits d un plaqu n polystyrèn + Sérum L factur rhumatoïd s fix sur l complx antigèn-anticorps Lavag pour éliminr ls élémnts non fixés + Conjugé (anticorps anti IgM couplé à un nzym) Lavag pour éliminr ls élémnts non fixés + Substrat pour l'nzym L substrat s color malgré l'absnc d'igm spécifiqus IV Intrférnc du factur rhumatoïd dans ls Elisa IgM Il y a dux façon d évitr l fft du factur rhumatoïd t n mêm tmps d mpêchr l fft d un fort concntration d IgG spécifiqus : 4. Tchniqus diagnostiqus 14

16 IV. Diagnostic viral > 4. Tchniqus diagnostiqus 1. jout d anti-igg : on dilu l sérum avc un diluant contnant ds anticorps anti-igg humains. Cci complx ls IgG (donc moins d IgG n solution) t fix l factur rhumatoïd. FR (IgM) nti IgG FR (IgM) FR (IgM) + Sérum + anti-igg L FR rconnaît l complx IgG Séparation du sérum (avc évntullmnt IgM spécifiqus) Surnagant placé dans un plaqu ELIS pour la détction ds IgM spécifiqus IV jout d anti-igg 2. Tst d captur : on utilis un ELIS d captur d IgM : ls IgM sont capturés par ds anticorps anti-igm fixés sur la phas solid. Ensuit on détct ls IgM avc l antigèn viral concrné conjugué à un nzym. Suls ls IgM spécifiqus réagissnt. Lavag pour éliminr + ntigèn couplé ls élémnts non à un nzym fixés + Sérum nti IgM Si ds IgM spécifiqus d l'antigèn sont présnts, ls antigèns sont captés Si ds IgM non spécifiqus (par x FR) sont présnts, pas d captag d l'antigèn Lavag pour éliminr ls élémnts non fixés + Substrat Réaction positiv Réaction négativ IV Tst d captur différnciant ls IgM spécifiqus t ls IgM non spécifiqus 4. Tchniqus diagnostiqus 15

17 IV. Diagnostic viral 4. Tchniqus diagnostiqus 2. Rchrch dirct du virus 2.1. Microscopi éléctroniqu L microscop élctroniqu st un outil qui prmt d visualisr ds objts xtrêmmnt ptits. Pour ctt raison, il a été utilisé abondammnt pour caractérisr t idntifir ls virus. Conçu au cours ds annés 1930, notammnt par Ernst Ruska qui obtindra un prix Nobl pour cla n 1986, l microscop élctroniqu à transmission «transmission lctron microscop» (TEM) génèr un faiscau d élctrons au départ d un cathod soumis à un voltag très élvé. C faiscau d élctrons st dirigé sur un échantillon qu il travrs pour n révélr l imag sur un écran fluorscnt, un plaqu photographiqu ou plus récmmnt sur un camra CCD qui put alors révélr l imag n tmps rél sur un monitur. D autrs microscops comm l microscop à balayag «Scanning Elctron Microscop» (SEM) ou l microscop d forc atomiqu «tomic Forc Microscop» (FM) prmttnt aussi d visualisr la structur ou ds détails d particuls virals. IV Microscop élctroniqu Si ll présnt un intérêt crtain pour la virologi, la microscopi élctroniqu st cpndant pu utilisé n rgard d l invstissmnt rquis t d la tchnicité élvé qu ll impliqu. Pour la mis n évidnc d virus, on travaill généralmnt avc ds grills d cuivr ou d zinc rcouvrts d un fin film d carbon t/ou d formvar. On dépos nsuit sur c film un préparation viral qu l on va colorr avc ds agnts comm l acétat d uranyl ou l acid phosphotungstiqu. Ls virus apparaissnt alors n contrast négatif comm ds structurs clairs sur un fond foncé. On parl d coloration négativ. La tchniqu prmt d idntifir l virus sur bas d sa structur t d sa taill. Son principal avantag st la rapidité d réalisation. On put la combinr avantagusmnt avc ls tchniqus immunologiqus : on parl alors d décoration immunologiqu (la particul viral st ntouré d immunoglobulins qui lui donnnt un aspct plus dns), d immunosorbnt lctron microscopy (ISEM) lorsqu l on adsorb ls particuls virals à l aid d immunoglobulins, un pu à la manièr d un ELIS. Dans crtains cas, on a utilisé ds particuls métalliqus sphériqus pour marqur spécifiqumnt crtains structurs virals (immunogold-lablling) IV Particuls virals (n microscopi élctroniqu) IV Idntification d structur viral par la tchniqu d la décoration immunologiqu IV diagnostic viral 4. Tchniqus diagnostiqus 16

