Centre d expertise en analyse environnementale du Québec PROTOCOLE POUR LA VALIDATION ET LA VÉRIFICATION D UNE MÉTHODE D ANALYSE EN MICROBIOLOGIE
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- Laurent Boivin
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1 Cetre d expertise e aalyse eviroemetale du Québec Programme d accréditatio des laboratoires d aalyse PROTOCOLE POUR LA VALIDATION ET LA VÉRIFICATION D UNE MÉTHODE D ANALYSE EN MICROBIOLOGIE DR-12-VMM Éditio : 6 février 2012
2 Pour toute iformatio complémetaire sur les activités du Cetre d expertise e aalyse eviroemetale du Québec ou pour vous procurer os documets, veuillez cosulter otre site Iteret à l adresse suivate : ou commuiquer avec ous : Cetre d expertise e aalyse eviroemetale du Québec Complexe scietifique 2700, rue Eistei, bureau E Québec (Québec) G1P 3W8 Téléphoe : Télécopieur : Courriel : ceaeq@mddep.gouv.qc.ca Référece bibliographique CENTRE D EXPERTISE EN ANALYSE ENVIRONNEMENTALE DU QUÉBEC, Protocole pour la validatio et la vérificatio d ue méthode d aalyse e microbiologie, DR-12-VMM, Québec, Cetre d expertise e aalyse eviroemetale du Québec, 6 février Dépôt légal Bibliothèque et Archives atioales du Québec, 2012 ISBN (PDF) ISBN (PDF), Éditio précédete Gouveremet du Québec, 2012
3 AVANT-PROPOS Au cours des deux derières déceies, le Québec a vu s implater u grad ombre de laboratoires commerciaux, idustriels et istitutioels exerçat leurs activités das le domaie de la protectio de l eviroemet. Ce réseau de laboratoires est o seulemet importat pour l écoomie de la provice, mais il permet égalemet de répodre aux besois e matière de coaissaces eviroemetales à la gradeur du territoire. Le miistère du Développemet durable, de l Eviroemet et des Parcs, au moye du Programme d accréditatio des laboratoires d aalyse (PALA), a facilité e quelque sorte l émergece de cette partie de l idustrie. Le Protocole pour la validatio et la vérificatio d ue méthode d aalyse e microbiologie s iscrit das la série de documets de référece produits par le Cetre d expertise e aalyse eviroemetale du Québec, resposable de la gestio du PALA pour le Miistère. Le protocole précise les exigeces liées à la validatio des méthodes d aalyse e microbiologie lors de l implatatio de ouvelles méthodes ormalisées au laboratoire et du suivi des méthodes e utilisatio. Ce documet est réservé aux méthodes quatitatives uiquemet. La vérificatio des méthodes présece/absece se fait par les cotrôles réguliers de la méthode. DR-12-VMM Page 3 de 17
4 TABLE DES MATIÈRES AVANT-PROPOS INTRODUCTION LIMITE DE DÉTECTION D UNE MÉTHODE LIMITES DE QUANTIFICATION D UNE MÉTHODE FIDÉLITÉ Réplicabilité Répétabilité Reproductibilité Méthode de calcul de la réplicabilité, la répétabilité et la reproductibilité POURCENTAGE DE RÉCUPÉRATION Méthode de calcul du pourcetage de récupératio PERFORMANCE DE LA MÉTHODE Méthode de calcul de la performace SÉLECTIVITÉ DE LA MÉTHODE Méthode de calcul de la sélectivité :...10 GLOSSAIRE...11 RÉFÉRENCES...12 ANNEXE I...13 ANNEXE II...14 ANNEXE III...15 ANNEXE IV...16 DR-12-VMM Page 4 de 17
5 1. INTRODUCTION Ce documet défiit les termes et le processus relatifs à la fiabilité et à la validatio secodaire d ue méthode d aalyse e microbiologie lors de so implatatio et à la vérificatio de la performace d ue méthode déjà e utilisatio au laboratoire. La validatio iitiale (primaire) d ue méthode d aalyse etraîe la détermiatio de plusieurs paramètres : la limite de détectio d ue méthode, les limites de quatificatio d ue méthode, la fidélité (réplicabilité, répétabilité, reproductibilité), la performace, la sélectivité et, fialemet, la récupératio. Elle est gééralemet effectuée par l orgaisme ayat mis au poit cette méthode. La validatio secodaire est effectuée lors de l implatatio d ue méthode de référece ormalisée (par le