18 IV. Diagnostic viral > 4. Tchniqus diagnostiqus 2.2. Cultur viral La cultur d clluls (cll cultur) prmt d maintnir n croissanc ds clluls n conditions contrôlés. C procédé a été largmnt utilisé pour l isolmnt t la maintnanc d souchs virals. in qu ctt approch soit souvnt lnt t qu ll rquirt un tchnicité élvé, ll a longtmps été considéré comm l standard pour ls laboratoirs d diagnostic d maladis virals humains ou animals (Lland and Ginocchio, 2007). Son principal avantag st d prmttr l isolmnt d un grand nombr d virus très différnts. L chrchur va chrchr à détctr, par xamn microscopiqu d clluls n cultur, ds indics d infction viral. L spctr ds ffts st assz larg t rquirt un xpérinc conséqunt. On put citr l gonflmnt ou l rétrécissmnt ds clluls, ls rgroupmnts ou la formation d syncytium pour allr dans crtains cas jusqu à la dstruction complèt. Cs changmnts sont applés ffts cytopathiqus (cytopathic ffcts CPE). Crtains détctions puvnt êtr réalisés ndéans ls prmièrs 24h comm souvnt pour l HSV (uman Hrps Simplx Virus), mais d autrs dmandnt un périod bin plus longu. Dans crtains cas, on va combinr l tst à un hémadsorption (HD) qui prmttra l idntification spécifiqu d virus qui xprimnt ds hémagglutinins. IV Efft cytopathiqu Flèchs noirs : clluls normals Flèchs griss : après infction, ds îlots d clluls commncnt à s arrondir Flèchs blanchs : ls clluls s détachnt t murnt Un détction dirct d antigèns viraux par fluorscnc put complètr adéquatmnt la tchnologi t raccourcir d façon important la duré d la cultur. Ls tchniqus d cultur cllulair ont baucoup évolué au cours ds drnièrs annés pour offrir d nouvaux formats d cultur t ds altrnativs intérssants n trm d diagnostic. D autrs tchniqus, comm l inoculation d œufs mbryonnés ou ncor d animaux d laboratoir, si lls n sont pas à proprmnt parlr ds tchniqus liés à la cultur d clluls, prmttnt la mis n évidnc d virus. Côté virus d plants, on a aussi utilisé ls culturs d clluls végétals (protoplasts) pour la multiplication t l étud d virus. Toutfois, la tchnicité élvé rquis n a limité l intérêt dans l cadr du diagnostic viral. IV diagnostic viral 4. Tchniqus diagnostiqus 17

19 IV. Diagnostic viral > 4. Tchniqus diagnostiqus 2.3. Détction dirct d antigèns La détction dirct ds protéins antigéniqus d origin viral prmt dans d nombrux cas d posr un diagnostic rapid. Dans crtains cas, ctt détction st rapid t facil, comm par xmpl pour la détction du virus rspiratoir syncytial (RSV) dans ds sécrétions rspiratoirs ou la détction d un antigénémi dans ls polymorphonucléairs nutrophils lors d un infction par l cytomgalovirus (CMV). IV Elisa - Vidéo Lorsqu l virus n st pas cultivabl, ctt approch d détction dirct st souvnt privilégié. C sra l cas par xmpl pour la détction d l antigèn d surfac du virus d l hépatit (ghs) présnt dans l sang ou ncor pour ls virus qui infctnt ls plants. Lorsqu l virus st cultivabl, l utilisation d la détction dirct prmt d accélérr l diagnostic t d obtnir un détction plus rapid. Ls tchniqus utilisés pour la détction dirct d antigèns sont ls mêms qu clls utilisés pour la détction d anticorps, déjà décrits. On va donc utilisr ds tchniqus d agglutination, d précipitation, ELIS (nzym-linkd immunosorbnt assay) ou d immunofluorscnc. Dans c drnir cas, on va utilisr ds anticorps anti-antigèn marqués avc un molécul fluorscnt, comm l isothiocyanat d fluorscéin. L xamn d la préparation à l aid d un microscop à épifluorscnc, qui émt un lumièr ultravioltt, prmt la détction d un coloration spécifiqu n surfac ds clluls xaminés. Il st aussi possibl d détctr ls protéins virals après élctrophorès sur gl d polyacrylamid t transfrt sur un mmbran d nitrocllulos : on parl alors d «Wstrn blot»(figure: Wstrn blot VQ protéin d capsid). Ctt tchniqu prmt notammnt, outr la détction d la protéin viral, qu l on put détctr au moyn d anticorps, d mttr n évidnc son poids moléculair. Ctt tchniqu st égalmnt utilisé pour la rchrch d anticorps contr ds composants virals. gglutination ntigèn Elisa Immunofluorscnc dirct f + Conjugué (IgG couplé à un fluorscéin) qui s fix sur ls antigèns U.V. f IV Détction d antigèns IV diagnostic viral 4. Tchniqus diagnostiqus 18