CEAEQ, le miistère de l Eviroemet de l Otario, l USEPA, Saté Caada, ISO, AFNOR, etc.) pour vérifier la capacité du laboratoire à obteir ue performace comparable aux doées de validatio publiées. Elle permet d établir si la ouvelle méthode est équivalete ou supérieure à la méthode usuelle du laboratoire. Les doées de validatio permettet esuite d effectuer le suivi de la performace de la méthode e cours d utilisatio, de détecter des tedaces et des problèmes potetiels sur le pla aalytique, d évaluer la performace des aalystes et de détermier l icertitude de mesure des méthodes. Il existe plusieurs défiitios et de ombreuses faços de calculer les différets paramètres liés à la validatio d ue méthode. Il deviet essetiel d uiformiser ces défiitios aisi que les méthodes de calcul utilisées pour détermier la coformité du laboratoire aux exigeces du préset protocole. L aexe I illustre les formules de calcul qui sot utilisées pour la détermiatio des différets paramètres de validatio secodaire. 2. LIMITE DE DÉTECTION D UNE MÉTHODE La limite de détectio d ue méthode (LDM) permet de déceler la cocetratio miimale, à l aide d ue méthode d aalyse, avec ue fiabilité défiie. Théoriquemet, pour ue méthode e microbiologie, il s agit d u (1) orgaisme cible das le volume d échatillo aalysé. La limite de détectio est ormalemet défiie das la méthode de référece ormalisée. DR-12-VMM Page 5 de 17
6 3. LIMITES DE QUANTIFICATION D UNE MÉTHODE Les limites de quatificatio d ue méthode (LQM) sot les cocetratios la plus basse et la plus élevée, correspodat au ombre de coloies isolées d u volume doé d échatillo, qui peuvet être déombrées sur ue seule membrae ou gélose, à l aide d ue méthode d aalyse avec ue fiabilité défiie et qui costitue la zoe quatifiable d ue méthode. Les limites de quatificatio sot défiies das les méthodes de référece ormalisées. La limite supérieure de quatificatio est la valeur au-delà de laquelle la fiabilité d u déombremet sur ue seule membrae ou gélose à l aide d u volume détermié d échatillo est affectée par des facteurs icotrôlables. La limite iférieure de quatificatio est la valeur e deçà de laquelle l erreur aticipée deviet trop grade par rapport au ombre de coloies déombrées. 4. FIDÉLITÉ La fidélité à u iveau doé correspod à l étroitesse de l accord etre les résultats obteus e appliquat le procédé expérimetal à plusieurs reprises ( = 10 réplicats) das des coditios détermiées. Selo les coditios d exécutio de l essai, cette caractéristique s exprime sous forme de réplicabilité, de répétabilité ou de reproductibilité pour ue méthode Réplicabilité La réplicabilité 1 à u iveau doé correspod à l étroitesse de l accord etre les résultats idividuels successifs obteus pour le même échatillo soumis à l essai das le même laboratoire et das les mêmes coditios : même aalyste, mêmes etooirs (filtratio), même lot de milieu de culture et membrae filtrate, même icubateur, même jour d aalyse. La réplicabilité peut varier d u aalyste à u autre. Das la littérature, l expressio «précisio itra-techicie» est souvet employée. D ailleurs, cette doée peut servir ultérieuremet à l évaluatio et au suivi de la performace techique d u aalyste. Ce paramètre de validatio est détermié à partir de l équatio suivate : t 0, 975; -1 s1 où s 1 : écart type d ue série de mesures se référat à la réplicabilité. 1 Cette défiitio correspod à la défiitio de répétabilité du documet CAN-P-1585 Appedice C du Coseil caadie des ormes. DR-12-VMM Page 6 de 17
7 4.2. Répétabilité La répétabilité 1 à u iveau doé correspod à l étroitesse de l accord etre les résultats idividuels obteus pour le même échatillo soumis à l essai das le même laboratoire et dot les coditios aalytiques variet, comme par exemple: l aalyste, le lot de préparatio de milieu de culture, le lot d eau de riçage, le lot de membrae filtrate, l icubateur, le momet de la jourée (avat-midi et après-midi), le poste de travail, etc. Ce paramètre de validatio est détermié à partir de l équatio suivate : t 0, 975; -1 s2 où s 2 : écart type d ue série de mesures se référat à la répétabilité Reproductibilité La reproductibilité à u iveau doé correspod à l étroitesse de l accord etre les résultats idividuels obteus pour le même échatillo soumis à l essai das des laboratoires différets et das les coditios suivates : aalyste différet, appareil différet, même jour. Cette doée est dispoible que si le laboratoire participe à u essai iter-laboratoire pour ue méthode idetique et u même échatillo et est requise que pour la validatio d ue méthode développée par le laboratoire. À l itérieur du PALA, le critère de variatio relatif (CVR) est u excellet idicateur de la reproductibilité d ue méthode Méthode de calcul de la réplicabilité, la répétabilité et la reproductibilité Les trois termes précédets se rapportat à la fidélité s exprimet à l aide d u itervalle de cofiace à ue cocetratio doée, e foctio de l écart type (s () ), à u iveau de cofiace spécifié, habituellemet 95 %, et pour u ombre doé de détermiatios ( = 10 réplicats). L itervalle de cofiace à 95% sur la moyee arithmétique d ue série de mesures est défii par: x t 0, 975; -1 s 1 Cette défiitio correspod à la défiitio de fidélité itermédiaire du documet CAN-P-1585 Appedice C du Coseil caadie des ormes. DR-12-VMM Page 7 de 17
8 Il faut se référer à ue table statistique de la distributio de Studet pour coaître la valeur de t (0,975; -1) correspodat à la probabilité au dépassemet bilatéral (voir l aexe II). Pour 10 réplicats, t (0,975; -1) = 2,262. La réplicabilité, la répétabilité et la reproductibilité doivet être détermiées das la zoe quatifiable de la méthode. Il faut doc choisir ue cocetratio d u échatillo réel ou fortifié et faire dix réplicats du même échatillo. Chaque échatillo doit subir toutes les étapes de la méthode d aalyse e respectat les coditios spécifiées à l égard de la réplicabilité, la répétabilité et la reproductibilité. Faire l esemble des calculs liés à la méthode et reporter les résultats e utilisat les uités appropriées et le ombre de chiffres sigificatifs écessaire. U test de rejet recou (Grubb, Dixo, etc.) doit être iclus das les calculs si certaies doées semblet aberrates. L aexe IV présete des exemples d approches pour le calcul de la réplicabilité et de la répétabilité. 5. POURCENTAGE DE RÉCUPÉRATION Le pourcetage de récupératio permet de détermier, pour u échatillo doé ou u type de matrice doé et à u iveau de cocetratio doé, la présece d iterférece potetielle lors du processus d aalyse. Le taux de récupératio correspod à la différece (e pourcetage) etre la cocetratio mesurée d u échatillo fortifié et la cocetratio mesurée du même échatillo o fortifié, divisée par la cocetratio de l orgaisme ajouté. U miimum de ciq essais est exigé pour la détermiatio du pourcetage de récupératio d ue méthode d aalyse Méthode de calcul du pourcetage de récupératio Das la zoe quatifiable de la méthode, aalyser ciq échatillos réels. L eau stérile ou démiéralisée est pas cosidérée comme u échatillo réel, cotrairemet à l eau prélevé à même le robiet. Ajouter ue cocetratio de l orgaisme ciblé tout e évitat de se redre au-delà de la limite supérieure de quatificatio de la méthode. La cocetratio de l orgaisme ajoutée doit être détermiée par ue autre méthode comme l icorporatio à la gélose utilisat u milieu de culture o sélectif. où Cf - C Récupératio (%) = 100 Ca C f : cocetratio mesurée de l orgaisme cible d u échatillo fortifié C : cocetratio mesurée de l orgaisme cible d u échatillo o fortifié C a : cocetratio de l orgaisme cible ajoutée DR-12-VMM Page 8 de 17