20 IV. Diagnostic viral > 4. Tchniqus diagnostiqus 2.4. Détction d acids nucléiqus Il st possibl d détctr l DN ou l RN viral par hybridation. L princip à la bas d ctt tchniqu st tout simplmnt clui d la complémntarité ds doubls brins! Si l on soumt ls acids nucléiqus à un tmpératur élvé (94 C), ls brins s dissocint. Si lors du rfroidissmnt, un sond complémntair à un ds brins st présnt, ll s apparira alors au brin cibl. Ls sonds sont généralmnt marqués à l aid d marquurs radioactifs ou d un molécul comm la digoxigénin, facilmnt idntifiabl. ppliqué à la détction d l RN, on va parlr d «Northrn blot», t d «Southrn blot» lorsqu il s agit d détction d DN. Ctt tchniqu st utilisé pour la détction d crtains virus n anatomopathologi. Ell st d moins n moins utilisé dans l domain du diagnostic pur, mais consrv tout son intérêt pour l étud du fonctionnmnt viral au sin d la cllul. IV Thrmocyclur Mais dpuis un vingtain d annés, d nouvlls tchniqus ont véritablmnt révolutionné l domain du diagnostic. La réaction d polymérisation n chaîn («polymras chain raction» ou PCR) prmt d copir un séqunc nucléotidiqu connu un très grand nombr d fois c qui n facilit la détction, à l aid d amorcs spécifiqus t d un apparil applé thrmocyclur. 5' 3' 5' 3' G G C G G C T T G G C C G G C G C G T T C C G G G C C G G T G C G C T C G C G G C G C G T T C C G G G C C G G T G C G C T Taq Polymras 3' 5' 5' Ct apparil st capabl d répétr rapidmnt un séri d cycls d chauff t d rfroidissmnts. L xcllnt connaissanc ds génoms viraux a facilité c dévloppmnt tchnologiqu. Dans l cas ds virus à RN, on réalisra d abord un transcription invrs (rvrs transcription) à l aid d un nzym applé transcriptas invrs (rvrs transcriptas), avant la réalisation d la PCR. On parlra alors d un RT-PCR. La tchniqu st maintnant largmnt utilisé n virologi t décliné n plusiurs vrsions, comm la PCR multiplx qui vis l amplification d plusiurs cibls au sin d la mêm réaction ou ncor la PCR niché (nstd PCR), qui prmt d augmntr ncor la snsibilité d la réaction n réalisant un PCR suivi d un duxièm PCR ciblant un portion intrn du prmir amplicon produit. La tchniqu PCR, si ll offr l avantag d un très grand snsibilité, n n présnt pas moins ds défauts! L prmir st la difficulté d quantifir l DN ciblé. C problèm a été contourné avc l dévloppmnt d PCR quantita- Dénaturation (95 C) 5' 3' 3' 5' Hybridation (50 C) 5' 3' 3' 5' Extnsion (72 C) 5' 3' 3' 5' IV Princip d la PCR IV diagnostic viral 4. Tchniqus diagnostiqus 19

21 IV. Diagnostic viral > 4. Tchniqus diagnostiqus tivs La quantification d la fluorscnc associé à un sond Taqman ou à un agnt colorant comm l SYR grn prmt d quantifir l DN ciblé dans la réaction, n suivant l élaboration ds produits d amplification au fur t à msur d la réaction, sans dvoir ouvrir l tub réactionnl : il s agit d un PCR quantitativ n tmps rél. 5' 3' 3' 5' Un duxièm problèm rncontré avc ctt tchnologi st sa très grand snsibilité : un simpl contamination d l échantillon à tstr put conduir à ds faux positifs. Ctt limitation impliqu la mis n plac d msurs stricts par l laboratoir d manièr à limitr au maximum cs risqus. Par aillurs ls produits d amplification, fort richs n amplicons, sont un sourc important d contamination, si on n sépar pas clairmnt ls zons d préparation ds zons d amplification dans l laboratoir. C risqu n xist par n cas d PCR n tmps rél où l tub d amplification rst frmé. Troisièm problèm : ls virus ont un génom xtrêmmnt variabl. Lorsqu la séqunc nucléotidiqu rchrché n st plus xactmnt idntiqu à cll ciblé par la PCR, cla put ntraînr ds résultats faussmnt négatifs. Plusiurs solutions tchniqus minimisnt c problèm : choix judiciux ds amorcs dans un zon très stabl du génom, utilisation d amorcs dégénérés, c.à.d. où à un mêm position plusiurs nucléotids sont possibls. La PCR t ls tchniqus d hybridation prmttnt d quantifir ls acids nucléiqus viraux, t donc ls virus uxmêms! On parl alors d charg viral. Ell st souvnt détrminé par PCR ou RT-PCR. L étud d la charg viral prmt d suivr avc précision l dévloppmnt d un infction, d proposr ds indications d traitmnt t d n suivr ls ffts. Par xmpl, la charg viral st actullmnt souvnt utilisé comm outil d suivi dans ls infctions par l virus d l hépatit, d l hépatit C, d l immunodéficinc acquis (VIH ou HIV) ou l cytomégalovirus. D la mêm manièr, on chrch à quantifir ls virus pathogèns ds végétaux au sin d culturs d protoplasts, pour comprndr lur fonctionnmnt au sin d la cllul végétal. IV Cycls succssifs 5' 3' 3' 5' IV Xièm cycl IV diagnostic viral 4. Tchniqus diagnostiqus 20

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