9 6. PERFORMANCE DE LA MÉTHODE La performace de la méthode peut se mesurer à l aide de la sesibilité, de la spécificité, du taux de faux positifs, du taux de faux égatifs et de l efficacité. Les doées de cofirmatio amassées au cours des derières aées peuvet être utilisées par le laboratoire. Le résultat sera bie plus représetatif de la réalité de la méthode si u grad ombre de doées est utilisé. La sesibilité est la fractio de tous les résultats positifs correctemet idetifiée das le comptage présumé; la spécificité est la fractio de tous les résultats égatifs correctemet idetifiée das le comptage présumé; le taux de faux positifs est la fractio de positifs observés o correctemet idetifiée; le taux de faux égatifs est la fractio de égatifs observés o correctemet idetifiée; l efficacité est la fractio de coloies idetifiée correctemet Méthode de calcul de la performace À l aide des résultats des coloies typiques et atypiques présumées et cofirmées, détermier la performace de la méthode à l aide des formules suivates : où Sesibilité : a/(a + b) Spécificité : d/(c + d) Taux de faux positifs : c/(a + c) Taux de faux égatifs : b/(b + d) Efficacité : (a + d)/ a b c d : ombre de résultats présumés positifs et cofirmés positifs (vrais positifs) : ombre de résultats présumés égatifs et cofirmés positifs (faux égatifs) : ombre de résultats présumés positifs et cofirmés égatifs (faux positifs) : ombre de résultats présumés égatifs et cofirmés égatifs (vrais égatifs) : ombre total de coloies Référer à l aexe III pour u tableau schématisat ces défiitios. 7. SÉLECTIVITÉ DE LA MÉTHODE La sélectivité est la caractéristique d ue méthode qui favorise la croissace de l orgaisme désiré tout e retardat la croissace d autres orgaismes offrat pas d itérêt. Les doées de cofirmatio amassées au cours des derières aées peuvet être utilisées par le laboratoire. Le résultat sera bie plus représetatif de la réalité de la méthode si u grad ombre de doées est utilisé. L idex de sélectivité est calculé à l aide du rapport du ombre de coloies typiques, recherchées et observées, sur le ombre total de coloies isolées sur les milieux de culture pedat l aalyse. La sélectivité est meilleure lorsque l idex se rapproche de l uité. DR-12-VMM Page 9 de 17
10 7.1. Méthode de calcul de la sélectivité : À l aide des résultats de cofirmatio des coloies typiques et atypiques effectuée lors du cotrôle de la méthode, détermier la sélectivité (F) à l aide de la formule suivate : où a c F = ((a + c)/) : ombre de résultats présumés positifs et cofirmés positifs (vrais positifs) : ombre de résultats présumés positifs et cofirmés égatifs (faux positifs) : ombre total de coloies DR-12-VMM Page 10 de 17
11 GLOSSAIRE Coloie atypique : Coloie qui e présete pas la morphologie coloiale attedue (aspect et couleur) sur le milieu de culture employé. Coloie typique : Coloie qui présete la morphologie coloiale attedue (aspect et couleur) sur le milieu de culture employé. Comptage cofirmé : Comptage obteu après avoir soumis les coloies présumées à d autres tests. Comptage présumé : Nombre de coloies qui, selo leur morphologie coloiale attedue (aspect et couleur), correspodet à l orgaisme cible. Duplicata : Deux parties aliquotes distictes obteues à partir d u même échatillo et soumises à toutes les étapes de la procédure aalytique. Échatillo fortifié : Échatillo réel auquel o a ajouté ue quatité coue d u ou de plusieurs orgaismes cibles. La quatité ajoutée doit se situer das les limites de quatificatio de la méthode. Échatillo réel : Échatillo prélevé directemet das l eviroemet (ex. : eau du robiet, eau de surface, eau usée). Réplicat : Plusieurs parties aliquotes distictes obteues à partir d u même échatillo et soumises aux mêmes procédures aalytiques du prétraitemet au dosage. DR-12-VMM Page 11 de 17
12 RÉFÉRENCES APHA-AWWA-WEF. Stadard Methods for the Examiatio of Water ad Wastewater, 21st Editio, Washigto D.C., BUREAU DE NORMALISATION DU QUÉBEC. Norme : Eaux Recherche et déombremet de coliformes fécaux thermotolérats Méthode par filtratio sur membrae, Québec, Bureau de ormalisatio du Québec, 1992, 26 p. (Projet NQ ) CENTRE D EXPERTISE EN ANALYSE ENVIRONNEMENTALE DU QUÉBEC. Critères de variatio relatifs, DR-12-CVR, Cetre d expertise e aalyse eviroemetale du Québec, Éditio courate. CENTRE D EXPERTISE EN ANALYSE ENVIRONNEMENTALE DU QUÉBEC. Programme d'accréditatio des laboratoires d'aalyse, DR-12-PALA, Québec, Cetre d'expertise e aalyse eviroemetale du Québec, Éditio courate. CENTRE D EXPERTISE EN ANALYSE ENVIRONNEMENTALE DU QUÉBEC. Protocole de validatio des méthodes d aalyses e chimie, DR-12-VMC, Miistère du Développemet durable, de l Eviroemet et des Parcs, Éditio courate. CONSEIL CANADIEN DES NORMES, Défiitios pour le programme du DSP-AE, CAN-P-1585 Appedice C, Otario, 23 jui EPA. Microbiological Methods for Moitorig the Eviromet (Water ad Waste), ISO/TR 13843:2000. Qualité de l eau Liges directrices pour la validatio des méthodes microbiologiques, 1 re éditio, Suisse, 2000, 47 p. ISO Qualité de l eau Critères permettat d établir l équivalece de méthodes microbiologiques, 1 re éditio, Suisse, 2004, 20 p. TAYLOR, Joh Keea. Quality Assurace of Chemical Measuremets, U.S.A., Lewis Publishers, 1987, 328 p. TAYLOR, Joh Keea. Statistical Techiques for Data Aalysis, U.S.A, Lewis Publishers, 1990, p DR-12-VMM Page 12 de 17
13 ANNEXE I FORMULES Moyee arithmétique des réplicats x i 1 x i s Écart type i 1 ( x x ) 1 i 2 Récupératio Cf - C Récupératio % = 100 Ca Sesibilité a/(a + b) Réplicabilité t (, 975; -1 ) 0 Spécificité d/(c + d) s 1 Répétabilité t (, 975;-1 ) 0 s Taux de faux positifs c/(a + c) 2 Taux de faux égatifs b/(b + d) Efficacité (a + d)/ Sélectivité F = ((a + c)/) où s : écart type : ombre de doées sur lesquelles s appuiet les calculs x : moyee arithmétique de mesures s 1 : écart type d ue série de mesures se référat à la réplicabilité s 2 : écart type d ue série de mesures se référat à la répétabilité V o : moyee des valeurs observées C f : cocetratio de l orgaisme cible de l échatillo fortifié C : cocetratio de l orgaisme cible de l échatillo o fortifié C a : cocetratio de l orgaisme cible ajoutée F : idex de sélectivité d ue méthode t (0,975; -1) : valeur t de Studet pour u itervalle bilatéral à u iveau de cofiace de 95 % pour échatillos a : ombre de résultats présumés positifs et cofirmés positifs (vrais positifs) b : ombre de résultats présumés égatifs et cofirmés positifs (faux égatifs) c : ombre de résultats présumés positifs et cofirmés égatifs (faux positifs) d : ombre de résultats présumés égatifs et cofirmés égatifs (vrais égatifs) DR-12-VMM Page 13 de 17
14 ANNEXE II Valeur du t de Studet pour u itervalle bilatéral à u seuil de cofiace à 95 % Degré de liberté ( - 1) t (0,975) 1 12, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , ,000 Tiré de: Taylor, Joh Keea. Quality Assurace of Chemical Measuremets, 1987, 328 p. Note: Des tables statistiques plus complètes sot dispoibles sur Iteret. DR-12-VMM Page 14 de 17
15 ANNEXE III Tableau schématisat les vrais positifs, les vrais égatifs, les faux positifs et les faux égatifs Comptage présumé + - Comptage cofirmé + a b - c d a b c d : ombre de résultats présumés positifs et cofirmés positifs (vrais positifs) : ombre de résultats présumés égatifs et cofirmés positifs (faux égatifs) : ombre de résultats présumés positifs et cofirmés égatifs (faux positifs) : ombre de résultats présumés égatifs et cofirmés égatifs (vrais égatifs) DR-12-VMM Page 15 de 17
16 ANNEXE IV Approches proposées pour la validatio des méthodes Réplicabilité Approche A : 10 aalyses complètes pour chaque paramètre/matrice : Pour chaque techicie effectuat l aalyse : 1. Chaque techicie effectue 10 filtratios d u même échatillo réel (si la matrice cotiet l orgaisme cible) ou fortifié das les mêmes coditios. 2. L écart type des résultats obteus est esuite calculé. 3. L écart-type est etré das le calcul de la réplicabilité. Ou Exemple : Pour 10 filtratios effectuées sur le milieu m-fc das l eau potable, la moyee des coliformes fécaux observés est de 40 et l écart type obteu est de 3. O effectue le calcul de la réplicabilité : x 3 = La réplicabilité est doc de 40 ± 2, soit 5%. Approche B 1 : 10 filtratios pour u paramètre/matrice + 10 lectures de pétris pour chaque paramètre/matrice : Pour chaque techicie effectuat l aalyse : 1. Chaque techicie effectue 10 filtratios d u même échatillo réel (si la matrice cotiet l orgaisme cible) ou fortifié das les mêmes coditios avec u seul milieu de culture. 2. L écart type des résultats obteus pour la filtratio est esuite calculé : s F 3. Pour chaque milieu de culture utilisé pour les méthodes de membraes filtrates, chaque techicie lit 10 fois ue boîte de Pétri coteat u ombre de coloies se situat das les limites de quatificatio de la méthode. Il est préférable d utiliser u échatillo positif aturel e présetat pas de cofluece plutôt qu u échatillo fortifié. 4. L écart type des résultats obteus pour la lecture est calculé : s L 2 5. L écart type total est calculé avec l équatio suivate : (S total = (s F + s 2 L )) 6. L écart type total est etré das le calcul de la réplicabilité. La moyee arithmétique utilisée pour la double iégalité de l itervalle de cofiace bilatéral se doit d être celle obteue avec les résultats de filtratio. Exemple : 1 Cette approche est pas applicable pour l aalyse des BHAA par icorporatio à la gélose. DR-12-VMM Page 16 de 17
17 Pour 10 filtratios effectuées sur le milieu m-fc das l eau potable, la moyee des coliformes fécaux observés est de 40 et l écart type obteu est de 3. Égalemet, 10 lectures ot été effectuées sur le milieu m-edo avec u échatillo réel. La moyee des lectures est de 60 avec u écart type de 2. O calcul l écart type total : ( ) = 3.6 O effectue le calcul de la réplicabilité : x 3.6 = La réplicabilité pour le milieu m-edo est doc de 40 (valeur de la filtratio) ± 3, soit 7,5%. Répétabilité Pour la répétabilité, ue seule approche est possible état doé que les dix coditios différetes sot davatage reliées à la filtratio et à l icubatio : 10 aalyses complètes pour chaque paramètre/matrice filtratios d u même échatillo réel (si la matrice cotiet l orgaisme cible) ou fortifié sot effectuées avec ue combiaiso de 10 coditios différetes (aalystes, lot de fabricatio de milieu de culture, lot d eau de riçage, lot de membrae filtrate, icubateur, momet de la jourée (am ou pm), poste de travail, etc). 2. L écart type des résultats obteus est esuite calculé. 3. L écart type est etré das le calcul de la répétabilité. Exemple : Pour 10 filtratios effectuées sur le milieu m-fc das l eau potable avec 10 coditios différetes, la moyee des coliformes fécaux observés est de 40 et l écart type obteu est de 5. O effectue le calcul de la répétabilité : x 5 = La répétabilité est doc de 40 ± 4, soit 10%. Note 1 : La réplicabilité et la répétabilité doivet être effectuées par matrice pour teir compte des dilutios requises das l eau usée. Par exemple, u laboratoire qui est accrédité pour les coliformes totaux (domaies 1 et 31) doit produire des doées de réplicabilité et de répétabilité pour u volume de 100 ml (domaie 1) et pour des volumes de 50, 10 et 1 ml (selo les dilutios utilisées par le laboratoire) (domaie 31) Note 2 : Les laboratoires qui utiliset des milieux combiés doivet fourir des doées de réplicabilité et de répétabilité pour les coliformes totaux et pour E. coli. Si u échatillo fortifié est utilisé, les deux souches microbiees doivet être utilisées. DR-12-VMM Page 17 de 17
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